Hokkaido University (北海道大学) / 博士 / 医学

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Seizures have important consequences in terms of mortality and quality of life of the affected population, being a risk factor for the development of cognitive and behavioral abnormalities. Considering the promising pharmacological properties of molecules containing selenium, in article 1, we evaluated the anticonvulsant action of 1-(2,5-diphenylselenophen-3-yl)-3-methylpent-1-yn-3-ol, generically called 3-alkynyl selenophene (3-ASP) against seizures induced by pilocarpine (PC), pentylenetetrazole (PTZ) and kainate (KA) in 21-days-old rats. Animals were pre-treated with 3-ASP (10, 25 or 50 mg/kg; per oral, p.o.) or vehicle, 30 minutes before of intraperitoneally administration of PC (400 mg/kg), PTZ (80 mg/kg) or KA (45 mg/kg). 3-ASP pre-treatment (50 mg/kg) abolished seizures and the death induced by PC administration. 3-ASP (50 mg/kg) increased the latency to the first convulsive episode, as well as decreased the mortality and incidence of seizures caused by PTZ and KA. In article 1, the antioxidant activity of 3-ASP (10, 25 or 50 mg/kg; p.o.) against the oxidative stress induced by PC (400 mg/kg, i.p.) in 21-days-old rats was evaluated. Our results demonstrated that 3-ASP pre-treatment was effective in protecting against the inhibition of cerebral activity of superoxide dismutase, decreased ascorbic acid levels, stimulation of catalase activity and increase of reactive species levels caused by PC. Additionally, 3-ASP protected against the inhibition of acetylcholinesterase and Na+, K+-ATPase activities resulting from convulsions induced by PC. The involvement of glutamatergic and GABAergic systems in the anticonvulsant action of 3-ASP was investigated (Articles 1 and 2). The combination of sub-effective doses of 3-ASP (10 mg/kg, p.o.) and diazepam (GABA agonist; 0,5 mg/kg, i.p.), 5S,10R-(+)-5-methyl-10,11-dihydro- 5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-5,10-imine maleate (MK-801, a non-competitive N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antagonist; 0.1mg/kg, i.p.) or 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione (DNQX, a non-NMDA receptor antagonist; 5 mg/kg, i.p.) was effective in increasing the latency to the first convulsive episode, as well as, in decreasing the incidence of convulsions induced by PC. On the other hand, the combination of 3-ASP and 2-methyl-6-phenylethynyl pyridine hydrochloride (MPEP, an antagonist of metabotropic glutamate receptor mGluR5; 0,5 mg/kg, i.p.) did not protect against convulsions. The oral administration of 3-ASP (50 mg/kg) caused an inhibition of 64% and 58% of GABA uptake in the cortex and hippocampus, respectively. However, no change in glutamate uptake after 3-ASP administration (50 mg/kg) was found. Additionally, in article 2, we investigated the possible interaction between sub-effective doses of 3-ASP and GABA uptake or GABA transaminase (GABA-T) inhibitors against PC-induced seizures in 21-days-old rats. To this, sub-effective doses of 3-ASP (10 mg/kg; p.o.) and DL-2,4-diamino-n-butyric acid hydrochloride (DABA, an inhibitor of GABA uptake; 2 mg/kg; i.p.) or aminooxyacetic acid hemihydrochloride (AOAA; a GABA-T inhibitor; 10 mg/kg, i.p.) were co-administrated in 21-days-old rats before of PC administration (400 mg/kg). The treatment with 3-ASP and DABA abolished the PC-induced seizures. Similar results were found when sub-effective doses of 3-ASP and AOAA were administrated in 21-days-old rats. Finally, in the article 3 we investigated the effect of 3-ASP or diazepam against convulsions, the increased susceptibility to the development of seizures and long term memory impairment resulting from febrile seizures induced by hyperthermia. 21-Days-old rats were pre-treated with 3-ASP (25, 50 or 100 mg/kg; p.o), diazepam (1 or 5 mg/kg; i.p.) or vehicle. After the treatment, animals were exposed to a stream of heated air to approximately 41°C. Thirty days after the exposure to hyperthermia, the susceptibility to the development of seizures and long term memory impairment were evaluated. We verified that the pre-treatment with 3-ASP or diazepam did not protect against stereotyped behavior, facial automatisms and body flexion induced by hyperthermia. The protective effect of 3-ASP (100 mg/kg) against the increased susceptibility to the development of seizures and long term memory impairment resulting from febrile seizures induced by hyperthermia was demonstrated. Diazepam (1 or 5 mg/kg) did not protect