Οι θειωμένες γλυκοζαμινογλυκάνες είναι σημαντικά μόρια του εξωκυττάριου χώρου που επιτελούν σημαντικές διεργασίες. Η βιοσύνθεσή τους επιτυγχάνεται με τη συμμετοχή πολλών ενζύμων που έχουν διάφορους ρόλους. Τα κυριότερα ένζυμα που βιοσυνθέτουν θειική χονδροϊτίνη/ δερματάνη είναι οι συνθάσες χονδροϊτίνης, οι γλυκοσυλοτρανσφεράσες, οι σουλφοτρανσφεράσες και η επιμεράση της θειικής δερματάνης. Οι συνθάσες χονδροϊτίνης έχουν διττό ρόλο, γιατί έχουν δύο ενεργά κέντρα: Το ένα προσθέτει γλυκουρονικό οξύ και το άλλο Ν-ακετυλογαλακτοζαμίνη στο μη αναγωγικό άκρο μιας νεοσυντιθέμενης αλυσίδας. Παράλληλα, οι σουλφοτρανσφεράσες προσθέτουν θειικά σε συγκεκριμένες θέσεις ενώ η επιμεράση μετατρέπει κατάλοιπα γλυκουρονικού σε ιδουρονικό πριν συμβεί θείωση του δισακχαρίτη. Οι συνθάσες χονδροϊτίνης είναι οι εξής: CHSY1, CHSY2 (CHPF) και CHSY3. Η γλυκουρονυλοτρανσφεράση θειικής χονδροϊτίνης είναι η CSGlcA-T. Οι κυριότερες σουλφοτρανσφεράσες είναι οι C4ST1, D4ST1 και CHST3. Η μελέτη των ενζύμων αυτών στον καρκίνο είναι εξαιρετικού ενδιαφέροντος, γιατί έχει βρεθεί ότι οι γλυκοζαμινογλυκάνες συμμετέχουν στην ανάπτυξη του καρκίνου. Έχει παρατηρηθεί ότι οι γλυκοζάμινογλυκάνες υφίστανται ποιοτικές και ποσοτικές μεταβολές στους διάφορους καρκίνους. Οι μεταβολές αυτές φαίνεται να συμβάλλουν τόσο στην ανάπτυξη του καρκίνου όσο και στον φαινότυπό του. Η κατανόηση των μηχανισμών που οδηγούν στις μεταβολές των γλυκοζαμινογλυκανών είναι πολύ σημαντική. Η μελέτη επικεντρώθηκε στις μεταβολές που υφίστανται τα παραπάνω ένζυμα στον καρκίνο του παχέος εντέρου και του λάρυγγα. Οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: RT-PCR ανάλυση έπειτα από απομόνωση ολικού RNA, Western blotting ύστερα από διαδοχική εκχύλιση με PBS, υδροχλωρική γουανιδίνη και υδροχλωρική γουανιδίνη Triton-X100 για τη διερεύνηση της έκφρασης των γονιδίων, μεθυλοειδική PCR (MSP) για τη διερεύνηση των επιγενετικών μηχανισμών μετά από απομόνωση DNA και μέτρηση της δραστικότητας C-4 σουλφοτρανσφεράσης με χρήση αποθειωμένης δερματάνης ως υπόστρωμα. Στα δείγματα του παχέος εντέρου, η έκφραση της συνθάσης χονδροϊτίνης Ι ήταν υψηλότερη στα πρώτα στάδια του καρκίνου. Επίσης, ήταν αρκετά υψηλή στα μακροσκοπικά φυσιολογικά δείγματα που είναι παρακείμενα στους καλοήθεις όγκους. Στους τελευταίους και στους υγιείς ιστούς δεν υπήρχε σημαντική έκφραση του ενζύμου. Όσον αφορά τον λάρυγγα η έκφραση ήταν υψηλή στα παθολογικά δείγματα και ελαφρώς χαμηλότερη στα υγιή. Τα φυσιολογικά δείγματα δεν παρουσίαζαν σημαντική έκφραση του ενζύμου. Ο παράγοντας πολυμερισμού της χονδροϊτίνης, είχε υψηλότερη έκφραση στα παθολογικά δείγματα σε σχέση με τα φυσιολογικά στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Επίσης, φαίνεται να αυξανόταν στα παθολογικά δείγματα με το στάδιο του καρκίνου. Η έκφρασή του στους υγιείς ιστούς και στους παρακείμενους μακροσκοπικά φυσιολογικούς ιστούς των αδενωμάτων ήταν περιορισμένη. Αντίθετα, στα λαρυγγικά δείγματα η έκφρασή του ήταν αυξημένη στους υγιείς ιστούς. Η γλυκουρονυλoτρανσφεράση θειικής χονδροϊτίνης είχε περιορισμένη και σταθερή έκφραση στα πρώτα στάδια του καρκίνου του παχέος εντέρου αλλά στα ανώτερα στάδια αυξανόταν στα παθολογικά δείγματα. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφοροποιήσεις στη έκφραση των γονιδίων συνθάση χονδροϊτίνης ΙΙΙ και 6-σουλφοτρανσφεράση θειικής χονδροϊτίνης στον καρκίνο του παχέος εντέρου ή του λάρυγγα. Παρόλο αυτά, στον υγιή λάρυγγα τα δύο αυτά ένζυμα εκφράζονταν περισσότερο από τον καρκίνο. Το αντίθετο ισχύει για το υγιές παχύ έντερο που παρουσίαζε περιορισμένη έκφραση των δύο αυτών γονιδίων σε σχέση με τον καρκίνο. Τα επίπεδα mRNA της C-4 σουλφοτρανσφεράσης της θειικής δερματάνης στον καρκίνο του παχέος εντέρου φαίνεται να μειώθηκαν με το στάδιο του καρκίνου αλλά τα επίπεδα της πρωτεΐνης ήταν σταθερά. Στην υγιή κατάσταση το ένζυμο υποεκφραζόταν αλλά το αντίθετο ίσχυε για τα λαρυγγικά δείγματα. Επίσης, η περιοχή του υποκινητή του γονιδίου που εξετάστηκε παρέμενε πλήρως αμεθυλίωτη τόσο στα λαρυγγικά όσο και στα δείγματα του παχέος εντέρου κάτι που σημαίνει ότι πιθανώς δεν υπάρχει ρύθμιση της