PPARγ est un récepteur nucléaire ligand-activé qui contrôle, dans différents organes, de nombreuses fonctions cellulaires, impliquées notamment dans le contrôle de l'inflammation, de la carcinogenèse ou du métabolisme. Au niveau de la cellule épithéliale intestinale, certaines fonctions de PPARγ, comme son rôle métabolique, reste méconnu. Les effets génomiques des ligands de PPARγ sont eux aussi très mal connus dans cette cellule. L'objectif de ce travail était de comparer l'expression génomique induite par différents agonistes de PPARγ dans la cellule épithéliale intestinale par la technique de microarrays, et ainsi identifier de nouveaux gènes cibles de PPARγ et les différentes fonctions cellulaires contrôlées par ce récepteur nucléaire. Nous avons pu identifier le gène lactase, dont le déficit d'expression est responsable de l'intolérance au lactose, comme un gène cible de PPARγ. Nous avons ensuite pu montrer que les agonistes de PPARγ étaient capables d'augmenter l'expression et l'activité de la lactase in vitro et in vivo, ainsi que d'améliorer les symptômes d'intolérance au lactose dans un modèle animal ; identifiant les agonistes de PPARγ comme potentiellement le premier traitement pharmacologique de l'intolérance au lactose. Nous avons pu ensuite confirmer l'effet antinéoplasique du 5ASA au niveau de la cellule épithéliale intestinale, in vivo et in vitro, et confirmer que cette action était dépendante de PPARγ. Comme dans d'utres organes, PPARγ régule dans la cellule épithéliale intestinale les voies de l'inflammation, la différenciation et la maturation cellulaire mais aussi des fonctions métaboliques, confirmant le rôle clé de PPARγ dans le contrôle de l'homéostasie intestinale, et le potentiel thérapeutique des agonistes de PPARγ / PPARγ is a ligand-activated nuclear receptor that controls, in various organs, numerous cellular functions, involved in the control of inflammation, carcinogenesis or metabolism. In intestinal epithelial cell, some functions of PPARγ, as its metabolic role, remain unknown. The genomic effects of PPARγ ligands are also poorly known in this cell. Our objective was to compare the genomic expression induced by different PPARγ agonists in the intestinal epithelial cells by a microarrays technique, and thus to identify new PPARγ target genes and the different cellular functions controlled by this nuclear receptor. We have identified the lactase gene, whose lack of expression is responsible for lactose intolerance, as a target gene of PPARγ. We then showed that PPARγ agonists were able to increase lactase expression and activity in vitro and in vivo, identifying PPARγ agonists as potentially the first pharmacological treatment of lactose intolerance. We then confirmed the antineoplastic effect of 5ASA in intestinal epithelial cell, both in vivo and in vitro, and confirmed that this action was PPARγ-dependent. As in other organs, PPARγ regulates in intestinal epithelial cell inflammation, cell differentiation and maturation as well as metabolic functions, confirming the key role of PPARγ in the control of intestinal homeostasis, and the potential therapeutic effect of PPARγ agonists

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / L'endothélium cornéen est la couche cellulaire la plus postérieure de la cornée. Elle a pour rôle de maintenir la cornée en déturgescence nécessaire à sa transparence. À cette fin, les cellules endothéliales cornéennes agissent comme une barrière pour limiter l'entrée de liquide et, à l'aide de pompes Na⁺/K⁺ ATPases, expulsent les liquides du stroma cornéen vers la chambre antérieure. La dystrophie endothéliale cornéenne de Fuchs (FECD) est une maladie de la cornée qui compromet le rôle de l'endothélium menant à des pertes de vision. La pathologie est caractérisée par une perte de cellules endothéliales accélérée et la formation d'excroissances de matrice extracellulaire appelées les guttaes. La perte de l'intégrité de l'endothélium cornéen provoque des infiltrations de liquide dans le stroma menant à une perte de la transparence de la cornée. Le seul traitement curatif pour la FECD est la transplantation de cornée pour laquelle la quantité de greffons est limitante. Les causes de la FECD ne sont pas encore bien comprises. Toutefois il existe des évidences d'une implication des mitochondries et du stress oxydatif. Ces deux éléments seraient liés dans un cercle vicieux où les dommages mitochondriaux causés par le