Spelling suggestions: "subject:"πρωτεΐνη La"" "subject:"πρωτεΐνης La""
1 |
Μελέτες επί μεταλλαγμάτων της πρωτεΐνης La (Lupus antigen)Κωνσταντινίδου, Παρθένα 22 April 2015 (has links)
Η πρωτεΐνη La περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1974 ως αυτοαντιγόνο στον ορό των ασθενών που έπασχαν από συστηματικό ερυθηματώδη λύκο και σύνδρομο Sjögren. Απαντάται σε μεγάλες ποσότητες μέσα στα κύτταρα, όπου υπό φυσιολογικές συνθήκες δεσμεύει τα πρόδρομα μετάγραφα της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ προστατεύοντάς τα από την εξωνουκλεολυτική αποικοδόμηση. Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι μπορεί να δεσμεύεται σε μία πληθώρα κυτταρικών και ιικών mRNA ρυθμίζοντας τη μετάφρασή τους. Πρόσφατες έρευνες έχουν επιβεβαιώσει το ρόλο της ανθρώπινης πρωτεΐνης ως RNA συνοδό (RNA chaperone) που συμβάλλει στην ορθή αναδίπλωση των μορίων RNA που δεσμεύει. Παρά το γεγονός ότι η La περιγράφηκε για πρώτη φορά στον άνθρωπο, ομόλογες πρωτεΐνες έχουν βρεθεί σε μία ποικιλία ευκαρυωτικών οργανισμών. Σε όλους αυτούς τους οργανισμούς η πρωτεΐνη παρουσιάζει μία κοινή οργάνωση επικρατειών. Στο Ν-τελικό άκρο υπάρχει το εξαιρετικά συντηρημένο μοτίβο La motif, το οποίο ακολουθείται από ένα τουλάχιστον μοτίβο RNA αναγνώρισης (RRM) και ένα αρκετά μεταβλητό C-τελικό άκρο. Παρότι ο λειτουργικός ρόλος της πρωτεΐνης έχει μελετηθεί επαρκώς, ελάχιστα είναι γνωστά για τη δομή της και τον τρόπο με τον οποίο δεσμεύεται στα φυσικά της υποστρώματα, όπως είναι τα πρόδρομα tRNA. Η παρούσα διατριβή εστιάζεται στη μελέτη τριών επιμέρους επικρατειών της πρωτεΐνης La του οργανισμού Dictyostelium discoideum, η οποία παρουσιάζει πολύ μεγάλη ομολογία και παρόμοια δομική οργάνωση με την ανθρώπινη πρωτεΐνη. Κάθε επικράτεια μελετάται ως προς τη δυνατότητα και τον τρόπο αλληλεπίδρασης με ομόλογα πρόδρομα tRNA του D. discoideum. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκε μοριακή κλωνοποίηση των επικρατειών La motif, RRM1 και La motif-RRM1 και υπερέκφρασή τους σε βακτηριακά κύτταρα. Οι ανασυνδυασμένες επικράτειες απομονώθηκαν σε δύο στάδια καθαρισμού και εξετάστηκαν ως προς την ικανότητα δέσμευσης στα πρόδρομα tRNA, με Electrophoresis Mobility Shift Assay και Micro Scale Thermophoresis. Επιπλέον, με ανάλυση αποτυπώματος (footprinting) αποκαλύφθηκαν τα σημεία της αλληλεπίδρασης του κάθε τομέα επάνω στο μόριο του pre-tRNAArg. Από τα αποτελέσματα προκύπτει ότι η La χρησιμοποιεί τις διαφορετικές επικρατειές της για να αναγνωρίζει ξεχωριστά σημεία επάνω στο μόριο του pre-tRNA. Τέλος, με τη χρήση φασματοσκοπίας NMR σε διάλυμα, επιβεβαιώθηκε ότι τόσο το La motif όσο και το RRM1 μπορούν να αναδιπλώνονται ανεξάρτητα σε μία διαμόρφωση που πιθανότατα διατηρούν και μέσα σε ολόκληρο το μόριο in vivo. / La is a highly abundant nuclear phosphoprotein. It was first described as an autoantigen found in the sera of patients suffering from systemic lupus erythematosus and Sjögren’s syndrome. Under normal conditions, La protein associates with the newly synthesized RNA polymerase III transcripts and protects them from exonucleases. It has also been reported that La associates with a variety of cellular and viral mRNAs and regulates their translation. Recent research has established the role of human La as an RNA chaperone that contributes to the proper folding of the associated RNA molecules. Although La was first described in human, homologs have been identified in a wide variety of eukaryotes. All these proteins share a common domain organization. The N-terminus of all known La proteins contains the highly conserved La motif. La motif is followed by a less conserved RNA Recognition motif (RRM) and a notably variable C-terminus. While the functional properties of La have been adequately investigated, information regarding the exact mode of binding and the structure remains elusive. This study focusses on the interaction between distinct domains of Dictyostelium discoideum La and homologous pre-tRNAs. La motif, RRM1 and La motif-RRM1 were cloned and overexpressed in E. coli. The recombinant domains were purified by affinity chromatography and subsequent FPLC. Each domain was assayed regarding its capacity to bind the pre-tRNA using Electrophoresis Mobility Shift Assay and Micro Scale Thermophoresis. Foot-printing analysis revealed the specific pre-tRNA recognition patterns for each domain. The results suggest that La uses its distinct domains to bind different sites of the pre-tRNA molecule. Finally, structural analysis based on solution NMR spectroscopy, confirmed the independent folding of the domains. Probably each domain preserves its tertiary structure in the wild type protein.