έκφρασης με μηχανισμό μεθυλίωσης του υποκινητή. Τα επίπεδα mRNA της επιμεράσης της θειικής δερματάνης ήταν αυξημένα στα παθολογικά δείγματα στα ανώτερα στάδια του καρκίνου του παχέος εντέρου. Η έκφραση αυτή φαίνεται να επηρεάζεται από τη μεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου. Στα λαρυγγικά δείγματα δεν έγινε ανίχνευσή της στα φυσιολογικά δείγματα παρά μόνο στα παθολογικά και σε μικρότρο βαθμό στα υγιή. Σε ορισμένα τουλάχιστον παθολογικά λαρυγγικά δείγματα φαίνεται να υπάρχει υπομεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου. Σε αυτό το σημείο φαίνεται να υπάρχει ομοιότητα στη ρύθμιση των διαφορετικών καρκίνων. Η εκχυλισιμότητα των ενζύμων στο PBS τόσο στα λαρυγγικά όσο και στα δείγματα του παχέος εντέρου κατέδειξε ότι ένα σημαντικό μέρος τους εκκρίνεται από τα κύτταρα. Σε προηγούμενες μελέτες η παρουσία τέτοιων ενζύμων (CHSY1, C4ST1 και D4ST1) στο θρεπτικό υλικό κυτταροκαλλιεργειών έχει ταυτοποιηθεί. Το ένζυμο που συγκρατείται περισσότερο και έχει τη μικρότερη παρουσία στον εξωκυττάριο χώρο είναι ο CHPF που εκχυλίζεται κυρίως στην GdnHCl. Επιπλέον, αξιοσημείωτη εκχυλισιμότητα τόσο στην GdnHCl όσο και την GdnHCl-Triton X100 παρουσίασε η CHSY1 η οποία ανιχνεύθηκε σε μεγάλη ποσότητα και στα εκχυλίσματα PBS. Όλα τα υπόλοιπα ένζυμα βρέθηκαν κυρίως σε εκχυλίσματα PBS (CHST3, D4ST1, C4ST1 και CHSY3). Τέλος, μελετήθηκαν και κάποια άλλα μόρια στον καρκίνο του παχέος εντέρου-υποστρώματα των ενζύμων- για να εξεταστεί η πιθανή συσχέτισή τους με την έκφραση των ενζύμων: Τα επίπεδα mRNA της διακοσμητίνης, ήταν υψηλότερα στους υγιείς ιστούς. Στον καρκίνο, σε όλα τα φυσιολογικά δείγματα η έκφρασή της ήταν αυξημένη σε σχέση με τα παθολογικά. Επιπλέον, παρατηρήθηκε μείωση της έκφρασης με το στάδιο του καρκίνου τόσο στα φυσιολογικά όσο και τα παθολογικά δείγματα. Η ισομορφή V0 της βερσικάνης ήταν αυξημένη στον καρκίνο (στα ίδια επίπεδα ανάμεσα στους φυσιολογικούς και τους αντίστοιχους παθολογικούς ιστούς) σε σχέση με την υγιή κατάσταση. Με το στάδιο υπήρχε αύξηση. Αντίθετα η ισομορφή V1 της βερσικάνης είχε τα υψηλότερα επίπεδα mRNA στα υγιή δείγματα και ταυτόχρονα υπήρχε μείωση με το στάδιο τόσο στα φυσιολογικά όσο και στα παθολογικά δείγματα. Οι ισομορφές V2 κια V3 ήταν στα ίδια επίπεδα στους υγιείς, φυσιολογικούς και παθολογικούς ιστούς και δεν παρατηρήθηκε καμία διαφοροποίηση στην έκφρασή τους με το στάδιο του καρκίνου. Από προηγούμενες μελέτες στον καρκίνο του λάρυγγα έχει παρατηρηθεί ότι με το στάδιο του καρκίνου υπάρχει συνεχής μείωση της θειικής χονδροϊτίνης και της θειικής δερματάνης σε σχέση με την υγιή κατάσταση. Πιο συγκεκριμένα υπάρχει δραματική μείωση με το στάδιο της C-6 θείωσης ενώ η μείωση της C-4 θείωσης γίνεται βαθμιαία. Η γενική μείωση της θειικής χονδροϊτίνης και θεικής δερματάνης μπορεί να εξηγηθεί από τη μεγάλη μείωση που παρατηρήθηκε στον CHPF και την CHSY3 στον καρκίνο σε σχέση με τον υγιή λάρυγγα. Η αμυδρή αύξηση της CHSY1 και της CSGlcA-T δεν μπορούν να οδηγήσουν σε αύξηση της CS/ DS. Επιπλέον, η μείωση της CHST3 στον καρκίνο πρέπει να οδηγεί και στην σχετική μείωση της C-6 θείωσης. Επίσης, είναι γνωστό ότι η CHSY1 ευνοεί περισσότερο τη C-4 θείωση τόσο στην χονδροϊτίνη όσο και στην δερματάνη. Η αυξημένη C-4 θείωση πρέπει να οφείλεται σε θειική χονδροϊτίνη, γιατί ενώ η D4ST1 μειωνόταν σε σχέση με την υγιή κατάσταση η C4ST1 αυξανόταν. Επιπλέον, ο CHPF που επίσης μειωνόταν στον καρκίνο ευνοεί περισσότερο τη C-6 θείωση. Σε αυτό το σημείο πρέπει να αναφερθεί ότι τα καλύτερα υποστρώματα για όλες τις συνθάσες χονδροϊτίνης είναι η αθείωτη πολυμερής χονδροϊτίνη και η CSC. Σε προηγούμενες μελέτες που αφορούν τον καρκίνο του παχέος εντέρου έχει παρατηρηθεί αύξηση της C-6 θείωσης και σχετική μείωση της C-4 θείωσης. Η C-6 θείωση φαίνεται να αυξάνεται και με το στάδιο του καρκίνου ενώ η C-4 θείωση τείνει να μειώνεται. Τα αποτελέσματα αυτά μπορούν να εξηγηθούν από τη μείωση της CHSY1 και της C4ST1 στα ανώτερα στάδια καθώς και στην ταυτόχρονη αύξηση του CHPF. Είναι αξιοσημείωτο το ότι δεν παρατηρήθηκαν μεταβολές στα επίπεδα πρωτεΐνης με το στάδιο του καρκίνου στην CHST3 ή την