La compréhension des mécanismes qui contrôlent l'expression des gènes est un enjeu majeur pour la recherche médicale. Elle nécessite un ensemble d'approches pangénomiques telles que les puces à ADN et plus récemment le séquençage à très haut débit qui génèrent une masse toujours plus grande de données numériques à traiter. Au cours de ma thèse, j'ai développé plusieurs outils informatiques innovants pour faciliter leur exploitation. Ainsi, j'ai créé une librairie R (AgiND) qui vérifie la qualité des données de puces à ADN Agilent et permet de les normaliser. Le nombre croissant d'expériences stockées dans Gene Expression Omnibus a motivé la mise en place du projet TBrowser. Une méthode originale DBF-MCL a été créée pour extraire des signatures transcriptionnelles annotées par l'intégration de diverses sources d'information. Stockées dans une base de données, elles sont accessibles à travers une interface Java, un service web SOAP et une librairie R/Bioconductor (RTools4TB). Enfin, un pipeline d'analyse dédié au ChIP-seq a été implémenté. Tous ces outils ont servi pour l'étude de diverses maladies dans le cadre de collaborations. / Understanding the mechanisms that control gene expression is a major challenge for medical research. This requires using a large set of pangenomic approaches such as those using DNA microarrays and high-throughput sequencing that generate an ever growing mass of digital data. During my thesis, I have developed several computer-based tools to facilitate their processing and analysis. I have created a R library (AgiND) that controls the quality of Agilent DNA microarray data and allows their statistical normalization. The growing number of experiences stored in Gene Expression Omnibus has motivated the development of the TBrowser project. An original method, DBF-MCL, was created to extract annotated transcriptional signatures by integrating various sources of information. Stored in a database, these signatures are accessible using a Java interface, a SOAP web service and a R/Bioconductor library (RTools4TB). Finally, a pipeline dedicated to the ChIP-seq analyses has been implemented. All these tools were used to study various diseases in collaborations.

Le gène est défini comme une unité fonctionnelle de l'hérédité. En effet, les gènes, transcrits en ARN, codent pour des protéines qui assurent l'essentiel des fonctions cellulaires. Cependant, les gènes ne représentent que 2% du génome humain. Ainsi, notre génome est presque exclusivement composé d'ADN non codant (ADNnc) qui, en raison d'une absence apparente de fonction (c'est-à-dire de transcription et de traduction), est également connu sous le terme peu élogieux d' « ADN poubelle ». De manière surprenante, la quantité d'ADNnc présente dans les cellules est proportionnelle au degré de complexité des organismes, suggérant ainsi que cet ADNnc pourrait avoir une fonction. En particulier, les centromères et des péricentromères, qui contiennent des séquences d'ADNnc de type satellite, permettent la ségrégation correcte de chromatides sœurs lors de la mitose. De plus des études récentes réalisées chez la levure S.pombe montrent que les régions péricentromériques peuvent être transcrites. Les ARNnc ainsi produits participent à l'établissement et au maintien de l'hétérochromatine péricentromérique. Bien que les mécanismes impliqués dans ces processus soient en grande partie identifiés, très peu de choses sont connues quant à la capacité transcriptionnelle de ces séquences satellites chez d'autres espèces.<br /><br />Ainsi, l'objectif de ma thèse a été d'évaluer le potentiel transcriptionnel des séquences satellites du génome humain.<br /><br />A mon arrivée dans le laboratoire, l'équipe du Pr Claire Vourc'h était particulièrement engagée dans ce projet puisqu'elle venait de mettre en évidence la transcription des séquences satellites 3 du locus 9q12 au cours de la réponse au stress. Mon travail de thèse m'a conduit à approfondir cette étude en identifiant de nouvelles séquences satellites dont la transcription est induite par le stress thermique. Par ailleurs, j'ai développé la première approche trancriptomique dédiée à l'expression des séquences satellites du génome humain : la RepChip. Le modèle de la réponse au stress m'a permis de valider cet outil. Ainsi, j'ai pu identifier non seulement de nouveaux contextes cellulaires permettant l'expression de ces séquences mais également deux mécanismes indépendants impliqués dans leur transcription. En particulier, un lien entre la capacité transcriptionnelle de ces séquences et des modifications de l'épigénome a pu être établi. Finalement, j'ai identifié un modèle d'inhibition de la transcription des séquences satellites au cours du choc thermique, le syndrome ICF (Immunodeficiency, Centromeric instability and Facial anomalies).

