H κινάση εστιών προσκόλλησης (FAK) συμμετέχει στη μεταγωγή μηνυμάτων κατά την κυτταροφαγία. Στα αιμοκύτταρα των εντόμων υπάρχει σε διαφορετικές ποσότητες κατά την ανάπτυξη. Ενεργοποιείται με φωσφορυλίωση στην Tyr-397. Kατά την κυτταροφαγία του βακτηρίου Ε. coli ενεργοποιείται άμεσα. Ανάμεσα στα μόρια που σχηματίζουν σύμπλοκο με την FAK είναι και οι πρωτείνες pinch, Src και οι ΜΑΡΚ. Κάποια από τα παραπάνω σχηματίζουν σύμπλοκο κατά την κυτταροφαγία ενώ για άλλα το σύμπλοκο προυπάρχει. Ο κυτταροσκελετός ακτίνης και τουμπουλίνης χρειάζονται για την κυτταροφαγία, όπως χρειάζεται και η έκκριση. Τέλος διαπιστώθηκε πως κατά την κυτταροφαγία του βακτηρίου Ε. coli και του πεπτιδίου RGD, συμμετέχουν οι πρωτείνες Src, Ras, Rho και JNK. / Focal adhesion kinase (FAK) participates in signal transduction at phagocytosis. Insect hemocytes have FAK in different mounts during development. FAK becomes activated after phosphorylation at Tyr-397. During phagocytosis of E. coli, FAK becomes immediately activated. Pinch, Src and MAPK are some of the molecules which are in complex with FAK. Some of these molecules are in complex with FAK during phagocytosis, but some others there are in complex at any time. Phagocytosis, in order to happen, needs actin and tubulin cytoskeleton. Secretion is also needed for this purpose. Finally, we found that the proteins Src, Rho, Ras and JKN participate in phagocytosis of the RGD peptide and in phagocytosis of the microbe Escherichia coli.

Τα τελευταία χρόνια μελετώνται εκτενώς οι μηχανισμοί της κυτταροφαγίας που εμπλέκονται στην άμυνα τόσο των θηλαστικών όσο και των εντόμων και οι οποίοι είναι συντηρημένοι εξελικτικά. Στο εργαστήριο της Βιολογίας Κυττάρου έχουν γίνει αρκετά και μεγάλα βήματα προς την κατεύθυνση της διερεύνησης του μηχανισμού της κυτταροφαγίας από τα αιμοκύτταρα των εντόμων, αλλά σίγουρα η πλήρης κατανόηση του μηχανισμού αυτού χρειάζεται πολλά πειράματα ακόμη. Πρόσφατα δεδομένα του εργαστηρίου μας φανέρωσαν πως το σύστημα ενεργοποίησης της προφαινολοξειδάσης στην επιφάνεια των αιμοκυττάρων, κατέχει κυρίαρχο ρόλο στην διαδικασία της κυτταροφαγίας. Η φαινολοξειδάση είναι το τελευταίο προϊόν του συστήματος ενεργοποίησης της προφαινολοξειδάσης. Συνθέτεται στα αιμοκύτταρα και παρουσιάζεται στην επιφάνεια των αιμοκυττάρων ως ανενεργό ζυμογόνο. Η αναστολή της δράσης της φαινολοξειδάσης έχει ως αποτέλεσμα μια σημαντική μείωση της κυτταροφαγίας. Η φαινολοξειδάση συμμετέχει επίσης στη διαδικασία της μελανοποίησης (μέσω της μετατροπής της τυροσίνης σε Dopa) και το σχηματισμό των οζιδίων ως μηχανισμού άμυνας. Τα δεδομένα αυτά, μας ώθησαν να μελετήσουμε αν η αποκαρβοξυλάση της Dopa που μετατρέπει την Dopa σε ντοπαμίνη, βρίσκεται και αυτή στην επιφάνεια των αιμοκυττάρων της μύγας της Μεσογείου και αν συμμετέχει στις διαδικασίες της κυτταροφαγίας, του σχηματισμό οζιδίων και της μελανοποίησης, που είναι μηχανισμοί εγγενούς άμυνας των εντόμων. Επίσης, μελετήσαμε και κατά πόσο η αιμολίνη, μια πρωτεΐνη αναγνώρισης μοριακών προτύπων που έχει δειχτεί ότι βρίσκεται σε ορισμένα λεπιδόπτερα, υπάρχει και στα αιμοκύτταρα της μύγας της Μεσογείου και συμμετέχει στην κυτταροφαγία των παθογόνων. / -

