Στις μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες με καρκίνο μαστού, θετικό για οιστρογονικούς υποδοχείς, μετά από χειρουργική θεραπεία, η μακροχρόνια χορήγηση της ταμοξιφαίνης (SERM πρώτης γενεάς), έχει αποδειχθεί ευεργετική. Ο σκοπός της παρούσης μελέτης, ήταν να διαπιστώσει, εάν οι πολυμορφισμοί του γονιδίου των ER (PvuII & XbaI του ERα και οι RsaI & AluI του Erβ), οι οποίοι έχουν συσχετισθεί με καρκίνο μαστού, σχετίζονται με το στάδιο του καρκίνου του μαστού ή την ανταπόκριση του ενδομητρίου στην μακροχρόνια αγωγή με ταμοξιφαίνη, στις μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες με καρκίνο του μαστού. Η μελέτη περιέλαβε 87 μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες με καρκίνο μαστού θετικό για οιστρογονικούς υποδοχείς, στις οποίες χορηγήθηκε ταμοξιφαίνη. Η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 58,7± 4,7 έτη, και η μέση διάρκεια της αγωγής με ταμοξιφαίνη ήταν 3,9 ± 1,1 έτη. Το γονιδιακό DNA απομονώθηκε από τα λευκά αιμοσφαίρια δειγμάτων περιφερικού αίματος με την κλασσική μέθοδο φαινόλης - χλωροφορμίου. Τα κλάσματα των γονιδίων των ERα και Erβ, τα οποία συμπεριελάμβαναν τις θέσεις των πολυμορφισμών, πολλαπλασιάσθηκαν με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Ο προσδιορισμός της παρουσίας των πολυμορφισμών στο DNA πραγματοποιήθηκε με την χρήση ενζύμων περιορισμού. Συμπερασματικά, στις Ελληνίδες μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες με καρκίνο του μαστού υπό αγωγή με ταμοξιφαίνη, οι πολυμορφισμοί των οιστρογονικών υποδοχέων, δεν συνδέθηκαν, ούτε με την παρουσία παθολογίας του ενδομητρίου, ούτε με το στάδιο του καρκίνου του μαστού. / In postmenopausal women with estrogen receptor (ER) positive breast cancer, after surgical treatment long term tamoxifen administration has been proved beneficial. The aim of the present study was to identify whether these ER gene polymorphisms are associated with breast cancer stage or endometrial responsiveness to long-term tamoxifen treatment in postmenopausal women with breast cancer. The study included 87 postmenopausal women with estrogen receptor positive breast cancer treated with tamoxifen. The mean age of patients was 58,7 ± 4,7 years and the mean duration of Tamoxifen treatment was 3.9 ± 1,1 years. Genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocyte samples by the standard phenol/chloroform procedure. Fragments of the ERα and ERβ genes encompassing the polymorphic sites were amplified by the polymerase chain reaction (PCR). The determination of presence of polymorphisms in the DNA was realised with restriction endonucleases. Ιn conclusion, in Greek postmenopausal women with breast cancer under tamoxifen treatment, Estrogen Receptors polymorphisms were not linked to either the presence of endometrial pathology or the stage of breast cancer.

Για τις Ευρωπαίες γυναίκες ο καρκίνος του σώματος της μήτρας αποτελεί το τέταρτο συχνότερο νεόπλασμα και την δέκατη σε σειρά αιτία θανάτου από καρκίνο. Ανεξάρτητα από το εάν η διακολπική υπερηχογραφία (TVS) αποτελεί δόκιμο μέσο διαλογής (screening) για την ανίχνευση ενδομητρικού καρκίνου σε ασυμπτωματικές μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες, εντούτοις κυριαρχεί στους διαγνωστικούς αλγόριθμους διερεύνησης κάθε μητρορραγίας προς αποκλεισμό του καρκίνου αυτού. Παράλληλα με τα πιθανά οφέλη από την ενσωμάτωση τεχνικών Υπερηχοϋστερογραφίας (SIS) και Doppler στην ενδομητρική απεικόνιση, η δισδιά- στατη “gray scale” διακολπική υπερηχογραφία οφείλει μεγάλο μέρος της προόδου της στην ώθηση από τις εξελίξεις της τεχνολογίας. Μετά την εισαγωγή των διακολπικών ηχοβολέων πολλαπλών συχνοτήτων (multifrequency) και της “αρμονικής” (harmonic) απεικόνισης, τα σύγχρονα υπερηχογραφικά μηχανήματα διαθέτουν επιλογές λογισμι- κού για ενίσχυση της ανάλυσης της αντίθεσης δομών, λεπτών ρυθμίσεων για εξέταση διαφορετικών τύπων ιστών, πολλαπλού εύρους εστίασης, μετάδοσης της δέσμης σε πλάγια διεύθυνση ως προς το ακουστικό παράθυρο, κ.α. Τα παραπάνω, καθώς και φίλτρα μείωσης του θορύβου βελτιστοποιούν την απεικόνιση του ενδομητρίου διευκολύνοντας την αποτίμησή του, ακόμη και στα χέρια άπειρων εξεταστών. Το πάχος της διπλής ενδομητρικής στιβάδας αποτελεί ιστορικά τον πλέον αδιαμφισβήτητο ποσοτικό δείκτη ενδομητρικού καρκίνου, ειδικά στην παρουσία μετεμμηνοπαυσιακής μητρορραγίας. Η συνδυασμένη μελέτη της ενδομητρικής μορφο- λογίας και πάχους παρέχει περισσότερες πληροφορίες, ειδικά στην αποτίμηση της “γκρίζας ζώνης” των 4-10 χιλιοστών ενδομητρικού πάχους, αν και τα ευρήματα των “μορφολογικών” αυτών μελετών δεν υπήρξαν πάντα σταθερά. Με δεδομένη τη σημασία της μορφολογίας στην αποτίμηση του ενδομητρικού ιστού, και αποσκοπώντας στην υπέρβαση του υποκειμενικού