Είναι γνωστό ότι οι μεταγγίσεις ομόλογου αίματος ασκούν ανοσοκατασταλτική δράση, ευνοόντας την υποτροπή των καρκινικών όγκων και των μεταστάσεων. Επιπλέον η περιεγχειρητική αναιμία θεωρείται ανεξάρτητος προγνωστικός παράγων σε ασθενείς που υποβάλλονται σε ογκολογικές επεμβάσεις. Οι μείζονες θωρακικές επεμβάσεις, όπως αυτές για καρκίνο του πνεύμονα συνοδεύονται από αυξημένες απώλειες αίματος και ανάγκες για μετάγγιση οδηγώντας σε επακόλουθη αύξηση της νοσηρότητας και θνησιμότητας. Παράλληλα η ευεργετική επίδραση της απροτινίνης είναι ευρέως γνωστή όσον αφορά τις Καρδιοχειρουργικές επεμβάσεις. Σκοπό των μελετών μας αποτέλεσε, από τη μία η πιθανή επίδραση των μεταγγίσεων ομολόγου αίματος και της προεγχειρητικής αναιμίας στην απώτερη επιβίωση των ασθενών που υπεβλήθησαν σε εκτομή μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα και από την άλλη η επίδραση της απροτινίνης στις ανάγκες για μετάγγιση και την αιμορραγική διάθεση, χορηγούμενη σε πολύ χαμηλή δόση σε μείζωνες πνευμονικές εκτομές. Κατά την πρώτη μας μελέτη, 331 ασθενείς (άνδρες/γυναίκες=295/36, μέσης ηλικίας 64 ± 9 έτη), οι οποίοι υπεβλήθησαν σε ριζική εκτομή μη μικροκυτταρικού καρκίνου πνεύμονα, εξετάσθηκαν προοπτικά. Ο μέσος χρόνος μετεγχειρητικής παρακολούθησης ήταν 27,2 μήνες. Η συνολική επιβίωση των ασθενών εξετάσθηκε συγκριτικά με την χορήγηση μεταγγίσεων ομολόγου αίματος και την περιεγχερητική αναιμία. Οι παράμετροι αυτοί εξετάσθηκαν αρχικά για τον συνολικό πληθυσμό ασθενών και εν συνεχεία ξεχωριστά για τους ασθενείς σταδίου I. Οι ασθενείς ταξινομήθηκαν ανάλογα με την χορήγηση περιεχειρητικής μετάγγισης αίματος στην Ομάδα Α (μεταγγιζόμενοι) και Ομάδα Β (μη μεταγγιζόμενοι) και ανάλογα με το επίπεδο της προεγχειρητικής αιμοσφαιρίνης (Hb) στην Ομάδα 1 (Hb<12 g/dl) και Ομάδα 2 (Hb≥12 g/dl) αντίστοιχα. Κατά τη δέυτερη μας μελέτη, μια υποομάδα 59 ασθενών (μέσης ηλικίας 58 ± 13.25 έτη) οι οποίοι υπεβλήθησαν σε μείζονα θωρακοχειρουργική επέμβαση ταξινομήθηκαν στην ομάδα ελέγχου (Ομάδα Α) και στην ομάδα απροτινίνης (Ομάδα Β). Η δεύτερη ομάδα (n=29) έλαβε κατά την εισαγωγή της αναισθησίας διεγχειρητικά 500.000 I.U απροτινίνης, ακολουθούμενη από μία δεύτερη ισόποση δόση αμέσως μετά το κλείσιμο της θωρακοτομής. Τα αποτελέσματά μας για την πρώτη μελέτη κατέγραψαν ποσοστό μετάγγισης 25,7%. Η μονοπαραγοντική ανάλυση για το σύνολο του πλυθησμού ανέδειξε συνολική επιβίωση μικρότερη στην Ομάδα Α (μεταγγιζόμενοι) (μέση επιβίωση 33.6 μήνες, 5-ετής επιβίωση 25.1%) σε σύγκριση με την Ομάδα B (μέση επιβίωση 48.0 μήνες, 5-ετής επιβίωση 37.3%) (p=0.001). Παρατηρήσαμε επίσης ότι οι ασθενείς με προεγχειρητική τιμή Hb<12 g/dl (Ομάδα 1) (μέση επιβίωση 33.0 μήνες, 5-ετής επιβίωση 21.3%), παρουσίασαν μικρότερη επβίωση συγκρινόμενοι με την Ομάδα 2 (μέση επιβίωση 49.3 μήνες, 5-ετής επιβίωση 40%) (p=0.002). Η πολυπαραγοντική ανάλυση του συνόλου των ασθενών ανέδειξε ότι η προεγχειρητική αναιμία αποτελεί ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα για την επιβίωση, ενώ η μετάγγιση με μονάδες ομόλογου αίματος όχι. Παρατηρήσαμε επίσης κατά την πολυπαραγοντική ανάλυση ότι στους ασθενείς του σταδίου I, οι μεταγγίσεις ομόλογου αίματος αποτέλεσαν ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα για την απώτερη επιβίωση, γεγονός που δεν επιβεβαιώθηκε για την προεγχειρητική αναιμία. Στην δεύτερη μελέτη μας, η μέση παροχή αιματηρού περιεχομένου που κατεγράφη από τους σωλήνες θώρακος κατά την 1η και 2η μετεγχειρητική ημέρα στην Ομάδα Β (απροτινίνης) ήταν σημαντικά ελαττωμένη (412.6±199.2 έναντι 764.3±213.9 ml, p<0.000 και 248.3±178.5 έναντι 455.0±274.6, p<0.001 αντίστοιχα). Παρομοίως, οι ανάγκες μετάγγισης με φρέσκο κατεψυγμένο πλάσμα ήταν λιγότερες στην Ομάδα της απροτινίνης. Επιπλέον, τόσο ο διεγχειρητικός χρόνος, όσο και η διάρκεια παραμονής στο νοσοκομείο ήταν χαμηλότερα υπέρ της Ομάδας Β, χωρίς όμως να αγγίζουν την στατιστική σημαντικότητα (84.6±35.2 έναντι 101.2±52.45 λεπτών και 5.8±1.6 έναντι 7.2±3.6 ημερών