Στα έντομα, η κυτταροφαγία, διεργασία ανάλογη με αυτή των θηλαστικών, είναι μια σημαντική ανοσολογική απόκριση στην εισβολή παθογόνων και ρυθμίζεται από μια σειρά σηματοδοτικών μορίων. Στη μύγα της Μεσογείου έχει βρεθεί ότι συμμετέχουν οι κινάσες FAK, Src, MAPK και ο μεταγραφικός παράγοντας Elk-1. Στην εργασία αυτή, δείχτηκε με ανοσοκατακρήμνιση και συνεστιακή μικροσκοπία ότι η φωσφορυλιωμένη μορφή του Elk-1 συμπλοκοποιείται και συνεντοπίζεται μόνο με τη φωσφορυλιωμένη μορφή της FAK στη θέση Tyr925. Με ανάλογα πειράματα διαπιστώθηκε ότι οι κινάσες JNK και p38 συμπλοκοποιούνται και συγκατακρημνίζονται με την FAK, χωρίς όμως να συνεντοπίζονται. Με τον ίδιο τρόπο διαπιστώθηκε ότι η JNK και η p38 συμπλοκοποιούνται με την ERK1/2, χωρίς όμως να συνεντοπίζονται. Προφανώς τα μόρια αυτά δεν βρίσκονται σε άμεση επαφή μεταξύ τους και συμπλοκοποιούνται είτε μέσω της FAK, είτε μέσω τρίτων μορίων και όλα μαζί προσδένονται στην FAK. Τα φαγοκύτταρα των θηλαστικών, μακροφάγα και ουδετερόφιλα, καθώς και τα αιμοκύτταρα των εντόμων, παράγουν δραστικές μορφές οξυγόνου κατά την κυτταροφαγία, οι οποίες δρουν ως δεύτερα μηνύματα. Με κυτταρομετρία ροής διαπιστώθηκε ότι η E. coli επάγει τη σύνθεση Η2Ο2 από τα αιμοκύτταρα της μύγας της Μεσογείου. Ο ρυθμιστικός ρόλος του Η2Ο2 επιβεβαιώθηκε με τη χρήση αναστολέων των ενζύμων παραγωγής Ο2- και Η2Ο2, όπου παρατηρήθηκε αύξηση της κυτταροφαγίας. Με πειράματα ανοσοκατακρήμνισης, ανοσοαποτύπωσης και ανοσοφθορισμού φάνηκε ότι το ένζυμο σύνθεσης του Η2Ο2, η δεσμουτάση του υπεροξεικού ανιόντος (SOD), υπάρχει στο κυτταρόπλασμα και στην πλασματική μεμβράνη. Η αποσιώπηση της SOD με siRNA, αύξησε την κυτταροφαγία. Με ανοσοαποτύπωση διαπιστώθηκε ότι η αναστολή της παραγωγής του Η2Ο2 αύξησε τη φωσφορυλίωση της ERK1/2. Τέλος, με συνεστιακή μικροσκοπία φάνηκε ότι η SOD δεν συνεντοπίζεται με τη β υπομονάδα των ιντεγκρινών. Φαίνεται λοιπόν το Η2Ο2 να εμποδίζει την κυτταροφαγία μέσω ελέγχου της φωσφορυλίωσης της ERK1/2. / Phagocytosis is an important innate immune response against pathogen, with similar mechanisms in insects and mammals and is regulated by many different signalling molecules. In medfly Ceratitis capitata, focal adhesion kinase (FAK), Src, MAP kinases and Elk-1 transcription factor regulate this process. Co-immunoprecipitation and confocal microscopy analysis showed that pTyr925FAK associates and co-localizes with pElk-1, during phagocytosis of E. coli and S. aureus, by medfly haemocytes. Moreover, the physical association between JNK and p38 MAP kinases with FAK, was confirmed by immunoprecipitation, but confocal analysis revealed no co-localisation. Similar experiments for JNK and p38 with ERK1/2, revealed an association between JNK, p38 and ERK1/2 and no co-localisation. Apparently, these molecules do not interact directly but they appear to associate with each other indirectly, via FAK molecule or a third molecule and thus all together associate with FAK. Hydrogen peroxide (Η2Ο2) participates as a second messenger in cell signalling