|
2 |
Μελέτες της λειτουργικής συμμετοχής της La πρωτεΐνης του Dictyostelium discoideum στην ωρίμανση πρόδρομων μορίων tRNAΑποστολίδη, Μαρία 30 May 2012 (has links)
Η La πρωτεΐνη περιγράφηκε για πρώτη φορά στον άνθρωπο ως αυτοαντιγόνο το οποίο αναγνωρίζεται από αντισώματα που είναι παρόντα στον ορό ασθενών που πάσχουν από συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (systemic lupus erythematosus) και σύνδρομο Sjögren. Είναι γνωστό σήμερα ότι συμμετέχει ενεργά στη βιογένεση μικρών μορίων RNA, συμπεριλαμβανομένου της ιδιότητάς της να συνδέεται και να προστατεύει την 3’ ακόλουθη αλληλουχία των πρόδρομων tRNA μεταγράφων. Επιπλέον, έχει προταθεί ότι in vivo διευκολύνει την απομάκρυνση της 5’ οδηγού αλληλουχίας από την RNase P. Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκε μοριακή κλωνοποίηση της La πρωτεΐνης του D. discoideum (354aa, 40,3-kDa) και υπερέκφρασή της. Η ανασυνδυασμένη La-His6 απομονώθηκε σε δύο στάδια καθαρισμού και εξετάστηκε ως προς την ικανότητα δέσμευσής της σε μόρια tRNA με ανάλυση EMSA (Electrophoresis Mobility Shift Assay). Τα αποτελέσματα με τη δοκιμή του ομόλογου pre-tRNASer που φέρει 3’ ακόλουθη αλληλουχία ως προσδέτη σε σχέση με ένα pre- tRNASer στο οποίο απουσιάζει η αντίστοιχη αλληλουχία, έδειξε ότι η La πρωτεΐνη έχει προτίμηση για αυτούσια πρόδρομα tRNA. In silico ανάλυση της πρωτεΐνης, έδειξε ότι περιλαμβάνει μοτίβα χαρακτηριστικά για RNA πρόσδεση με υψηλή συντήρηση στο Ν-τελικό της άκρο. Η προσθήκη αυξανόμενων συγκεντρώσεων ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης La αναστέλλει σε ένα ποσοστό 10% την ωρίμανση του tRNA από την ομόλογη RNase P. Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκαν in vitro δοκιμές για τη μελέτη της ικανότητας της La να βοηθά στη σωστή αναδίπλωση και άλλων πρόδρομων μεταγράφων της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ. Για το λόγο αυτό ελέγχθηκε η ικανότητα ωρίμανσης παρουσία της La και της RNA υπομονάδας της RNase P. Κάτω από ποικίλες συνθήκες δοκιμής η παρουσία της La δεν ευνόησε την ενεργότητα του ριβοενζύμου. Τέλος, φωσφορυλίωση της La πρωτεΐνης σε συγκεκριμένα αμινοξέα δεν έδειξε ενίσχυση της συγγένειας για το υπόστρωμα. Η La του D. discoideum, μπορεί να συνδέεται με αρκετά μεγάλη συγγένεια με το ομόλογό της υπόστρωμα (Kd = 4±1nM, συγκρίσιμη με αντίστοιχες τιμές ομόλογων πρωτεϊνών) χωρίς την απαίτηση του μοτίβου 3’UUU-OH, το οποίο φαίνεται να είναι απαραίτητο για La πρωτεΐνες από άλλους οργανισμούς (H. sapiens, S. pombe, S. cerevisiae, T. brucei). Το γεγονός αυτό εγείρει πολλά ερωτήματα για την εξελικτική προέλευση αυτής της πρωτεΐνης και για την εξακρίβωση του ρόλου της ως αυτοαντιγόνου στα νοσήματα που αναφέρθηκαν. Βιοχημικές και δομικές μελέτες βρίσκονται σε εξέλιξη για να απαντήσουν σε αυτά τα ερωτήματα. / The La protein was first described in humans as an autoantigen recognized by antibodies present in serum of patients suffering from systemic lupus erythematosus and Sjögren syndrome. It is known that it participates actively in the biogenesis of small RNA molecules, including the binding and protection of the 3' trailer sequence of the precursor tRNA. Furthermore, it has been suggested that it facilitates the RNase P to remove the 5' leader sequence in vivo. In this study, molecular cloning and overexpression of the La protein D. discoideum (354aa, 40,3-kDa) were realized. Recombinant La-His6 was purified in two stages and was assayed regarding its capacity to bind tRNA using EMSA (Electrophoresis Mobility Shift Assay). The results testing the homologous pre- tRNASer bearing a 3' trailer sequence as a ligand compared to a pre- tRNASer which lacks the corresponding sequence, showed that the La protein has a preference for intact precursor tRNA. In silico analysis of the protein domain showed that it includes highly conserved motifs characteristic for RNA binding at the N-terminal site. The addition of increasing concentrations of recombinant La protein inhibits the maturation of tRNA by homologous RNase P at a 10% rate. Additionally, in vitro assays were carried out to study the ability of La to assist the proper folding of additional precursor transcripts of RNA polymerase III. Therefore the ability of maturation in presence of La and the RNA subunit of RNase P was assayed. Under various test conditions, the presence of La did not favor any riboenzyme activity. Finally, phosphorylation of La protein in specific amino acids showed no enhancing affinity to the substrate. The La protein from D. discoideum, can bind with quite a high affinity to its homologous substrate (Kd = 4 ± 1nM, comparable to corresponding values of homologous proteins) without the presence of the 3'UUU-OH motif, which appears to be necessary for La proteins from other organisms (H. sapiens, S. pombe, S. cerevisiae, T. brucei). This raises many questions about the evolutionary origin of this protein and the identification of its role as an autoantigen in many autoimmune diseases. Biochemical and structural studies are underway to answer these questions.
|
3 |
Καθορισμός πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων δεσμίνης και άλλων πρωτεϊνώνΒλάχου, Θεοδώρα-Ευανθία 30 July 2007 (has links)
Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. / Η δεσμίνη, το μυοειδικό μέλος της οικογένειας των ενδιάμεσων ινιδίων, εκφράζεται σε καρδιακό, γραμμωτό και λείο μυ. Στις ώριμες γραμμωτές μυϊκές ίνες, το δίκτυο των ενδιάμεσων ινιδίων δεσμίνης περιβάλλει τους Ζ-δίσκους, ενώνοντας τον ένα με τον άλλο και φαίνεται να συνδέει ολόκληρη τη συσταλτή συσκευή με το σαρκείλημμα, διάφορα μεμβρανώδη οργανίδια και τον πυρήνα. Σε μια προσπάθεια να κατανοηθεί η μοριακή φύση αυτών των αλληλεπιδράσεων, το εργαστήριο ξεκίνησε έναν έλεγχο χρησιμοποιώντας το σύστημα διπλού υβριδίου ζύμης, χρησιμοποιώντας διαφορετικά τμήματα της δεσμίνης, συμπεριλαμβανόμενων των περιοχών της κεφαλής και της ουράς του μορίου. Χρησιμοποιώντας την περιοχή του Ν-τελικού άκρου της δεσμίνης, βρέθηκαν αρκετές πιθανές πρωτεΐνικές αλληλεπιδράσεις. Αυτές περιλάμβαναν τη Smp3 mannosyltransferase, μια πρωτεΐνη με PDZ περιοχές και την prosaposin. Η Smp3 mannosyltransferase προσθέτει την 4η μαννόζη στη φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη κατά τη μετα-μεταφραστική τροποποίηση των γλυκοζυλοφωσφτιδυλοϊνοσιτολίων (GPIs). Η πρωτεΐνη με PDZ περιοχές (η οποία φαίνεται να είναι η MUPP1) περιέχει 13 PDZ περιοχές και είναι γνωστό ότι συνδέει τις διαμεμβρανικές περιοχές των στενοσυνδέσμων με ενδοκυττάρια μηνυματοφόρα μόρια. Η prosaposin είναι μια γλυκοπρωτεΐνη 511 αμινοξέων, η οποία αποτελεί πρόδρομο μόριο για τις τέσσερις saposins (sphingolipid activator proteins A, B, C, D). Ο σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η επιβεβαίωση των αλληλεπιδράσεων αυτών και η περαιτέρω μελέτη της πιο σημαντικής. Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο GST pull down βρέθηκε ότι το αμινοτελικό άκρο της δεσμίνης όντως αλληλεπιδρά με την Smp3 mannosyltransferase, την πρωτεΐνη PDZ και την prosaposin. Περαιτέρω ανάλυση με την prosaposin έδειξε ότι το αμινοτελικό άκρο της δεσμίνης αλληλεπιδρά με το τμήμα της prosaposin που αντιστοιχεί στη saposin D και όχι με το καρβοξυτελικό άκρο της prosaposin, το οποίο περιέχει μια saposin-like περιοχή. Τα παραπάνω αποτελέσματα αν επιβεβαιωθούν in vivo, προτείνουν έναν πιθανό ρόλο της δεσμίνης στη συγκρότηση πρωτεϊνικών συμπλόκων, τον έλεγχο της αναγέννησης και ανακύκλωσης μεμβρανών, τη μεταγωγή σήματος, το μεταβολισμό των λιπιδίων και τη μεταφορά στα υποκυτταρικά οργανίδια. / Desmin, the muscle-specific member of the intermediate filaments family, is expressed in cardiac, skeletal and smooth muscle. In the mature striated myofibrils, the network of desmin intermediate filaments surrounds Z-discs, extends from one Z-disc to the other and seems to associate with the nucleus, the plasma membrane and other membranous organelles, including mitochondria and sarcoplasmic reticulum. In an effort to understand the molecular nature of these interactions, the
laboratory has started a global yeast two-hybrid screen using different desmin fragments, including the head and tail domains of the molecule. Using the desmin N-terminal domain, several potential interacting proteins were found. These include prosaposin, a protein with PDZ domains and Smp3 mannosyltransferase. Smp3 mannosyltransferase adds the 4th mannose to phosphatidyloinositol during the post-translation modification of GPIs. The protein with PDZ domains, which seems to be MUPP1, has 13 PDZ domains and is known to connect the transmembrane domains of the tight junctions with messenger molecules. Prosaposin is a glycoprotein with 511 amino acids, which is cleaved in four mature saposins (sphingolipid activator proteins), when it reaches the lysosomes. The purpose of this work is to verify these interactions and further study the most important one. Using the GST pull down assays, it was verified that the amino terminus of desmin interacts indeed with Smp3 mannosyltransferase, protein PDZ and prosaposin. Further analysis with prosaposin demonstrated that the amino terminus of desmin interacts with the part of prosaposin that corresponds to saposin D and not with the downstream carboxy terminus of prosaposin that contains a saposin-like domain. All the above data, if verified in vivo could suggest a possible role of desmin in the assembly and stabilization of protein-complexes, in the control of biogenesis and regeneration of membranes, in signal transduction, in lipid metabolism and trafficking towards subcellular organelles.