D4ST1. Παρόλο αυτά, στην υγιή κατάσταση (όπου η παρουσία χονδροϊτίνης-δερματάνης είναι περιορισμένη) τα ένζυμα εκφράζονταν ελάχιστα. Επιπλέον, τα επίπεδα του miR124 ήταν σταθερά. Συμπερασματικά, τα γονίδια βιοσύνθεσης των θειωμένων γλυκοζαμινογλυκανών υφίστανται μεταβολές στην έκφρασή τους στον καρκίνο του παχέος εντέρου συμμετέχοντας στην ογκογένεση και την ανάπτυξη του καρκίνου. Έτσι, πρωτεογλυκάνες που περιέχουν γλυκοζαμινογλυκανικές αλυσίδες με συγκεκριμένες ιδιότητες επηρεάζουν την κυτταρική σηματοδότηση. Η διαλεύκανση των μηχανισμών που επηρεάζουν την έκφραση των βιοσυνθετικών ενζύμων των γλυκοζαμινογλυκανών είναι μεγάλης σημασίας. / Sulfated glycosaminoglycans are important molecules of the extracellular matrix. Their biosynthesis is accomplished by the contribution of many different enzymes which have distinct roles. The most important enzymes in the chondroitin/ dematan sulfate biosynthesis are chondroitin synthases, glycosyltransferases, sulfotransferases and dermatan sulfate epimerase (DSE). Chondroitin synthases possess dual role containing two different active sites: One adding glucuronic acid and one adding N-acetylgalacosamine in the non-reducing end of a synthesizing chain. In parallel, sulfotransferases modify the newly-synthesized chains by adding sulfate in certain positions. The chondroitin synthases are CHSY1, CHSY2 (CHPF) and CHSY3. The glycosyltransferase acting in chondroitin is CSGlcA-T. Prior to sulfation, dermatan sulfate epimerase converts glucuronic acid to iduronic. The main sulfotransferases are C4ST1, D4ST1 and CHST3. CHST3 and C4ST1 acting mainly in chondroitin whereas D4ST1 acts mainly in dermatan. It was observed that the various glycosaminoglycans undergo many alterations in quantitative and qualitative terms. These alterations seem to contribute in cancer development and progression as well as in cancer phenotype. The deep understanding of the mechanisms which lead in glycosaminoglycan changes is of great importance. The study focuses in the variation of the levels of the chondroitin / dermatan polymerizing and modifying enzymes in healthy and cancerous tissues (both macroscopically normal and pathological specimens) in colorectal and laryngeal cancer.RT-PCR analysis was carried out to determine the expression of these enzymes after RNA isolation. For Western blotting tissue samples were subjected to sequential extraction with PBS, 4 M guanidine hydrochloride and 4 M guanidine hydrochloride – 1% Triton X-100. For epigenetic studies, methylation-specific PCR was carried out after DNA isolation. Furthermore, we have examined the levels of other molecules (decorin, versican isoforms and miR124) to find out if their presence can be correlated with the obtained enzymes’ profile. In colorectal samples, chondroitin synthase I expression was higher in the adjacent normal tissue of the benign tumors. In healthy tissues and benign tumors the enzyme was expressed in trivial amounts. In cancer, its expression was high at early stages. In laryngeal samples, chondroitin synthase I was expressed mainly in the pathologic samples and to a lower extent in the healthy specimens. Trivial amounts of the enzyme were detected in the pathologic samples. Chondroitin polymerizing factor was found to be elevated in colorectal cancer in the pathologic specimens compared to macroscopically normal. Furthermore, its mRNA levels had the tendency to elevate progressively with cancer stage in the pathologic specimens. In healthy samples and the adjacent normal specimens of the benign tumors its expression was trivial. In contrast in laryngeal samples the enzyme was elevated in the healthy tissues. In colorectal tissues CSGlcA-T expression was increased in adenomas (in the pathological parts) and in advanced stages of the disease. In the middle stages its expression is relatively suppressed and the tumors possess the same amount of the enzyme with the adjacent macroscopically normal tissue. No significant differences between macroscopically normal and pathologic specimens were observed at the