Chez Arabidopsis thaliana, les gènes d'ARNr5S, transcrits par l'ARN polymérase III, sont présents à environs 1000 copies regroupées en blocs situés au niveau de l'hétérochromatine péricentromérique des chromosomes 3,4 et 5. Le chromosome 5 porte un locus d'ADNr 5S sur chacun de ses bras. Seuls les loci du chromosome 4 et du bras gauche du chromosome 5 contiennent des gènes d'arn 5S transcrits. La population d'ARNr 5S est hétérogène chez Arabidopsis et se caractérise par la présence d'un ARNr 5S dit "majoritaire", représentant plus de 90% des transcrits 5S de la cellule, et d'ARN 5S "minoritaires" différant du transcrit 5S majoritaire par une ou deux substitutions nucléotidiques. Dans le cadre de l'étude de la régulation génétique de l'expression des gènes d'ARN 5S, nous avons identifié cloné et caractérisé TFIIIA d'Arabidopsis, qui est le facteur de transcription spécifique des gènes d'ARNr 5S. Lors de cette étude, nous avons également identifié un produit d'épissage alternatif du gène TFIIIA, codant une protéine plus courte que TFIIIA dans sa partie N-terminale dénomée TFIIIAbis. L'analyse de lignées RNAi ciblant TFIIIAbis et des expériences de transcription in vitro, ont suggéré que l'TFIIIAbis aurait un effet positif sur le taux global des ARNr 5S, probablement en stabilisant ces ARN. Nous avons aussi mené une étude de la régulation épigénétique de l'expression des gènes d'ARNr 5S. Ainsi, nous avons démontré l'implication de la méthylation de l'ADN dans la répression de la transcription des gènes d'ARNr 5S minoritaires. L'expression de ces gènes est aussi contrôlée par la voie de répression transcriptionnelle indépendante de la méthylation ADN dont MOM1 fait partie. Nous avons identifié un nouveau type de transcrits provenant de gènes d'ARNr 5S, appelés ARNr 5S-210. De la même façon que les ARNr 5S minoritaires, l'expression des ARNr 5S-210 est contrôlée par la méthylation de l'ADN et par la voie de répression contenant MOM1. Enfin, nous montrons que toutes les séquences répétées hétérochromatiques, à l'exception des éléments transposables, sont soumises à ces deux voies de répression