αντίστοιχα) (p<0.064). το συνολικό ποσοστό μετάγγισης δεν δέφερε σημαντικά ανάμεσα στις δύο ομάδες. Δεν παρατηρήθηκαν ανεπιθύμητες ενέργειες κατά τη χορήγηση της ουσίας. Τα συμπεράσματά μας συνιστούν ότι οι μεταγγίσεις ομολόγου αίματος επηρεάζουν αρνητικά την απώτερη επιβίωση των ασθενών με πρώιμο μη μικροκυτταρικό καρκίνο (σταδίου I) του πνεύμονα, χωρίς να παρατηρείται όμως η ίδια επίδραση στην επιβίωση αυτών με χειρουργικά εξαιρέσιμη πιο προχωρημένη νόσο. Τα ευρήματα αυτά καταδεικνύουν ότι οι μεταγγίσεις ομολόγου αίματος πιθανώς να ασκούν ανοσοτροποποιητική δράση στα πρώιμα στάδια της νόσου, ενώ για τα πιο προχωρημένα το φιανόμενο αυτό δεν είναι προφανές. Επιπλέον, η χορήγηση της απροτινίνης σε πολύ χαμηλή δόση, συνοδεύεται από ελάττωση των μετεγχειρητικών απωλειών αίματος και αναγκών για μετάγγιση των παραγώγων του αίματος. Με βάση τα δεδομένα αυτά θεωρούμε την χορήγηση της απροτινίνης ως ασφαλή και ευεργετική στις μείζονες θωρακοχειρουργικές επεμβάσεις. / It has been postulated that transfusions have immunosuppressive effects that promote tumor growth and metastasis. Moreover perioperative anaemia is considered an independent prognostic factor on outcome in patients operated for malignancy. Major thoracic operations (such as lung cancer resections) are associated with increased blood losses and transfusion requirements leading to increased mortality and morbidity. In addition, the blood saving effect of aprotinin has been well documented in cardiac surgery. The aims of our studies were to evaluate, on the one hand the possible influence of red blood cell (RBC) transfusions and perioperative anaemia on survival in patients operated for non-small cell lung carcinoma (NSCLC); and on the other hand, we have tested the influence of aprotinin using an ultra-low dose drug regime on major pulmonary operations concerning bleeding diathesis and need for transfusion. In our first study, 331 consecutive patients, male/female=295/36, (mean age 64±9 years), who underwent radical surgery for NSCLC were prospectively enrolled in this cohort and followed up for a mean of 27.2 months. The overall survival of patients was analyzed in relation to RBC transfusions and perioperative anemia. These parameters were analyzed in the whole cohort of patients and separately for stage I patients. Patients were divided according to perioperative transfusion, into Group A (transfused) and Group B (non-transfused) and according to the preoperative haemoglobin (Hb) level into Group 1 (Hb<12g/dl) and Group 2 (Hb≥12gr/dl) respectively. Furthermore in our second study, a subgroup of 59 patients, of mean age 58±13.25 years (mean±SD) undergoing general major thoracic procedures were randomized into placebo (Group A) and treatment–aprotinin group (Group B). The group B (n=29) received 500.000 IU of aprotinin after induction to anesthesia and a repeat dose immediately after chest closure. In our fisrt study, the overall transfusion rate was 25.7%. Univariate analysis showed that in the whole cohort of patients overall survival was significantly shorter in Group A (mean 33.6 months, 5-year survival 25.1%) compared to Group B (mean 48.0 months, 5-year survival 37.3%) (p=0.001). It also showed that patients with preoperative Hb level<12g/dl (Group 1), (mean of 33.0 months, 5-year survival 21.3%) had shorter survival compared to Group 2 patients (mean 49.3 months and 5-year survival 40.0%) respectively (p=0.002). Multivariate analysis in the whole cohort of patients showed that preoperative anemia was an independent risk factor for survival while RBC transfusion was not. In particular for stage I patients, it was shown that RBC transfusion was an independent prognostic factor for long-term survival as detected by multivariate analysis (p=0.043), while anemia was not. In our second study, the two groups were similar in terms of age, gender, diagnosis, pathology, comorbidity and operations performed. The