stress oxydatif mèneraient à une augmentation de la production d'espèces réactives de l'oxygène. L'effet de ce cercle vicieux sur la fonction mitochondriale et comment cela affecte la progression de FECD reste peu connu et c'est à ce niveau que les travaux de cette thèse sont contributoires. En prenant en compte la démonstration de variation dans la masse mitochondriale entre les cellules endothéliales FECD réalisée précédemment dans notre équipe, nous avons tout d'abord lié la masse mitochondriale à des marqueurs de santé mitochondriale et d'état de la cellule. Ceci a permis de lier ces marqueurs à la progression de la pathologie. En effet, nous avons montré que le statut apoptotique et oxydatif ainsi qu'un niveau de calcium et de potentiel membranaire mitochondrial des cellules de l'endothélium provenant de patients FECD variaient en fonction de leur masse mitochondriale. Nous avons émis l'hypothèse que les variations de masse mitochondriale observées sont liées à des évènements dans la progression de la FECD liée à une surutilisation mitochondriale qu'on a appelé le «burnout mitochondrial». Nous avons ensuite lié la présence des guttae aux différents indicateurs du «burnout mitochondrial». En mesurant l'aire des guttae en conjonction avec les marqueurs de santé mitochondriale et d'état cellulaire, il a été possible de montrer que la présence des guttae est liée à un bilan négatif pour la santé mitochondriale et le statut apoptotique et oxydatif des cellules endothéliales des patients FECD. Nos travaux montrant que l'endommagement des mitochondries par la FECD jouait un rôle central dans la progression de la pathologie nous ont permis de soulever l'hypothèse que l'ajout de mitochondries saines dans les cellules endothéliales ralentirait la progression de la pathologie. Pour tester cette hypothèse, nous avons transplanté des mitochondries via la co-incubation avec des endothélia de patients FECD. Nous avons ensuite évalué l'effet de la transplantation de mitochondries sur les différents marqueurs cellulaires de progression de la FECD. Une amélioration de la santé mitochondriale, autant au niveau du potentiel mitochondrial que du calcium mitochondrial et de la mitophagie, a été observée à la suite de la transplantation. Nous avons également observé une amélioration de l'état cellulaire par la diminution du stress oxydatif et une perte du statut apoptotique pour la majorité des cellules endothéliales. Les travaux de cette thèse mettent en lumière une chronologie des évènements de la FECD liés à la progression de la pathologie ainsi que l'apparition de guttae. Ces travaux présentent aussi une nouvelle avenue de traitement pour la FECD en utilisant la transplantation mitochondriale. Cela pourrait permettre de diminuer, voire d'abolir, le besoin de greffons de cornée pour traiter la pathologie. / The corneal endothelium is the most posterior cell layer of the cornea. Its role is to maintain the cornea in deturgescence which is necessary for its transparency. To this end, corneal endothelial cells act as a barrier to limit fluid entry and, with the help of Na⁺/K⁺ ATPase pumps, expel fluids from the corneal stroma to the anterior chamber. Fuchs corneal endothelial dystrophy (FECD) is a corneal disease that compromises the role of the endothelium leading to loss of vision. The pathology is characterized by accelerate dendothelial cell loss and the formation of extracellular matrix growths called guttae. The loss of integrity of the corneal endothelium causes fluid infiltration into the stroma leading to a loss of corneal transparency. The only curative treatment for FECD is corneal transplantation for which the quantity of grafts is limited. The causes of FECD are not well understood yet, however there is evidence of the involvement of mitochondria and oxidative stress. These two elements appear to be linked in a vicious circle where mitochondrial damage caused by oxidative stress leads to an increase in the production of reactive oxygen species. The effect of this vicious circle on mitochondrial function and how it affects the progression of FECD remains unknown and it is at this level that the work of this thesis is contributory. Considering the demonstration of variation in mitochondrial mass between FECD endothelial cells made previously in our team, we first linked mitochondrial mass to markers of mitochondrial health and cell status. This made it possible to link these markers to the