levels of chondroitin-6-sulfotransferase and chondroitin synthase III in both laryngeal and colorectal cancer. Besides, in healthy larynx the specified enzymes were expressed intensively compared to cancer but the opposite profile was obtained in colon. In colorectal cancer, dermatan-4-sulfotransferase mRNA levels were in decreasing amounts in both macroscopically normal and cancerous tissues but its protein levels were constant in cancer. In laryngeal samples D4ST1 was expressed mainly in the healthy tissues but the oppοsite profile was obtained for colorectal samples. The CpG island near the promoter region of the D4ST1 gene in both colorectal and laryngeal cancer was fully unmethylated therefore it did not affect the enzyme expression another regulatory mechanism(s) should be considered. C4ST1 levels were trivial in healthy tissues and pre-cancerous situations in colon samples. In advanced stages C4ST1 was expressed about at the same levels in both normal and cancerous specimens. Its promoter was heavily methylated in the pathologic specimens but the unmethylated allele was not intense possibly due to semimethylation. In laryngeal tissues, C4ST1 gene expression was very low in healthy specimens and increased in patients' specimens. Its expression seemed to be controlled via methylation of a CpG island, since hypomethylation of the gene was observed in the pathologic samples compared to the macroscopically normal samples RT-PCR analysis indicated that in colorectal cancer dermatan sulfate epimerase mRNA levels were elevated in the pathologic specimens in the advanced stages. All the macroscopically normal specimens as well as the pathologic specimens of early stage of cancer possessed trivial amounts. MSP revealed that the mRNA levels observed correlate with the promoters’ methylation status. In laryngeal tissues, dermatan sulfate epimerase mRNA was detected in healthy and mainly in the pathologic specimens but not in the corresponding normal tissues. Relative hypomethylation of its promoter was observed in some pathologic specimens. The extractability of the studied enzymes in PBS in both laryngeal and colorectal samples indicated that a major part of them is secreted from the cells. In previous studies, the presence of such enzymes (CHSY1, D4ST1 and C4ST1) in the conditioned medium in cultured cells was also identified. The most “restrained” enzyme is CHPF which was extracted mainly in GdnHCl. CHSY1 showed a remarkable extractability in both GdnHCl and GdnHCl-Triton X100 but it was also detected in great amounts in the PBS extracts. All the other enzymes were found mainly in the PBS extracts (CHST3, D4ST1, C4ST1 and CHSY3). We have also studied some other molecules to find out if they have acorrelation with the enzymes’ profile in colorectal cancer: Decorin mRNA levels were the highest in the healthy tissues. In cancer, in all the normal specimens its expression was found to be elevated compared to pathological specimens. Furthermore, a stage-related decrease was observed in both normal and cancerous specimens. Versican-V0 isoform was increased in cancer (in normal and pathological specimens) compared to the healthy specimens with no significant differences between them. By stage, the mRNA levels increased. On the other hand, versican-V1 mRNA levels were the highest in the healthy specimens. Both normal and cancerous specimens contained similar levels of its mRNA which was in decreasing amounts by stage. Versican-V2 and V3 isoforms were similar in healthy, normal and cancerous specimens without any change in the various cancer stages. The present study took place in order to explain the chondroitin/ dermatan sulfate profiles obtained in colorectal and laryngeal cancer in previous studies. In laryngeal cancer, it was indicated that in the cartilaginous parts the chondroitin/dermatan profile is intensively altered in the advanced stages of cancer compared to the healthy cartilage: It was observed that the healthy laryngeal cartilage possesses great amounts of chondroitin/dermatan sulfate which in