Orientador: Maria de Lourdes Garboggini da Gama / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-17T17:46:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hakmi_SelemChain_M.pdf: 1254972 bytes, checksum: 6973e0b80a6434e9a0d72f14d430bd2c (MD5) Previous issue date: 1988 / Resumo: Não informado / Abstract: Not informed. / Mestrado / Mestre em Odontologia

Orientador : Aldo Focesi Junior / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-18T11:26:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amazonas_MariaAngelaLopesdeAlmeida_D.pdf: 8072162 bytes, checksum: 306d833807fef1df9778d78273e59d2b (MD5) Previous issue date: 1993 / Resumo: Piruvato descarboxilase (PDC, EC 4.1.1.1) é uma enzima chave no metabolismo do carbono de levedura, direcionando o ácido pirúvico para a produção de etanol. Embora esteja bem estabelecido que a enzima é um tetrâmero de aproximadamente 240 KD, a estrutura das suas subunidades monoméricas é ainda uma questão controvertida. Tanto um como dois tipos de subunidades têm sido descritos, tendo sido identificados até o momento três genes estruturais -- PDC 1, PDC 5 e PDC 6. Esta tese se propôs a contribuir para a elucidação da questão. Experimentos preliminares foram executados visandoestabelecer as condições adequadas à produção e à estabilidade da enzima durante sua purificação e estocagem.Três formas de PDC, separáveis por cromatografia de troca iônica, foram isoladas e as seguintes hipóteses foram levantadas para explicar suas origens: 1. dissociação dímerotetrâmero/holoenzima-apoenzima; 2. fosforilação reversível;3. proteólise; e 4. diferentes subunidades/isoenzimas / Abstract: Pyruvate decarboxylase (PDC, EC 4.1.1.1) is a key enzyme in the yeast carbon metabolism, driving pyruvic acid towards ethanol production. Although it is well established that the enzyme is a tetramer of about 240 KD, its monomeric subunit structure is still a matter of controversy. Either one or two subunit types have been described and three structural genes -- PDC 1, PDC 5 and PDC 6 -- identified so faro This thesis had the aim of contributing for the elucidation of the questiono preliminary experiments were developed to establish the adequate conditions to the enzyme production and stability during its purification and storage. Three types of PDC,separable by ion exchange chromatography, were isolated and the following hypotheses to explain their origin were brought foward: 1.dimer-tetramer/holoenzyme-apoenzyme dissociation;2. reversible phosphorylation; 3.proteolysis;and 4. different subunits/isoenzymes / Doutorado / Doutor em Ciências Biológicas

Doctor en Nutrición y Alimentos / La oxidación lipídica es una de las principales reacciones que afectan la calidad de los aceites, transformándose en uno de los principales problemas para la industria alimentaria por la aparición de olores y sabores indeseables. Para la protección de la oxidación lipídica, se pueden utilizar micropartículas de flavonoides de liberación controlada para extender la vida útil de las materias grasas y disminuir la utilización inefectiva del antioxidante natural. De acuerdo a estos antecedentes el objetivo de este estudio fue estudiar la cinética y mecanismo de liberación de flavonoides desde micropartículas con y sin la adición de un agente canalizante en linoleato de metilo (LM) y su efecto en la formación de compuestos polares. Se encapsularon los flavonoides quercetina (Q), naringenina (N) o epicatequina (E), mediante secado por atomización, utilizando inulina (IN) o hidroxipropilcelulosa (HPC) como agentes encapsulantes y Capsul® (C) como agente canalizante, de acuerdo a un diseño Box-Behnken, con un total de 15 experimentos para cada sistema de micropartículas estudiado (Q-(IN-C), N-(IN-C), E-(IN-C), Q-(HPC-C), N-(HPC-C) y E-(HPC-C)). Las variables independientes fueron la relación flavonoide/agente encapsulante, temperatura del aire entrada y contenido de Capsul. Las variables dependientes fueron la eficiencia de encapsulación y liberación de flavonoides a los 14 días (t14) y a los 28 días (t28) de almacenamiento en hexano (H) para los sistemas con IN y HPC, respectivamente. Se utilizó la metodología de Superficie Respuesta para la obtención de micropartículas bajo condiciones óptimas. Los sistemas de micropartículas obtenidos bajo condiciones óptimas (Q-IN, Q-(IN-C), N-IN, N-(IN-C), E-IN, E-(IN-C), Q-(HPC-C), N-(HPC-C) y E-(HPC-C)) se utilizaron para determinar la EE y el perfil de liberación de flavonoides en H y LM. La determinación de flavonoides se realizó mediante HPLC. Las micropartículas obtenidas mostraron EE superiores al 60% para los sistemas de Q y E y menores para los sistemas con N. Un incremento en el número de grupos OH en el flavonoide aumentó la EE debido a la interacción entre los grupos OH del flavonoide con los sitios OH de IN y HPC mediante puentes de hidrógeno. El perfil de liberación de flavonoides desde las micropartículas en H y en LM durante el almacenamiento en estufa a 30 ºC, mostró que para las micropartículas con IN sin y con C, la constante de velocidad de liberación de N fue significativamente mayor (p≤0,05) respecto a las de Q y E en LM y en H. Mientras que la constante de velocidad de liberación de E fue significativamente menor (p≤0,05) respecto a Q y N en LM y en H. El parámetro “n” en el modelo de Peppas para las micropartículas con IN sugiere que el mecanismo de liberación de los flavonoides se atribuye a la presencia de un agente canalizante, independiente