progression of the pathology. Indeed, we showed that the apoptotic and oxidative status as well as a level of calcium and mitochondrial potential of endothelial cells from FECD patients varied according to their mitochondrial mass. We hypothesized that the observed mitochondrial mass variations are related to events in the progression of FECD related to mitochondrial overuse that we have named "mitochondrial burnout". Then, we linked the presence of guttae to different indicators of "mitochondrial burnout". By measuring the area of guttae in conjunction with markers of mitochondrial health and cellular state, it was possible to show that the presence of guttae is linked to a negative outcome for mitochondrial health and the apoptotic and oxidative status of cells. endothelial disease of FECD patients. Our work shows that the damage of mitochondria by FECD plays a central role in the progression of the pathology, we raised the hypothesis that the addition of healthy mitochondria to endothelial cells would slow down the progression of the pathology. To test this hypothesis, we transplanted mitochondria via co-incubation to FECD patient endothelium. We then evaluated the effect of mitochondria transplantation on the different cellular markers of FECD progression. An improvement in mitochondrial health, both in terms of mitochondrial potential and mitochondrial calcium and mitophagy, was observed following transplantation. We also observed an improvement in the cellular state by the reduction of oxidative stress and a loss of apoptotic status for a majority of endothelial cells. The work of this thesis sheds light on a chronology of FECD events related to the progression of the pathology as well as the appearance of guttae. This work also presents a new avenue of treatment for FECD using mitochondrial transplantation. This could reduce or even eliminate the need for corneal grafts to treat the pathology.

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Les protéases sont impliquées dans de nombreux processus biologiques et ont des origines très variées (cellules immunitaires, cellules épithéliales...). Leur activité est régulée par des inhibiteurs de protéases. Cette étude s'intéresse a` la balance entre les protéases épithéliales et leurs inhibiteurs dans le contexte de pathologies affectant l'intégrité´ de l'épithélium intestinal. Les conséquences d'un déséquilibre de la balance protéolytique ont été étudiées dans deux maladies chroniques aux composantes différentes, les Maladies Inflammatoires Chroniques de l'Intestin (MICI) (cycles de poussées inflammatoires) et le Syndrome du Côlon Irritable (SCI) (cycles de douleur). La muqueuse colique de patients atteints de SCI sécrète une activité de type trypsine dont l'origine et les fonctions sont mal définies. Cette étude s'intéresse à la source de cette activité trypsique dans le côlon des patients atteints de SCI, sa nature et son rôle dans l'activation neuronale. L'activité trypsique chez les patients atteints de SCI est augmentée majoritairement dans les cellules épithéliales (CEI). La stimulation de monocouches de cellules épithéliales avec du LPS ou de l'épinéphrine induit une augmentation de la quantité de trypsine-3 et de sa sécrétion au pôle basal de la cellule épithéliale stimulée, en corrélation avec une augmentation de l'activité trypsique. L'hyperactivité de la trypsine-3 au pôle basal entraine une perte de la fonction barrière de l'épithélium, anomalie retrouvée aussi chez les patients atteints de SCI. De plus, nous avons mis en évidence que la trypsine-3 est capable d'activer les neurones humains myentériques et les neurones sensitifs murins. In vivo, son administration intra-rectale à des souris induit une hypersensibilité viscérale dépendante du récepteur PAR2 (Protease Activated Receptor-2). Ainsi, les cellules épithéliales intestinales des patients atteints de SCI produisent et sécrètent de la trypsine-3 spécifiquement au pôle basal. Cette activité trypsique active des neurones sensitifs, participant à l'hypersensibilité viscérale, symptôme majeur dont souffrent les patients atteints de SCI. Les pathologies inflammatoires peuvent aussi être source d'un dérèglement protéolytique. Les patients atteints de MICI présentent une dérégulation de la balance élastolytique colique. Notre équipe a montré que l'apport d'ELAFINE (un inhibiteur d'élastase) par la bactérie génétiquement modifiée L.lactis au contact de la muqueuse