cancer are decreased. We have found that CHSY3 and CHSY2 were significantly decreased, whereas CHSY1 and CSGlcA-T were slightly increased. Since the decrease of CHSY2 and CHSY3 were very high compared to the increase of the latter, the general decrease of CS/DS is explained. The obtained sulfation profile by previous stydies indicated a dramatic decrease of C-6 sulfation and a more stagy loss of C-4 sulfation. This profile is explainable because CSA and mainly CSB (the C-4 sulfated chondroitin and dermatan sulfate, respectively) are synthesized preferentially by CHSY1. Furthermore, CHST3 gene expression was decreased in cancer compared to healthy tissues profoundly leading to C-6 sulfation decrease. D4ST1 gene expression was decreased, whereas C4ST1 gene was expressed more in the cancerous parts than in the macroscopically normal. Consequently, C-4 sulfation in CS-disaccharides could be relatively augmented in cancer but C-4 sulfation in DS-disaccharides decreased, yielding to an overall gradual C-4 sulfation decrease. Therefore, the C-4 sulfation is favored in cancer. CHPF preferentially synthesizes C-6 chondroitin sulfate. It is noteworthy that all chondroitin synthases prefer nonsulfated and CSC substrates. However, it has been shown that chondroitin polymerization is achieved by formation of complexes between the various chondroitin synthases and CSGlcA-T In colorectal cancer, an increase in absolute amounts of Δdi-6S together with a decrease of Δdi-4S was noted, both having a stage-related order. The amounts of Δdi-6S observed in the pathologic parts followed a stage-related increase. A quite different profile was obtained in the case of Δdi-4S, where its amounts were found to be increased in stage I, compared to healthy. Thereafter Δdi-4S amounts showed a tendency to become lower as the stage of cancer increased. These results can be explained by the decreased expression of CHSY1 and C4ST1 in the advancced stages and the inctrased expression of CHPF. It is noteworthy that significant changes in CHST3 and D4ST1 between the various cancer stages were not observed. In healthy samples which contain the smallest quantity of CS/ DS the latter enzymes were slightly expressed. In addition, we have studied the levels of miR124 which were found constant. In conclusion, the various glycosaminoglycan synthesizing enzymes showed different expression pattern in cancer implying specific roles in cancer development and progression. As a result, the formation of proteoglycans with characteristic features affects the cell signaling. The elucidation of the mechanisms which are involved in the expression of the glycosaminoglycan synthesizing enzymes is of great interest.

H neurocan και η phosphacan είναι πρωτεογλυκάνες θειικής χονδροϊτίνης. Η neurocan θεωρείτο οτι είναι μια πρωτεογλυκάνη αποκλειστικά του εγκεφάλου. Η phosphacan έχει μελετηθεί σε προχωρημένα στάδια ανάπτυξης εμβρύων ποντικού και αρουραίου. Δεν ήταν γνωστό πότε αρχίζουν να εκφράζονται και πως κατανέμονται χωρο-χρονικά οι neurocan και phosphacan καθώς το έμβρυο αρχίζει την ανάπτυξή του. Μελετήσαμε την έκφραση της neurocan και της phosphacan με RΤ-PCR και ανοσοφθορισμό στο έμβρυο όρνιθας από το στάδιο Χ (μορίδιο) έως το στάδιο HH17 (29 σωμίτες/πρώιμη οργανογένεση). Επίσης μελετήσαμε το ρόλο της neurocan και phosphacan με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι αυτών κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου. Το mRNA της neurocan πρωτοανιχνεύτηκε στο στάδιο του προχωρημένου γαστριδίου (HH4) και η έκφραση του ρυθμίζεται αναπτυξιακά. Τα πειράματα μας του ανοσοφθορισμού επίσης έδειξαν ότι η neurocan άρχισε να ανιχνεύεται στη νευρική πλάκα και στην εξωκυττάρια ουσία στο στάδιο του προχωρημένου γαστριδίου (HH4). Στα έμβρυα στο στάδιο των 19 σωμιτών (ΗΗ13), ο φθορισμός ήταν έντονος στον μυελεγκέφαλο, τη νωτοχορδή, στα κύτταρα των νευρικών κρηπίδων, στο κάτω τοίχωμα του φάρυγγα, στο ραχιαίο μεσοκάρδιο και μυοκάρδιο και λιγότερο στο ενδοκάρδιο και στα φαρυγγικά τόξα όπου έχουν μεταναστεύσει κύτταρα των νευρικών κρηπίδων. Στο στάδιο