χαρακτήρα της ποιοτικής εκτίμησης της υπερηχογραφικής εικόνας, θα ήταν χρήσιμη η εφαρμογή αυτοματοποιημένων τεχνικών που αξιολογούν αντικειμενικά μορφολογικά χαρακτη- ριστικά, όπως η υποβοηθούμενη από υπολογιστή ανάλυση υφής, (“computerized texture analysis”). Στις ψηφιακές εικόνες, η υφή αντικατοπτρίζει τονικές (ένταση των εικονο- στοιχείων) και δομικές (χωρική κατανομή της έντασης των εικονοστοιχείων) ιδιότητες. Η “ανάλυση υφής” αναφέρεται σε αλγόριθμους που ποσοτικοποιούν περιεχόμενο και στοιχεία υφής που πιθανόν, ή όχι, να γίνονται αντιληπτά με το γυμνό μάτι. Δεδομένου ότι στην ιατρική απεικόνιση οι εικόνες περιλαμβάνουν πολλαπλές ιδιότητες των βιολογικών δομών, η ανάλυση υφής των εικόνων αυτών παρέχει ποσοτικές πληροφο- ρίες σχετικές με τα χαρακτηριστικά, τη μορφολογία και τις ιδιότητες των δομών αυτών. Σχήματα ταξινόμησης στηριζόμενα στην υφή έχουν χρησιμοποιηθεί με επιτυχία σε ποικιλία υπερηχογραφικών εφαρμογών. Η βασισμένη σε υπολογιστή αποτίμηση εικόνων του ενδομητρίου έχει βρει κυρίως εφαρμογή στη Υποβοηθούμενη Αναπαραγωγή, αλλά δεν έχει χρησιμοποιηθεί για τη διάγνωση ενδομητρικών κακοηθειών στην δισδιάστατη υπερηχογραφία. Σκοπός της διδακτορικής αυτής διατριβής είναι η αξιολόγηση του εφικτού της υποβοηθούμενης από υπολογιστή ανάλυσης υφής του ενδομητρικού ιστού όπως απεικονίζεται σε δισδιάστατες “gray scale” υπερηχογραφικές εικόνες. Περαιτέρω, διερευνήθηκε το αποτέλεσμα μιας τεχνικής επεξεργασίας βασισμένης σε μετασχη- ματισμό κυματίου (wavelet) στη διαδικασία τμηματοποίησης και χαρακτηρισμού του ενδομητρικού ιστού. / Cancer of the corpus uteri represents the fourth commonest neoplasm among European women and the tenth most common cause of death attributed to cancer. Irrespective whether the use of transvaginal ultrasonography (TVS) as a screening tool for detecting endometrial cancer in asymptomatic postmenopausal women is warranted, TVS dominates most diagnostic algorithms in assessing metrorrhagias to exclude this cancer. Alongside the potential benefits stemming from the integration of Saline Infusion Sonography) and Doppler modalities in endometrial imaging, gray scale TVS showed remarkable advances in the previous decades, largely attributed to the evolution in computer sciences. Following the introduction of multifrequency transvaginal probes and harmonic imaging, modern scanners are equipped with software options that enhance the resolution or the contrast between different structures, fine tune while assessing different types of tissue, implement different depth of focusing, transmit the ultrasonic beam in oblique directions to the acoustic window; all these features, in addition to de-speckle filters optimize the endometrial depiction, facilitating its assessment, even in the hands of moderately skilled operators. Double stripe endometrial thickness has illustrated a remarkable robustness over time as a quantitative indicator of endometrial cancer, especially in the presence of postmenopausal bleeding. The combined consideration of endometrial morphology and thickness has proven particularly beneficial, especially in the assessment of the 4-10 mm endometrial thickness “grey zone”, although the findings of the “morphologic” studies haven’t always been consistent. Given the importance of morphology in assessing endometrial tissue, and aiming to overcome the inherent subjectivity of the qualitative consideration of ultrasonic images, implementation of automated techniques assessing objective morphologic features such as “computerized texture analysis” would be beneficial. In digital images, texture reflects tonal (intensities of image pixels) and structural (spatial distribution of pixel intensities) properties. Texture analysis refers to algorithms that quantify texture content that may, or may not, be visually perceived. Since medical images capture various properties of biological structures, texture analysis of medical images can provide quantitative metrics relevant to structure, morphology and status of biological tissues. Texture based classification schemes have been successfully implemented in a variety of ultrasound applications. Computerized TVS assessment of endometrial morphology, has been applied mainly in assisted reproduction techniques; however, computerized texture analysis has not been implemented for diagnosing endometrial malignancies in grey scale TVS. The aim of this study is to investigate the feasibility of computerized texture analysis in characterizing endometrial tissue as depicted in 2D grey scale TVS images. Furthermore, we assess the effect of a wavelet-based image processing technique in the segmentation and subsequent characterization tasks of endometrial tissue.