inflammatoire protège les souris traitées en réduisant l'inflammation intestinale. Cependant les mécanismes protecteurs médiés par L'Elafine restent encore à déterminer. L'ELAFINE est un inhibiteur d'élastases mais possède aussi des propriétés antimicrobiennes. Afin de mettre en lumière quelles fonctions de L'Elafine portent les propriétés anti-inflammatoires des mutants de L'Elafine ont été générés et insérés dans la bactérie L.lactis: une mutation pour annuler sa fonction inhibiteur de protéase, un second mutant de son domaine antimicrobien et un dernier mutant ayant perdu ces 2 fonctions. Dans des monocouches de cellules intestinales épithéliales, l'apport d'ELAFINE protège de l'inflammation médiée par un déséquilibre de l'activité élastolytique : on observe une restauration de la fonction barrière de l'épithélium et une diminution des cytokines pro-inflammatoires (CXCL8 et IP10). La mutation du domaine antimicrobien n'affecte pas ces propriétés. Cependant, l'absence de la boucle inhibitrice annihile les propriétés anti-inflammatoires de L'Elafine. Ces travaux ont pu mettre en évidence l'importance de l'équilibre protéolytique au sein de la cellule épithéliale dans les pathologies intestinales. La balance entre les protéases et leurs inhibiteurs joue donc un rôle dans l'homéostasie épithéliale et les pathologies inflammatoires. / Proteases are involved in some biologic processes and their origins are variable (immune cells, epithelial cells...). Their activity is regulated by antiproteases. This study investigates the balance between proteases and their inhibitors in pathologies which modify epithelium integrity. Consequences of an unbalance in proteolytic activity was studied in two chronic pathologies with different components: Inflammatory Bowel Disease (IBD) (cycles of inflammatory boost) and Irritable Bowel Syndrome (IBS) (cycles of pain symptoms). Colonic mucosa from IBS patients releases trypsin activity. The origin and the functions of this activity are not well defined. This study investigated the source of this trypsin activity in the côlon of IBS patients, its nature and its role in neuronal activation. Trypsin activity from IBS patients is increased mostly in epithelial cells. Stimulation of epithelial cell monolayers with LPS or epinephrine induces an increase of trypsin-3 quantity and its secretion specifically in the basal side of epithelial cells. This is in correlation with the increase of trypsin activity. Trypsin-3 hyperactivity at the basal side provokes a loss of epithelium barrier function, which is also found in colons of IBS patients. Then, we have highlighted that trypsin-3 is able to activate human myenteric neurons and murine sensitive neurons. In vivo, its intra-rectal administration to mice induces a visceral hypersensitivity dependent of PAR2 (Protease Activated Receptors 2). Thus, intestinal epithelial cells from IBS patients produce and release trypsin-3 specifically on their basal side. This trypsin activity activates sensitive neurons which participate to visceral hypersensitivity, a major symptom of IBS patients. Inflammatory pathologies could be a source of proteolytic malfunction. IBD patients have a dysregulation of elastolytic balance in the colon. Our team has shown that ELAFIN (an elastase inhibitor) delivered by the bacteria genetically modified L.lactis near the inflamed mucosa, protects mice from intestinal inflammation. However, the protective mechanisms induced by ELAFIN need to be investigate. ELAFIN is an elastase inhibitor but have also antimicrobial properties. With the aim to highlight what function of ELAFIN owns anti-inflammatory properties, mutants of ELAFIN have been generated and were insered into L.lactis: a first mutant lacked its antiprotease function, a second lacked antimicrobial properties and a last mutant lacked both properties. In intestinal epithelial monolayers, ELAFIN delivered by L.lactis protects against inflammation: a restauration of epithelial barrier function and a decrease of pro-inflammatory cytokines (CXCL8 and IP10) are observed. Mutation of antimicrobial domain doesn't affected these properties. Nevertheless, the absence of inhibitory loop annihilates anti-inflammatory functions of ELAFIN. This work highlights the importance of proteolytic balance inside the epithelial cell in intestinal pathologies. The balance between proteases and antiproteases plays an important role in epithelial homeostasis.