των 29 σωμιτών (HH17), η έκφραση της neurocan ήταν ισχυρή στον τελεγκέφαλο, μυελεγκέφαλο και στο νευρικό σωλήνα. Η έκφραση της neurocan ήταν ισχυρή στον αμφιβληστροειδή, λιγότερη στο φακό και έδειχνε μεγάλη ένταση στον κερατοειδή χιτώνα στον οφθαλμό, έντονη στο ραχιαίο μεσοκάρδιο, στο μυοκάρδιο και αχνή στο ενδοκάρδιο στην καρδιά και έντονη στους σωμίτες, στο μεσονέφρο και στις νησίδες αίματος. Σε μια σειρά λειτουργικών πειραμάτων με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι της neurocan προκάλεσε τα νευροεξωδερμικά κύτταρα να επιδεικνύουν μεσεγχυματικά χαρακτηριστικά και ο εγκέφαλος να μην έχει αναπτυχθεί φυσιολογικά. Επίσης ανεστάλη η μορφογένεση της καρδιάς και των σωμιτών στα έμβρυα αυτά. / Neurocan, a chondroitin sulfate proteoglycan, interacts with other molecules of the extracellular matrix and the cell surface and participates in signalling pathways. Phosphacan is a chondroitin/ keratan sulfate proteoglycan that has been studied extensively in the late embryonic and postnatal brain and in the spinal cord. Relatively little is known about the neurocan tissue-specific distribution or function during the development of the embryo. We studied the neurocan and phosphacan spatio-temporal expression pattern by RT-PCR and immunofluorescene in the early chick embryo from the morula stage (stage XI) to early organogenesis (stage HH17, 29 somites). We also studied the role of neurocan and phosphacan by using blocking antibodies directed against neurocan or phosphacan in a set of functional studies. Neurocan mRNA was first detectable at the late gastrula stage (HH4) and its expression was developmentally regulated. Neurocan protein was first detectable in cells of the inchoate neural plate and in the extracellular matrix in embryos at stage HH4. At stage HH13 (19 somites), neurocan fluorescence was intense in the myelencephalon, notochord, neural crest cells, the foregut lower wall, pharyngeal arches, dorsal mesocardium, myocardium and in the endocardium. At stage HH17 (29 somites), neurocan expression was intense in the telencephalon, myelecenphalon, diencephalon and in the neural tube. Expression of neurocan was strong in the retina, lens and intense in the cornea in the eye, intense in the myocardium and lower in endocardium in the heart. In a set of functional studies using monoclonal antibodies directed against neurocan, the inhibition of neurocan function resulted in neural plate duplications, the neurepithelial cells exhibited mesenchymal characteristics and the somite, heart and gut formation were inhibited. The observed neural plate duplications point to an important role of neurocan to modulate the activity and availability of growth factor(s) during the induction of neurectoderm. Phosphacan mRNA was first detectable at the morula stage (XI) and it continued to be expressed during development. At the blastula stage (XIII)phosphacan immunofluorescence was strong in the epiblast and hypoblast. At the gastrula stage (HH3-ΗΗ4), immunofluorescence was strong in the cells around and also ingressing through the streak and in mesenchymal cells. At stage HH8 (4 somites), immunofluorescence was intense in the elevated neural plate, especially in its dorsal surface. This implies a role for phosphacan in the fusion of neural folds medially during the formation of the neural tube. At stage HH11 (13 somites), phosphacan immunofluorescence was strong in the neural tube, somites, gut lower wall and in the myocardium, endocardium and dorsal mesocardium in the heart and intense in the blood islands. By stage HH17 (29 somites), phosphacan immunofluorescence was strong in the myelencephalon and diencephalon, in the lens and retina in the eye, the neural crest cells, the myotome but not the dermatome and sclerotome in somites, the myocardium and endocardium in the heart and the dorsal aorta. Inhibition of function of phosphacan by blocking antibodies showed that phosphacan participates in the fusion of neural folds to form the neural tube, in the opticoele determination to form the retina and in somite, heart and gut morphogenesis.