mean drainage of the first and second postoperative day in group B was significantly reduced (412.6±199.2 vs. 764.3±213.9 ml, p<0.000, and 248.3±178.5 vs. 455.0±274.6, p<0.001). Similarly, the need for fresh frozen plasma transfusion was lower in group B, p<0.035. Both the operation time and the hospital stay were also less for group B but without reaching statistical significance (84.6±35.2 vs 101.2±52.45 min. and 5.8±1.6 vs 7.2±3.6 days respectively, p<0.064). The overall transfusion rate did not differ significantly. No side effects of aprotinin were noted Our conclusions suggested that RBC transfusions affect adversely the survival of stage I NSCLC patients, while do not exert any effect on survival of patients with surgically resectable more advanced disease, where preoperative anemia is an independent negative prognostic factor. These findings indicate that RBC transfusion might exert an immunomodulatory effect on patients with early disease while in more advanced stages this effect is not apparent. Additionally perioperative ultra-low dose aprotinin administration was associated with a reduction of total blood losses and blood product requirements. We therefore consider the use of aprotinin safe and effective in major thoracic surgery.

Recent studies have suggested significant variation in radiotherapy schedules used to treat advanced NSCLC, both between different centres as well as between countries. In this study, treatment methodologies have been explored using management plans proposed by radiation oncologists when given general questions and theoretical case histories for patients with advanced NSCLC. Methods and Materials The survey was conducted by sending a questionnaire to twenty four radiotherapy centres in Europe. The questionnaire was composed of two sections. The first section concerned reasons for starting radiotherapy, parameters that influence the choice of total dose and fractionation for radiotherapy and the kind of equipment that is used. The second section examines five case histories and asked the responders about the management of these five theoretical patients also regarding the radiotherapy techniques proposed and the aim of treatment (radical or palliative). Furthermore, trials comparing different regimens of palliative radiotherapy in patients with NSCLC were compared. Nineteen trials were reviewed. There were important differences in the doses of radiotherapy investigated, the patient characteristics and the outcome measures. Results In the first part responders (70% of the centres) suggested as the most important factors that influence the choice of total dose and fractionation for radiotherapy, distant metastases, performance status of the patient, lung function and size of the primary tumour. The most common reasons for starting the treatment is not only symptom relief, but also cure and prolongation of life. In the second part, more than 95% of the responders replied that they would give radiotherapy in each of these cases. The median total doses proposed where 20Gy/5fractions/1week or 30Gy/10fractions/2weeks for cases A and D (equivalent dose for fractionation 2Gy per fraction=23 and 33Gy) and 60-68Gy/30fractions/6weeks or 68Gy/34fractions/7weeks for cases B, C and E. For case E, 20% of the responders suggested Stereotactic Body Radiotherapy with 63Gy in 3 Fractions. The total dose and number of fractions of radiotherapy could be related to the perceived aims and expectations of treatment e.g. those aiming to extent life would give significantly higher total doses in a larger number of fractions, whereas those aiming to relieve symptoms would give significantly lower total doses. For the review to the literature there is no strong evidence that any regimen gives greater palliation. Higher dose regimens give more acute toxicity, especially oesophagitis. There is evidence for a modest increase in survival (5% at 1 year