in either macrophages and polymorphonuclear cells or insect haemocytes. In this work, the role of Η2Ο2 was investigated, in E. coli phagocytosis by the medfly haemocytes. Block of H2O2 synthesis by specific enzymic inhibitors, namely N-ethylmaleimide (ΝΕΜ) for NADPH oxidase and diethyldithiocarbamate (DDC) for SOD, resulted in the increase of E. coli phagocytosis. Immunoblot analysis, flow cytometry and confocal microscopy, revealed the constitutive expression of SOD, in the medfly haemocytes. Phagocytosis increased by small interfering RNA (siRNA) for SOD, revealing the active involvement of SOD and Η2Ο2. Immunoblot analysis showed an increase of the ERK1/2 phosphorylation, in the presence of the above H2O2 synthesis enzymic inhibitors. In addition, confocal microscopy showed no co-localization of SOD with β integrin subunit. It appears that SOD participates in the regulation of bacterial phagocytosis, due to involvement of the produced Η2Ο2 in the differential phosphorylation of MAP kinases.

Τα ουδετερόφιλα κύτταρα του ανθρώπινου περιφερικού αίματος, ανήκουν σε μία κατηγορία κυττάρων, τα οποία ονομάζονται επαγγελματίες φαγοκύτταρα και τα οποία είναι υπεύθυνα για την πρόσληψη και θανάτωση των παθογόνων μικροοργανισμών (Bessler et al.2002). Από παλαιότερες έρευνες της ερευνητικής μας ομάδας, έχει δειχθεί η συμμετοχή των σηματοδοτικών μορίων FAK, Elk-1 και MAP κινασών στη ρύθμιση της κυτταροφαγίας από τα εξειδικευμένα φαγοκύτταρα (πλασματοκύτταρα), που βρίσκονται στην αιμολέμφο της μύγας της Μεσογείου, Ceratitis capitata. (Lamprou et al. 2007, Mamali et al. 2008). Είναι επίσης γνωστό ότι κατά την κυτταροφαγία παράγονται διάφορες μορφές δραστικού οξυγόνου (ROS) και αζώτου (RNS), με κύριες το Η2Ο2 και ΝΟ αντίστοιχα. Οι παραγόμενες ROS και RNS συμμετέχουν ως μόρια μεταγωγής σήματος σε διάφορα ενδοκυτταρικά σηματοδοτικά μονοπάτια που ρυθμίζουν την κυτταροφαγία από τα λευκοκύτταρα. Όμως τα βιβλιογραφικά δεδομένα στο πεδίο αυτό είναι λιγοστά. Στην παρούσα εργασία, μελετήθηκε η συμμετοχή των FAK, Elk-1, MAP κινασών και Η2Ο2 στην κυτταροφαγία των βακτηρίων E.coli και S.aureus από τα ουδετερόφιλα κύτταρα του ανθρώπου καθώς και η αλληλεπίδραση μεταξύ των FAK, Elk-1, MAP κινασών και του Η2Ο2 που παράγεται από τα κύτταρα λόγω της παρουσίας των βακτηρίων E.coli και S.aureus. Με κυτταρομετρία ροής και τη χρήση του εξειδικευμένου φθοροχρώματος διυδροροδαμίνη (DHR), πιστοποιήθηκε η παραγωγή Η2Ο2 από τα ουδετερόφιλα κύτταρα του αίματος, παρουσία E.coli και S.aureus. Η ενεργός συμμετοχή του παραγόμενου Η2Ο2 αποδείχτηκε όταν η μείωση της παραγωγής υπεροξεικών ανιόντων με τη χρήση του εξειδικευμένου αναστολέα Ν-εθυλεν-μαλεϊμίδιο (NEM), μείωσε την πρόσληψη βακτηρίων από τα κύτταρα. Η συμμετοχή των FAK και Elk-1 στην κυτταροφαγία ελέγχθηκε με καταστολή της γονιδιακής τους έκφρασης με τη χρήση μορίων siRNA, ενώ αντίστοιχα για τις MAP κινάσες χρησιμοποιήθηκαν αναστολείς της φωσφορυλίωσης τους, οι οποίοι καταστέλλουν την ενεργότητα τους. Με τη χρήση των ίδιων μεθόδων αναστολής για τα μόρια FAK, Elk-1 και MAPKs, μελετήθηκε και ο ρόλος τους στην