|
4 |
Μοριακοί μηχανισμοί ηπατικής καρκινογένεσης επί εδάφους ιογενούς ηπατίτιδας ΒΠερουκίδης, Σταύρος Ν. 30 August 2007 (has links)
Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (ΗΚΚ) είναι η πιο σημαντική πρωτοπαθής νεοπλασία του ήπατος παγκοσμίως. Πολλοί αιτιολογικοί παράγοντες έχουν συσχετιστεί με την ανάπτυξη του ΗΚΚ, όπως η κίρρωση, οι ιοί της ηπατίτιδας και το αλκοόλ. Χρόνια λοίμωξη με ηπατίτιδα Β (HBV) και C (HCV) συχνά καταλήγει σε κίρρωση και ενισχύει την πιθανότητα ανάπτυξης ΗΚΚ. Ωστόσο οι υποκείμενοι μηχανισμοί που οδηγούν στην κακοήθη εξαλλαγή των κυττάρων παραμένουν αδιευκρίνιστοι. Ο HBV είναι ένας DNA ιός που ενσωματώνεται στο γονιδίωμα του ξενιστή και θεωρείται ότι με τον τρόπο αυτό προκαλεί καρκινογένεση. Επιπρόσθετα, ο ιός κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη 17 kDa,την HBx, η οποία είναι γνωστό ότι αποτελεί αιτιολογικό παράγοντα ανάπτυξης ΗΚΚ.
Η παρούσα ανασκόπηση αναλύει το ρόλο της HBx στους μοριακούς μηχανισμούς που σχετίζονται με την παθογένεση της επαγόμενης από τον HBV ηπατικής καρκινογένεσης. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most important primary hepatic cancer, being a common cancer type worldwide. Many aetiological factors have been related with HCC development, such as cirrhosis, hepatitis viruses and alcohol. Chronic infection with hepatitis B (HBV) and C viruses (HCV) often results in cirrhosis and enhances the probability of developing HCC. The underlying mechanisms that lead to malignant transformation of infected cells, however, remain unclear. HBV is a DNA virus that integrates into the host genome, and this integration is believed, in part, to be carcinogenic. Besides, the virus encodes a 17 kDa protein, HBx, which is known to be a causative agent in the formation of HCC.
This review examines the role of HBx in the molecular mechanisms involved in the pathogenesis of HBV-induced hepatocarcinogenesis.
|
5 |
Μελέτη αλληλεπίδρασης ινωδογόνου-επιφανειών με τη χρήση του Μικροσκοπίου Ατομικής ΔύναμηςΤσαπικούνη, Θεοδώρα 10 October 2008 (has links)
Αντικείμενο της διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση των μηχανισμών προσρόφησης
των πρωτεϊνών και η μέτρηση των δυνάμεων απoκόλλησής τους από την επιφάνεια τεχνητών
υλικών. Ως βασικό εργαλείο για τα πειράματα χρησιμοποιήθηκε το Μικροσκόπιο Ατομικής Δύναμης (AFM), με το οποίο ελήφθησαν εικόνες από δείγματα μέσα σε υδατικό διάλυμα καθώς και καταγράφηκαν οι δυνάμεις αλληλεπίδρασης μορίων με επιφάνειες. Η πρωτεΐνη ινωδογόνο
επιλέχθηκε για τη μελέτη εξαιτίας της σημασίας της για τη βιοσυμβατότητα των βιοϋλικών, καθώς ο πολυμερισμός της σε ινώδες είναι δυνατό να καταλήξει στο σχηματισμό θρόμβων. Ως υποστρώματα
προσρόφησης χρησιμοποιήθηκαν η μίκα και το γυαλί λόγω της απαίτησης λείων επιφανειών για το AFM.
Το πρώτο στάδιο της έρευνας περιελάμβανε την ποσοτικοποίηση της προσρόφησης μεμονωμένων μορίων ινωδογόνου πάνω σε επιφάνεια μίκας υπό μεταβλητές συνθήκες ιοντικής
ισχύος και pH. Στόχος ήταν η κατανόηση του τρόπου, μέσω του οποίου η κατανομή των
ηλεκτροστατικών φορτίων, τόσο στα πρωτεϊνικά μόρια όσο και στην επιφάνεια, επηρεάζει την
αλληλεπίδρασή τους. Η μελέτη της προσρόφησης με μεμονωμένα πρωτεϊνικά μόρια, αντί του
συνήθους συμπαγούς στρώματος, προτιμήθηκε για να αποφευχθεί η παρεμβολή των πλευρικών
αλληλεπιδράσεων μεταξύ των μορίων στο τελικό αποτέλεσμα. Έτσι, οι εικόνες, οι οποίες
ελήφθησαν με την τεχνική της ταλαντούμενης ακίδας σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα και η
στατιστική ανάλυση της επιφανειακής κάλυψης στις διάφορες συνθήκες διαλύματος έδειξαν ότι η
ισορροπία των απωστικών ηλεκτροστατικών δυνάμεων και των δυνάμεων ενυδάτωσης με τις
ελκτικές van der Waals καθορίζει την έκβαση της προσρόφησης από τα πρώτα στάδιά της, όταν
δηλαδή την επιφάνεια προσεγγίζουν ανεξάρτητα πρωτεϊνικά μόρια.
Περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου της ιοντικής ισχύος και του pH στην αλληλεπίδραση
ινωδογόνου‐επιφανειών επιχειρήθηκε με μέτρηση της δύναμης έλξης και αποκόλλησης ακίδων του
AFM από δείγματα μίκας. Οι ακίδες είχαν προηγουμένως τροποποιηθεί με μικροσφαιρίδια, στην
επιφάνεια των οποίων είχε προσδεθεί ομοιοπολικά, με κατάλληλη χημική διαδικασία, ένα στρώμα
μορίων ινωδογόνου. Οι καμπύλες προσέγγισης‐απομάκρυνσης, οι οποίες περιγράφηκαν θεωρητικά
με βάση το μοντέλο DLVO, απέδειξαν την ύπαρξη συσχέτισης ανάμεσα στις μετρούμενες δυνάμεις και το βαθμό προσρόφησης στις διάφορες συνθήκες. Ειδικότερα οι μετρήσεις σε pH 3.5 έδωσαν
ισχυρές ενδείξεις για αλλαγές της μοριακής διάταξης του ινωδογόνου, οι οποίες μπορούν να
συσχετιστούν με τις ενζυμικά καταλυόμενες αναδιατάξεις της δομής του κατά το σχηματισμό του
ινώδους.
Η τελευταία ομάδα των πειραμάτων επικεντρώθηκε στη μέτρηση της δύναμης αποκόλλησης
μεμονωμένων μορίων ινωδογόνου από την επιφάνεια γυαλιού. Για το σκοπό αυτό η πρωτεΐνη
προσδέθηκε ομοιοπολικά στις ακίδες του AFM μέσω αλυσίδων πολυαιθυλενικής γλυκόλης (PEG),
αφού πρώτα εξετάστηκαν τρεις διαφορετικές τεχνικές επιφανειακής χημικής τροποποίησης (3‐
αμινοπροπυλο‐τριαιθοξυσιλάνιο, αιθανολαμίνη και 3‐αμινοπροπυλο‐διμεθυλ‐αιθοξυσιλάνιο). Ο
εντοπισμός στο σύνολο των καμπύλων, που συλλέχθηκαν, εκείνων, οι οποίες αντιπροσωπεύουν
αποκόλληση ενός μόνο πρωτεϊνικού μορίου, στηρίχθηκε στα χαρακτηριστικά των καμπύλων
τάνυσης των ανεξάρτητων μορίων ινωδογόνου, οι οποίες και προσαρμόστηκαν από το μοντέλο
“Worm‐Like Chain”. Η επεξεργασία των πειραματικών καμπύλων και ο προσδιορισμός της δύναμης
αποκόλλησης σε κάθε μία έγινε με τη βοήθεια πρωτότυπου κώδικα στη Matlab. Οι μετρηθείσες
δυνάμεις ομαδοποιήθηκαν με κριτήριο την ταχύτητα αποκόλλησης και εξετάστηκε κατά πόσο η
θεωρία των Bell και Evans μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την περιγραφή της δυναμικής των δεσμών,
οι οποίοι σχηματίζονται μεταξύ του ινωδογόνου και του υποστρώματος του γυαλιού. Τέλος,
προτάθηκαν δύο θεωρήσεις για τη φυσική ερμηνεία των πειραματικών καμπύλων, οι οποίες
παρουσίαζαν πολλαπλά συμβάντα αποκόλλησης, η θεώρηση της διαδοχικής διάσπασης δεσμών
μιας μοναδικής πρωτεϊνικής αλυσίδας με το υπόστρωμα και η θεώρηση των παράλληλων μορίων.
Συμπερασματικά η διατριβή αυτή παρουσιάζει ολοκληρωμένα τη χρήση του AFM για τη
μελέτη, στο νανοεπίπεδο, της συμπεριφοράς ανεξάρτητων πρωτεϊνικών μορίων σε διεπιφάνειες. Η
πρωτοτυπία της έγκειται στη μέτρηση της δύναμης αποκόλλησης μεμονωμένων μορίων
ινωδογόνου από την επιφάνεια. Η επέκταση της τεχνικής αυτής σε χημικά τροποποιημένες και
σαφώς χαρακτηρισμένες επιφάνειες καθώς και χρήση άλλων πρωτεϊνών μπορεί να φέρει την
τεχνική αυτή κοντά σε ακριβέστερες εφαρμογές ελέγχου της βιοσυμβατότητας
χρησιμοποιούμενων από την ιατρική υλικών. / The aim of this doctoral thesis was the study of the mechanisms of protein adsorption and
the measurement of the detachment forces of proteins from surfaces. The experiments were
conducted with the Atomic Force Microscope (AFM), with which images of adsorbed proteins were
obtained in liquid and protein‐surface interaction forces were recorded. The study was focused on
fibrinogen, a protein the behavior of which on biomaterial surfaces is critical for their
biocompatibility assessment, since its polymerization into fibrin leads to the formation clots. Mica
and glass were used as substrates for adsorption due to the restrictions imposed by AFM techniques
for smooth surfaces.
In the first set of experiments we tried to quantify the adsorption of single protein molecules
on mica at different conditions of pH and ionic strength. The objective was to clarify the role of
electrostatic charge distribution both on the surface and the molecules upon their interaction. Single
protein molecules were studied instead of confluent monolayers in order to exclude the effect of
lateral intermolecular interactions in the measurements. The images acquired with tapping mode in
phosphate buffered saline and the statistical analysis of the surface coverage at the various
conditions indicated that the balance between the repulsive electrostatic or hydration forces and the
attractive van der Waals forces determines adsorption from its very early steps, when individual
molecules approach the surface.
To further investigate the pH and ionic strength effect in fibrinogen‐surface interaction, the
force of attraction and detachment of colloid probes from mica surface was measured. The probes
were constructed from silica microspheres attached to AFM cantilevers and were modified with a
fibrinogen layer covalently bound to their surface. The approach‐retract curves, which were fitted by
the DLVO model, proved that the measured interaction forces, can be correlated with the degree of
adsorption at the various conditions. Particularly measurements at pH 3.5 offered evidence of
fibrinogen conformational changes, which may be related to enzymically catalyzed restructurings
during the formation of fibrin.
The last set of experiments was focused on the measurement of the detachment force of
single fibrinogen molecules from glass surfaces. For this purpose the protein was covalently bound to
AFM tips, through polyethylene glycol linkers, after three different methods of surface chemical modification had been tested (3‐aminopropyl(triethoxysilane), ethanolamine, 3‐
aminopropyl(dimethylethoxysilane)). The experimental curves representing single molecule
detachment were identified from the characteristic stretching curves of the protein chains which
were fitted by the Worm‐Like Chain model. For the automatic processing of force data an algorithm
was written in Matlab. Then the measured rupture forces were grouped according to the loading
rate and an attempt was made to describe the dynamics of fibrinogen‐substrate bindings with the
Bell‐Evans theory. Finally, two models were suggested for the physical interpretation of curves with
multiple rupture events. The first refers to successive ruptures of multiple connections of a single
fibrinogen molecule with the substrate, while the second to parallel molecules stretched between
the tip and the substrate.
In conclusion this thesis demonstrated in detail the use of AFM for the study, at the
nanoscale, of protein molecules at interfaces. An important novelty was the measurement of the
rupture force of single protein molecules from surfaces. Extension of the tested techniques to
chemically modified and well‐characterized surfaces as well as to different proteins can be applied
for the accurate prediction of realistic biomaterial biocompatibility.
|
6 |
Μελέτη της έκφρασης των NFY-C και RORA και συσχέτιση της έκφρασης του NFY-C με το p53 σε αδενοκαρκινώματα παχέος εντέρου / NFY-C and RORA expression and association of NFY-C expression with p53 in colorectal adenocarcinomasΚοττόρου, Αναστασία 07 April 2011 (has links)
Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της έκφρασης των γονιδίων NFY-C και RORA σε αδενοκαρκινώματα παχέος εντέρου και η σχέση της έκφρασης του NFY-C με την κατάσταση του γονιδίου p53.