de la naturaleza del flavonoide. Para las micropartículas con HPC solamente se observó la liberación de N en LM y correspondió a liberación de los flavonoides superficiales. Mientras que en H se observó liberación de N y Q sin diferencias significativas (p>0,05) entre las constantes de liberación. El parámetro “n” en el modelo de Peppas sugiere que el mecanismo de liberación de los flavonoides se atribuye a la interacción agente encapsulante-medio de disolución y flavonoide-agente encapsulante. Se realizaron ensayos de estabilidad oxidativa en linoleato de metilo a 60 ºC con la adición de flavonoides libres (LM-N, LM-Q y LM-E) y encapsulados (LM-Q-IN, LM-Q-(IN-C), LM-Q-(HPC-C), LM-E-IN, LM-E-(IN-C) y LM-E-(HPC-C)) (200 mg/Kg). Las micropartículas de flavonoides se elaboraron utilizando la misma relación flavonoide-agente encapsulante, mientras que el contenido de C y temperatura de entrada al secador correspondieron a las utilizadas en la elaboración de micropartículas obtenidas bajo condiciones óptimas. La determinación de compuestos de oxidación se realizó por HPSEC y la retención de flavonoides por HPLC. La adición de flavonoides libres mostró un factor de protección y tiempo de inducción significativamente mayor para E, en relación a Q y N, mientras que N no ejerció ningún efecto sobre la estabilidad oxidativa. La adición de flavonoides encapsulados al LM mostró un aumento significativo en el factor de protección y tiempo de inducción, respecto al LM y fue mayor para el sistema LM-Q-(IN-C) mostrando el efecto del agente canalizante sobre el control de la liberación. En todos los sistemas el final de la fase lag e inicio de la propagación fue claramente marcado por la desaparición de Q y E y la iniciación de la formación de polímeros coincide con el tiempo de inducción Se puede concluir que conocer el perfil de liberación y capacidad antioxidante determina la aplicabilidad de las micropartículas en sistemas lipídicos / Lipid oxidation is one of the main reactions affecting the quality of oils; it is also responsible for the appearance of unwanted smells and tastes, negatively impacting the food industry. However, the use of controlled-release flavonoid microparticles can reduce the effects of lipid oxidation, thus extending the shelf life of fats, and reducing the ineffective use of natural antioxidants. Based on the above, the objective of this research was to study the kinetics and mechanism of flavonoid release from microparticles with and without the addition of a channeling agent in methyl linoleate (ML), and its effect on the formation of polar compounds. The flavonoids quercetin (Q), naringenin (N) or epicatechin (E) were encapsulated by spray-drying, using Inulin (IN) or Hydroxypropylcellulose (HPC) as encapsulating agents, and Capsul (C) as channeling agent, using a Box-Behnken design. A total of 15 experiments were conducted for each microparticles system (Q-(IN-C), N-(IN-C), E-(IN-C), Q-(HPC-C), N-(HPC-C) and E-(HPC-C)). The independent variables were the flavonoid/encapsulating agent ratio, air inlet temperature and Capsul content, whereas the dependent variables were encapsulation efficiency and flavonoid release at 14 (t14) and 28 (t28) days of storage in hexane (H) for the IN and HPC systems, respectively. The Response Surface methodology was used to obtain microparticles under optimal conditions. The microparticles systems obtained under optimal conditions (Q-(IN-C), N-(IN-C), E-(IN-C), Q-(HPC-C), N-(HPC-C) and E-(HPC-C)) were used to determine the EE, and the flavonoid release profile in H and ML. The determination of flavonoids was performed using HPLC. The obtained microparticles indicated that the encapsulation efficiency (EE) to be greater than 60% for the Q and E systems, and less for the N systems. An increase in the number of OH groups in the flavonoid increased the EE due to the interaction between the OH groups of the flavonoid with the OH sites of IN and HPC through hydrogen bonds. The release profile of flavonoids from the microparticles in H and in ML during oven storage at 30° showed that, for the microparticles with IN and with and without C, the constant release rate of N was significantly greater than (p≤0.05) with respect to the one of Q and E in ML and in H. While the release rate constant of E was significantly lower (p≤0.05) with respect to Q and N in ML and in H, the “n” parameter for Peppas model for the microparticles with IN suggests that the release mechanism of flavonoids is attributed to the presence of a channeling agent, irrespective of the nature of the flavonoid. For the microparticles with HPC, only the release of N in ML was observed, and it corresponded to the release of superficial flavonoids, whereas for H the release of N and Q was observed without significant differences (p>0,05) amongst the release constants. The “n” parameter in Peppas model suggests that the release mechanism of flavonoids is attributed to the interaction of both the encapsulating agent-dissolution medium and flavonoid-encapsulating agent medium. Oxidative stability trials were performed in methyl linoleate at 60° with the addition of free flavonoids (ML-N, ML-Q and ML-E) and encapsulated flavonoids (ML-Q-IN, ML-Q-(IN-C), ML-Q-(HPC-C), ML-E-IN, ML-E-(IN-C) and MLE-E-(HPC-C)) (200 mg/kg). The flavonoid microparticles were elaborated using the same flavonoid-encapsulating agent ratio, while the content of C and inlet temperature of the dryer corresponded