Breast cancer is among the well-researched type compared to other common types of cancer. However, there still remain important open issues for investigation. One of these issues is the clarification of the importance of certain biological factors, such as histological tumour grade and estrogens reception (ER) status, to clinical management of the disease. Until now, histological grading and ER status assessment is based on the visual evaluation of breast tissue specimens under the microscope. More specifically, grading is determined on the visual estimation of certain histological features, on H&E (Hematoxylin & Eosin) stained specimens according to the World Health Organization (WHO) guidelines, whereas ER-status is assessed as the percentage of expressed nuclei on immunohistochemically stained (IHC) specimens as suggested by the American Society of Clinical Oncology (ASCO) protocol. Recent studies have attempted to examine whether histological tumour grade relates to ER status. Such a relation seems to be of importance in the various treatment strategies followed in breast tumours. However, the quantification of ER status presents certain weaknesses: a) there is a lack of consensus among experts regarding the protocol to be followed for calculating the ER status; b) an exact estimate of the ER status is difficult to be obtained, since the latter would require manual counting of positively expressed nuclei. In clinical practice often a gross estimate is obtained by the histopathologists through visual inspection on representative specimen areas. Consequently, the evaluation of ER status, which has been considered by previous studies as the key measure for assessing the correlation between ERs and tumour grade, is prone to the physician’s subjective estimation. Therefore, more reliable methods are needed. This thesis has been carried out in the search of such alternative, more reliable, methods. Accordingly, the aims of the present thesis are: (i) to develop a reliable segmentation methodology for detection of ER-expressed nuclei in breast cancer tissue images stained with IHC, (ii) to objectively quantify ER status in breast cancer tissue images stained with IHC, (iii) to investigate potential correlation between ER status and histological grade by combining information from IHC and H&E stained breast cancer tissue images obtained from the same patient, (iv) to establish evidence for linking chromatin texture variations with textural variations on ER-expressed nuclei, (v) to investigate the potential of the proposed hybrid supervised pattern recognition strategies to other challenging fields of medical image processing and analysis. To address the above issues and in search of reliable methods for quantitatively assessing ER status and its correlation with histological grade based, a novel hybrid (unsupervised-supervised) pattern recognition methodology has been designed, developed and implemented for the analysis of breast cancer tissue images. Moreover, it will be shown that proper modification of the proposed methodology may result to generalize pixel classification approach suitable for processing and analysis of medical images other than microscopic such as Computed Tomography Angiography images. / Σε σχέση με άλλες μορφές καρκίνου, ο καρκίνος του μαστού είναι μεταξύ των ευρέως μελετημένων τύπων καρκίνου, ωστόσο, υπάρχουν ακόμη σημαντικά ανοικτά ζητήματα προς διερεύνηση. Ένα από αυτά τα είναι ο προσδιορισμός της σπουδαιότητας ορισμένων βιολογικών παραγόντων, όπως ο βαθμός διαφοροποίησης της κακοήθειας (ΒΔΚ) του όγκου και το επίπεδο έκφρασης των Οιστρογονικών Υποδοχέων (ΟΥ), στην κλινική διαχείριση της νόσου. Μέχρι τώρα, η εκτίμηση του ΒΔΚ του όγκου και της έκφρασης των ΟΥ είναι βασισμένη στην οπτική αξιολόγηση ιστολογικών δειγμάτων, τα οποία λαμβάνονται από αντιπροσωπευτικές περιοχές του μαστού, στο μικροσκόπιο. Συγκεκριμένα, σύμφωνα με τις οδηγίες του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας, ο ΒΔΚ του όγκου καθορίζεται από την οπτική εκτίμηση ορισμένων ιστολογικών χαρακτηριστικών γνωρισμάτων σε ιστολογικά δείγματα που έχουν υποστεί χρώση Αιματοξυλίνης - Ηωσίνης (Heamatoxylin & Eosin-Η&Ε), ενώ σύμφωνα με τις οδηγίες της Αμερικάνικης Εταιρείας Κλινικής Ογκολογίας, η έκφραση των ΟΥ πρέπει να εκτιμάται ως το εκατοστιαίο ποσοστό των εκφρασμένων πυρήνων σε δείγματα βαμμένα με ανοσοϊστοχημικές τεχνικές (Immunohistochemistry-IHC). Πρόσφατες μελέτες έχουν προσπαθήσει να εντοπίσουν εάν υπάρχει σύνδεση μεταξύ του ΒΔΚ του όγκου και της έκφρασης των ΟΥ στον όγκο, συσχετίζοντας τον ΒΔΚ από εικόνες με χρώση H&E με τον