and 3% at 2 years) in patients with better performance status (PS) given higher dose radiotherapy. Some regimens are associated with an increased risk of radiation myelitis. Conclusions This survey demonstrates a range of treatment strategies for advanced and inoperable NSCLC within Europe. There are a number of factors that influence the perceived aims of treatment and treatment planning. These factors should be taken into account when evaluating the effectiveness of different irradiation techniques, especially in the determination of radiobiological parameters and dose-response relations. The majority of patients should be treated with short courses of palliative radiotherapy, of 1 or 2 fractions. Care should be taken with the dose to the spinal cord. The use of high dose palliative regimens should be considered for and discussed with selected patients with good performance status. More research is needed into reducing the acute toxicity of large fraction regimens and into the role of radical compared to high dose palliative radiotherapy. In the future, large trials comparing different RT regimens may be difficult to set up because of the increasing use of systemic chemotherapy. Trials looking at how best to integrate these two modalities, particularly in good PS patients need to be carried out. / Πρόσφατες μελέτες έχουν αναδείξει σημαντική ποικιλία στα ακτινοθεραπευτικά σχήματα που χρησιμοποιούνται στην ακτινοθεραπεία του μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα προχωρημένου σταδίου. Στη συγκεκριμένη μελέτη θεραπευτικές μεθοδολογίες έχουν διερευνηθεί χρησιμοποιώντας τεχνικές που προτείνονται από ογκολόγους ακτινοθεραπευτές . Υλικά και Μέθοδοι: Η μελέτη αποτελείται από δυο μέρη. Στο πρώτο ένα ερωτηματολόγιο εστάλη σε είκοσι τέσσερα ακτινοθεραπευτικά κέντρα στην Ευρώπη .Το ερωτηματολόγιο αποτελούνταν από δυο τμήματα. Στο πρώτο ζητούνταν οι λόγοι για τους οποίους γίνεται έναρξη της ακτινοθεραπείας, οι παράμετροι που επηρεάζουν την επιλογή για τη συνολική δόση και τις συνεδρίες για την θεραπεία και τον εξοπλισμό που χρησιμοποιούν. Στο δεύτερο τμήμα παρουσιαστήκαν πέντε θεωρητικά κλινικά περιστατικά και ζητήθηκε η αντιμετώπιση αυτών των θεωρητικών ασθενών. Στο δεύτερο μέρος της μελέτης πραγματοποιήθηκε ανασκόπηση στη βιβλιογραφία και σύγκριση των αποτελεσμάτων κλινικών δοκιμών που έχουν πραγματοποιηθεί στο παρελθόν. Αποτελέσματα: Στο ερωτηματολόγιο απάντησαν το εβδομήντα τοις εκατό των κέντρων στα όποια εστάλη. Στο πρώτο μέρος ως οι πιο σημαντικοί παρόντες που επηρεάζουν την επιλογή της τελικής δόσης και τις συνεδρίες οριστήκαν οι παρουσία απομακρυσμένων μεταστάσεων, η κλινική εικόνα του ασθενούς, η πνευμονική λειτουργία και το μέγεθος του πρωτογενούς όγκου. Οι σημαντικότεροι λόγοι για έναρξη θεραπείας είναι ανακούφιση από τα συμπτώματα καθώς και επιμήκυνση της ζωής. Στο δεύτερο μέρος ενενήντα πέντε τοις εκατό των κέντρων απάντησαν ότι θα πραγματοποιούσαν ακτινοθεραπεία και στους πέντε αυτούς ασθενείς. Η επιλογή της συνολικής δόσης και συνεδρίων επηρεάζεται από την θεώρηση της θεραπείας ως παρηγορική ή θεραπευτική. Τα κέντρα που είχαν στόχο την επιμήκυνση της ζωής έδιναν μεγαλύτερες δόσεις και περισσότερες συνεδρίες εν αντιθέσει με τα κέντρα που είχαν στόχο την υποχώρηση των συμπτωμάτων που έδιναν μικρότερης δόσεις σε λιγότερες συνεδρίες. Στο δεύτερο μέρος υπολογιστήκαν οι σχετικές βιολογικές δραστικότητες από τα δεδομένα της βιβλιογραφίας καθώς και ο παράγοντας πολλαπλασιασμού του όγκου και κατασκευάστηκαν καμπύλες δόσης απόκρισης. Συμπεράσματα: Η μελέτη αποδεικνύει την ύπαρξη ποικιλίας στις τεχνικές που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία προχωρημένου και ανεγχείρητου μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα. Αυτοί οι παράγοντες πρέπει να συνυπολογίζονται όταν εκτιμάται η αποτελεσματικότητα διαφορετικών ακτινοθεραπευτικών τεχνικών, κυρίως στο προσδιορισμό ακτινολογικών παραμέτρων και σχέσεων δόσης –απόκρισης.