to those used in the elaboration of microparticles obtained under optimal conditions. The determination of oxidative compounds was performed using HPSEC, and the retention of flavonoids using HPLC. The addition of free flavonoids presented a protection factor and induction time significantly higher for E in relation to Q and N, whereas N did not have an effect on the oxidative stability. The addition of encapsulated flavonoids to ML showed a significant increase in the protection factor and induction period with respect to ML, and it was greater for the ML-Q-(IN-C) system, displaying the effect of the channeling agent over the release control. In all systems, the end of lag phase and the initiation of propagation were clearly marked by the vanishing of Q and E. The appearance of the formation of polymers coincides with the induction period. It can be concluded that knowing the release profile and antioxidant capacity determine the applicability of microparticles in a lipid systems / Fondecyt

Este estudo foi realizado com cenouras processadas pelo calor, acidificadas com combinações de ácido acético e lático. A qualidade dos produtos processados foi avaliada por análises físicas, químicas, microbiológicas e sensoriais após um, dois e três meses de armazenamento a temperatura ambiente. A combinação de ácidos que mostrou melhores resultados foi de 75% de ácido acético com 25% de ácido lático. Os resultados mostraram a possibilidade de processar termicamente cenouras em pequenas indústrias obtendo produtos de alta qualidade, com redução de custos em equipamentos e energia. / A study was conducted on canned carrots acidified with the combination of acetic and lactic acids. The quality of the processed products was determined by physical, chemical, microbiological and sensory analyses after one, two and three months storage periods at room temperature. The best results of acids combination was 75% of acetic with 25% of lactic. The results indicated the possibility of processing high quality canned carrots by small canneries, with low cost equipment and low energy requirements.

Orientador: Renata Marques de Melo Marinho / Banca: Tarcísio José Arruda Paes Júnior / Banca: Laís Regiane da Silva Concílio / Resumo: No presente trabalho, avaliou-se o efeito de diferentes concentrações de ácido fluorídrico (5% e 10%), na resistência de união entre uma cerâmica de silicato de lítio reforçado por zircônia (sem cristalização adicional, com queima de glaze e com queima adicional de cristalização) e um cimento resinoso, com e sem envelhecimento. Avaliou-se também o comportamento em fadiga de uma cerâmica à base de silicato de lítio reforçado por zircônia (sem cristalização adicional, com de queima de glaze e com queima adicional de cristalização) cimentada adesivamente a um material análogo a dentina (NEMA G10), na ausência ou presença de envelhecimento. Para o teste de microtração os blocos cerâmicos de silicato de lítio reforçado por zircônia foram cortados em blocos menores e divididos aleatoriamente em 12 grupos (N = 72; n = 6). No teste de fadiga os espécimes foram em formato de discos (diâmetro de 12 mm e espessura de 1,2 mm) cimentados a discos de resina epoxi Nema G10 (diâmetro de 12mm e espessura de 2,3mm), divididos em 6 grupos (N = 120; n = 20) e submetidos a ensaio de fadiga pelo método da escada (100.000 ciclos, 20 Hertz de frequência). Os dados resistência de união (MPa) e fadiga (N) foram submetidos à ANOVA 2-fatores, e respectivamente submetidos aos testes de Tukey e Bonferroni (p<0,05). Os resultados mostraram diferença estatisticamente significante para o fator "termociclagem" (ANOVA 2 fatores, p<0,05) sendo os grupos sem termociclagem superiores aos grupos com envelhecimento... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract : This study evaluated the effect of different hydrofluoric acid concentrations (5% and 10%) on the bond strength between a zirconium-reinforced lithium silicate ceramic (without additional crystallization, glaze firing and additional crystallization firing) and a resinous cement, with and without aging. The fatigue behavior of a zirconium-reinforced lithium silicate-based ceramic (without additional crystallization, glaze firing and additional crystallization firing) adhesively cemented to a material like dentin (NEMA G10) was also evaluated with or without thermal aging. For the microtensile test, the zirconia reinforced lithium silicate ceramic blocks were cut into smaller blocks and randomly divided into 12 groups (N=72; n=6). In the fatigue test, discs (diameter 12 mm and thickness 1.2 mm) were cut, cemented to NEMA G10 epoxy resin discs (diameter 12 mm and thickness 2.3 mm), assigned into 6 groups (N=120, n=20) and subjected to the fatigue test by the ladder method (100,000 cycles, 20 Hertz frequency). The bond strength (MPa) and fatigue (N) data were submitted to 2-Way ANOVA, and respectively submitted to Tukey and Bonferroni tests (p <0.05). The results showed a statistically significant difference for the "thermocycling" factor (2-Way ANOVA, p <0.05), with the groups without thermocycling been superior to the aged groups (Tukey). The Bonferroni test indicated that within the same condition (with or without thermocycling), the groups with additional crystallization or glaze firing showed higher results than the groups without additional firing. Thus, the bond between ZLS and the resin cement was negatively affected by thermal aging in water. On the other hand, the fatigue behavior of ZLS discs cemented on NEMA G10 was higher in the groups that received glaze or crystallization firing and lower in the aged groups...(Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A deficiência da enzima desidrogenase de acil-CoA de cadeia curta (SCAD) é um erro inato do metabolismo potencialmente letal que afeta o último ciclo da oxidação de ácidos graxos. O bloqueio da rota na conversão de n-butiril-CoA a acetil-CoA resultante da deficiência enzimática leva ao acúmulo tecidual e aumento da concentração nos líquidos biológicos predominantemente dos ácidos etilmalônico e metilsucínico. Os pacientes afetados apresentam episódios de acidose metabólica intermitente, hiperamonemia, coma e acidose neonatal com hiperreflexia, miopatia por depósito de lipídios e hipotonia. Os sinais e sintomas dessa doença são variáveis, podendo aparecer em qualquer idade, do nascimento à vida adulta, e em combinações variáveis, freqüentemente levando a episódios ameaçadores à vida de descompensação metabólica depois de um período de ingesta inadequada de calorias e/ou doença intercorrente. Tendo em vista que a patogênese do dano cerebral na deficiência da SCAD é pouco conhecida, no presente estudo investigamos a ação dos ácidos etilmalônico e metilsucínico sobre alguns parâmetros envolvendo o sistema glutamatérgico e a produção de estresse oxidativo em cérebro de ratos jovens. Observamos inicialmente que o ácido etilmalônico promoveu uma diminuição significativa na captação de L-[3H]glutamato por fatias de córtex nas concentrações de 0,01, 0,1 e 1,0 mM. Já nas técnicas relacionadas à união de L-[3H]glutamato em membranas sinápticas plasmáticas, o ácido provocou uma diminuição da ligação de L-[3H]glutamato às membranas na ausência de sódio em todas as concentrações testadas (0,01 – 1,0 mM) e, quando em presença de sódio, houve diminuição da união somente na concentração de 1,0 mM do ácido. Por outro lado, não foi verificado qualquer efeito desse ácido sobre a captação vesicular de L-[3H]glutamato nas concentrações utilizadas. O ácido metilsucínico comportou-se de forma semelhante ao ácido etilmalônico nos parâmetros de captação de L-[3H]glutamato por fatias e união de L-[3H]glutamato em membranas sinápticas plasmáticas. Houve uma diminuição da captação de glutamato por fatias de córtex cerebral, uma diminuição da união de L-[3H]glutamato na ausência de sódio em todas as concentrações e, na presença de sódio, uma diminuição da captação apenas na concentração de 1,0 mM. Por outro lado, distintamente do que ocorreu com o ácido etilmalônico, na captação vesicular observamos uma diminuição da captação em todas as concentrações testadas. Nossos resultados demonstram, desta forma, alterações importantes no sistema glutamatérgico pelos ácidos acumulados na deficiência da desidrogenase de acil-CoA de cadeia curta. A etapa seguinte foi investigar o efeito dos ácidos etilmalônico e metilsucínico sobre parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens: medida do potencial antioxidante total (TRAP), medida das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e medida de quimiluminescência. Foi verificado que os dois ácidos não afetam a lipoperoxidação, medida através do TBA-RS e quimiluminescência e tampouco as defesas antioxidantes não-enzimáticas, medidas através do TRAP. Embora não tenhamos medido o efeito dos ácidos sobre as defesas enzimáticas antioxidantes representadas pelas enzimas superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase, os resultados dos parâmetros analisados no presente trabalho sugerem que os ácidos acumulados na deficiência da SCAD não produzem estresse oxidativo.

A deficiência da enzima desidrogenase de acil-CoA de cadeia curta (SCAD) é um erro inato do metabolismo potencialmente letal que afeta o último ciclo da oxidação de ácidos graxos. O bloqueio da rota na conversão de n-butiril-CoA a acetil-CoA resultante da deficiência enzimática leva ao acúmulo tecidual e aumento da concentração nos líquidos biológicos predominantemente dos ácidos etilmalônico e metilsucínico. Os pacientes afetados apresentam episódios de acidose metabólica intermitente, hiperamonemia, coma e acidose neonatal com hiperreflexia, miopatia por depósito de lipídios e hipotonia. Os sinais e sintomas dessa doença são variáveis, podendo aparecer em qualquer idade, do nascimento à vida adulta, e em combinações variáveis, freqüentemente levando a episódios ameaçadores à vida de descompensação metabólica depois de um período de ingesta inadequada de calorias e/ou doença intercorrente. Tendo em vista que a patogênese do dano cerebral na deficiência da SCAD é pouco conhecida, no presente estudo investigamos a ação dos ácidos etilmalônico e metilsucínico sobre alguns parâmetros envolvendo o sistema glutamatérgico e a produção de estresse oxidativo em cérebro de ratos jovens. Observamos inicialmente que o ácido etilmalônico promoveu uma diminuição significativa na captação de L-[3H]glutamato por fatias de córtex nas concentrações de 0,01, 0,1 e 1,0 mM. Já nas técnicas relacionadas à união de L-[3H]glutamato em membranas sinápticas plasmáticas, o ácido provocou uma diminuição da ligação de L-[3H]glutamato às membranas na ausência de sódio em todas as concentrações testadas (0,01 – 1,0 mM) e, quando em presença de sódio, houve diminuição da união somente na concentração de 1,0 mM do ácido. Por outro lado, não foi verificado qualquer efeito desse ácido sobre a captação