Les glioblastomes (GBM) sont des tumeurs intracrâniennes caractérisées par une résistance très élevée aux thérapies classiques en raison d'un degré de néovascularisation accru et un phénotype extrêmement infiltrant. Malgré de nombreuses études menées à ce sujet, ce cancer du cerveau reste jusqu'à ce jour essentiellement incurable. Cet ouvrage traite de l'action moléculaire du TLN-4601, un nouvel agent anti-cancéreux capable de traverser la barrière hémato-encéphalique et de s'accumuler de manière préférentielle au niveau de la tumeur. Ces propriétés ont permis au composé d'être reconnu comme traitement thérapeutique pour combattre les tumeurs cérébrales. Ce projet se veut donc être à l'interface entre la caractérisation moléculaire du mécanisme d'action et le ciblage thérapeutique de la molécule envers différentes lignées de GBM humains. Dans le but d'étudier l'effet thérapeutique du médicament sur les GBM, trois modèles cellulaires ont été utilisés soit les U87 MG, les U87 EGFRwt et les U87 EGFRvIII. L'amplification du récepteur à l'EGF (EGFR) de type sauvage et du récepteur tronqué EGFRvIII sont des anomalies génétiques communément observées chez ce type de tumeur. Ces phénotypes tumoraux sont notamment corrélés à la résistance des GBM aux traitements conventionnels de chimiothérapie. Le premier volet de cette étude a permis de déterminer que TLN-4601 antagonise le caractère infiltrant des glioblastomes en ciblant deux voies de signalisation associées au développement tumoral soit les voies de RAS/MAPK et de P13K/AKT. Il a également été démontré que le médicament augmente la sensibilité des cellules tumorales à la mort cellulaire via un processus apoptotique impliquant une modulation à la baisse de la phosphorylation de BAD, une augmentation de l'activité caspasique et un clivage de PARP. D'autre part, les résultats montrent que les U87 EGFRvlII semblent être plus réfractaires au médicament comparativement aux deux autres lignées à l'étude. Le second volet de l'étude a permis de caractériser les propriétés anti-angiogéniques du TLN-4601. Il a été établi que le composé inhibe le recrutement des cellules endothéliales (CE) au foyer tumoral en antagonisant leur potentiel migratoire, la tubulogénèse et la synthèse de VEGF par les glioblastomes, un des principaux messagers biochimiques impliqués dans l'angiogenèse. Cet effet pourrait résulter de l'inhibition par TLN-4601 des voies de signalisation RAS/MAPK et PI3K/AKT également observée chez les CE. Finalement, une action cytotoxique du médicament plus spécifique envers le compartiment cérébral tumoral par rapport à l'endothélium vasculaire semble être relevée. Cette action serait associée à la surexpression des récepteurs périphériques benzodiazépines (PBR), chez les glioblastomes comparativement aux cellules endothéliales. De manière globale, nous rapportons que l'action thérapeutique du TLN-4601 semble réduire la nature extrêmement infiltrante des glioblastomes et l'angiogénèse tumorale qui sont des évènements indispensables à la progression des cancers cérébraux. De plus, la cytotoxicité préférentielle du médicament envers les tissus cancéreux plutôt que les tissus sains fait état de la sélectivité du produit. Ces effets thérapeutiques multiples répertoriés dans cette étude justifient son utilisation en tant qu'agent chimiothérapeutique dans la lutte contre le GBM. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : TLN-4601, Glioblastomes, Cellules endothéliales cérébrales, PI3K/AKT, RAS/MAPK, Angiogénèse, Invasion tumorale, Apoptose.