against long term memory impairment caused by febrile seizures. In addition, diazepam (1 mg/kg) treatment caused a significant cognitive impairment in animals kept at room temperature. These results suggest that 3-ASP had anticonvulsant action in 21-days-old rats and that this action appears to be mediated by glutamatergic and GABAergic systems. In addition, the anticonvulsant action of 3-ASP seems to be associated with its antioxidant activity. Finally, 3-ASP can represent an important tool to protect against increased susceptibility to seizures and cognitive impairment resulting from febrile seizures. / As convulsões têm conseqüências importantes em termos de mortalidade e qualidade de vida da população afetada, sendo um fator de risco para o desenvolvimento de alterações cognitivas e anormalidades comportamentais. Tendo em vista as promissoras propriedades farmacológicas das moléculas contendo selênio, no artigo 1 avaliamos a ação anticonvulsivante do (1-(2,5-difenilselenofeno-3-il)-3-metilpent-1-in-3-ol, que foi genericamente denominado de 3-alquinil selenofeno (3-ASP) frente as convulsões induzidas por pilocarpina (PC), pentilenotetrazole (PTZ) e cainato (KA) em ratos de 21 dias de vida. Os animais foram pré-tratados com 3-ASP (10, 25 ou 50 mg/kg; per oral, p.o.) ou veículo, 30 minutos antes da administração intraperitoneal (i.p.) de PC (400 mg/kg), PTZ (80 mg/kg) ou KA (45 mg/kg). Verificamos que o pré-tratamento com 3-ASP (50 mg/kg) aboliu as convulsões e a morte induzidas pela administração de PC. O 3-ASP (50 mg/kg) aumentou a latência para o primeiro episódio convulsivo, bem como, diminuiu a mortalidade e a incidência das convulsões causadas por PTZ e KA. Ainda no artigo 1, consideramos importante o estudo da ação antioxidante do 3-ASP (10, 25 e 50 mg/kg; p.o.) frente ao estresse oxidativo induzido pela PC (400 mg/kg, i.p.) em ratos de 21 dias de vida. Os resultados demonstraram que o pré-tratamento com 3-ASP mostrou-se eficaz na proteção contra a inibição da atividade cerebral da superóxido dismutase, diminuição dos níveis de ácido ascórbico, estimulação da atividade da catalase e aumento dos níveis de espécies reativas causadas pela PC. Adicionalmente, o 3-ASP protegeu contra a inibição da atividade da acetilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase resultantes das convulsões induzidas pela PC. Em um segundo momento, o envolvimento dos sistemas glutamatérgico e GABAérgico na ação anticonvulsivante do 3-ASP foi verificado (Artigos 1 e 2). A combinação de doses sub-efetivas de 3-ASP (10 mg/kg, p.o.) e diazepam (agonista GABAérgico; 0,5 mg/kg, i.p.), 5S,10R (+)-5-metil-10,11-dihidro-5H-dibenzo [a,d] ciclohepteno -5,10- imina maleato (MK-801; antagonista não-competitivo do receptor NMDA; 0.1mg/kg, i.p.) ou 6,7-dinitroquinoxalina-2,3-diona (DNQX; antagonista de receptores não-NMDA; 5 mg/kg, i.p.) aumentou a latência para o primeiro episódio convulsivo, bem como diminuiu a incidência de convulsões induzidas pela PC. Por outro lado, a combinação de 3-ASP e 2-metil-6-feniletinil piridina hidroclorada (MPEP; antagonista do receptor glutamatérgico metabotrópico do tipo 5; 0,5 mg/kg, i.p.) não apresentou efeito protetor contra os episódios convulsivos. A administração oral de 3-ASP (50 mg/kg) causou uma inibição de 64% e 58% da captação de GABA no córtex e no hipocampo, respectivamente. Entretanto, nenhuma alteração na captação de glutamato após a administração de 3-ASP (50 mg/kg) foi observada. Adicionalmente, no artigo 2 investigamos a possível interação entre doses sub-efetivas de 3-ASP e inibidores da captação de GABA ou da GABA transaminase (GABA-T) frente às convulsões induzidas por PC em ratos de 21 dias de vida. Para isto, doses sub-efetivas de 3-ASP (10 mg/kg; p.o.) e ácido DL-2,4-diamino-n-butírico hidroclorado (DABA - um inibidor da captação de GABA; 2 mg/kg; i.p.) ou ácido aminooxiacético hemihidroclorado (AOAA um inibidor da GABA-T; 10 mg/kg, i.p.) foram co-administrados em ratos de 21 dias de vida antes da administração de PC (400 mg/kg; i.p.). A presença de episódios convulsivos foi avaliada. Verificamos que o tratamento com o 3-ASP e DABA aboliu as convulsões induzidas por PC, corroborando com nossos resultados neuroquímicos. O mesmo foi observado quando foram administradas doses sub-efetivas de 3-ASP e AOAA. Por fim, no artigo 3 investigamos o efeito do 3-ASP ou diazepam frente as convulsões, aumento da susceptibilidade ao desenvolvimento de convulsões e prejuízo na memória a longo prazo resultantes da convulsão febril induzida pela