L'épigénétique est un composant essentiel du fonctionnement des génomes eucaryotes. Les divers phénomènes épigénétiques modifient l'état chromatinien et participent à la plasticité du génome, mais aussi au maintien de son identité fonctionnelle à travers les générations cellulaires. Parmi ces processus, la méthylation de l'ADN joue un rôle fondamental dans la régulation de l'expression des gènes.Chez les mammifères, la méthylation de l'ADN est associée à la répression transcriptionnelle, et elle remplit au moins trois fonctions essentielles. Premièrement, elle permet de réprimer les séquences répétées afin de préserver l'intégrité du génome. Deuxièmement, la méthylation contrôle l'expression des gènes soumis à l'empreinte parentale, qui sont des régulateurs cruciaux du développement et de la vie adulte. Enfin, la méthylation permet de réprimer certains gènes tissu-spécifiques dans les organes où ils doivent être silencieux. En plus de ces rôles physiologiques, la méthylation est liée au cancer. En effet, des patrons de méthylation anormaux sont fréquemment observés dans les cellules tumorales, et ces anomalies participent à la transformation cellulaire par plusieurs mécanismes.La méthylation exerce ces effets par l'intermédiaire de protéines dédiées, qui reconnaissent spécifiquement l'ADN méthylé et contrôlent la transcription en modulant la chromatine. Trois familles de protéines liant l'ADN méthylé sont connues chez les mammifères, et elles totalisent entre elles neuf membres. De nombreux arguments suggèrent que cette liste est encore incomplète, et que des protéines humaines liant l'ADN méthylé restent à découvrir. Dans cette optique, nous avons opté pour deux types d'approches distinctes, une approche basée sur la littérature et une approche génétique. L'étude des protéines candidates ne nous a pas permis d'identifier de nouvelles protéines liant l'ADN méthylé et l'approche génétique par phage display a révélé deux protéines intéressantes, CHD3 et HMGB1 qui doivent désormais être validées par des approches in vivo et in vitro.Par ailleurs, nous avons entrepris l'étude de la régulation des éléments répétés par la protéine Zbtb4 chez la souris. Les expériences préliminaires indiquent une possible régulation des satellites mineurs par Zbtb4. Le rôle de cette régulation sera, par la suite, approfondi.

Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) ont la capacité unique de se diviser indéfiniment et de pouvoir se différencier en de multiples types cellulaires. Elles apparaissent donc très prometteuses comme agents thérapeutiques dans les traitements médicaux du futur. Un enjeu majeur de la recherche actuelle consiste à comprendre la contribution des protéines régulatrices de la chromatine à la plasticité et au contrôle de l'expression du génome des cellules. La famille des remodeleurs Chd, qui fait partie de la super famille SNF2, comprend neuf membres, soit le tiers des remodeleurs exprimés dans les cellules ES murines. L'objectif principal de ce projet de thèse a consisté à identifier de manière exhaustive les gènes cibles de chaque facteur pour comprendre comment ils participent à la régulation du génome et se partagent le remodelage de la chromatine. Nous avons entrepris un projet à grande échelle dans lequel chaque gène codant chaque Chd a été fusionné, à son extrémité carboxy-terminale, à une séquence codant une étiquette, par recombinaison homologue en cellules ES. Les cellules ES étiquetées ont ensuite été utilisées pour des expériences d'immunoprécipitation de chromatine (ChIP-seq). La présence de l'étiquette a permis de standardiser et d'optimiser les méthodes d'immunoprécipitation des protéines. Les fragments d'ADN isolés ont ensuite été séquencés dans le laboratoire d'Ivo Gut (CEA/CNG -Evry- et CNAG -Barcelone-). Nous avons également analysé les transcriptomes des cellules ES où la déplétion de chaque protéine Chd a été réalisée, par hybridation sur puce et RNA-seq. Ces données ont permis de montrer le rôle de NuRD (Chd4, Hdac2) au sein des réseaux de la régulation transcriptionnelle des ES. Les données obtenues pour les facteurs Chd1, Chd8 et Chd4 montrent des rôles différents mais interconnectés pour chaque protéine. Enfin, ces données nous ont permis de proposer des hypothèses pour expliquer comment ces protéines contribuent à la régulation du génome.

During mammalian post-implantation development, germ cells are induced from the somatic tissues of the embryo. Following their induction, primordial germ cells undergo a genome-wide erasure and de novo re-establishment of DNA methylation marks. This epigenetic reprogramming re-instates pluripotency and allows parental imprints to be deposited. In the male germ line, a unique RNAi pathway involving PIWI proteins and their associated small RNAs (piRNAs) is necessary for proper de novo methylation. PIWI mutant mice are infertile and display methylation defects over transposon sequences. Using a transgenic approach, we investigated the signals necessary for piRNA production. We show that artificial piRNAs can be produced from reprogrammed loci outside of their native context. We then studied the genome-wide impact of piRNA loss on germ cell methylation. Whereas most of the genome is properly methylated, only a small group of transposons transiently reactivated in primordial germ cells is affected. Also we identified important structural differences in de novo methylation profiles between human sperm and ES cells. Finally, we compared sperm methylation profiles between human and chimpanzee and showed that the genome and the epigenome can evolve independently. Taken together, our results highlight the surprising plasticity of genome and epigenome interactions during development and evolution