ποσοστό των εκφρασμένων ΟΥ σε δείγματα IHC. Αυτή η συσχέτιση φαίνεται να είναι σημαντική στις διάφορες ακολουθούμενες στρατηγικές για τη θεραπεία του καρκίνου του μαστού. Εντούτοις, ο προσδιορισμός της έκφρασης των ΟΥ παρουσιάζει ορισμένες αδυναμίες: α) υπάρχει σημαντική μεταβλητότητα μεταξύ των ειδικών σχετικά με το πρωτόκολλο που ακολουθείται για τον υπολογισμό της έκφρασης των ΟΥ, β) είναι δύσκολο να εκτιμηθεί με ακρίβεια η έκφραση των ΟΥ, δεδομένου ότι θα απαιτούσε τη μέτρηση του συνόλου των θετικά εκφρασμένων πυρήνων από τον ειδικό ιστοπαθολόγο. Στην κλινική πράξη, λαμβάνεται συνήθως μια χονδρική εκτίμηση από τον ιστοπαθολόγο, μέσω μικροσκοπίου, παρατηρώντας αντιπροσωπευτικές περιοχές των δειγμάτων όπου υπάρχει μεγάλη συγκέντρωση εκφρασμένων πυρήνων σε ΟΥ. Ως εκ τούτου, η αξιολόγηση της έκφρασης των ΟΥ, που έχει θεωρηθεί από προηγούμενες μελέτες ως βασική μέτρηση για τη συσχέτιση μεταξύ ΟΥ και του βαθμού διαφοροποίησης των όγκων, είναι επιρρεπής στην υποκειμενικότητα του ειδικού. Για τον λόγο αυτό απαιτούνται πιο αξιόπιστες μέθοδοι. Η παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε σε αναζήτηση εναλλακτικών, πιο αξιόπιστων μεθόδων. Έτσι οι στόχοι της παρούσας διατριβής είναι: (i) η ανάπτυξη μιας αξιόπιστης μεθοδολογίας τμηματοποίησης ιστολογικών εικόνων μικροσκοπίας επεξεργασμένες με χρώση IHC για τον εντοπισμό των πυρήνων που εκφράζουν τους ΟΥ για την αντικειμενική ποσοτικοποίηση της έκφρασης των ΟΥ στον καρκίνο του μαστού, (ii) η διερεύνηση ενδεχόμενης σχέσης μεταξύ της έκφρασης των ΟΥ και του ΒΔΚ του όγκου, συνδυάζοντας την πληροφορία των ιστολογικών δειγμάτων, που προέρχονται από τον καρκινικό ιστό του ίδιου ασθενούς και έχουν υποστεί επεξεργασία με ανοσοϊστοχημική χρώση και με χρώση H&E, (iii) η διερεύνηση πιθανής συσχέτισης στις μεταβολές της υφής της χρωματίνης με τις μεταβολές στην υφή των πυρήνων που εκφράζουν τους ΟΥ, και (iv) η διερεύνηση της δυνατότητας της προτεινόμενης μεθοδολογίας σε άλλους τομείς επεξεργασίας και ανάλυσης ιατρικών εικόνων. Για την εκπλήρωση των ανωτέρω στόχων και σε αναζήτηση αξιόπιστων μεθόδων για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης των ΟΥ και της σύνδεσή της με το ΒΔΚ του όγκου, σχεδιάστηκε, αναπτύχθηκε και εφαρμόστηκε μια νέα μεθοδολογία βασισμένη στην αναγνώριση προτύπων ημι-εποπτευόμενης μάθησης για την ανάλυση ιστοπαθολογικής εικόνας. Επιπλέον, η κατάλληλη τροποποίηση της προτεινόμενης μεθόδου μπορεί να οδηγήσει στη γενίκευση της μεθοδολογικής προσέγγισης της ταξινόμησης εικονοστοιχείων για την επεξεργασία και την ανάλυση ιατρικών εικόνων, πέρα αυτών της μικροσκοπίας, όπως εικόνες από Aγγειογραφία Υπολογιστικής Τομογραφίας.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή δείχθηκε ότι το γονίδιο της ανθρώπινης καλλικρεΐνης 6 μπορεί να ενεργοποιηθεί φαρμακολογικά σε καρκινικές κυτταρικές σειρές μαστού και μελετήθηκε ο μοριακός μηχανισμός της ενεργοποίησης. Το cDNA της ανθρώπινης καλλικρεΐνης 6 αρχικά κλωνοποιήθηκε με την τεχνική της διαφορικής παράθεσης των mRNAs βάσει της υπερέκφρασης σε πρωτοπαθή όγκο μαστού σε σχέση με την πλήρη αποσιώπηση στην μετάστασή του στον πνεύμονα, καθώς και στις περισσότερες μεταστατικές καρκινικές σειρές μαστού και δείγματα ιστών. Λόγω της καταστολής της έκφρασής της σε μεταστατικούς όγκους του μαστού, θεωρήθηκε ότι η κωδικοποιούμενη πρωτεΐνη (hK6)-μια νέα σερινοπρωτεάση- θα μπορούσε να έχει ογκοκατασταλτική δράση. Πρόσφατα δεδομένα δείχθουν ότι η hK6 αντιπροσωπεύει έναν νέο μοριακό δείκτη του καρκίνου, αφού αυξημένες συγκεντρώσεις της στον ορό είναι διαγνωστικές για τον καρκίνο των ωοθηκών και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παρακολούθηση της θεραπευτικής αγωγής. Οι φυσιολογικές λειτουργίες της hK6 δεν έχουν βρεθεί. Πρόσφατα, αλλαγές στην έκφραση του γονιδίου KLK6 έχουν συσχετιστεί με την παθογένεση των πιο κοινών νευροεκφυλιστικών νόσων, όπως Alzheimer’s και Parkinson’s. Σημαντικό, είναι το γεγονός της αποικοδόμησης της μυελίνης από την hK6, που πιστοποιεί την συμμετοχή της στην σκλήρυνση κατά πλάκας. Για τους παραπάνω λόγους η hK6, καθώς και το γονίδιο KLK6 αποτελούν ένα σημαντικό θεραπευτικό στόχο. Στην παρούσα εργασία, δείχθηκε ότι οι μηχανισμοί που ρυθμίζουν την μεταγραφή καθώς και την ιστο-εξειδικευμένη έκφραση του γονιδίου KLK6 περιλαμβάνουν την δραστικότητα δύο υποκινητών. Επίσης κλωνοποιήθηκαν νέες ισομορφές του γονιδίου που προκύπτουν από εναλλακτικό μάτισμα και αντιστοιχούν στο 10-20% των KLK6 mRNAs. Προηγούμενη έρευνα δεν είχε παρατηρήσει εκτεταμένες γονιδιωματικές αλλαγές σε καρκινικούς όγκους στην γενετικό τόπο 19q13.4 που εδρεύει το γονίδιο KLK6, και σε συνδυασμό με την πιθανή ογκοκατασταλτική