vesicular de L-[3H]glutamato nas concentrações utilizadas. O ácido metilsucínico comportou-se de forma semelhante ao ácido etilmalônico nos parâmetros de captação de L-[3H]glutamato por fatias e união de L-[3H]glutamato em membranas sinápticas plasmáticas. Houve uma diminuição da captação de glutamato por fatias de córtex cerebral, uma diminuição da união de L-[3H]glutamato na ausência de sódio em todas as concentrações e, na presença de sódio, uma diminuição da captação apenas na concentração de 1,0 mM. Por outro lado, distintamente do que ocorreu com o ácido etilmalônico, na captação vesicular observamos uma diminuição da captação em todas as concentrações testadas. Nossos resultados demonstram, desta forma, alterações importantes no sistema glutamatérgico pelos ácidos acumulados na deficiência da desidrogenase de acil-CoA de cadeia curta. A etapa seguinte foi investigar o efeito dos ácidos etilmalônico e metilsucínico sobre parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens: medida do potencial antioxidante total (TRAP), medida das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e medida de quimiluminescência. Foi verificado que os dois ácidos não afetam a lipoperoxidação, medida através do TBA-RS e quimiluminescência e tampouco as defesas antioxidantes não-enzimáticas, medidas através do TRAP. Embora não tenhamos medido o efeito dos ácidos sobre as defesas enzimáticas antioxidantes representadas pelas enzimas superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase, os resultados dos parâmetros analisados no presente trabalho sugerem que os ácidos acumulados na deficiência da SCAD não produzem estresse oxidativo.

Sorbitol e ácido glucônico são obtidos equimolarmente em reação catalisada por glicose-frutose oxidorredutase (GFOR) e glucono-δ-lactonase (GL), enzimas periplasmáticas de Zymomonas mobilis. Visto que a demanda comercial do sorbitol é muito superior à do ácido glucônico, este trabalho objetivou aprofundar o conhecimento sobre a capacidade do complexo GFOR/GL de oxidar outras aldoses a seus respectivos ácidos orgânicos. O cultivo de Z. mobilis foi analisado visando a obtenção de biomassa, GFOR/GL e etanol. Em cultivo descontínuo em meio com 7,5 a 10,0 g/L de extrato de levedura bruto, obtiveramse cerca de 24 unidades de GFOR/GL por grama de células secas (U/g). Em regime descontínuo alimentado, atividade de 27 U/g e rendimento em etanol de 95% foram atingidos. A ação de GFOR/GL sobre diferentes pares frutose/aldoses foi avaliada com células permeabilizadas livres ou imobilizadas em alginato de cálcio. Com 0,7 mol/L de frutose/glicose, em sistema imobilizado, as mais altas atividades foram medidas entre 47 e 50°C com pH de 7,8 a 8,2, constatando-se que um valor de pH mais alto no meio permite a ocorrência de um pH próximo ao ideal (6,4) no interior das esferas de alginato. Conforme os substratos são consumidos, com conseqüente redução da velocidade reacional, pHs mais baixos no meio externo são exigidos. Entre as aldoses testadas, a maior afinidade enzima / substrato foi observada com maltose e a menor com lactose. Devido às aplicações comerciais do seu produto de oxidação - ácido lactobiônico - lactose foi estudada em detalhes. Com 0,7 mol/L de lactose/frutose, a máxima velocidade específica de formação de ácido lactobiônico foi, em média, de 4,0 mmol/g/h, com células livres, a 39°C e pH 6,4, e de 2,0 mmol/g/h, com o sistema imobilizado, a 47ºC e pH 6,4. Os resultados indicam a viabilidade da produção de ácido lactobiônico por este processo, já que conversões superiores a 85 % são obtidas. / Sorbitol and gluconic acid can be obtained, in equimolar basis, by reaction catalysed by the periplasmic enzymes glucose-fructose oxidoreductase (GFOR) and glucono-δ-lactonase (GL) of Zymomonas mobilis. Since the commercial demand for sorbitol is much larger than that for gluconic acid, the aim of this work was to achieve a deeper knowledge on the capacity of GFOR/GL complex in oxidising other aldoses to their respective organic acids. Z. mobilis cultivation was analysed with respect to growth and GFOR/GL and ethanol production. In batch cultivation in medium with 7.5 and 10.0 g/L of non-purified yeast extract, ca. of 24 GFOR/GL units per gram of dry cells (U/g) were obtained. In fed-batch mode, an activity of 27 U/g and an ethanol yield over 95% were achieved. The action of GFOR/GL on different fructose/aldose pairs was assessed with permeabilised cells, either free or immobilised in calcium alginate. With 0.7 mol/L of fructose/aldose, in immobilised system, the highest activities were measured between 47 and 50°C at pH 7.8-8.2, observing that higher pH values in the reaction medium led to the occurrence of pH values close to the optimum (6.4) in the inner space of alginate beads. As substrates were consumed, and as a consequence the reaction rate decreased, lower pH values in the external medium were needed. Among the aldoses tested, the highest enzyme - substrate affinity was observed for maltose and the lowest for lactose. Due to the commercial uses of its oxidation product - lactobionic acid - lactose was studied in details. With 0.7 mol/L of lactose/fructose, the maximum lactobionic acid specific production rate was in average 4.0 mmol/g/h with free cells, at 39ºC and pH 6.4, and 2.0 mmol/g/h with immobilised system, at 47ºC and pH 6.4. The results indicate the feasibility of producing lactobionic acid by this process, since conversion over 85% are obtained.