Η NFY-C πρωτεΐνη είναι μια από τις τρεις υπομονάδες του μεταγραφικού παράγοντα NFY, ο οποίος προσδένεται στους υποκινητές πολλών ευκαρυωτικών γονιδίων, περιλαμβανομένων γονιδίων που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο, επάγοντας τη μεταγραφή τους. Η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53 συνδέεται με τον NFY για τη μεταγραφή γονιδίων. Η πρωτεΐνη RORA είναι ένας υποδοχέας στεροειδών ορμονών, ο οποίος εμπλέκεται σε μια σειρά κυτταρικών διαδικασιών.
Στην παρούσα μελέτη προσδιορίστηκαν τα επίπεδα mRNA του NFY-C και του RORA με ποσοτική RT-PCR σε 81 δείγματα καρκινικού ιστού παχέος εντέρου και 53 δείγματα φυσιολογικού ιστού παχέος εντέρου από ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου και διερευνήθηκε η σχέση τους με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών. Η πρωτεϊνική έκφραση του NFY-C προσδιορίστηκε με ανοσοϊστοχημεία σε 92 δείγματα νεοπλασματικού ιστού και 36 δείγματα φυσιολογικού ιστού παχέος εντέρου. Η κατάσταση των εξωνίων 5, 6, 7 και 8 του γονιδίου p53 προσδιορίστηκε με τη μέθοδο PCR-SSCP.
Τα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης του NFY-C ήταν αυξημένα στους καρκινικούς ιστούς σε σχέση με τους φυσιολογικούς και διέφεραν ανάμεσα σε όγκους διαφορετικής εντόπισης. Τα υψηλά επίπεδα mRNA του NFY-C σχετίστηκαν με μεγαλύτερο ελεύθερο νόσου διάστημα (TTP) σε ασθενείς σταδίου Β. Η NFY-C πρωτεΐνη εντοπίστηκε μόνο στο κυτταρόπλασμα του κυττάρου και όχι στον πυρήνα και η έκφρασή της διέφερε ανάμεσα σε όγκους διαφορετικού σταδίου. Τα επίπεδα mRNA του RORA ήταν μειωμένα στους καρκινικούς ιστούς σε σχέση με τους φυσιολογικούς και διέφεραν ανάμεσα σε όγκους διαφορετικής εντόπισης. Η πρωτεϊνική έκφραση του NFY-C σχετίζεται με την κατάσταση του p53 ως προς την επιβίωση των ασθενών και το TTP.
Συμπερασματικά, οι διαφορές έκφρασης των μορίων NFY-C και RORA υποδηλώνουν έναν πιθανό ρόλο στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου. / The aim of the current study was to evaluate NFY-C and RORA expression and investigate the correlation of NFY-C expression with p53 status in patients with colorectal carcinoma.
NFY-C protein is one of the three subunits of nuclear factor Y, which binds to the promoters of many eucaryotic genes, including cell cycle – related genes, inducing their transcription. p53 tumor supressor protein binds to NFY and induce gene expression. RORA protein is a steroid hormone receptor, which is implicated in many cellular processes.
In the current study NFY-C and RORA mRNA levels were evaluated by quantitative RT-PCR in 81 neoplastic colorectal tissue specimens and 53 normal tissue specimens from patients with colorectal adenocarcinoma and were analysed in relation to clinicopathological parameters of the patients. Protein expression of NFY-C was assessed by immunochemistry in 92 malignant and 36 normal samples from patients with colorectal adenocarcinoma. p53 status of the exons 5, 6, 7 and 8 was detected using PCR-SSCP method.
NFY-C mRNA and protein levels were elevated in malignant tissues compared to normal tissues and were related to the primary site of the tumor. Elevated mRNA levels of NFYC of stage B patients were significantly correlated with time to disease progression. NFY-C protein was detected only in the cytoplasm and not in the nucleus and its expression was correlated with the stage of the disease. RORA mRNA levels were decreased in normal tissues compared to malignant tissues and were related to the primary site. Protein expression of NFY-C in combination with p53 status is associated with overall survival and time to disease progression of the patients.
In conclusion, the differential expression of NFY-C and RORA indicates a possible role for these molecules in colon carcinogenesis.
|
7 |
Η πρωτεΐνη προσαρμοστής DRK και ο ρόλος της στον σχηματισμό της ανθεκτικής στην αναισθησία μνήμης στη Drosophila melanogasterΚωτούλα, Βασιλεία 31 August 2012 (has links)
Η Ανθεκτική στην Αναισθησία Μνήμη είναι ένας ιδιαίτερος τύπος μνήμης που προς το παρόν έχει χαρακτηριστεί μόνο στη Drosophila. Ελάχιστα είναι γνωστά για τον ρόλο της καθώς και για τα μόρια που παίζουν ρόλο στο σχηματισμό της. Στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι να διερευνήσει χρησιμοποιώντας τόσο συμπεριφορικά όσο και μοριακά εργαλία τον ρόλο της πρωτεΐνης προσαρμοστή DRK στην δημιουργία αυτού του ιδιαίτερου τύπου μνήμης. / Anesthesia Resistant Memory is a unique form of memory characterising Drosophila. Very few are known about its function and the molecules participating in its formation. The aim of this research is to examine the role of the adaptor protein DRK in the formation of Anesthesia Resitant Memory using both behavioural and molecular asseys.
