Η αδειοδότηση εξασφαλίζει τη χωροχρονική ρύθμιση της αντιγραφής του γενετικού υλικού. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, η πρωτεΐνη Cdt1 καθορίζει πότε θα λάβει χώρα η αδειοδότηση και η έκφρασή της είναι αυστηρώς ρυθμισμένη, διαμέσου πολλαπλών μονοπατιών. Διατάραξη της ισορροπίας της ρύθμισης της αντιγραφής οδηγεί σε γονιδιωματική αστάθεια, ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό ή σε κυτταρικό θάνατο. Γονιδιωματική αστάθεια σε ένα οργανισμό επίσης προκαλείται από βλάβες στο γενετικό υλικό, είτε εξαιτίας περιβαλλοντικών παραγόντων, είτε εξαιτίας τυχαίων αλλαγών που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια του μεταβολισμού του. Για την αντιμετώπιση των βλαβών έχουν εξελικτικά προκύψει επιδιορθωτικοί μηχανισμοί εξειδικευμένοι στην αντιμετώπιση κάθε τύπου βλάβης. Ο παράγοντας Cdt1 φαίνεται να διασυνδέει τα μονοπάτια της αδειοδότησης της αντιγραφής με αυτά της απόκρισης σε βλάβη στο DNA, γεγονός που τον καθιστά ενδιαφέροντα για περαιτέρω μελέτη. Στο πρώτο μέρος της μελέτης θα γίνει χαρακτηρισμός μια μεθόδου που προκαλεί ολική ή εντοπισμένη βλάβη στο γενετικό υλικό κυττάρων με χρήση υπεριώδους ακτινοβολίας. Με τη τεχνική αυτή θα μελετηθεί σε καρκινικές σειρές η πρωτεΐνη Cdt1 και η ταχύτητα πρωτεόλυσής της.Σε μικροσκόπιο φθορισμού θα μελετηθεί ο εντοπισμός και σε συνεστιακό μικροσκόπιο η κινητική της πρωτεΐνης αυτής, καθώς και η μεταλλαγμένη μορφή Cdt1 (Cdt1+4A), η οποία δεν αλληλεπιδρά με το πρωτεολυτικό μηχανισμό Cul4-DDB1Cdt2,. Η μελέτη της κινητικής γίνεται σε ζωντανά κύτταρα καρκινικών σειρών με σκοπό την κατανόηση της ιεράρχησης των γεγονότων που συμβαίνουν σε περιοχές στοχευμένης βλάβης από υπεριώδη ακτινοβολία στο γενετικό υλικό. Με την τεχνική επαναφοράς φθορισμού μετά από φωτολεύκανση (Fluoresent Recovery After Photobleaching) θα παρακολουθηθεί η επαναφορά του σήματος με σκοπό την ποσοτικοποίηση της δεσμευμένης πρωτεΐνης. Στο δεύτερο μέρος της μελέτης θα αναπτυχθούν μέθοδοι κανονικοποίησης και ανάλυσης 6 πειραματικών δεδομένων λειτουργικής μικροσκοπίας με εργαλεία το οποία αναπτύχθηκαν ειδικά για την ανάλυση πειραμάτων FRAP (easyFRAP). Επίσης αναλύεται η δημιουργία κατάλληλου λογισμικού και η βελτιστοποίηση τεχνικών παρατήρησης της επαναφοράς του φθορισμού μετά από μεγάλα χρονικά διαστήματα, της τάξεως των ωρών έναντι της κλασικής μεθόδου όπου η παρατήρηση διαρκεί κάποια δευτερόλεπτα. Τέλος ακολουθεί σύγκριση της εφαρμογής easyFRAP με την εφαρμογή FRAPcalc, η οποία χρησιμοποιείται επίσης για την κανονικοποίηση και οπτικοποίηση δεδομένων FRAP. / The process of licensing of DNA replication ensures that the cell cycle proceeds to timely regulated replication. In metazoa, Cdt1 is the factor that ensures the regulation of licensing. Cdt1 is tightly regulated through various biological pathways and it is functionally conserved through evolution. If the regulation of Cdt1 is disturbed, genomic instability, uncontrolled replication and apoptosis may occur. Genomic instability may also occur in an organism after DNA damage, either due to environmental factors, or due to random mutations. Evolution has provided cells with various DNA damage response