L'inactivation du chromosome X est la réponse trouvée par l'évolution pour pallier à la divergence gonosomique entre mâle (XY) et femelle (XX). Ce phénomène sert donc à mettre les deux sexes sur un pied d'égalité en limitant la quantité de transcrits provenant des chromosomes X présents dans les cellules femelles. Au cours de mon doctorat, j'ai tenté de contribuer à l'étude des mécanismes de régulation transcriptionnelle, notamment l'activation, des deux acteurs principaux de l'inactivation: Xist et Tsix, son transcrit antisens. Pendant ces 4 anne��es, j'ai entrepris de cartographier le profil de fixation de plusieurs protéines le long du locus Xist/Tsix, dans le but de comprendre les mécanismes permettant une surexpression de Xist lors de la disparition de ses facteurs répressifs en cours de différenciation. J'ai donc pu établir un modèle de régulation transcriptionnelle de l'ARN non-codant Xist, impliquant plusieurs protéines connues pour leur rôle dans la régulation transcriptionnelle (CTCF et YY1) aussi bien que dans la formation de structures tridimensionnelles (la cohésine). La pertinence de ce modèle est renforcée par nos études montrant que de nombreux aspects de ce modèle sont conservés à travers l'évolution (notamment chez l'homme). J'ai également pu contribuer à la découverte de nouveaux activateurs de Tsix, certains facteurs de pluripotence se fixant au minisatellite DxPas34 afin de réguler l'élongation de la transcription de l'antisens. Ces résultats apportent donc d'importantes informations concernant les mécanismes régulant la mise en place du phénomène d'inactivation du chromosome X au cours du développement précoce de l'embryon.

La reproduction sexuée implique une différentiation extrême des gamètes qui s'accompagne de profonds remaniements des chromosomes parentaux. Au moment de la fécondation, ces chromosomes doivent être rendus compétents pour la formation du premier noyau zygotique. Au cours de ma thèse, j'ai étudié l'importance fonctionnelle de plusieurs voies moléculaires paternelles et maternelles participant à cette étape chez la drosophile. Le complexe HIRA est impliqué dans l'assemblage de nucléosomes dans le pronoyau mâle à la fécondation. J'ai décrit le rôle de HIRA et de son partenaire Yemanucléine-α dans cette voie. J'ai caractérisé plus finement ce complexe en étudiant son rôle somatique dans l'assemblage des nucléosomes et son implication dans la stabilité de l'hétérochromatine, améliorant notre compréhension des besoins biologiques qui conditionnent sa conservation et son évolution. Je me suis aussi intéressé à diverses situations affectant l'intégrité des chromosomes parentaux à la fécondation. (1) J'ai décrit les conséquences catastrophiques pour la méiose femelle de l'expression naturelle d'un transposon à travers l'étude d'un cas de dysgénésie hybride. (2) J'ai contribué à montrer que la protéine K81 est essentielle pour la protection des télomères dans les chromosomes paternels au cours de la spermatogénèse. (3) J'ai participé à caractériser les conséquences pour les chromosomes paternels de l'incompatibilité cytoplasmique induite par la bactérie Wolbachia. Ensemble, ces travaux soulignent les particularités des chromosomes parentaux à la fécondation et aident à cerner l'importance des voies maternelles et paternelles dans leur intégration dans le premier noyau du zygote