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η πιο συχνή αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως. Είναι γνωστό ότι ο καρκίνος του πνεύμονα είναι διαδικασία πολλαπλών σταδίων, στην οποία ενέχονται γενετικοί και επιγενετικοί μηχανισμοί. Ενεργοποίηση ογκογονιδίων συμβαίνει σε όλους τους βρογχοπνευμονικούς καρκίνους με αποτέλεσμα την αύξηση των μιτογόνων σημάτων. Στον καρκίνο του πνεύμονα τα πιο συχνά ενεργοποιημένα ογκογονίδια είναι τα EGFR, ERbB2, MYC, KRAS, MET, CCND1, CDK4, EML4-ALK fusion, και BCL2. Επίσης, η απώλεια ογκοκατασταλτικών γονιδίων είναι ιδιαίτερα σημαντική στην πνευμονική καρκινογένεση και είναι συνήθως αποτέλεσμα απενεργοποίησης και των δυο αλληλόμορφων. Συχνά απενεργοποιημένα ογκοκατασταλτικά γονίδια στον καρκίνο του πνεύμονα είναι TP53, RB1, STK11, CDKN2A, FHIT και PTEN. Οι επιγενετικοί μηχανισμοί περιλαμβάνουν την μεθυλίωση του DNA, την τροποποίηση των ιστονών και τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης μέσω των microRNAs. Τα microRNAs είναι μικρά, μη κωδικοποιούντα μόρια RNA που εμπλέκονται στην αρνητική μετα-μεταγραφική ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων. Μελέτες έχουν αποδείξει το ρόλο των miRNAs στην φυσιολογική πνευμονική ανάπτυξη και ομοιόσταση αλλά και τον ενεργό ρολό τους στην παθογένεια πνευμονικών νοσημάτων όπως είναι ο καρκίνος του πνεύμονα. Η δημιουργία ωρίμων, λειτουργικών microRNAs απαιτεί τη συντονισμένη δράση μιας ομάδας πρωτεϊνών που στο σύνολο τους απαρτίζουν το μηχανισμό ρύθμισης των microRNA (microRNA machinery). Ο μηχανισμός ελέγχου των microRNA ρυθμίζει μέσω των παραγομένων microRNAs την έκφραση πολλών ογκοκατασταλτικών γονιδίων και ογκογονιδίων. Κύρια συστατικά του μηχανισμού ρύθμισης των microRNA είναι οι ριβονουκλεάσες Drosha, Dicer και AGO2. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της κυτταρικής εντόπισης και έκφρασης των συστατικών του μηχανισμού ρύθμισης των microRNA, Drosha, Dicer και AGO2, στον μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Συγκεκριμένα, ελέγχθηκε η κυτταρική εντόπιση των Drosha, Dicer και AGO2 στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα A549, H23, H358, H661, HCC827 με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού. Στις ίδιες κυτταρικές σειρές, μελετήθηκαν τα κυτταρικά επίπεδα των πρωτεϊνών Drosha, Dicer και AGO2 με την μέθοδο της SDS-PAGE και του ανοσοαποτυπώματος. H έκφραση των πρωτεϊνών αυτών μελετήθηκε σε ιστολογικές τομές παραφίνης μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα NSCLC με την μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας. Επιπλέον συσχετίσαμε τα επίπεδα της ανοσοϊστοχημικής χρώσης αυτών των ριβονουκλεασών με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. Η παρούσα εργασία είναι η πρώτη που μελετά την κυτταρική εντόπιση της Drosha in vitro και σε ιστούς από ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα. Τα επίπεδα ανοσοέκφρασης της Drosha ήταν στατιστικά χαμηλότερα στα νεοπλασματικά κύτταρα NSCLC, σε σχέση με τα φυσιολογικά. Επίσης, τα κυτταρικά επίπεδα της Drosha ήταν στατιστικά χαμηλότερα στα NSCLC σταδίου Ι σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό. Όμως, στατιστικά σημαντική διαφορά δεν προέκυψε από την σύγκριση καρκινικών ιστών μεταξύ τους κατά ιστολογικό τύπο, στάδιο νόσου και βαθμό κακοήθειας. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν συμμετοχή της ριβονουκλεάσης Drosha στην πνευμονική κακοήθη εξαλλαγή και στην παθογένεια του NSCLC αλλά όχι στην εξέλιξη της νόσου. Η παρούσα εργασία είναι η πρώτη που μελετά την κυτταρική εντόπιση της Dicer in vitro και σε ιστούς από ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα. Τα πειράματα ανοσοϊστοχημείας, ανέδειξαν ότι τα επίπεδα ανοσοέκφρασης της Dicer ήταν στατιστικά χαμηλότερα στα NSCLC σταδίου Ι σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό (p=0,040). Μάλιστα, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στην ανοσοέκφραση της Dicer στην σύγκριση των τριών σταδίων μεταξύ τους (p=0,049) και αυτό το εύρημα παρουσιάζεται για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία από την παρούσα μελέτη. Όμως, τα κυτταρικά επίπεδα αυτής της πρωτεΐνης δεν σχετίζονται με τον ιστολογικό τύπο αλλά και το βαθμό της κακοήθειας. Τα ευρήματα μας αυτά εισηγούνται τη συμμετοχή της ριβονουκλεάσης Dicer στην πνευμονική καρκινογένεση και