mechanisms for all kinds of damages. The cell cycle regulatory protein Cdt1 has been postulated to link the cell cycle and the DNA damage responses, therefore Cdt1 is a very interesting protein for further studying. At the first part of our study we introduced a method for total or localized DNA damage in live cells with the use of ultraviolet radiation. With this technique we showed that on different cancer cell lines the protein Cdt1, accumulate fast in the sites of damage. With a fluorescent microscope we studied the localization and with a confocal microscope we investigated the kinetics of wild type Cdt1 linked with a green fluorescent protein tag, along with the study of a Cdt1 mutant (Cdt1+4A) again linked with a green fluorescent protein tag. Cdt1+4A has lost the ability to associate with the proteolytic mechanism of Cul4-Ddb1Cdt2. In live cells, in order to investigate the spatiotemporal regulation of DNA damage response we used Fluorescent Recovery after Photobleaching (FRAP) technique and we studied the protein kinetics and we quantified the percentage of the bound protein on the chromatin. At the second part of our study, we present the normalization method we used for our raw experimental data. For the purpose of this analysis, tools and softwares were developed for accurate normalization. We also aimed to optimize a technique for the observation of fluorescent recovery after photobleaching during long periods of time, in contrast with the typical short FRAP experiments. Finally, we describe a brief comparison between the FRAP analysis tool we developed(easyFRAP) and another software commercially available (FRAPcalc) for that purpose.

Η παρούσα εργασία είχε ως αντικείμενο, αρχικά, τη δημιουργία υβριδικών μορφών της πρωτεΐνης Geminin- ενός αρνητικού ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου- με το φθορίζον μόριο GFP (Green Fluorescent Protein). Πραγματοποιήθηκε τόσο αμινοτελική όσο και καρβοξυτελική σύντηξη της Geminin με το μόριο-ιχνηθέτη, έτσι ώστε να μελετηθεί η συμπεριφορά του νέου, υβριδικού μορίου και στις δύο περιπτώσεις και να εξεταστεί εάν ο προσανατολισμός της GFP πρωτεΐνης δύναται να μεταβάλλει το χαρακτήρα της σημασμένης πρωτεΐνης. Ακολούθησε ανίχνευση και παρακολούθηση καθενός υβριδικού μορίου σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα μετά από διαμόλυνση για μικρό (παροδική διαμόλυνση διάρκειας 22 ωρών) ή μεγαλύτερο χρονικό διάστημα (σταθερά διαμολυσμένες κυτταρικές σειρές). Ο χαρακτηρισμός των φθοριζουσών μορφών της Geminin περιελάμβανε μελέτη τόσο του υποκυτταρικού εντοπισμού όσο και της χρονικής έκφρασης των μορίων και σύγκριση με τα αντίστοιχα χαρακτηριστικά του ενδογενούς μορίου. Ανάλυση του ενδοκυτταρικού εντοπισμού τόσο της καρβοξυτελικής όσο και της αμινοτελικής σύντηξης της Geminin με τη GFP, αποκάλυψε, εκτός του πυρηνικού φαινοτύπου, που παρατηρείται φυσιολογικά για το ενδογενές μόριο, σημαντικό ποσοστό παροδικά διαμολυσμένων κυττάρων με τα υβριδικά μόρια εκτός του πυρηνικού διαμερίσματος. Ο φαινότυπος αυτός εμφανίζεται – σε μικρότερο ποσοστό- ακόμη και στην περίπτωση σταθερά διαμολυσμένων κυττάρων, όπου τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin-GFP είναι παρόμοια με τα αντίστοιχα του ενδογενούς μορίου. Στη σειρά αυτή, το μεγαλύτερο ποσοστό κυττάρων, παρά την ισχυρή μεταγραφική δραστηριότητα που προσδίδει ο CMV υποκινητής, εκφράζει το εξωγενές μόριο σύμφωνα με το πρότυπο που παρουσιάζει η ενδογενής Geminin, δηλαδή κατά τις φάσεις S και G1. Επομένως, η ρύθμιση της Geminin-GFP υβριδικής πρωτεΐνης πραγματοποιείται σε μεγάλο βαθμό σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η αλλαγή στην ενδοκυτταρική κατανομή του υβριδικού μορίου δεν παρουσιάζει τυχαία χρονική εμφάνιση. Το γεγονός ότι εμφανίζεται αποκλειστικά σε αρνητικά για κυκλίνη Α κύτταρα, φανερώνει την ύπαρξη συσχέτισης με τη φάση του κυτταρικού κύκλου και μάλιστα υποδηλώνει την επιλεκτική έξοδό της από τον πυρήνα κατά τη φάση G1. Πιθανόν, η έξοδος της Geminin από τον πυρήνα κατά τη φάση αυτή, να διασφαλίζει τη διεκπεραίωση της διαδικασίας της αδειοδότησης του γενετικού υλικού –αναστολέας της oποίας είναι η Geminin και κατ’ επέκταση την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου Το φαινόμενο αυτό χρήζει περαιτέρω διερεύνησης μιας και η αλλαγή στην ενδοκυτταρική κατανομή πολλών ρυθμιστικών μορίων αποτελεί έναν αποδοτικό τρόπο ελέγχου της γονιδιακής έκφρασης στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, ενώ παράλληλα φαίνεται να επηρεάζει πολλές ζωτικής σημασίας λειτουργίες. / The aim of the present study was the construction of fused forms of Geminin- a negative cell cycle regulator-with GFP (Green Fluorescent Protein). Amino- and carboxy terminal fusions of Geminin and GFP were performed, in order to study the behaviour of the hybrid molecule in both cases and to examine if the orientation of the reporter gene can interfere with the character of the new molecule. Each fused molecule was either transiently or stably transfected in human cancer cells and its behaviour was studied. The characterization of the fluorescent molecules of Geminin was performed at the level of subcellular localization and regulation throughout the cell cycle and was compared to the endogenous characteristics. Analysis of the subcellular distribution of both fused forms, revealed -apart from the nuclear phenotype, normally observed- a significant percentage of transiently transfected cells, where the hybrid molecules were excluded from the nucleus. This phenotype was observed- though less strongly- in the case of stably transfected cells, where the expression levels of Geminin-GFP protein are similar to the endogenous molecule. The majority of these cells, despite the strong CMV driven transcriptional activity, express Geminin-GFP during S and G1 phase, like the endogenous protein, suggesting that the regulation of Geminin-GFP is performed mainly at post-transcriptional level. This nuclear exclusion was observed according to a cell cycle- dependent manner. The phenomenon of nucleocytoplasmic shuttling of many proteins seems to be a very efficient way of controlling gene expression in eukaryotes. In order to elucidate the role of sucellular distribution of Geminin-GFP in cell cycle regulation, further examination of this phenomenon is needed.