hipertermia. Os ratos de 21 dias de vida foram pré-tratados com 3-ASP (25, 50 ou 100 mg/kg; p.o), diazepam (1 ou 5 mg/kg; i.p.) ou veículo. Após o pré-tratamento, os animais foram expostos a uma temperatura de 41°C. Trinta dias após a exposição à hipertermia, avaliamos o aumento da susceptibilidade ao desenvolvimento de convulsões e prejuízo na memória a longo prazo. Verificamos que o pré-tratamento com 3-ASP ou diazepam não foi capaz de proteger contra o comportamento estereotipado, automatismos faciais e flexão corporal induzidos pela hipertermia. O efeito protetor do 3-ASP (100 mg/kg) contra o aumento da susceptibilidade ao desenvolvimento de convulsões e prejuízo na memória a longo prazo resultantes da convulsão febril induzida pela hipertermia foi verificado. O diazepam (1 ou 5 mg/kg) não protegeu contra o prejuízo na memória a longo prazo causado pela convulsão febril. Além disso, o tratamento com diazepam (1 mg/kg) nos animais mantidos a temperatura ambiente causou um significativo prejuízo cognitivo. Estes resultados sugerem que o 3-ASP apresenta ação anticonvulsivante em ratos de 21 dias de vida e que essa ação parece ser mediada pelos sistemas glutamatérgico e GABAérgico. Além disso, a ação anticonvulsivante do 3-ASP parece estar associada à sua atividade antioxidante. Por fim, o 3-ASP pode representar uma importante ferramenta para a proteção contra o aumento à susceptibilidade às convulsões e o prejuízo cognitivo resultantes das convulsões febris.

Gammaaminosmörsyrareceptorer typ A (GABAAR) är pentameriska ligandstyrda kloridkanaler som uppvisar neurohämmande egenskaper. Därmed är de primära läkemedelsmål för flera ångestdämpande och lugnande läkemedel som används för att minska förekomsten av aktionspotential i neuroner. Trots vikten av dessa receptorer har strukturen av öppen receptor för GABAAR inte lösts hittills, på grund av deras snabba desensibiliseringskinetik. Diazepambindande hämmare (DBI) är en neuropeptid som tidigare rapporterats vara en positiv modulerare för α5β3 GABAAR. I denna studie framställdes DBI genom rekombinant proteinexpression, och den positiva moduleringen undersöktes och karakteriserades med hjälp av voltage-clamp med två elektroder på Xenopus laevis oocyter. För att kunna studera DBI moduleringen skapades GABA dos-responskurvan, och dess karakteristik undersöktes. Baserat på resultaten verkar den positiva moduleringen av DBI vara koncentrationsberoende. Vidare orsakar moduleringen en 2,16-faldig ökning av GABA-framkallad ström vid dess maximala modulationskoncentration. Trots att ström signaler från voltage-clamp uppvisar en viss grad av variabilitet stämmer resultaten överens med tidigare rapporterade observationer som utredde DBI moduleringen respektive GABA dos-responskurvan för α5β3 GABAAR. Dessa resultat kan utnyttjas för att stödja framtida strukturella studier av GABAAR genom att använda denna kunskap om DBI för att potentiellt kunna stabilisera den öppna receptorn, såväl som för att förstå mekanismen för interaktionen mellan DBI och GABAAR. / γ-Aminobutyric acid type-A receptors (GABAARs) are pentameric ligand-gated chloride channels which exhibit neuro inhibitory effects. Hence, they are the primary drug-targets of multiple anxiolytic and sedative drugs used to inhibit the firing rate of neurons. Despite the importance of these receptors, the open structure of GABAAR has not been resolved, owing to their rapid desensitization kinetics. Diazepam binding inhibitor (DBI) is a neuropeptide previously reported to positively modulate the α5β3 GABAARs. In this study, DBI was recombinantly expressed, and this positive modulation was further investigated and characterized by using two-electrode voltage clamp of Xenopus oocytes. For the purpose of studying DBI modulation, GABA dose-response curve was generated, and its characteristics were assessed. Based on the results, the positive modulation of DBI appears to be concentration dependent. Furthermore, the modulation causes a 2.16-fold increase in GABA-elicited current at its maximum modulatory concentration. Although the current traces present some degree of variability, the results are supported by being consistent with previously reported findings investigating DBI modulation and the dose-response curve for α5β3 GABAARs, respectively. These findings can be used to support future structural studies of GABAARs by utilizing this knowledge of DBI to potentially stabilize the open structure of the receptor, as well as in understanding the mechanism of interaction between DBI and GABAARs.