|
8 |
Γενετική ποικιλομορφία του γονιδίου core του ιού της ηπατίτιδας C και μεταγραφική ρύθμισηΆιχερ, Στεφανή 02 May 2014 (has links)
Η πολυλειτουργική πρωτεΐνη core του ιού της ηπατίτιδας C (HCV) εμπλέκεται στην ανάπτυξη ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (HCC) που προκαλείται από τον ιό της ηπατίτιδας C, αλλά ο μηχανισμός με τον οποίο συμβαίνει αυτό δεν είναι κατανοητός. Η ενεργοποίηση του μονοπατιού Wnt/ β-κατενίνη, παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη ηπατοκυττταρικού καρκίνου, και τροποποιείται από την πρωτεΐνη core του ιού της ηπατίτιδας C. Ο ιός της ηπατίτιδας C χαρακτηρίζεται από εκτεταμένη γενετική ποικιλομορφία και διαφορετικά κλινικά δείγματα διαφέρουν όσον αφορά την μολυσματικότητα τους και την παθογένεια που προκαλούν. Σκοπός αυτής της μελέτης είναι να καθοριστεί ο ρόλος της γενετικής ποικιλομορφίας της πρωτεΐνης HCV core στην ενεργοποίηση του μονοπατιού Wnt/ β-κατενίνη και να μελετηθεί ο μοριακός μηχανισμός με τον οποίο η πρωτεΐνη HCV core ρυθμίζει την ενεργοποίηση αυτή. Η ενεργότητα του μονοπατιού Wnt/β-κατενίνη μελετήθηκε σε HEK 293T και Huh 7.5 κυτταρικές σειρές που εκφράζουν παροδικά τις πρωτεΐνες core των γενοτύπων 1a, 1b, 3a, 4a, 4f και από ένα μοναδικό δείγμα του γενοτύπου 1a που προέρχεται από έναν ασθενή από την Καμπότζη (1aCam). Μελέτες βασισμένες στη μέτρηση ενεργότητας της λουσιφεράσης, Western blot ανάλυση και qPCR, χρησιμοποιήθηκαν για την μέτρηση των επιπέδων έκφρασης γονιδίων και πρωτεϊνών. Βρέθηκε ότι η HCV core πρωτεΐνη ρυθμίζει θετικά την μεσολαβούμενη από τη β-κατενίνη Tcf-εξαρτώμενη ενεργότητα της λουσιφεράσης σε ένα γενοτυπο-εξαρτώμενο τρόπο. Σε συμφωνά με τα αποτελέσματα αυτά βρέθηκε ότι η πρωτεΐνη HCV core σταθεροποίει τα επίπεδα της β-κατενίνης, τόσο σε παροδικά μετασχηματισμένα κύτταρα, όσο και σε κύτταρα που μολύνονται με βακουλοϊούς που εκφράσουν τις πρωτεΐνες core των υποτύπων 4a και 4f. Τέλος, βρέθηκε ότι η πρωτεΐνη HCV core συμβάλει στην θετική ρύθμιση των γονιδίων c-myc, αξίνης και Tbx3, τα οποία είναι καθοδικά γονίδια στόχοι του μονοπατιού Wnt/β-κατενίνη και εμπλέκονται στην ανάπτυξη ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. Συμπερασματικά, οι πρωτεΐνες HCV core διαφορετικών γενοτύπων του ιού ρυθμίζουν διαφορετικά το μονοπάτι σηματοδότησης Wnt/β-κατενίνη και η διαφορετική αυτή ρύθμιση μπορεί να σχετίζεται με ικανότητα των διαφόρων γενοτύπων του ιού της ηπατίτιδας C να επάγουν την ανάπτυξη ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. / The multifunctional HCV core protein is implicated in the development of hepatocellular carcinoma (HCC) caused by HCV infection, but the underlying mechanism is not fully understood. Activation of the Wnt/ β-catenin pathway plays a major role in HCC and is modulated by the HCV core protein. HCV is characterized by extensive genetic diversity and different clinical isolates do vary in their infectivity and pathogenesis mainly due to variations in the structure/function relationships of individual viral proteins. The aim of this study is to determine the possible influence of genetic variability in HCV core protein in enhancing the Wnt/ β-catenin signaling activity and to elucidate the molecular mechanisms by which HCV core modulates activation of β-catenin. The Wnt/β-catenin activity was investigated in transiently transfected HEK 293T and Huh 7.5 cell lines transiently expressing HCV core proteins from HCV genotypes 1a, 1b, 4a, 4f and from a unique isolate of genotype 1a obtained from a Cambodian patient (1aCam). Luciferase-based reporter assay, Western blot, and qPCR, were used to measure gene and protein expression levels. We found that, HCV core protein upregulates β-catenin-mediated Tcf-dependent luciferase activity in a genotype specific manner. Consistent to these findings, HCV core stabilizes β-catenin levels. Finally, we showed that HCV core contributes to the upregulation of Tbx3 gene expression, a downstream target gene of Wnt/ β-catenin pathway contributing to HCC development. In conclusion, HCV core protein from different genotypes appears to differentially regulate the Wnt/β-catenin signaling pathway and this finding may contribute to different potential of HCV genotypes to induce HCC.
|
9 |
Μελέτη μακρομορίων του εξωκυττάριου χώρου : οργάνωση και ρόλος τους κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύουΓιακουμάκη, Αναστασία 22 September 2009 (has links)
Οι πρωτεογλυκάνες αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και με άλλα μορφορυθμιστικά μόρια όπως γλυκοπρωτεΐνες και ιντεγκρίνες, καθώς επίσης και με αυξητικούς παράγοντες. Μεγάλο μέρος των ποικίλων λειτουργιών των πρωτεογλυκανών συνδέεται με τις γλυκοζαμινογλυκανικές αλυσίδες (GAGs) τους. Για να μελετήσουμε τη λειτουργία των πρωτεογλυκανών κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου όρνιθας χρησιμοποιήσαμε το β-D-xyloside, έναν εξειδικευμένο αναστολέα της βιοσύνθεσης των πρωτεογλυκανών και ειδικότερα της πρόσδεσης των αλυσίδων γλυκοζαμινογλυκανών στον πρωτεϊνικό κορμό των πρωτεογλυκανών. Χαμηλές συγκεντρώσεις β-xyloside που είναι γνωστό ότι αναστέλλουν την προσθήκη θειϊκής χονδροϊτίνης αλλά όχι της θειϊκής ηπαράνης στον πρωτεϊνικό κορμό, αποτελούν ένα χρήσιμο εργαλείο για τη μελέτη του ρόλου των πρωτεογλυκανών. Τα πρότυπα των πρωτεϊνών στα έμβρυα που μεταχειρίστηκαν με β-xyloside έδειξαν μετατόπιση των ραδιενεργών κορυφών σε μικρότερη μοριακή μάζα που φαίνεται να οφείλεται στη μείωση του μεγέθους πρωτεογλυκανών. Ήταν αξιοσημείωτο στα αποτελέσματά μας ότι το β-xyloside μετέβαλλε τη μορφή της πρωτεογλυκάνης θειϊκής χονδροϊτίνης decorin προς χαμηλότερα μοριακά βάρη ενώ δε φάνηκε να επηρεάζει το μέγεθος της πρωτεογλυκάνης θειϊκής ηπαράνης perlecan. Στα έμβρυα που μεταχειρίστηκαν με β-xyloside περισσότερη πρωτεϊνη συντέθηκε στα έμβρυα του σταδίου ΧΙΙ (μορίδιο), σε σχέση με αυτά του σταδίου ΗΗ2 (αρχή πρωτογενούς αύλακας/πρώιμο γαστρίδιο), συγκρινόμενα με τα αντίστοιχα έμβρυα μάρτυρες. Αυτό θα μπορούσε να αντανακλά μια επιταχυνόμενη κινητοποίηση και/ή μια μετάφραση των ωογενετικών μεταγράφων στα έμβρυα του σταδίου ΧΙΙ, όταν διαταράχτηκε ο μεταβολισμός των πρωτεογλυκανών. Η απορρύθμιση πρωτεογλυκανών, τροποποιώντας τη λειτουργικότητα και επηρεάζοντας το επίπεδο έκφρασής τους, είχε ως αποτέλεσμα την αδυναμία του πρώιμου εμβρύου να δομήσει την εξωκυττάρια ύλη φυσιολογικά. Το αποτέλεσμα ήταν η κατάρρευση της τυπικής αρχιτεκτονικής του πρώιμου εμβρύου στα πειράματά μας. Πρωτεογλυκάνες θειϊκής χονδροϊτίνης φαίνεται να χρειάζονται για την οργάνωση του σταδίου του βλαστιδίου της όρνιθας. Για την επαγωγή του νευρικού συστήματος φάνηκε να χρειάζονται πρωτεογλυκάνες θειϊκής χονδροϊτίνης/δερματάνης που έχουν συγκεντρωθεί από το στάδιο πριν την έναρξη των μορφογενετικών κινήσεων της γαστριδίωσης και η συνεχής βιοσύνθεση των πρωτεογλυκανών είναι απαραίτητη για τη μορφογένεση του νευρικού σωλήνα. Μελετήσαμε επίσης το πρότυπο κατανομής της