δράση της hK6, διερευνήθηκε η συμμετοχή επιγενετικών μηχανισμών στην αποσιώπηση της έκφρασης του γονιδίου KLK6. Κατεργασία των καρκινικών κυτταρικών σειρών μαστού T47D και MDA-MB-231 με το απομεθυλιωτικό αντιδραστήριο 5-αζα-2΄-δεοξυκυτιδίνη επανενεργοποίησε την έκφραση του γονιδίου KLK6. Η τριχοστατίνη Α, αναστολέας των αποακετυλασών των ιστονών, επανενεργοποίησε την έκφραση KLK6 μόνο στα MDA-MB-231 κύτταρα. Επίσης, βρήκαμε ότι η καταστολή της έκφρασης KLK6 στις καρκινικές κυτταρικές σειρές μαστού συνδέεται με την μεθυλίωση συγκεκριμένων δινουκλεοτιδικών αλληλουχιών CpGs που βρίσκονται στον εγγύς υποκινητή του γονιδίου και σε θέσεις πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα Sp1. Η αποσιώπηση της έκφρασης λαμβάνει χώρα με την πρόσδεση του εξαρτώμενου από μεθυλίωση μεταγραφικού καταστολέα MeCP2 και την δημιουργία ετεροχρωματινικής δομής λόγω αποακετυλίωσης των ιστονών. Επειδή η επιγενετική αποσιώπηση του γονιδίου KLK6 υποδηλώνει ογκοκατασταλτικό ρόλο στον καρκίνο του μαστού, διαμολύνθηκε σταθερά το KLK6 cDNA στην μεταστική σειρά MDA-MB-231 με σκοπό τη διαπίστωση του πιθανού αυτού ρόλου. Τα σταθερά διαμολυσμένα κύτταρα που προέκυψαν, είχαν μικρότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού, ενώ δεν μπορούσαν να σχηματίσουν αποικίες σε μαλακό άγαρ. Συμπερασματικά στην παρούσα διατριβή δείχθηκε ότι το γονίδιο KLK6 αποτελεί πιθανό ογκοκατασταλτικό γονίδιο, που αποσιωπάται σε καρκινικές σειρές μαστού μέσω μεθυλίωσης του γονιδιωματικού DNA, καθώς και δημιουργίας ετεροχρωματινικής δομής στον εγγύς υποκινητή του. Η φαρμακολογική ενεργοποίηση της έκφρασης του γονιδίου KLK6 μέσω επιγενετικών φαρμάκων, είναι πιθανό να ανοίξει νέους δρόμους για την αντιμετώπιση του καρκίνου του μαστού. / In the present thesis it was shown that the human kallikrein 6 gene is pharmacologically modulated in breast cancer cell lines and the molecular mechanism accounting for the modulation was analyzed. The cDNA encoding human kallikrein 6 (protease M) was originally cloned by mRNA differential display as being over expressed in a primary breast tumor but completely inactivated in its lung metastasis, and in the majority of metastatic breast cancer cell lines and tissue specimens. Based on this expression pattern, it was suggested that the encoded protein (hK6)-a novel serine protease-could play a suppressor role in cancer progression. Recent evidence suggests that hK6 represents a novel cancer biomarker, since elevated serum concentrations of hK6 are diagnostic of ovarian cancer and can be exploited for monitoring therapeutic response to treatment. The physiological function(s) of hK6 have not been elucidated. Recently, aberrant expression of the KLK6 gene has been implicated in the pathogenesis of most common neurodegenerative disorders, such as Alzheimer’s and Parkinson’s disease. In addition, hK6 is involved in enhanced proteolysis of myelin basic protein associated with multiple sclerosis. Therefore, hK6 and KLK6 gene, represent potential therapeutic targets for pharmacological intervention. In the present study, we have shown that the mechanisms regulating KLK6 transcription and tissue-specific expression involve the action of two different promoters. Also, new KLK6 splice variants were cloned, and shown to account for 10-20% of all KLK6 mRNA species. Previous study had shown no gross genomic alterations in tumor speciments in the KLK6 genomic locus 19q13.4, and in accordance with putative tumor suppressor activity the involvement of epigenetic mechanisms in KLK6 gene silencing in breast cancer was studied. Treatment of KLK6-negative T47D and MDA-MB-231 human breast cancer cell lines with the demethylating agent 5-aza-2\\\\\\\\

Απο τις απαρχές της μελέτης του PAR1, είχε βρεθεί οτι βρίσκεται σε στενή συνάφεια με τον καρκίνο, με ποικιλία πειραμάτων που έγιναν σε καρκινικές σειρές και σε διάφορα πειραματικά μοντέλα ζώων. Οι σκοποί της παρούσας εργασίας μπορούν να συνοψιστούν ως εξης: Η διερεύνηση της έκφρασης του υποδοχέα 1 της θρομβίνης (PAR1) σε καρκινικές σειρές προερχόμενες από ανθρώπινους όγκους και συγκεκριμένα: Στις σειρές από καρκίνο του προστάτη PC3 και LNCaP και στις σειρές από καρκίνο του μαστού MDA-231 και MCF-7. Η διερεύνηση της λειτουργικότητας του παραπάνω υποδοχέα στις προαναφερθείσες σειρές και το αποτέλεσμα της αναστολής του υποδοχέα στην επιβίωση και στον πολλαπλασιασμό των μελετώμενων κυττάρων. Η διερεύνηση της ενεργοποίησης της ΜΑΡ κινάσης μέσω του PAR1. Και τελικά, η διερεύνηση της έκφρασης του PAR-1 σε ασθενείς που χειρουργήθηκαν για καρκίνο του πνεύμονα στην Παν/μιακη Καρδιοθωρακοχειρουργική κλινική της