Η χρονική και χωρική ρύθμιση της έναρξης της αντιγραφής του DNA συντονίζεται από τη διαδικασία της «αδειοδότησης της αντιγραφής», η οποία εξασφαλίζει ότι η αντιγραφή θα λάβει χώρα μόνο μία φορά ανά κυτταρικό κύκλο. Η αδειοδότηση της αντιγραφής περιλαμβάνει την κατά βήμα συγκρότηση ενός συμπλόκου πρωτεϊνών, του προαντιγραφικού συμπλόκου, στις περιοχές έναρξης της αντιγραφής. Μείζον συστατικό του συμπλόκου αυτού είναι η πρωτεΐνη Cdt1, η οποία επίσης αποτελεί πρωτεολυτικό στόχο των σημείων ελέγχου κυττάρων που φέρουν βλάβες στο DNA. Στα μετάζωα, υπάρχει μια μικρή πρωτεΐνη καλούμενη Geminin, η οποία προσδένεται στην πρωτεΐνη Cdt1, αναστέλλοντας την αδειοδότηση της αντιγραφής. Η πρωτεΐνη Geminin αλληλεπιδρά με ομοιοτικούς μεταγραφικούς παράγοντες και πρωτεΐνες που αναδιαμορφώνουν τη χρωματίνη και πιστεύεται ότι αποτελεί πιθανό κρίκο που συνδέει τις διαδικασίες του κυτταρικού κύκλου και της διαφοροποίησης. Στην παρούσα μελέτη δείξαμε πως η πρωτεΐνη Geminin κατατμείται σε πρωτογενή κύτταρα και καρκινικές κυτταρικές σειρές που οδηγούνται προς απόπτωση. Η κατάτμηση της πρωτεΐνης Geminin διαμεσολαβείται από την κασπάση- 3 τόσο in vivo όσο και in vitro. Δύο περιοχές στο καρβοξυτελικό τμήμα της Geminin (Κ1 και Κ2), στοχεύονται κατά την απόπτωση προκαλώντας τη δημιουργία θρυσμάτων της πρωτεΐνης Geminin. Δείξαμε ότι η κατάτμηση της πρωτεΐνης Geminin στη θέση Κ1 προάγει τον αποπτωτικό φαινότυπο και ρυθμίζεται μέσω φωσφορυλίωσης από την κινάση Casein Kinase II. Αντίθετα, μετά από κατάτμηση στη θέση Κ2, η πρωτεΐνη Geminin χάνει την ικανότητα αλληλεπίδρασης με την πρωτεΐνη Brm, καταλυτική υπομονάδα του συμπλόκου αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης SWI/SNF, ενώ διατηρεί την ικανότητα να προσδένεται στην πρωτεΐνη Cdt1, υποδεικνύοντας πως η στόχευση της πρωτεΐνης Geminin κατά την απόπτωση, επηρεάζει διαφορικά τη λειτουργία του μορίου. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας διερευνήσαμε τη ρύθμιση της πρωτεΐνης Cdt1 στο χώρο και στο χρόνο σε κύτταρα με βλάβες στο DNA. Για το σκοπό αυτό, χαρακτηρίσαμε μια μέθοδο που προκαλεί εντοπισμένες βλάβες στο DNA των κυττάρων, βασιζόμενη στη χρήση ενός παλμικού UVA laser. Με τη χρήση της μεθόδου αυτής, δείξαμε ότι η πρωτεΐνη Cdt1 συσσωρεύεται στην περιοχή της βλάβης τόσο σε καρκινικά όσο και πρωτογενή κύτταρα, παράλληλα με πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην κυτταρική απόκριση στη βλάβη (γH2AX, BRCA1, MRE11, Ku70, pATM κ.ά.). Η συσσώρευση της πρωτεΐνης Cdt1 λαμβάνει χώρα ταχύτατα και προηγείται της αποικοδόμησής της. Με τη δημιουργία μεταλλαγμένων μορφών της πρωτεΐνης Cdt1 και την καταστολή της έκφρασης πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με την πρωτεΐνη Cdt1 με τη χρήση siRNA, δείξαμε πως η στρατολόγηση της πρωτεΐνης Cdt1 στην περιοχή της βλάβης απαιτεί αλληλεπίδραση με την πρωτεΐνη PCNA. Βρέθηκε πως η πρωτεΐνη Cdt2, που αποτελεί μέλος του συμπλόκου της λιγάσης της ουβικουϊτίνης Cul4-DDB1Cdt2 επίσης στρατολογείται στην περιοχή της βλάβης. Ποσοτικοποίηση της κινητικής συσσώρευσης πρωτεϊνών στην περιοχή της βλάβης έδειξε ότι η συσσώρευση της πρωτεΐνης Cdt1 υφίσταται κορεσμό νωρίτερα από τις πρωτεΐνες PCNA και Cdt2, ενώ αποσιώπηση της πρωτεΐνης Cdt1 δεν επηρεάζει τη στρατολόγηση των πρωτεϊνών PCNA και Cdt2. Πειράματα προσδιορισμού κινητικών αλληλεπιδράσεων με τη μέθοδο FRAP, έδειξαν ότι η πρωτεΐνη PCNA παραμένει σταθερά προσδεδεμένη στην περιοχή της βλάβης, ενώ η πρωτεΐνη Cdt1 εμφανίζει ιδιαίτερα γρήγορη κινητική. Οι μελέτες αυτές οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η πρόκληση εντοπισμένης βλάβης στο DNA οδηγεί σε εντοπισμένη κυτταρική απόκριση και στη στρατολόγηση της πρωτεΐνης PCNA στην περιοχή της βλάβης η οποία δρά ως ικρίωμα για τη δυναμική αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης Cdt1. Συμπερασματικά, στο πρώτο μέρος της διδακτορική διατριβής περιγράφεται για πρώτη φορά ότι η πρωτεϊνη Geminin στοχεύεται για κατάτμηση κατά την απόπτωση, διαλευκάνονται τα μοριακά μονοπάτια που ρυθμίζουν το φαινόμενο αυτό και διερευνάται η φυσιολογική του σημασία. Προτείνεται ότι η στόχευση της Geminin από την κασπάση 3 επηρεάζει τη φυσιολογική ισορροπία μεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης. Στο δεύτερο μέρος της διδακτορικής διατριβής δείχνεται ότι η πρωτεϊνη Cdt1 στρατολογείται σε περιοχές της χρωματίνης που φέρους βλάβες στο DNA. Η στρατολόγηση της πρωτεΐνης Cdt1 στην περιοχή της βλάβης, παράλληλα με πρωτεϊνες απόκρισης στη βλάβη όπως οι BRCA1, pATM και Ku70, οδηγεί σε μία νέα υπόθεση για πιθανή εμπλοκή της πρωτεϊνης Cdt1 στην κυτταρική απόκριση σε βλάβες στο DNA. / The timely initiation of DNA replication is achieved through a process called licensing, which ensures that only after passage through mitosis the chromatin becomes competent for a new round of DNA replication. Licensing involves the stepwise formation of a multiprotein complex at the origins of replication, called prereplicative complex. A major component of this complex is Cdt1, which is also a critical and evolutionarily conserved proteolytic target of the DNA damage checkpoint. In metazoans, a small protein called Geminin binds to Cdt1, inhibiting replication licensing. Geminin has been proposed to coordinate cell cycle and differentiation events through balanced interactions with the cell cycle regulator Cdt1 and with homeobox transcription factors and chromatin remodeling activities implicated in cell fate decisions. Here we show that Geminin is cleaved in primary cells and cancer cell lines induced to undergo apoptosis by a variety of stimuli. Geminin targeting is mediated by caspase-3 both in vivo and in vitro. Two sites at the carboxyl terminus of Geminin are cleaved by the caspase (termed K1 and K2), producing truncated forms of Geminin. We provide evidence that Geminin cleavage is regulated by phosphorylation by Casein kinase II. Geminin cleaved at site K1 has a proapoptotic effect. Geminin cleaved at the site K2 has lost the ability to interact with Brahma (Brm), a catalytic subunit of the SWI/SNF chromatin remodeling complex, while binding efficiently to Cdt1, indicating that targeting of Geminin during apoptosis differentially affects interactions with its binding partners. In the second part of this thesis, we investigated the spatiotemporal regulation of Cdt1 in DNA-damaged cells. We introduced and characterized a method of inducing localized DNA damage, based on a UVA-pulsed laser. Using this method, we show that Cdt1 is recruited at the site of damage in parallel to the recruitment of known response factors, such as γH2AX, BRCA1, MRE11, Ku70 etc. Cdt1 recruitment at the site of damage precedes its degradation in both cancer cell lines and primary cells. Mutated forms of Cdt1 and siRNA for Cdt1-interacting proteins show that Cdt1 accumulation at the site of damage requires interactions with the protein PCNA. In addition, we found that Cdt2, a member of the Cul4-DDB1Cdt2 complex that ubiquitinates Cdt1 after DNA damage, is recruited at the site of damage. Experiments of knocking down the protein expression using siRNA and quantification of the recruitment kinetics address the molecular interplay of these proteins for the recruitment at the site of damage, while FRAP experiments revealed their dynamics. Taken together our results suggest that following DNA damage, PCNA is recruited to the site of damage, and acts as a scaffold for the dynamic interaction of Cdt1 with the damaged sites. The accumulation of Cdt1 at the site of damage suggest a possible involvement this cell cycle regulator in the DNA damage response.