L’endothélium cornéen est responsable de la déturgescence, un processus de déshydratation nécessaire à la transparence de la cornée. La dystrophie endothéliale cornéenne de Fuchs (FECD) est la principale cause de dysfonction endothéliale chez l’humain. C’est une maladie multifactorielle associée à (1) une plus grande apoptose dépendante du stress oxydatif des cellules endothéliales cornéennes, (2) un dépôt accru de protéine matricielle causant un épaississement de la membrane basale, et finalement (3) une perte de la capacité des cellules à assurer la déturgescence cornéenne. Actuellement, les modèles d’étude de la FECD montrent une capacité limitée à caractériser l’étiologie de la maladie, ce qui restreint notre capacité à développer des traitements pharmacologiques appropriés. Le seul traitement pour cette pathologie est la greffe de cornée. Afin d’étudier cette pathologie, mon laboratoire a développé des techniques de culture et de reconstruction par génie tissulaire d’endothélia FECD. Mes travaux ont utilisé ces modèles afin de comparer, par profilage génique, PCR quantitatif, immunofluorescence, résistance transendothéliale et essai de perméabilité, l’expression, la distribution et les capacités fonctionnelles des molécules impliquées dans la déturgescence et la sécrétion matricielle. Les résultats de mes études ont montré que les protéines associées à la fonction des cellules FECD (familles de transporteurs ioniques et de jonctions intercellulaires) n’avaient aucune différence d’expression suivant la mise en culture lorsque comparées à des équivalents non pathologiques. De plus, aucune différence fonctionnelle n’a été déterminée par résistance transendothéliale et essai de perméabilité. Toutefois, une plus grande quantité de fibronectine était déposée sous les cellules. Ce faisant, ces études suggèrent que la perte de fonction dans la FECD n’aurait pas un rôle primaire dans la pathologie et serait secondaire à un dépôt anormal de fibronectine. Des recherches antérieures du laboratoire avaient démontré une amélioration dans l’expression des marqueurs de fonctionnalité suite à des greffes in vivo. Le 3e objectif présenté dans cette thèse était de déterminer si les conditions environnementales in vivo (telle que la pression intraoculaire) étaient impliquées dans cette amélioration. Pour ce faire, nous avons utilisé un système de chambre antérieure artificielle permettant d’exercer une pression sur l’endothélium dans un circuit fermé. Cette étude a montré une plus grande expression de ZO-1 à la périphérie des cellules endothéliales, une protéine associée aux jonctions serrées, par la pression. Ce résultat met en perspective l’importance de l’environnement sur la fonctionnalité de l’endothélium cornéen. / The role of the corneal endothelium is to maintain the corneal transparency by a partial dehydration process named deturgescence. Fuchs endothelial corneal dystrophy (FECD) is the main cause of human endothelial dysfunction. It is a multifactorial disease associated with an increased oxidative-related cell death, a thickened basal lamina and a loss in the endothelial pump function resulting in a corneal opacification. Due to the lack of appropriate models, the exact cause of the pathology remains unknown, which restrains our ability to develop appropriate pharmacological treatments. As of now, the only cure is the transplantation of a healthy endothelium from a deceased donor. My laboratory has previoulsly developed in vitro cell and tissue models of FECD. My research projects used these models and analyzed, by gene profiling, quantitative PCR, immunofluorescence, trans-endothelial resistance and permeability assay, the expression, the distribution and the functional capacity of molecules engaged in deturgescence and extracellular matrix (ECM) deposition. Results show no difference between FECD and healthy cells for genes and proteins related to deturgescence (ion transporters and intercellular jonctions). However, an increased deposition of fibronectin was observed. These studies therefore suggest that the endothelial dysfunction would not be a primary aspect of the pathology and would rather be secondary to an aberrant deposition of fibronectin. A previous in vivo study showed an amelioration of the endothelial phenotype upon transplantation in an animal model. It suggested a beneficial effect from the environment, such as the intraocular pressure (IOP). The effect of pressure on the endothelium was investigated by placing tissue-engineered endothelia in an artificial anterior chamber that mimicked the natural IOP. Increased ZO-1, a protein associated with tight junctions, was observed at the cell periphery. This result suggest that the in vivo environment influences the functionality of the corneal endothelium.