συνδετικής πρωτεϊνης πρωτεογλυκανών με ανοσοφθορισμό και ανοσοκατακρήμνιση και το ρόλο αυτής της γλυκοπρωτεϊνης με τη χρήση αντισωμάτων έναντι αυτής. Η συνδετική πρωτεΐνη μεσολαβεί στην πρόσδεση στο υαλουρονικό οξύ πρωτεογλυκανών όπως οι aggrecan, neurocan, versican και brevican δημιουργώντας σταθερά σύμπλοκα στην εξωκυττάρια ύλη. Η αναγνώριση των μορφών της συνδετικής πρωτεΐνης 1 (LP1, 48kDa) και συνδετικής πρωτεΐνης 2 (LP2, 44kDa) στο πρώιμο έμβρυο ήταν επίσης ένα ενδιαφέρον εύρημα των πειραμάτων μας. Είναι γνωστό ότι συνδυασμοί των LP1 και LP2 δημιουργούν πιο σταθερά σύμπλοκα απ’ ότι μόνο του το καθένα από τα δύο μόρια αυτά. Αυτό φαίνεται και από τα πειράματά μας που δείχνουν ότι η aggrecan (180kDa) φαίνεται να συν-κατακρημνίζεται με τις συνδετικές πρωτεΐνες LP1 και LP2. Τα πειράματα ανοσοφθορισμού έδειξαν ότι η συνδετική πρωτεΐνη αρχίζει να εκφράζεται στο στάδιο του βλαστιδίου και επιδεικνύει μια διαφορική έκφραση χωρο-χρονικά κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου υποδεικνύοντας ότι είναι σημαντική στην κυτταρική μετανάστευση και διαφοροποίηση κυττάρων και στη μορφογένεση ιστών και οργάνων. Αυτό επιβεβαιώθηκε και από τη μελέτη του ρόλου της, στην επόμενη σειρά πειραμάτων μας με τη χρήση μονοκλωνικού αντισώματος έναντι αυτής. Η αναστολή της λειτουργίας της συνδετικής πρωτεϊνης με τη χρήση αντισωμάτων έναντι αυτής έδειξε ότι αυτή η πρωτεϊνη φαίνεται να είναι σημαντική στην οργάνωση της νευρικής πλάκας και τη μορφογένεση του νευρικού σωλήνα, στη μορφογένεση του καρδιακού σωλήνα, του εντέρου, στο σχηματισμό της ραχιαίας αορτής και στην επιθηλιοποίηση των σωμιτών. / Proteoglycans participate in cellular interactions via modulating the effects of growth factors or with other mechanisms in early embryo. The majority of the functions of proteoglycans are associated with the glycosaminoglycan (GAG) chains. We used β-D-xyloside, an inhibitor of proteoglycan synthesis and specifically of GAG attachment to proteoglycan core proteins, to study proteoglycan functions in early chick embryo development. Low concentrations of β-xyloside which are known to affect differentially chondroitin but not heparan sulfate proteoglycan biosynthesis have provided a convenient tool for altering proteoglycan production. The protein patterns of xyloside-treated embryos showed a shift of radioactive peaks to lower molecular mass which could be attributed to the reduction of proteoglycan size as was demonstrated by chondroitinase ABC/AC II treatments. It was notable in our data that β-xyloside altered the chondroitin sulfate proteoglycan decorin to lower molecular mass while it did not seem to affect the size of the heparin sulfate proteoglycan perlecan. More protein was synthesized from xyloside-treated embryos at stage XII (morula) than from embryos at stage HH2 (initial primitive streak/early gastrula) when compared to the controls. This could have reflected an accelerated translation and/or mobilization of oogenetic transcripts in embryos at stage XII when proteoglycan metabolism was disrupted. Misregulation of proteoglycans by modulating the functionality of the protein and by influencing their expression level resulted in an inability of the early embryo to assemble a stable extracellular matrix that would have been normally produced. These changes were associated with the collapse of the typical blastula architecture and inhibition of the induction of mesoderm in the chick embryo. Induction of neuroectoderm required proteoglycans assembled before the initiation of gastrulation movements. However, sustained proteoglycan biosynthesis was required for the morphogenetic movements to form the neural tube and the rest of the embryonic axis. We also studied the spatiotemporal distribution pattern of link protein by immunofluorescence and immunoprecipitation and the role of this glycoprotein by blocking antibodies in the early chick embryo. The recognition of the link protein 1 (LP1, 48 kDa) and link protein 2 (LP2, 44 kDa) types was an important finding of our study. Link protein links several proteoglycans, such as aggrecan to hyaluronan, creating stable aggregates in the extracellular matrix and has a general function in the organization of the extracellular matrix. It is known that combinations of LP1 and LP2 create more stable complexes than the individual link protein molecule. This was also shown in our experiments, in that aggrecan (180kDa) co-precipitated with LP1 and LP2. Our immunofluorescent experiments showed that link protein expression was first detectable at the blastula stage (st. XIII) and its presence may be fundamental as the first extracellular matrix starts to assemble before the initiation of the first major cellular migrations during the gastrula stage. Link protein influorescence was strong in the cells ingressing through the primitive streak and in the migrating cells in embryos at stage HH3 (intermediate streak/mid-gastrula). At stage HH4 (definitive streak/late gastrula), link protein fluorescence was strong at the apical surface of the neural plate. At stage HH4-5 (head process), link protein fluorescence was strong at the apical surface of the neural folds, notochord and endoderm. At stage HH13 (19 somites), link protein fluorescence was intense in the encephalic vesicles, in the extracellular matrix, in the lumen of encephalic vesicles, intense in migrating neural crest cells, neural tube and in notochord, strong in gut lower wall, hard tube and dorsal aorta wall, intense in dermomyotome and strong in sclerotome in somites. By stage HH17 (29 somites), link protein fluorescence was strong in neuroepithelium and extracellular matrix in the lumen of the diencephalon, strong in neural crest cells, in the intraretinal space in the eye, in myocardium and endocardium, in dorsal aorta, in dermomyotome, the outer surface of pharyngeal arches wall of aortic arches and intense in thyroid rudiment. Inhibition of function of link protein by blocking antibodies showed that link protein was important in neuroepithelial tissue organization and neural tube closure, in normal differentiation of the neural tube to form the brain, in the morphogenesis of the heart tube, the dorsal aorta and gut and in somite epithelialization.
|
10 |
Παρασκευή και πιστοποίηση ζωοτροφής για πειραματική μελέτη των επιδράσεων των μετάλλων στις λιπιδαιμίεςΛέκκας, Παναγιώτης 21 July 2015 (has links)
O ψευδάργυρος -Zn ελέγχει τον μεταβολισμό των λιπιδίων και γλυκόζης μέσω Ζn-μεταγραφικών παραγόντων. Δίαιτες υψηλών λιπαρών οδηγούν στην ενδοκυτταρική συσσώρευση ελευθέρων ριζών, μειώνουν την μεταγραφική έκφραση των εκκαθαριστών τους και την ενεργότητα αντιοξειδωτικών ενζύμων και οδηγούν σε μεταβολικό σύνδρομο. Οι πρωτεϊνες του θερμικού shock (Heat shock proteins-HSP) παίζουν σημαντικό ρόλο στην αντίσταση στο κυτταρικό stress ως προσαρμογή ,μετά από έκθεση, σε διάφορα ερεθίσματα.