Η αδειοδότηση της αντιγραφή του DNA συνίσταται στη συγκρότηση προαντιγραφικών συμπλόκων στη χρωματίνη, στα οποία μετέχουν οι πρωτεΐνες ORC, Cdt1, Cdc6 και MCM2-7. Η πρωτεΐνη Cdt1 αποικοδομείται μετά από βλάβη στο DNA και ενδέχεται να συνδέει το σύστημα αδειοδότησης και το σύστημα απόκρισης σε βλάβη στο DNA. Στη διδακτορική αυτή διατριβή μελετήθηκε η αλληλεπίδραση των συστημάτων αδειοδότησης και απόκρισης σε βλάβη στο DNA με μεθόδους λειτουργικής μικροσκοπίας σε ανθρώπινα κύτταρα, εστιάζοντας στους παράγοντες αδειοδότησης Cdt1 και MCM4. Ο παράγοντας Cdt1 μελετήθηκε μετά από καθολική και εντοπισμένη έκθεση ανθρώπινων κυττάρων σε υπεριώδη ακτινοβολία (UV). Δείχθηκε ότι ακτινοβόληση με UV οδηγεί στην αποικοδόμηση του παράγοντα Cdt1 σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Ο χρόνος αποικοδόμησης της πρωτεΐνης Cdt1 όμως διαφοροποιείται σημαντικά ανάλογα με τον κυτταρικό τύπο και συγκεκριμένα παρουσιάζει καθυστέρηση στην κυτταρική σειρά καρκινώματος μαστού MCF7 σε σχέση με άλλες καρκινικές σειρές (HeLa, U2OS) και φυσιολογικούς ανθρώπινους ινοβλάστες. Μελέτη της πρωτεΐνης Cdt1 στο χώρο μετά από εντοπισμένη ακτινοβόληση μιας μικρής υποπεριοχής του πυρήνα έδειξε ότι η πρωτεΐνη Cdt1 συσσωρεύεται στην περιοχή της βλάβης από υπεριώδη ακτινοβολία πριν από την αποικοδόμηση της. Παράλληλα, παρατηρήθηκε συσσώρευση στην περιοχή της βλάβης από UV των πρωτεϊνών PCNA, Cdt2 (συστατικό του Cul4-DDB1Cdt2 συστήματος ουβικουιτίνωσης, που είναι υπεύθυνο για την αποικοδόμηση του παράγοντα Cdt1), καθώς και της πρωτεΐνης p21 που στοχεύεται από το ίδιο σύστημα. Πειράματα επαναφοράς φθορισμού σε ζωντανά κύτταρα (Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP) έδειξαν ότι στις περιοχές εντοπισμένης ακτινοβόλησης με UV οι πρωτεΐνες Cdt1, Cdt2, PCNA και p21 εμφανίζουν τροποποιημένη κινητική συμπεριφορά. Πειράματα αποσιώπησης της έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 ανέδειξαν έναν ανασταλτικό ρόλο για το Cdt1 στο μονοπάτι επιδιόρθωσης διπλών θραύσεων με ομόλογο ανασυνδυασμό κατά τη διάρκεια της G1 φάσης. Στο δεύτερο μέρος αυτής της εργασίας, εισάγαμε μια νέα in vivo μέθοδο μελέτης της αδειοδότησης που στηρίζεται στην εφαρμογή της FRAP τεχνικής σε MCF7 κύτταρα σταθερά διαμολυσμένα με την πρωτεΐνη MCM4 σημασμένη με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη GFP (GFP-MCM4). Η μέθοδος αυτή επιτρέπει τη μελέτη της κινητικής συμπεριφοράς της πρωτεΐνης MCM4 σε ζωντανά κύτταρα και σε πραγματικό χρόνο. Δείχθηκε ότι το σύστημα αναπαράγει τη λειτουργία της ενδογενούς MCM4 πρωτεΐνης και μπορεί να διακρίνει επιτυχώς μεταξύ αδειοδοτημένης και μη κατάστασης. Ακολούθως, το σύστημα χρησιμοποιήθηκε για να μελετηθεί η επίδραση της υπεριώδους ακτινοβολίας στην αδειοδότηση της χρωματίνης για αντιγραφή. Διαπιστώθηκε ότι επίδραση με υπεριώδη ακτινοβολία οδηγεί σε μείωση του κλάσματος της MCM4 που είναι προσδεδεμένο στη χρωματίνη. Περαιτέρω μέλετη έδειξε ότι η μείωση αυτή παρουσιάζεται στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου και περιορίζεται στην περιοχή της βλάβης, δείχνοντας ότι αποτελεί εντοπισμένη απόκριση του κυττάρου στην ύπαρξη βλάβης. Συμπερασματικά, η συγκεκριμένη διδακτορική διατριβή ανέδειξε την αλληλεπίδραση των συστημάτων αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA και της κυτταρικής απόκρισης σε βλάβη στο DNA και εισήγαγε μια νέα μέθοδο μελέτης της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA. Μελετήθηκαν οι παράγοντες του συστήματος αδειοδότησης Cdt1 και MCM4, οι οποίοι αποκρίνονται στη βλάβη στο DNA, με το Cdt1 να παίζει ρόλο στην επιλογή επιδιορθωτικού μηχανισμού μετά από πρόκληση βλάβης διπλών θραύσεων του DNA και την πρωτεΐνη MCM4 να εμφανίζει μειωμένη πρόσδεση στη χρωματίνη στην περιοχή της βλάβης μετά από ακτινοβόληση με UV. / Licensing DNA for replication involves the formation of pre-replicative complexes on chromatin, consisting of the proteins ORC, Cdt1, Cdc6 and MCM2-7. Cdt1 is degraded following DNA damage and this suggests a regulatory crosstalk between DNA licensing and DNA damage response (DDR) systems. Here the molecular interplay between these two systems was studied in human cell cultures. The kinetics of Cdt1 degradation in response to UV irradiation was shown to differ in different human cell lines, exhibiting a delay in MCF7 cells in comparison to HeLa, U2OS and human fibroblasts, which implies a difference in the DDR sensitivity of these cells. By studying the spatial regulation of Cdt1 in response to localized DNA damage, the accumulation of Cdt1 in UV irradiated sites prior to its degradation was recorded. Proteins participating in the degradation of Cdt1 through ubiquitin dependent proteolysis (PCNA and Cdt2), as well as protein p21 which is targeted by the same ubiquitin ligase following DNA damage, were also shown to accumulate at UV irradiated sites. Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) experiments showed that Cdt1, Cdt2, PCNA and p21 exhibit altered kinetics at UV irradiated sites. Silencing of Cdt1 expression revealed an inhibitory role of Cdt1 in the repair of double strand breaks through homologous recombination during the G1 phase of the cell cycle. In the second part of this thesis, we introduced an in vivo licensing assay based on FRAP in MCF7 cells stably expressing MCM4 tagged with the Green Fluorescent Protein (GFP). This assay allows the study of the kinetic behaviour of MCM4 in live cells and in real time. A plasmid expressing GFP-MCM4 was constructed and MCF7 cells stably expressing this plasmid were produced. The GFP-MCM4 cell line was further characterized to ensure a correct cell cycle profile, GFP-MCM4 levels, subcellular localization, interactions with other MCM proteins and binding to chromatin. FRAP experiments on the stable GFP-MCM4 cells verified that the assay could successfully distinguish between licensed and unlicensed state. Using this assay, the effect of UV irradiation on MCM4 kinetics was studied. UV irradiation led to a decrease in the fraction of MCM4 binding to chromatin. This effect was more profound in middle G1 phase and was restricted to the site of UV irradiation. In conclusion, this thesis addressed the interaction of DNA licensing and DNA damage response systems and introduced an in vivo DNA licensing assay. Licensing proteins Cdt1 and MCM4 were shown to respond to DNA damage, with Cdt1 affecting the double strand break repair choice pathway and MCM4 exhibiting reduced chromatin binding following UV irradiation.