Plusieurs évidences indiquent que de la dérégulation des récepteurs tyrosine kinase (RTK) joue un rôle clé dans l'étiologie et la progression du cancer colorectal (CCR). Notamment, des bénéfices ont été observés en clinique avec des agents ciblant le récepteur de EGF dans le traitement des CCR métastatiques avancés. Considérant l'hétérogénéité des RTK dérégulés dans le CCR, une approche thérapeutique alternative serait de plutôt cibler les protéines effectrices engagées par plusieurs RTK, notamment celles qui régulent des processus essentiels à la progression du CCR. Toutefois, le rôle des protéines de signalisation engagées par les RTK dans le CCR reste encore très peu défini. De récents travaux menés dans notre laboratoire ont démontré que l'activation oncogénique du RTK Met, le récepteur du facteur de croissance d'hépatocyte (HGF), confère aux cellules épithéliales intestinales non cancéreuses IEC-6, des propriétés angiogéniques, tumorigéniques et métastatiques in vitro et in vivo . L'activité biologique des RTK, telle que celle du récepteur Met, s'avère étroitement liée à leur capacité d'initier une variété de voies de signalisation intracellulaire par le biais du recrutement de protéines adaptatrices, dont les protéines Gab1 et Gab2 (Grb2-associated binder). Ainsi, le but de mon projet fut de valider l'hypothèse que le pouvoir oncogénique du récepteur Met dans les cellules épithéliales intestinales serait en partie dépendant de l'engagement des voies de signalisation des protéines Gab. Pour ce faire, nous avons utilisé une approche dominante négative, soit par l'expression du domaine MBD (Met-Binding Domain) de Gab1 dans les cellules IEC-6 transformées par la forme oncogénique du récepteur Met, Tpr-Met (Tpr-Met-IEC-6). Cette stratégie repose sur le fait que la région MBD de Gab1 renferme les deux motifs de liaison, un motif riche en proline qui lie les protéines Gab aux RTK par un mécanisme indirect dépendant, de Grb2, ainsi que le motif MBM (Met-Binding Motif) qui est unique à Gab1, et qui permet une interaction directe entre Gab1 et le récepteur Met. Mes résultats montrent que l'expression du domaine MBD de Gab1 dans les cellules TprMet-IEC-6 diminue la phosphorylation de la protéine Gab1 sur tyrosine, restaure la formation de contacts cellule-cellule et une morphologie épithéliale typique ainsi qu'augmente le niveau protéique du marqueur épithéliale E-cadhérine et sa relocalisation membranaire aux zones de contact cellule-cellule. De plus, les cellules Tpr-Met-IEC-6 qui expriment le MBD de Gab1 affichent en culture une capacité réduite à proliférer au-delà de la confluence et en absence d'ancrage à la matrice extracellulaire, et de migration, ainsi qu'une diminution de leur aptitude à former des tumeurs sous-cutanées in vivo dans les souris nues. L'ensemble de mes résultats démontre pour la première fois que le pouvoir oncogénique du récepteur Met dans les cellules épithéliales intestinales dépend en partie de l'engagement des voies de signalisation de Gab1. En considérant que tous les RTK dérégulés dans le CCR peuvent se lier aux protéines Gab, ou engager leurs voies de signalisation, nos résultats identifient ces dernières comme des cibles prometteuses pour le développement de nouveaux agents thérapeutiques contre le CCR.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le développement de l’épithélium mammaire dépend des cellules souches qui, en proliférant et se différenciant, donnent naissance aux cellules du lignage épithélial. Les cellules souches sont ensuite sollicitées à chaque gestation pour régénérer une partie de l’épithélium. L’objectif de cette thèse est d’identifier et de caractériser en profondeur les différents types de cellules du lignage épithélial mammaire bovin par des approches de cytométrie en flux et de tri cellulaire. Nous avons défini et étudié des (sous)populations épithéliales engagées dans le développement mammaire à la puberté. A ce stade, l’épithélium mammaire contient de rares cellules souches mammaires, des cellules progénitrices à typage mixte luminal/basal et des cellules luminales et basales. Ces (sous)populations diffèrent soit en proportion soit en caractéristiques, voire les deux, aux stades physiologiques majeurssuivants (lactation et tarissement). Les cellules basales diminuent en lactation et au tarissement. Elles possèdent une signature moléculaire propre à chaque stade. La population luminale, composée de plusieurs sous-populations, est la plus variable. Elle arbore une réceptivité hormonale différente à chaque stade. Des (sous)populations épithéliales n’apparaissent qu’à un stade précis (puberté ou lactation) et disparaissent aux autres, comme certaines cellules prolifératives définies