A acidemia glutárica tipo I (AG I) é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência severa da atividade da enzima glutaril-CoA desidrogenase. Bioquimicamente, a AG I caracteriza-se por um aumento nas concentrações dos ácidos glutárico (AG) e 3-hidróxiglutárico (3HG) nos tecidos e líquidos corporais. Os pacientes afetados por essa doença apresentam macrocefalia ao nascimento e hipomielinização ou desmielinização progressiva do córtex cerebral. Crises de descompensação metabólica com encefalopatia aguda ocorrem principalmente entre 3 e 36 meses de vida, levando a uma marcada degeneração estriatal. Após as crises, os pacientes apresentam distonia e discinesia que progridem rapidamente até espasticidade. Apesar de diversos estudos apontarem para efeitos do AG e do 3HG induzindo disfunção energética, estresse oxidativo e excitotoxicidade, os mecanismos fisiopatológicos da AG I ainda são pouco conhecidos. Por outro lado, praticamente nada foi investigado sobre o comportamento de animais submetidos a modelos de AG I. Assim, os objetivos do presente trabalho foram estabelecer um modelo químico de AG I através de injeções subcutâneas de AG em ratos durante uma fase de intenso desenvolvimento do SNC, bem como investigar os efeitos deste modelo sobre o desempenho de ratos em tarefas comportamentais e sobre parâmetros de metabolismo energético em tecidos cerebrais (córtex cerebral e cérebro médio) e músculo esquelético. Observamos que esse tratamento não teve efeito sobre o peso corporal dos animais, bem como sobre a data de aparecimento dos pelos, abertura dos olhos, erupção dos dentes incisivos ou a tarefa do endireitamento em queda livre, indicando que o desenvolvimento físico e motor dos animais não foi alterado. Verificamos também que na tarefa do labirinto aquático de Morris os animais administrados com AG permaneceram por um período de tempo significativamente menor no quadrante alvo (onde a plataforma foi inicialmente colocada), além de permanecer por mais tempo no quadrante oposto ao quadrante alvo. Além disso, os animais administrados com AG também tiveram um menor número de passagens pelo local exato da plataforma e apresentaram uma maior latência para passar pela primeira vez sobre a posição da plataforma no dia do teste, em comparação aos animais controle (administrados com solução salina). Esses resultados indicam que a administração de AG provocou um déficit na memória e no aprendizado dos ratos. Por outro lado, observamos que o comportamento dos ratos na tarefa do labirinto em cruz elevado e no campo aberto não foi alterado pela administração do AG. Em relação aos parâmetros de metabolismo energético, observamos que a administração crônica do AG inibiu significativamente as atividades dos complexos I-III e II e aumentou a atividade do complexo IV da cadeia transportadora de elétrons em músculo esquelético, sem afetar essas atividades enzimáticas nas estruturas cerebrais estudadas. Observamos ainda que a atividade do ciclo de Krebs, medida pela produção de CO2 a partir de acetato, não foi alterada pela administração crônica do AG, porém a atividade da enzima creatina quinase (CK) foi marcadamente reduzida apenas no músculo esquelético dos animais. Esses resultados indicam que a administração crônica do AG provocou um déficit energético em músculo esquelético sem afetar as estruturas cerebrais, o que pode estar relacionado com as diferentes concentrações de AG atingidas nesses tecidos. Outro objetivo deste trabalho foi investigar o efeito combinado in vitro do ácido quinolínico (AQ) que foi recentemente associado à fisiopatologia da AG I, com o AG ou o 3HG e do AG com o 3HG sobre vários parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens. Observamos que, quando o AG, 3HG ou AQ foram testados isoladamente, ou quando AQ foi co-incubado com o AG ou o 3HG, não foram observadas alterações nos parâmetros de metabolismo energético examinados. Por outro lado, a combinação do AG com o 3HG provocou uma inibição da produção de CO2 a partir de glicose, da atividade da enzima piruvato desidrogenase e a utilização de glicose em córtex cerebral de ratos, bem como um moderado aumento na produção de lactato a partir de glicose, porém de uma forma não significativa. Finalmente, observamos que a atividade da CK, particularmente a fração mitocondrial, foi significativamente inibida pela coincubação do AG com o 3HG e que o GSH ou a combinação das enzimas catalase e superóxido dismutase preveniram totalmente a inibição dessa enzima. Concluindo, demonstramos neste trabalho que a administração crônica de AG compromete o aprendizado/memória especial e inibe o metabolismo energético em ratos jovens. Mostramos também um efeito sinérgico in vitro do AG com o 3HG, alterando vários parâmetros do metabolismo energético. / Glutaric acidemia type I (GA I) is an inborn error of metabolism caused by a deficiency in the glutaryl-CoA dehydrogenase activity. Biochemically, GA I is characterized by the accumulation of glutaric (GA) and 3-hydroxyglutaric (3HG) acids in tissue and body fluids of affected patients, which present macrocephaly at birth and a progressive demyelination of cerebral cortex. Striatal degeneration following metabolic crises is the main neurological finding in this disease, occurring between 3 and 