στην εξέλιξη της νόσου. Τέλος, τα κυτταρικά επίπεδα της ενδονουκλεάσης AGO2 είναι στατιστικά χαμηλότερα στα πνευμονικά νεοπλασματικά κύτταρα σε σχέση με τα φυσιολογικά. Η πρωτεϊνική έκφραση των κυτταρικών σειρών NSCLC παρουσίασε σχεδόν ομοιόμορφη κατανομή. Μάλιστα, και για την πρωτεΐνη AGO2 τα επίπεδα ανοσοέκφρασης είναι στατιστικά χαμηλότερα στα NSCLC σταδίου Ι σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό (p=0,000). Όμως, παρατηρήθηκε ότι τα κυτταρικά επίπεδα αυτής της πρωτεΐνης δεν σχετίζονται με τον ιστολογικό τύπο, το στάδιο της νόσου αλλά και το βαθμό της κακοήθειας. Το γεγονός αυτό ενισχύει την άποψη ότι η AGO2 συμμετέχει στην παθοβιολογία του NSCLC αλλά πιθανά όχι στην εξέλιξη της νόσου. Εάν αποδειχθεί σημαντική η συμμετοχή του μηχανισμού ρύθμισης των microRNA στην παθογένεια της πνευμονικής κακοήθειας, θα υπάρξει η δυνατότητα να χρησιμοποιηθούν για την δημιουργία υποομάδων («μοριακά πορτραίτα») του καρκίνου του πνεύμονα, οι οποίες να έχουν προγνωστική αλλά και θεραπευτική αξία (στοχευμένες θεραπείες). / Lung cancer is the leading cause of cancer related death worldwide. Decades of research have contributed to our understanding that lung cancer is a multistep process involving genetic and epigenetic alterations. Oncogene activation occurs in all lung cancers, resulting in persistent upregulation of mitogenic signals. In lung cancer commonly activated oncogenes are EGFR, ERbB2, MYC, KRAS, MET, CCND1, CDK4, EML4-ALK fusion, and BCL2. Loss of tumor suppressor gene (TSG) function is also important in lung carcinogenesis and usually results from silencing of both alleles. Commonly unactivated TSGs in lung cancer are TP53, RB1, STK11, CDKN2A, FHIT and PTEN. Epigenetic alterations include DNA methylation, histone modification and microRNA regulation of gene expression. MicroRNAs are small non-protein encoding RNAs, responsible for the negative post transcriptional regulation of gene expression. Studies have shown the role of microRNAs in normal pulmonary development and homeostasis but also in the pathogenesis of multiple lung diseases including lung cancer. The biogenesis of mature and functional microRNAs requires the orchestrated action of a group of proteins, collectively refered to as miRNA machinery. The miRNA machinery regulates the expression of many TSGs and oncogenes in a miRNA guided fashion. Drosha, Dicer and AGO2 are main components of the miRNA machinery. Our study adressed the cellular localization and protein levels of Drosha, Dicer and AGO2, components of the miRNA machinery, in NSCLC cell lines, and in NSCLC FFPE tissue sections. We employed immunofluorescence and Western blot analysis in five NSCLC cell lines and immunohistochemistry on FFPE NSCLC tissue sections. Staining intensity of the FFPE tissues was correlated with clinicopathological parameters. Altered Drosha cellular distribution was evident in neoplasia. The staining intensity of Drosha (p=0,03) was significantly lower in neoplastic tissues compared to normal tissues. When we compared neoplastic tissue stage I with normal tissues, Drosha’s staining intensity (p=0,002) was significantly lower. Drosha, protein levels were not significantly associated with age, tumor histology, grade or stage. Altered Dicer nuclear distribution was evident in lung neoplasia. The staining intensity of Dicer was significantly lower in neoplastic tissues stage I compared to normal tissues (p=0,04). Dicer’s protein levels in FFPE tissues were significantly associated with tumor stage (p=0,049). AGO2 excibited physiological cytoplasmic distribution in lung neoplasia. The staining intensity of AGO2 was significantly lower in neoplastic tissues compared to normal tissues (p=0,000). When we compared neoplastic tissue stage I with normal tissues, AGO2 staining intensity (p=0,000) was significantly lower. AGO2 protein levels were not significantly associated with age, tumor histology, grade or stage. Our findings provide evidence that the miRNA machinery components Drosha, Dicer and AGO2 are involved in lung carcinogenesis but only Dicer is implicated in cancer progression. The expression levels of the miRNA processing components might contribute to improved cancerous molecular portraits for achieving personalized medicine, the selection of patient-tailored treatment regimens.