comme cellules progénitrices. Enfin, la fraction de rares cellules souches putatives diminue graduellement, de la puberté aux stades suivants, tout en conservant des caractéristiques moléculaires similaires. Ces / The development of the mammary epithelium relies on the mammary stem cells which, by proliferating and differentiating, give rise to the luminal, basal and progenitor cells of the epithelial lineage. The stem cells are then solicited at each gestation to regenerate a part of the epithelium. In this thesis work, we aim at identifying and characterizing in depth the different types of cell constitutive of the bovine mammary epithelial cell lineage by flow cytometry and cell sorting approaches. We defined and studied epithelial (sub)populations committed to mammary development at puberty. At this stage, the mammary epithelium contains rare mammary stem cells, mixed luminal/ basal progenitors, as well as luminal and basal cells.These (sub)populations were found to differ in proportion and/or characteristics at thesubsequent major physiological stages (lactation and dry periods). Basal cells decrease at lactation and dry off. They harbor a specific molecular signature at each stage. The luminal population, composed of several subpopulations, is the most variable. The hormonal receptivity of these cells changes at each physiological stage. Interestingly, some epithelial populations only appear at specific stages (puberty or lactation) and disappear at others, as one subpopulation of proliferative cells that we defined as progenitor cells. At last, the pool of rare putative stem cells gradually decreases from puberty to the next stages while maintaining a similar molecular signature. These are novel insights that show that the epithelial lineage evolves substantially through the

La morphogenèse épithéliale est essentielle à la formation des organes. J'utilise le follicule ovarien de Drosophila comme modèle d'étude de l’aplatissement des cellules. Un follicule est composé de cellules germinales en croissance entourées d'une monocouche de cellules épithéliales cuboïdes. À un stade de développement spécifique, une part de ces cellules s'aplatit en suivant une vague régulée. Cet aplatissement est en partie contrôlé par un gradient de pression provenant d’un groupe de cellules germinales (les cellules nourricières). Toutes les cellules germinales sont connectées via des ponts cytoplasmiques. Cette thèse étudie les mécanismes conduisant à la génération du gradient de pression, et à la modulation moléculaire induite par cette force mécanique pour permettre l'aplatissement. J'ai montré que le nombre et le diamètre des ponts cytoplasmiques influaient sur la pression. En utilisant des reconstructions tridimensionnelles de follicules, j’ai étudié le rôle de la croissance différentielle des cellules nourricières en mesurant le changement de volume des cellules germinales lors de l'aplatissement des cellules. Enfin, j’ai cherché le mécanisme moléculaire conduisant à l’aplatissement des cellules et influencé par un stimulus mécanique à partir de la pression germinale, en proposant un rôle de la voie Hippo dans ce processus. En conclusion, nous proposons que la croissance des cellules germinales influe de manière mécanique et génétique sur les cellules épithéliales pour permettre l’élongation, et donc l'acquisition de la forme finale du follicule. / Epithelial morphogenesis is essential for organ formation. I use the Drosophila ovarian follicle as a model for studying cell flattening. A follicle is composed of growing germ cells surrounded by a monolayer of cuboidal epithelial cells. At a specific stage of development, some of these cells flatten out following a regulated wave. This flattening is partly controlled by a pressure gradient from part of the germ cells (the nurse cells). All germ cells are connected via cytoplasmic bridges. This thesis studies the mechanisms leading to the generation of the gradient of pressure, and to the molecular modulation induced by this mechanical force to allow flattening. I have shown that the number and diameter of cytoplasmic bridges affect the pressure. Using three-dimensional reconstructions of follicles, I studied the role of differential growth of nurse cells by measuring the change in germ cell volume during epithelial cell flattening. Finally, I looked for the molecular mechanism leading to the flattening and influenced by a mechanical stimulus from the germinal pressure, supporting a role of the Hippo pathway in this process. In conclusion, we propose that germ cell growth mechanically and genetically influences epithelial cells to allow elongation, and thus the acquisition of the final form of the follicle.