36 months of life. After crises, dystonia and diskinesia progress quickly. Although several studies suggest neurotoxic effects for GA and 3HG inducing energy dysfunction, oxidative stress and excitotoxicity, the pathophysiology of GA I is poorly unknown. However, practically nothing has been done to investigate whether GA, the most pronounced metabolite accumulating in GA I, could provoke deficit of performance in behavioral tasks. In this scenario, the aim of the present work was to establish chemically-induced animal model of GA I by subcutaneous injections of GA during a phase of rapid CNS development. We also aimed to investigate the effects of this model on rat performance in behavioral tasks and on energy metabolism in brain tissues (cerebral cortex and midbrain) and skeletal muscle of rats. It was observed that chronic GA administration did not change the animal body weight, the date of appearance of coat, eye opening or upper incisor eruption, nor the free-fall righting task, indicating that the physical and motor development was not altered. We also verified that GA-treated animals stayed for a significantly shorter time in the target quadrant, where the platform was formerly located, and spent significantly more time in the opposite quadrant as compared to controls (injected with saline). GA-treated rats also had a lower number of correct annulus crossings and presented a higher latency to cross over the platform position than saline-treated animals. These data suggest that early chronic postnatal GA administration caused a long-standing deficit in learning and memory processes of rats. On the other hand, we observed that rat behavior in the elevated plus maze and in the open field was not affected by GA administration. With regards to energy metabolism parameters, we observed that GA treatment significantly inhibited respiratory chain complexes I-III and II and increased complex IV enzyme activity in skeletal muscle, with no effects on these enzyme activities in brain tissues. We also observed that chronic GA treatment did not modify Krebs cycle activity, as assessed by CO2 production from acetate, but markedly inhibited creatine kinase (CK) activity specifically in skeletal muscle. These data indicate that GA administration provoked energy deficit in rat skeletal muscle but not in brain structures. It is possible that this difference in GA effects is related to different GA levels reached in these tissues during the treatment. We also aimed with this work to investigate the combined in vitro effect of quinolinic acid (QA), recently associated to GA I pathophysiology, with GA or 3HG and of GA with 3HG on various parameters of energy metabolism in brain of young rats. We found that when GA, 3HG or AQ were tested isolated, or when QA was co-incubated with GA or 3HG, no alterations were found in the examined parameters. On the other hand, the combination of GA with 3HG resulted in an inhibitition of CO2 production from glucose, pyruvate dehydrogenase enzyme activity and glucose uptake from cerebral cortex, as well as in a mild increase in the lactate production, although non-significantly. Finally, it was observed that CK activity, particularly the mitochondrial fraction, was significantly inhibited by the coincubation of GA with 3HG and that GSH or the combination of catalase and superoxide dismutase enzymes were able to fully prevent this inhibition. Concluding, we here demonstrated that chronic GA administration compromises the learning/memory processes and inhibits energy metabolism in young rats. We also showed a synergic in vitro effect between GA and 3HG, leading to alterations in various parameters of energy metabolism.

Acidemia glutárica tipo I (AGI) é uma doença metabólica hereditária causada pela mutação no gene que codifica a enzima glutaril-CoA desidrogenase (GCDH). Os principais sintomas aparecem entre os 6 meses e 3 anos de idade e são caracterizados por distonia progressiva, discinesia déficit neurológico, macrocefalia e crises epilépticas recorrentes. Um importante modelo experimental que apresenta características e fenótipo bioquímico muito semelhantes a AGI em humanos é o de camundongos nocaute para a enzima GCDH submetidos à dieta com sobrecarga de lisina (Gcdh -/--Lis). Estudos têm mostrado um desequilíbrio de neurotransmissão excitatória e inibitória no SNC, diminuição da recaptação de glutamato, diminuição da atividade da bomba Na+K+-ATPase, e inibição da enzima descarboxilase do ácido glutâmico (GAD) em modelos animais e em pacientes com AGI. Estas alterações parecem ser causadas pelo acúmulo dos ácidos glutárico, 3-OH-glutárico e glutacônico nos tecidos e fluidos corporais. Neste trabalho avaliamos o desenvolvimento de crises epilépticas espontâneas ou induzidas nos animais Gcdh - /--Lis e a possível associação com mudanças no padrão de liberação de glutamato e GABA no córtex cerebral, Para tanto, analisamos primeiramente o padrão de oscilações cerebrais e a presença de crises epilépticas espontâneas e induzidas por pentilenotetrazol (PTZ) através de técnicas eletrofisiológicas in vivo (vídeo-EEG). Posteriormente avaliamos em sinaptossomas corticais a liberação de glutamato e GABA por HPLC e o imunoconteúdo de vGLUT1, vGAT e GAD utilizando Western blot. A abordagem