Πάτρας, απο τον Καθηγητή Κο Δ. Δουγένη και την ομάδα του. Ο ανταγωνιστής του PAR-1, SCH 79797, προκάλεσε μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού των προαναφερθέντων καρκινικών σειρών, όπως μελετήθηκε με τη μέθοδο ΜΤΤ και την ενσωμάτωση ραδιενεργού θυμιδίνης. Αυτή η μη ειδική ανταπόκριση όλων των μελετώμενων σειρών στον SCH, αποδόθηκε κατόπιν στο γεγονός ότι αυτοί οι ανταγωνιστές δεν ήταν απολύτως εκλεκτικοί για τον PAR-1 όπως πιστευόταν, όταν σχεδιάστηκαν. Ο συγκεκριμένος ανταγωνιστής επιλέχθηκε μεταξύ των λίγων, της μοναδικής κατηγορίας που υπήρχε, όταν ξεκίνησαν τα πειράματα. Η θρομβίνη υπερδιπλασίασε τον πολλαπλασιασμό της σειράς PC3 και δεν είχε κανένα αποτέλεσμα στον πολλαπλασιασμό της σειράς MDA-231. Το τελευταίο συμφωνεί και με προηγούμενη έρευνα όπου καταδείχθηκε ότι η θρομβίνη δεν επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό, αλλά μειώνει τη μεταστατικότητα της σειράς MDA-231 (Kamath et al., 2001). Η αύξηση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων του προστάτη PC3, από τη θρομβίνη γίνεται μέσω ενεργοποίησης του υποδοχέα της PAR-1, και μέσω ενεργοποίησης της ΜΑΡ κινάσης, όπως φάνηκε από τα πειράματα στα οποία χρησιμοποιήθηκε ο ειδικός αγωνιστής του PAR1, το εξαπεπτίδιο SFLLRN. Από κάποια πρώτα ενδεικτικά πειράματα φαίνεται ότι η ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ λαμβάνει χώρα μέσω διενεργοποίησης του EGFR, κάτι που έχει αποδειχθεί για άλλους GPCRs. Η έκφραση του PAR1 όπως μελετήθηκε με RT-PCR, σε δείγματα ασθενών που χειρουργήθηκαν για κακοήθεις όγκους στους πνεύμονες, ανιχνεύθηκε σε όλα τα δείγματα καρκινικού ιστού. Η υψηλότερη έκφραση του PAR1 ανιχνεύθηκε στον ασθενή με μελάνωμα και στον ασθενή του υψηλότερου σταδίου. Φυσικά ο αριθμός των ασθενών που μελετήθηκαν δεν αρκεί για εξαγωγή συμπερασμάτων, αλλά τα παραπάνω αποτελέσματα συμφωνούν με τα γνωστά ως σήμερα ευρήματα για τον PAR1. Παραμένει να διευκρινιστεί η σημασία της αυξημένης έκφρασης του PAR1 σε ασθενείς με κακοήθεις όγκους στους πνεύμονες, αφού πρώτα επιβεβαιωθεί αυτή η αυξημένη έκφραση σε μεγαλύτερο αριθμό ασθενών. / From the onset of studies of PAR1, it has been concluded that this receptor is closely related to cancer. This relationship has been established after various experiments in cancer cell lines and in experimental animal models. The purposes of the present study can be summarized as follows: To explore the expression of PAR1 in cell lines established from human solid tumors and specifically PC3 and LNCaP from prostate cancer and MDA-231 and MCF-7 from breast cancer. To explore the suppression of PAR1 to the above cell lines in cell division. To determine if the activation of PAR1 to the above cell lines leads to MAPK phosphorylation. And ultimatilly, to explore the expression of PAR1 in patients that have been operated for tumor in lungs in Patras University Hospitall by Dr. D. Dougenis and colleagues. It was found that PAR1 is strongly expressed in highly metastatic cell lines PC3 and MDA-231, opposite to the cells LNCaP and MCF-7 that have lower metastatic capacity. The finding for the breast cancer cells MDA-231 and MCF-7 was according to published results (Kamath et al., 2001). PAR1 selective antagonist SCH 79797, reduced cell survival and DNA synthesis to all the above mentioned cell lines, independently of PAR1 expression. These non-specific results contributed to the recent fact that these antagonists were not PAR1 selective finally. Thrombin caused more than 100% induction of DNA synthesis in PC3 cells and had no effect in MDA-231 cells in accordance with published results that thrombin reduces the metastatic capacity of MDA-231 cells (Kamath et al., 2001). This effect of thrombin in PC3 cells, is mediated by activation of PAR1 as it was shown with the use of the selective agonist peptide SFLLRN. The activation of PAR1 by thrombin in PC3 cells leads to MAPK activation as it was shown by Western analysis. Furthrmore, preliminary experiments indicate that MAPK phosphorylation after PAR1 activation may be result of EGFR transactivation. In the sample tissues from patients, PAR1 expression was detected in all cancers with different ODs. The number of the samples is not enough to lead to conclusions, but there are some important observations. The highest level of PAR1 expression as was detected by RT-PCR were found to the sample tissues of the patient diagnosed for melanoma and of the patient with the most advanced stage of lung cancer. More patients shoulde be examined and more experiments to be done in order to proceed to conclusions for the significance of PAR1 in lung cancer.