Δύο από τα σημαντικότερα δομικά και λειτουργικά βιομόρια του εξωκυττάριου χώρου είναι το κολλαγόνο και οι γλυκοζαμινογλυκάνες (GAGs), ανιοντικοί πολυσακχαρίτες που αποτελούν το βασικό δομικό συστατικό των πρωτεογλυκανών. Οι κύριοι τύποι γλυκοζαμινογλυκανών είναι η θειική χονδροϊτίνη, η θειική δερματάνη, η ηπαρίνη, η θειική ηπαράνη, η θειική κερατάνη και το υαλουρονικό οξύ. Το κολλαγόνο τύπου Ι είναι η πιο άφθονη πρωτεΐνη στους ιστούς των θηλαστικών. Το κολλαγόνο τύπου ΙΙ αποτελεί το κύριο συστατικό του εξωκυττάριου χώρου του αρθρικού χόνδρου και άλλων ιστών. Τα παραπάνω μακρομόρια είναι υπεύθυνα για τη ρύθμιση διαφόρων διεργασιών των κυττάρων τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε παθολογικές καταστάσεις, όπως παθήσεις των αρθρώσεων και νεοπλασματικές ασθένειες. Αντικείμενο της παρούσας εργασίας αποτέλεσε η ανάπτυξη μιας μεθοδολογίας για τον προσδιορισμό των αλληλεπιδράσεων μεταξύ γλυκοζαμινογλυκανών και των δύο τύπων κολλαγόνου, η οποία θα συνεισφέρει στη βαθύτερη κατανόηση της βιολογικής τους λειτουργίας. Μερικές από τις τεχνικές που έχουν χρησιμοποιηθεί για το συγκεκριμένο σκοπό είναι η χρωματογραφία συγγένειας, η ηλεκτροφόρηση και η φασματοσκοπία φθορισμού. Η φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR), η περίθλαση ακτίνων-Χ και ο κυκλικός διχρωισμός (Circular Dichroism, CD) προσφέρουν δομικές πληροφορίες για τις αλλαγές στη διαμόρφωση και τα σημεία πρόσδεσης μεταξύ γλυκοζαμινογλυκανών και πρωτεϊνών. Θερμοδυναμικές πληροφορίες για τις αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών-γλυκοζαμινογλυκανών αντλούνται από τη θερμιδομετρία ισόθερμης τιτλοδότησης (Isothermal Titration Calorimetry, ITC), ενώ με την τεχνική της διέγερσης επιφανειακών πλασμονίων (Surface Plasmon Resonance, SPR) μελετώνται η σταθερά σύνδεσης και η σταθερά διάστασης της αλληλεπίδρασης σε πραγματικό χρόνο. Το κυριότερο μειονέκτημα των παραπάνω τεχνικών είναι το ότι δεν προσφέρουν πληροφορίες για χημικούς δεσμούς, ενώ ο χρόνος ανάλυσης είναι μεγάλος και απαιτούνται μεγάλες ποσότητες δειγμάτων. Η τεχνική που χρησιμοποιήθηκε ήταν εκείνη της φασματοσκοπίας micro-Raman, μια μη καταστρεπτική τεχνική, η οποία προσφέρει πληροφορίες για τη χημική δομή του εξεταζόμενου δείγματος, ενώ παράλληλα είναι γρήγορη και ακριβής. Παρασκευάστηκαν δύο είδη μιγμάτων γλυκοζαμινογλυκανών με κολλαγόνο. Στην πρώτη περίπτωση, κολλαγόνο τύπου Ι ή τύπου ΙΙ εμβαπτίστηκε σε διάλυμα θειικής χονδροϊτίνης, ηπαρίνης ή μίγμα τους που παρασκευάστηκε με αναλογία όγκων 1:1. Στη δεύτερη περίπτωση, μίγματα των δύο ουσιών προέκυψαν με ανάμιξη ίσων ποσοτήτων των δύο ουσιών. Τα παραπάνω μίγματα μελετήθηκαν με φασματοσκοπία Raman και με την τεχνική της Διαφορικής Θερμιδομετρίας Σάρωσης (Differential Scanning Calorimetry, DSC) και συγκρίθηκαν με τα φάσματα των προτύπων ουσιών. Κάθε ουσία έχει ένα χαρακτηριστικό φάσμα Raman, η ερμηνεία του οποίου οδήγησε στην ταυτοποίηση χαρακτηριστικών ομάδων των μορίων, όπως οι δεσμοί C-OH, οι θειικές ομάδες (O-SO3-, N-SO3-), η Ν-ακετυλομάδα, οι δεσμοί C=O και οι δεσμοί C-Ν. Οι φασματικές περιοχές που παρουσιάζουν τα πιο έντονα χαρακτηριστικά στα φάσματα Raman των μιγμάτων GAG-κολλαγόνου είναι οι εξής: 800-920 cm-1, 900-1000 cm-1 και 980-1170 cm-1. Όσον αφορά στην τελευταία φασματική περιοχή, παρατηρήθηκε σημαντική μετατόπιση της χαρακτηριστικής κορυφής της δόνησης έκτασης των θειομάδων προς χαμηλότερους κυματάριθμους (από τους 1070 cm-1 περίπου στους 1062-1064 cm-1) και η εμφάνιση μιας κορυφής στους 1072 cm-1, σε σχέση με τα αντίστοιχα φάσματα των προτύπων ουσιών, στα φάσματα όλων των μιγμάτων που μελετήθηκαν. Η μετατόπιση της συγκεκριμένης κορυφής αποτελεί ένδειξη αλληλεπίδρασης μεταξύ των δύο ουσιών και καταδεικνύει το σημαντικό ρόλο των θειομάδων των γλυκοζαμινογλυκανών στις αλληλεπιδράσεις τους με τη συγκεκριμένη πρωτεΐνη. Τα αποτελέσματα της φασματοσκοπίας Raman βρίσκονται σε συμφωνία με εκείνα που προκύπτουν από την τεχνική της Διαφορικής Θερμιδομετρίας Σάρωσης (DSC), καθώς τα θερμογραφήματα DSC των μιγμάτων θειικής χονδροϊτίνης-κολλαγόνου τύπου Ι είναι