experimental foi igualmente realizada em animais Gcdh-/- com dieta normal e animais Gcdh+/+ com e sem sobrecarga de lisina (controle). Nossos resultados mostram que 72% dos animais Gcdh-/--Lis (13/18) apresentaram crises epilépticas espontâneas, sem nenhuma manifestação nos animais dos grupos Gcdh- /- (n= 18) ou controle (n=17). Além disso, houve um aumento da severidade das crises epilépticas induzidas com PTZ nos animais Gcdh-/--Lis quando comparados aos grupos Gcdh-/- e controle. Análise espectral do EEG evidenciou uma diminuição significativa das oscilações teta e gama com predomínio de ondas lentas nos animais Gcdh -/--Lis (n=9) quando comparados aos grupos Gcdh -/- (n=5) e controle (n=15). A liberação de glutamato e GABA basais e após despolarização nas preparações de sinaptossoma cortical nos grupos Gcdh -/- e Gcdh -/--Lis foi significativamente menor quando comparada com o grupo controle (p<0,05). Porém, a porcentagem de glutamato liberado após despolarização em relação ao basal aumentou significativamente no grupo Gcdh -/--Lis quando comparado com demais grupos (p<0,05) sem um aumento na porcentagem de liberação de GABA pósdespolarização. Esta diminuição na liberação de GABA foi associada a uma diminuição do imunoconteúdo de GAD em sinaptossomas corticais do grupo Gcdh -/- -Lis. Entretanto o imunoconteúdo dos transportados vesiculares de glutamato (vGLUT1) e GABA (vGAT) foram semelhantes em todos os grupos. Nossos resultados mostram uma hiperexcitabilidade neuronal nos animais Gcdh -/--Lis que pode, pelo menos em parte, estar relacionada com a diminuição nos níveis corticais de GABA pela diminuição da enzima GAD e pelo aumento da liberação de glutamato em relação ao GABA em situações de despolarização neuronal. Observamos também uma mudança no perfil de oscilações corticais que pode estar associada às alterações neurológicas e epileptogênese em AGI. Mecanismos eletrofisiológicos e moleculares envolvidos na epileptogênese dos animais Gcdh-/-- Lis estão em andamento. / Glutaric acidemia type I (GAI) is an inherited metabolic caused by mutations in the gene encoding glutaryl-CoA dehydrogenase (GCDH). Symptoms appear from 6 months to 3 years of age and are characterized by progressive dystonia, dyskinesia, neurological deficit, macrocephaly and recurrent seizures. An important experimental model with features and biochemical phenotype very similar to GAI in humans is the GCDH knockout mice under lysine overload special diet (Gcdh -/--Lis). Studies have shown an imbalance of excitatory and inhibitory neurotransmission in CNS, decreased reuptake of glutamate, and Na + K + ATPase pump activity and glutamic acid decarboxylase (GAD) inhibition in animal models and patients with GAI. These changes appear to be attributed to the increase of glutaric, 3-OH-glutaric and glutaconic acids in tissues and body fluids. In this work, we evaluated the development of spontaneous or induced seizures in Gcdh -/--Lis mice and the possible association with changes in glutamate and GABA release pattern in the cerebral cortex. Therefore, firstly we analyze the brain oscillation profile and the presence of spontaneous epileptic seizures and pentylenetetrazol (PTZ) - induced seizures using in vivo electrophysiology (video - EEG). Subsequently, we evaluated, in cortical synaptosomes, the glutamate and GABA release by HPLC and the VGLUT1, vGAT and GAD immunocontents using Western blot. The same experimental approach was conducted in Gcdh-/- mice under normal diet and Gcdh+/+ mice under either normal diet or under lysine overload (control). Our results show that 72 % of Gcdh -/--Lis mice ( 13/18 ) had spontaneous seizures, while no seizures were observed in Gcdh-/-(n = 18) and control (n = 17) groups. In addition there was an increase in severity of PTZ-induced seizures in Gcdh -/--Lis mice when compared to Gcdh-/- and control groups. EEG spectral analysis showed a significant decrease in theta and gamma oscillations with a predominance of slow waves in Gcdh -/--Lis mice (n = 9) when compared to Gcdh-/- (n = 5) and control (n = 15) groups. The release of glutamate and GABA before and after depolarization was significantly lower in cortical synaptosome preparations from Gcdh -/- and Gcdh -/--Lis mice when compared with control group (p<0.05). However, the percentage of glutamate released after depolarization increased significantly in Gcdh -/--Lis mice when compared with other groups (p<0.05), with no increase in percentage of GABA release post-depolarization. This reduction in GABA release was associated with a decreased immunocontent of GAD in cortical synaptosomes from Gcdh -/--Lis. However, the immunocontent of vesicular glutamate and GABA transporter (VGLUT1 and vGAT) were similar in all groups. Our results show that Gcdh -/--Lis mice exhibited neuronal hyperexcitability that can be, at least in part, related to reduced levels of GABA in cerebral cortex induced by decreased in the GAD immunocontent and the increased glutamate release during neuronal depolarization. We also observed a change in the cortical oscillation profile that can be associated with neurological abnormalities and epileptogenesis in AGI. Electrophysiological and molecular mechanisms underlying epileptogenesis in Gcdh -/--Lis mice are under investigation.