The purpose of this work is to make an attempt to quantify and model various types of cell death for a small cell lung cancer (SCLC) cell line (U1690) after exposure to a 137Cs source and as well as to compare cell survival models, the Linear-Quadratic (LQ) and Repairable Conditionally – Repairable model (RCR). This study is based on four different experiments that were taken place at Cancer Centrum Karolinska (CCK). A human small cell lung cancer (SCLC) cell line after the exposure to a 137Cs source was used for the extraction of the clonogenic cell survival curve. Additionally for the determination and quantification of various modes of cell death the method of fluorescence staining was implemented, where we categorized the cell death based on morphological characteristics. As next with the flow cytometry analysis we measured the properties of individual particles and more specifically the percentage of cells in each phase of the cell cycle. The quantification of senescent cells was performed by staining the samples with senescence associated-β-gal solution and then scoring as senescent cells those that had incorporated the substance. These data were introduced into a maximum likelihood fitting to calculate the best estimates of the parameters used by the model in section 2.8. In this model we sorted the modes of cell death into three categories: apoptotic, senescent and other types of cell death (nec/apop, necrotic, micronuclei, giant). In regards to the clonogenic cell survival assay the RCR model shows a ρ2 value that is equal to 6.10 whereas for the LQ model is 9.61. Moreover from the fluorescence microscopy and senescence assay we observed an initial increase of the probability of three different categories of cell death on day 2 and at higher doses there was saturation. On day 7 a significant induction of apoptosis in a dose and time dependent manner was evident whereas senescence was slightly increased in response to dose but not to time. As for the „other types of cell death‟ category on day 7 showed a higher probability that the one on day 2 and as well as a prominent dose dependence. A dose dependent accumulation of cells in the G2/M phase of the cell cycle was induced by photons on day 2. The accumulation in the G2/M phase on day 2 is released on day 7 and simultaneously an increase of the probability of apoptosis with time was observed. The RCR model is fitted better to the experimental data rather than the LQ model. On day 2 there is a slight increase of the apoptotic and senescent probability with dose. On the other hand on day 7 the shape of the curve of apoptosis differs and we observe a sigmoidal increase with dose. At both time points the mathematical model fit the data reasonable well. Due to the fact that the clonogenic survival doesn‟t coincide with the one extracted from the fluorescence microscopy, a more accurate way of quantification of cell death need to be used (e.g. CVTL). / Ο σκοπός αυτής της μελέτης είναι η ποσοτικοποίηση και μοντελοποίηση διαφόρων τύπων κυτταρικού θανάτου μικροκυτταρικού καρκίνου πνεύμονα μετά από ακτινοβόληση με πηγή Καισίου (137Cs) καθώς και η σύγκριση μοντέλων κυτταρικής επιβίωσης, Linear-Quadratic (LQ) και Repairable Conditionally-Repairable. Η μελέτη είναι βασισμένη σε τέσσερα ξεχωριστά πειράματα τα οποία πραγματοποιήθηκαν στο Cancer Centrum Karolinska (CCK). Ανθρώπινος μικροκυτταρικός καρκίνος πνεύμονα χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της καμπύλης κυτταρικής επιβίωσης μετά από ακτινοβόληση με πηγή Καισίου (137Cs). Επιπρόσθετα για τον προσδιορισμό και την μοντελοποίηση των διαφόρων ειδών θανάτου εφαρμόστηκε η μέθοδος της φθορίζουσας μικροσκοπίας, με την βοήθεια της οποίας κατηγοριοποιήθηκε ο κυτταρικός θάνατος βάσει μορφολογικών χαρακτηριστικών. Στη συνέχεια μέσω της κυτταρομετρίας ροής υπολογίσαμε τις ιδιότητες μεμονομένων σωματιδίων (κυττάρων) και πιο συγκεκριμένα το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου. Η ποσοτικοποίηση των κυττάρων γήρανσης πραγματοποιήθηκε μέσω της χρώσης των δειγμάτων με διάλυμα συσχετιζόμενο με την γήρανση και μετά καταγράφηκαν σαν κύτταρα γήρανσης αυτά τα οποία είχαν ενσωματώσει την ουσία. Τα δεδομένα χρησιμοποιήθηκαν σε μια διαδικασία προσαρμογής μέγιστης πιθανοφάνειας (maximum likelihood fitting) ώστε να υπολογιστούν οι βέλτιστες τιμές των παράμετρων