Une grande partie du génome des eucaryotes est constituée d'éléments transposables(ET). Ces séquences d'ADN répétées ont la capacité de se déplacer d'un site chromosomiqueà un autre et de multiplier le nombre de leurs copies, pouvant ainsi être la cause d'uneinstabilité génétique. Face à ce potentiel de mutagénèse, un certain nombre de systèmes ontété sélectionnés dans les génomes eucaryotes qui conduisent à une réduction de l'activité desET. Notamment, chez la drosophile, on a récemment mis en évidence des mécanismes derégulation impliquant les modifications d'histones, et une nouvelle classe de petits ARN,appelés piARN, qui contrôlent spécifiquement les éléments transposables dans les tissusreproducteurs.tirant est un rétrotransposon à LTR de la drosophile, de type Gypsy, isolé au sein dulaboratoire dans les populations naturelles de D. simulans, où le nombre de ses copies estvariable entre populations. Cet ET possède la même structure génomique que les rétrovirus.Dans la première partie de cette thèse, j'ai caractérisé un élément tirant actif dans lespopulations naturelles de D. simulans. Je me suis intéressé en particulier au gène de laprotéine d'enveloppe (env), qui confère le caractère infectieux du rétrovirus. La comparaisondes transcrits et de la protéine du gène env entre populations de D. simulans a montré quetirant est actif dans une population, et cette activation est associée à sa mobilisation, alors quedans les autres populations tirant est présent, mais régulé.Dans la deuxième partie de mon travail, je me suis intéressé à l'étude de l'influence detirant sur la structure de la chromatine au niveau de son site d'insertion et à son influence surl'expression des gènes voisins. J'ai étudié trois modifications d'histones dans troispopulations naturelles, dont une où tirant est inséré dans un intron du gène tkv. Les résultatsobtenus montrent que tirant est capable de modifier la structure de la chromatine au niveau deson site d'insertion, mais aussi en amont, par l'hétérochromatinisation d'un promoteur du gènetkv, en affectant ainsi son taux de transcription.Enfin, je me suis intéressé à la régulation post-transcriptionnelle de tirant par lespiARN. Par l'analyse de croisements intraspécifiques entre des souches contenant ou non descopies de tirant dans l'euchromatine, j'ai montré qu'une régulation post-transcriptionnelle parles piARN germinaux qui contrôle tirant dans les cellules folliculaires de l'ovaire. J'ai aussipu montrer une expression variable entre populations des gènes de la voie piARN.

Le facteur de transcription Aiolos, membre de la famille des protéines à doigts de zinc de type Ikaros, joue un rôle important dans la différenciation des lymphocytes B. Notre premier objectif a été de définir les mécanismes impliqués dans la régulation de la transcription du gène aiolos humain. Nous avons analysé la méthylation de l'îlot CpG d'Aiolos et les modifications de ses histones dans différentes lignées et cellules primaires. Nous avons observé une méthylation dense de l'ilot CpG, associée à des niveaux faibles de marques d'euchromatine (H3K4 di-/tri-méthylées, H3K9 acétylées) dans les lignées Aiolos négatives U937 et 1106mel, tandis que les cellules exprimant Aiolos présentaient les caractéristiques opposées. L'inhibition des Dnmt dans les U937 et 1106mel avec la 5-Aza-dC a entrainé une déméthylation de l'îlot CpG, associée à une augmentation des marques d'euchromatine et à une induction d'Aiolos. La répression d'Aiolos dans les monocytes et mélanocytes primaires a quant à elle été associée à une augmentation des H3K9me3 et H3K27me3, indépendamment de la méthylation de l'ADN. Notre deuxième objectif était d'étudier l'implication d'Aiolos dans les syndromes lymphoprolifératifs des cellules B matures chez l'homme (leucémie lymphoïde chronique et autres lymphomes B). Nous avons démontré que les cellules B, saines et tumorales, exprimaient majoritairement le variant hAio1 (80%) et nous avons observé pour la première fois une augmentation globale des transcrits Aiolos dans la LLC, indépendamment des marqueurs pronostiques (ZAP-70, statut mutationnel des IgVH). Cette augmentation, confirmée au niveau protéique, semble indépendante des niveaux d'H3K4me3 et H3K9ace.