ΣΚΟΠΟΣ : Μελέτη της επίδρασης του διατροφικού Ζn και των Hsp70,στην μεταβονομική των λιπιδίων αίματος και ήπατος ποντικών
ΥΛΙΚΟ-ΜΕΘΟΔΟΙ :Ενήλικα αρσενικά ποντίκια: 1. Wild type (Wt) Hybrid (F1/F1) C57Bl/6 x CBA και 2. Transgenic (Tg) human HSP70 overexpressing mice, από ηλικίας ενός μηνός εντάχθηκαν στις παρακάτω διατροφές ,επί 10 εβδομάδες.
Διατροφή Αριθμός Wt Αριθμός Tg
Chow Diet (30 Zn) 6 10
High Fat Diet (3 Zn) 13 12
High Fat Diet (30 Zn) 9 8
High Fat Diet (300 Zn) 12 12
Σύνθεση των τριών διαιτών υψηλών λιπαρών -HFD: 3mg, 30mg, 300mg Zn /kg τροφής (mucedoola s.r.l Ιtaly-55% Cal από λιπαρά στοιχεία), Chow : δίαιτα ελέγχου
Βιοχημικές αναλύσεις: Cholesterol ,Triglycerides ,HDL-cholesterol, Glucose ,Insulin
Μετρήσεις μετάλλων και αντιοξειδωτικών παραγόντων: SOD (ερυθρά αιμοσφαίρια ) TAC (ορός αίματος) Zn , Cu (ερυθρά αιμοσφαίρια και ιστός ήπατος)
Μεταβονομική ανάλυση και αξιολόγηση λιπιδίων :Εκχύλιση ορού αίματος και ηπατικού ιστού για λήψη Φάσματος 1H-NMR
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ
1. Η HF δίαιτα αύξησε σημαντικά ,το τελικό βάρος και τον ρυθμό αύξησης βάρους ,τη χοληστερόλη -CL και την λιποπρωτεϊνη υψηλής πυκνότητας-ΗDL ,την ινσουλίνη –Ins, στα WT & Tg και μείωσε την ολική αντιοξειδωτική ικανότητα-TAC στο πλάσμα και την δραστηριότητα της σουπεροξείδιο-δισμουτάσης-SOD στα ερυθροκύταρα των WΤ και Tg
2. Ο επαρκής διατροφικός Zn (30mg/kgτροφής) φαίνεται να αποτελεί κρίσιμο παράγοντα διαμόρφωσης προστατευτικού ηπατολιπιδαιμικού προφίλ, ποντικών σε υπερλιπιδική δίαιτα.
Η αύξηση ή μείωση του Zn σε HFDς φαίνεται να μειώνει την TAC του πλάσματος σε WΤ και Tg ενώ η δραστικότητα της SOD φαίνεται ανάλογη των επιπέδων του Zn
Η ανεπάρκεια ή περίσσεια Zn αυξάνει τα αθηρογόνα SFA και μειώνει τα αντι-αθηρογόνα λιπίδια, PC, DU, LA DIAL ,UFA στις HDL, nonHDL και το ήπαρ, στα WΤHFD και στα ΤgHFD
3. Οι HSP70 : Τα διαγονιδιακά ζώα που φέρουν το γονίδιο hHsp70, φαίνεται ότι είτε σε έλλειψη είτε σε περίσσεια Ζn, που συνήθως συνοδεύoνται από μεταβολικό σύνδρομο, κατορθώνουν να διατηρούν καλλίτερους δείκτες λιπιδικού προφίλ σε σχέση με τα WT ζώα.
Τα Τg εμφάνισαν σημαντικά χαμηλότερη CL ,TG , HDL σε σύγκριση με τα WT ενώ η HSP70 αύξησε σημαντικά την ενεργότητα της ολικής SOD στα ερυθρά αιμοσφαίρια.
Η HSP70 μείωσε τα αθηρογόνα SFA και αύξησε τα αντιαθηρογόνα λιπίδια DIAL, DU, LA, UFA, SM στις HDL, nonHDL , και στο ήπαρ ποντικών που εκτέθηκαν σε HFD και σε όλες τις συγκεντρώσεις Zn. / Zinc –Zn controls lipid and glucose metabolism via Zn-transcription factors. High fat diets –HFDs lead to intracellular free radicals accumulation, decrease the transcriptional expression of their scavengers and anti-oxidative enzymes’ activity leading finally to metabolic syndrome. Heat shock proteins-HSPs play a significant role in cellular resistance response , as an adaptation mechanism, after exposure to various stimuli.
SCOPE: To study the effects of nutritional Zn and HSP70s on the metabonomics of serum and liver lipids in mice
MATERIALS-METHODS: Male mice: 1. Wild type (Wt) Hybrid (F1/F1) C57Bl/6 x CBA και 2. Transgenic (Tg) human HSP70 overexpressing mice, one month old, were subjected for 10 weeks to the following diets :
Diet Number of Wt Number of Tg
Chow Diet (30 Zn) 6 10
High Fat Diet (3 Zn) 13 12
High Fat Diet (30 Zn) 9 8
High Fat Diet (300 Zn) 12 12
Composition of the three HF Diets: 3mg, 30mg, 300mg Zn /kg τροφής (mucedoola s.r.l Ιtaly-55% Cal from greasy ingredients),Chow :control diet
Biochemical analyses: Cholesterol ,Triglycerides ,HDL-cholesterol, Glucose ,Insulin
Metals and antioxidative factors levels: SOD (red blood cells )TAC (blood serum) Zn , Cu (red blood cells and liver tissue)
Lipids metabonomics : Blood serum and liver tissue extracts for 1H-NMR spectrum analysis and evaluation
CONCLUSIONS
1. HFDiet significantly increased the rate of mice body weight gaining, as well as, cholesterol-CL, high density lipoproteins-HDL, insulin, in WT and Tg mice and decreased plasma total antioxidant capacity-TAC and red blood cell super oxide dismutase –SOD activity , in WT and Tg mice
2.Suficient nutritional Zn (30 mg/kg food) prevails as a crucial modulator of a protective hepato-lipidaemic profil of mice in high fat diet.
Zinc deficiency or excessiveness , in HFDiets , decreases plasma TAC in WT and Tg mice, while SOD activity shows proportional to Zn levels.
Zinc deficiency or excessiveness increases the atherogenic SFA and decreases the anti –atherogenic lipids : PC, DU, LA DIAL ,UFA, in HDL, nonHDL and liver, in WΤ-HFD and Τg-HFD mice
3. HSP70s : Transgenic mice over-expressing hHsp70 gene and exposed either to Zn deficiency or Zn excessiveness , both driving usually to metabolic syndrome , reveal significantly better lipid profile indicators, comparing to WT mice.
Tg mice revealed significantly lower CL , TG , HDL levels compared to WT, while HSP70 in Τg mice significantly increased total SOD activity in red blood cells.
HSP70 also decreased the atherogenic SFAs and increased the anti-atherogenic lipids DIAL, DU, LA, UFA, SM in HDL, nonHDL and in the liver of mice exposed to HFDiets and all Zn concentrations
|
Page generated in 0.0427 seconds