που χρησιμοποιούνται από το μοντέλο στην ενότητα 2.8. Στο παρόν μοντέλο έχουμε ταξινομήσει τον κυτταρικό θάνατο σε τρεις κατηγορίες: απόπτωση, γήρανση και άλλοι τύποι κυτταρικού θανάτου (νεκ/αποπ, νέκρωση, μικροπυρήνες και γίγαντες). Όσον αφορά την κλωνογόνο κυτταρική επιβίωση το RCR μοντέλο παρουσιάζει τιμή χ2 ίση με 6.10 ενώ για το LQ μοντέλο ίση με 9.61. Επιπλέον μέσω της φθορίζουσας μικροσκοπίας και της χημικής δοκιμής για την κυτταρική γήρανση παρατηρήσαμε την 2η μέρα αρχική αύξηση της πιθανότητας και για τις τρεις κατηγορίες κυτταρικού θανάτου ενώ εμφανής ήταν ο κορεσμός στις υψηλότερες δόσεις. Την 7η μέρα παρουσιάστηκε επαγωγή της απόπτωσης με δοσο/χρονο-εξαρτώμενο τρόπο καθώς και το ότι η γήρανση των κυττάρων αυξήθηκε ελάχιστα με την δόση αλλά όχι με τον χρόνο. Σχετικά με την τρίτη κατηγορία ‘άλλοι τύποι κυτταρικού θανάτου’ την 7η μέρα ανέδειξε υψηλότερη πιθανότητα συγκριτικά με την 2η μέρα καθώς και μια έκδηλη εξάρτηση με την δόση. Κατά την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου για την 2η μέρα αναδεικνύεται συσσώρευση των κυττάρων με δοσοεξαρτώμενο τρόπο στην φάση G2/M του κυτταρικού κύκλου. Η συσσώρευση των κυττάρων στην φάση G2/M την 2η μέρα απελευθερώθηκε την 7η μέρα με ταυτόχρονη αύξηση της πιθανότητας για απόπτωση συναρτήσει της δόσης. Βρέθηκε ότι το RCR μοντέλο προσαρμόζεται καλύτερα στα πειραματικά δεδομένα σε σχέση με το LQ μοντέλο. Την 2η μέρα παρατηρήθηκε πολύ μικρή αύξηση της πιθανότητας για απόπτωση και γήρανση συναρτήσει της δόσης. Ενώ την 7η μέρα η μορφή της καμπύλης της απόπτωσης διαφοροποιήθηκε και παρατηρήθηκε σιγμοειδής αύξηση με την δόση. Το μαθηματικό μοντέλο προσαρμόζεται αρκετά καλά στα δεδομένα για την 2η και 7η μέρα. Ένας πιο ακριβής τρόπος υπολογισμού της ποσοτικοποίησης του κυτταρικού θανάτου θα πρέπει να χρησιμοποιηθεί εξ’αιτίας του γεγονότος ότι η καμπύλη της κλωνογόνου επιβίωσης δεν συμπίπτει με αυτή που παράχθηκε από την μικροσκοπία φθορισμού.

Με την εργασία έγινε μελέτη του σηματοδοτικού μονοπατιού Sonic Hedgehog σε 96 περιστατικά καρκίνου πνεύμονα με τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας. Επίσης μελετήσαμε την πιθανή συμμετοχή του μεταγραφικού παράγοντα FoxM1 στο καρκίνωμα του πνεύμονα και την πιθανή συσχέτισή του με το μονπάτι του Hedgehog. Έγινε μελέτη της έκφρασης των μορίων Shh, Ptch1, Smo, Gli1, Gli2 και FoxM1. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν μια έντονη έκφραση των μορίων του μονοπατιού και αυξημένα ποσοστά ενεργοποίησής του. Επίσης βρέθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση με τα πλακώδη καρκινώματα και με τα χαμηλού grade καρκινώματα. Ανάλογη σημαντική συσχέτιση βρέθηκε και με το φύλο,συχνότερα ενεργοποιημένο μονοπάτι στους άντρες. Ακόμα ανιχνεύτηκε μια συσχέτιση της έκφρασης του FoxM1 με το ενεργοποιημένο μονοπάτι. / The hedgehog (HH)-signaling pathway is implicated in developmental processes and its aberrant activation in adult tissues has been associated with malignancy. The aim of this study was to determine the expression pattern of HH-signaling molecules in lung carcinomas, as well as the involvement of the transcription factor FOXM1, that controls cell proliferation, in this process. Paraffin-embedded tissue sections of 96 lung cancer cases and adjacent non-neoplastic lung parenchyma were immunohistochemically analyzed with anti-SHH, anti-Patched1 (PTCH1), anti-Smoothened (SMO), anti-GLI1, anti-GLI2 and anti-FOXM1 antibodies. Correlations of HH molecules with clinicopathological parameters and FOXM1 expression were evaluated. All the HH-signaling molecules examined were overexpressed in lung cancer compared with the adjacent non-neoplastic lung parenchyma. HH pathway activity and expression of PTCH1 and SMO were significantly higher in squamous cell carcinomas compared to other histological types. Activation of HH pathway and PTCH1 expression were correlated with tumor grade being higher in low grade tumors. There was a significant correlation of lymph node metastases with expression of SMO in all histological types and with the gender higher in men. Overexpression of FOXM1 in lung cancer was also significantly correlated with PTCH1, SMO and GLI1 expression. In conclusion, HH-signaling pathway is activated in lung cancer and correlates with histological type, prognostic parameters of the tumors as well as with the increased expression of FOXM1.