The aim of the current thesis is the exploitation of texture analysis approaches for the computer-aided diagnosis (CADx) of breast cancer. The first objective of the presented thesis is the exploitation of texture properties of the tissue surrounding microcalcifications (MCs) on x-ray mammograms for its differentiation into malignant or benign type. This approach is differentiated from previously reported texture-based CADx schemes by analyzing the “net texture pattern” of the underlying breast tissue, removing any bias introduced by the presence of MCs. This is achieved by employing a “coarse” MC segmentation step, relaxing requirements for accurate segmentation in morphology-based CADx schemes, and subsequently “excluding” the segmented MCs from the tissue area being analyzed by means of texture analysis approaches. The discriminating ability of the MCs surrounding tissue texture analysis approach is compared to that of a current state-of-the-art texture analysis approach and to a morphology-based one, employing supervised classification schemes. Classification performance is evaluated by means of Receiver Operating Characteristic (ROC) analysis on a dataset of 108 pleomorphic MC clusters originating from the Digital Database for Screening Mammography (DDSM). Results suggested that the exploitation of texture properties of the tissue surrounding MCs on screening x-ray mammograms accounts for a competitive new methodological approach towards computer-aided diagnosis of breast cancer. The second objective of the current thesis is the exploitation of lesion enhancement kinetics heterogeneity for the differentiation of breast lesions in Dynamic Contrast-Enhanced Magnetic Resonance Imaging (DCE-MRI). This approach is differentiated from previously reported studies by investigating the texture of the lesion not as depicted on a single post-contrast frame but by considering serial post-contrast data. This is achieved by generating parametric maps the reflect lesion enhancement kinetics properties and then subjecting the parametric maps to texture analysis. The discriminating ability of the enhancement kinetics “texture” analysis approach is compared to that of current state-of-the-art approach of single time frame texture analysis, employing supervised classification schemes. Classification performance is evaluated by means of ROC analysis on a dataset of 81 mass-like lesions, originating from a locally available Database. Results suggested that texture features extracted from parametric maps that reflect lesion washout properties can discriminate malignant from benign lesions more efficiently as compared to texture features extracted from either the 1st post-contrast frame lesion area or from a parametric map that reflects lesion initial uptake. Results of the current thesis suggest the contribution of texture analysis methods in breast imaging for the quantification of both anatomical and functional tissue heterogeneity, providing important information for breast cancer diagnosis. / Στα πλαίσια της παρούσας Διατριβής μελετήθηκε η συμβολή μεθόδων ανάλυσης υφής μαστογραφικών εικόνων στη διάγνωση καρκίνου του μαστού. Η μελέτη εστιάσθηκε σε δύο διαγνωστικά προβλήματα τα οποία αποτελούν ανοικτά ζητήματα τόσο στην κλινική ρουτίνα όσο και στις μεθοδολογικές προσεγγίσεις αυτόματων συστημάτων ανάλυσης εικόνας για την υποβοήθηση της διάγνωσης με χρήση υπολογιστή (Computer-aided diagnosis - CADx). Το πρώτο διαγνωστικό πρόβλημα στο οποίο εστίασε η παρούσα Διατριβή αφορά στο χαρακτηρισμό μικροαποτατινώσεων στη μαστογραφία ακτίνων-Χ. Στην παρούσα μελέτη ακολουθείται μια διαφορετική προσέγγιση για τη διάγνωση συστάδων μικροαποτιτανώσεων, βάσει της οποίας μελετάται η ετερογένεια του ιστού ο οποίος περιβάλλει τις μικροαποτιτανώσεις. Ο «περιβάλλων ιστός» προκύπτει από εφαρμογή μεθόδου τμηματοποίησης των μικροαποτιτανώσεων και εξαίρεσής τους από την περιοχής ενδιαφέροντος. Οι απαιτήσεις ακρίβειας της μεθόδου τμηματοποίησης στην προσέγγιση ανάλυση υφής του «περιβάλλοντος ιστού» είναι μειωμένες, σε σχέση με τις αντίστοιχες μεθόδους των CADx συστημάτων βάσει μορφολογίας, καθώς απαιτείται μόνο «αδρός» καθορισμός των ορίων τους. Η ετερογένεια του περιβάλλοντος ιστού μελετήθηκε βάσει μεθόδων εξαγωγής χαρακτηριστικών υφής εικόνας, σε δείγμα 108 συστάδων μικροαποτιτανώσεων, που αντλήθηκαν από μαστογραφικές εικόνες της ψηφιακής βάσης αναφοράς Digital Database for Screening Mammography. Η διαχωριστική ικανότητα των εξαχθέντων χαρακτηριστικών υφής διερυνήθηκε με χρήση επιβλεπόμενων σχημάτων ταξινόμησης. Η ακρίβεια ταξινόμησης αξιολογήθηκε βάσει του εμβαδού της καμπύλης απόκρισης παρατηρητών. Η προσέγγιση «ανάλυσης υφής του περιβάλλοντος ιστού» συγκρίθηκε με την τρέχουσα μέθοδο ανάλυσης υφής εικόνας περιοχής ενδιαφέροντος που εμπεριέχει τη συστάδα μικροαποτιτανώσεων, αλλά και με προσέγγιση βάσει ανάλυσης μορφολογίας μικροαποτιτανώσεων. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης συνιστούν ότι η προσέγγιση ανάλυσης υφής «του περιβάλλοντος ιστού» αποτελεί μία νέα ανταγωνιστική μεθοδολογία στη διάγνωση καρκίνου του μαστού υποβοηθούμενη από υπολογιστή. Το δεύτερο διαγνωστικό πρόβλημα στο οποίο εστίασε η παρούσα Διατριβή αφορά στο χαρακτηρισμό χωροκατακτητικών αλλοιώσεων στη μαστογραφία μαγνητικής τομογραφίας με χρήση σκιαγραφικού (Dynamic Contrast-Enhanced Magnetic Resonance Imaging: DCE-MRI). Στην παρούσα μελέτη διερευνάται η ικανότητα ποσοτικοποίησης της ετερογένειας των αλλοιώσεων ως προς τη δυναμική τους συμπεριφορά για τη διάγνωση χωροκατακτητικών αλλοιώσεων στη DCE-MRI. Για το σκοπό αυτό δημιουργήθηκαν τρεις παραμετρικοί χάρτες βάσει υπολογισμού τριών δυναμικών χαρακτηριστικών των αλλοιώσεων σε επίπεδο εικονοστοιχείου, οι οποίοι αποτέλεσαν τη βάση για την εφαρμογή μεθόδου ανάλυσης υφής εικόνας, βάσει μητρών συνεμφάνισης στο πεδίο διαβαθμίσεων του γκρι. Μελετήθηκε η διαχωριστική ικανότητα μεμονωμένων χαρακτηριστικών υφής αλλά και επιλεχθέντων υποσυνόλων από κάθε παραμετρικό χάρτη με χρήση επιβλεπόμενων σχημάτων ταξινόμησης. Η ακρίβεια ταξινόμησης αξιολογήθηκε βάσει του εμβαδού της καμπύλης απόκρισης παρατηρητών. Η μέθοδος συγκρίθηκε με τη συμβατική προσέγγιση ποσοτικοποίησης ετερογένειας της αλλοίωσης σε συγκεκριμένο χρονικό στιγμιότυπο, όπως υιοθετείται από τρέχουσες προσεγγίσεις συστημάτων CADx στη DCE-MRI, σε δείγμα 81 αλλοιώσεων. Τα χαρακτηριστικά υφής που εξήχθησαν από χάρτες που εκφράζουν τη μεταβολή του σήματος κατά τη φάση της έκπλυσης του σκιαγραφικού παρουσίασαν την υψηλότερη ακρίβεια ταξινόμησης η οποία ήταν στατιστικώς σημαντικά διαφορετική συγκρινόμενη με χαρακτηριστικά που εξήχθησαν είτε από χάρτη που εκφράζει μεταβολή του σήματος κατά τη φάση της πρόσληψης του σκιαγραφικού ή από αλλοίωση όπως απεικονίζεται σε συγκεκριμένο χρονικό στιγμιότυπο. Τα αποτελέσματα της παρούσας Διατριβής υποδηλώνουν την ικανότητα μεθόδων ανάλυσης υφής στη μαστογραφική απεικόνιση για την ποσοτικοποίηση τόσο της ανατομικής όσο και της λειτουργικής ετερογένειας των αλλοιώσεων, παρέχοντας σημαντική πληροφορία για τη διάγνωση καρκίνου του μαστού.

Η αυτόματη επεξεργασία εικόνων του ενδομητρίου αποτελεί ένα δύσκολο και πολυδιάστατο πρόβλημα, το οποίο έχει απασχολήσει πλήθος ερευνητών και για το οποίο έχει αναπτυχθεί μεγάλος αριθμός τεχνικών. Στην παρούσα διατριβή, παρουσιάζεται μια μεθοδολογική προσέγγιση, η οποία βασίζεται στη χρήση αλγορίθμων ψηφιακής επεξεργασίας και ανάλυσης εικόνων, για την αυτόματη εκτίμηση χαρακτηριστικών που περιγράφουν την αγγείωση και την υφή εικόνων του ενδομητρίου. Αφορμή της μελέτης αποτελεί ο ρόλος που διαπιστώνεται ότι διαδραματίζει η μεταβολή των τιμών των εν λόγω χαρακτηριστικών στην έγκαιρη διάγνωση των παθήσεων του ενδομητρίου. Στα πλαίσια της διατριβής, υλοποιήθηκε κατάλληλη μεθοδολογία για τον υπολογισμό ενός συνόλου χαρακτηριστικών τόσο για υστεροσκοπικές εικόνες, όσο και για ιστολογικές εικόνες του ενδομητρίου. Ιδιαίτερη βαρύτητα δόθηκε στην προ – επεξεργασία των εικόνων προκειμένου να προκύψει βελτίωση της ποιότητας καθώς και ενίσχυση της αντίθεσης αυτών. Στη συνέχεια, ανιχνεύτηκαν τα σημεία που αποτελούν τους κεντρικούς άξονες των υπό εξέταση αγγείων με χρήση διαφορικού λογισμού για τις υστεροσκοπικές εικόνες και υπολογίστηκε ένα σύνολο χαρακτηριστικών μεγεθών που περιγράφουν την αγγείωση και την υφή των εικόνων τόσο για τις υστεροσκοπικές όσο και για τις ιστολογικές εικόνες. Τέλος, εφαρμόστηκαν κατάλληλοι αλγόριθμοι με σκοπό την κατηγοριοποίηση των υστεροσκοπικών και των ιστολογικών εικόνων και συγκεκριμένα τον διαχωρισμό των παθολογικών και των φυσιολογικών εικόνων του ενδομητρίου. Παράλληλα, χρησιμοποιήθηκε η ROC ανάλυση στην απεικόνιση και ανάλυση της συμπεριφοράς των εν λόγω κατηγοριοποιητών. / Automatic analysis of the endometrial images is a difficult and multidimensional problem. For this reason, the number of papers and techniques regarding this issue is numerous. In this Thesis, a methodology is presented, based on advance image processing techniques in order to automatically estimate texture and vessel’s features in endometrial images. Motivation for the Thesis is the fact that the variation of the measurements of the specific features plays significant role in the seasonable diagnosis of endometrial disorders. Throughout this Thesis, an appropriate methodology is developed in order to estimate the features for the hysteroscopical and histological images of the endometrium. An important step is the pre – processing of the images in order to enhance the image quality and the image contrast. Then, the pixels that constitute the centerlines of vessels are detected by using differential calculus for the hysteroscopical images, only. Furthermore, the texture and vessel’s features in hysteroscopical and histological images are estimated. Finally, appropriate algorithms are applied in order to classify the hysteroscopical and histological images and distinguish pathological and normal endometrial images. ROC analysis is used in order to evaluate the discrimination power of the features that were estimated.