διαφορετικά από εκείνο του μίγματος που προέκυψε από την ανάμιξη των δύο συστατικών, υποδεικνύοντας την ύπαρξη αλληλεπίδρασης μεταξύ των δύο ουσιών. Με την τεχνική της φασματοσκοπίας Raman διαπιστώθηκε ότι το κολλαγόνο τύπου Ι έδειξε μεγαλύτερη «χημική προτίμηση» προς την ηπαρίνη σε σχέση με τη θειική χονδροϊτίνη, ενώ το κολλαγόνο τύπου ΙΙ προτίμησε να αλληλεπιδράσει με τη θειική χονδροϊτίνη. / Collagen and glycosaminoglycans (GAGs) co-exist as major constituents of the extracellular matrix (ECM) in a variety of tissues. Collagen type I is the most abundant protein in the human body, whereas another important type of collagen is type II, which forms the extracellular matrix of cartilage and other tissues. Glycosaminoglycans are negatively charged polysaccharides that occur as a structural component of proteoglycans and can be divided in four major groups: i) chondroitin sulfate and dermatan sulfate, ii) heparin and heparin sulfate, iii) keratan sulfate, and iv) hyaluronic acid. Both GAGs and collagen not only regulate a variety of cellular functions but they also seem to be involved in many pathological conditions, including cancer and joint diseases. Therefore, a more detailed investigation of the interactions between them will result in a deeper understanding of their biological function. Most common methods for identifying GAG-collagen interactions include affinity chromatography, affinity electrophoresis and fluorescence spectroscopy. Nuclear Magnetic Resonance (NMR), X-ray diffraction and Circular Dichroism (CD) provide structural data characterizing conformational changes and contact points between the interacting species. Using Isothermal Titration Calorimetry (ITC), information on the thermodynamics of glycosaminoglycan-protein interactions can be obtained. Surface Plasmon Resonance (SPR) allows the measurement of association and dissociation constants of glycosaminoglycan-protein interactions in real time. The major disadvantage of the techniques described above is the inability to identify specific chemical bonds. Other disadvantages are the long analysis time and that large amounts of the interacting substances are required. In the present work, Raman spectroscopy, a non-destructive, vibrational technique which yields information on the chemical composition of the specimen, was employed for the exploration of the interactions between collagen type I and type II and two glycosaminoglycans, chondroitin sulfate and heparin. Two sets of mixtures composed of glycosaminoglycans and each type of collagen were prepared: i) collagen type I or type II was immersed in aqueous solutions of chondroitin sulfate, heparin and a 1:1 mixture of both GAGs, and ii) GAG-collagen mixtures were obtained by blending suitable amounts of the two substances. Differential Scanning Calorimetry (DSC) was also applied on the latter mixtures. From the Raman spectra identification of vibrational frequencies of the functional groups of the above molecules, such as C-OH linkages, sulfate groups (O-SO3-, N-SO3-), N-acetyl group, carboxyl group and C-Ν linkages is possible. The prominent features arising from the Raman spectra of GAG-collagen interactions are found in the regions 800-920 cm-1, 900-1000 cm-1 and 980-1170 cm-1. Processing of the spectra of all GAG-collagen mixtures has revealed that a shift of the most characteristic vibration of chondroitin sulfate’s and heparin’s spectrum from 1070 cm-1 to 1062-1064 cm-1, while a vibration at approximately 1072 cm-1 emerges. The sulfate band shift is indicative of an interaction between collagen and glycosaminoglycans and depicts the important role of the sulfate group of glycosaminoglycans in the interactions with the protein. This observation was in accordance with the results from Differential Scanning Calorimetry (DSC), which demonstrated an interaction between collagen and chondroitin sulfate. A stronger preference of collagen type I to interact with heparin rather than chondroitin sulfate and of collagen type II to interact with chondroitin sulfate was also observed.