παραγωγή Η2Ο2 κατά την κυτταροφαγία των βακτηρίων E.coli και S.aureus από τα ουδετερόφιλα κύτταρα του ανθρώπου. Τέλος, ερευνήθηκε και ο ρόλος του Η2Ο2, σαν σηματοδοτικό μόριο κατά τη διαδικασία της κυτταροφαγίας, μελετώντας με ανάλυση κατά western, την επίδραση της αναστολής της παραγωγής του Η2Ο2, στην φωσφορυλίωση (ενεργοποίηση) των MAP κινασών. / Neutrophil cells from human peripheral blood belong in a group of cells, that are called professional phagocytes and are responsible for the uptake and killing of pathogen microorganisms (Bessler et al.2002). Research data from our lab, has shown that the signaling molecules FAK, Elk-1 and MAP kinases participate in the regulation of phagocytosis from the phagocytes of the Mediterranean fly, C.capitata (Lamprou et al. 2007, Mamali et al. 2008). It is also known, that during phagocytosis phagocytes produce different forms of reactive oxygen species (ROS) and nitrogen species (RNS), mainly Η2Ο2 and ΝΟ, respectively. Produced ROS and RNS, act as signaling molecules in different intracellular signaling pathways that regulate phagocytosis in leykocytes. . In the present work, we examined the participation of FAK, Elk-1, MAPKs and Η2Ο2 in the phagocytosis of bacteria E.coli and S.aureus and also the interaction between FAK, Elk- 1, MAPKs and Η2Ο2 that is produced from the cells, due to the presence of the bacteria E.coli and S.aureus. Using flow cytometry and the specialized fluorescent dye Dihydrorodamine-123 (DHR), we certified the production of Η2Ο2 from the human neutrophil cells, in the presence of E.coli and S.aureus. The participation of the produced Η2Ο2 was shown, when the reduction of the produced Η2Ο2 with the use of the inhibitor Ν-etheylen-maleimide (NEM), reduced the uptake of bacteria from the cells. The participation of FAK and Elk-1 in phagocytosis was examined by suppressing their expression with the use of siRNA molecules, while for the MAP kinases we used specific activation inhibitors. By using the same inhibitng methods for the molecules FAK, Elk-1 and MAPKs we studied their role in the production of Η2Ο2 during the phagocytosis of bacteria E.coli and S.aureus from human neutrophil cells. Finally, by reducing the production of superoxide anions, thereby reducing the production of H2O2, by using the specific inhibitor Ν-etheylen-maleimide (NEM), we examined the expression of the phosphorylated forms of MAPKs, by western analysis, in human neutrophils in the presence of the bacteria E.coli and S.aureus.

Ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος είναι μία θεμελιώδης διαδικασία τόσο για την ανάπτυξη όσο και για την άμυνα και διατήρηση της δομής και της οργάνωσης όλων των πολυκύτταρων οργανισμών. Τα αιμοκύτταρα της μύγας της Μεσογείου υφίστανται απόπτωση με φυσιολογικούς μηχανισμούς κατά την μεταμόρφωση του εντόμου από το 3ο προνυμφικό στάδιο μέχρι και την νυμφοποίηση. Η απόπτωση των αιμοκυττάρων είναι δυνατό επίσης να επάγεται από εξωγενή χημικά ή φυσικά ερεθίσματα (κυκλοεξαμίδιο, ανισομυκίνη, λιποπολυσακχαρίτη, σταυροσπορίνη, θερμοκρασιακό σοκ). Η έκφραση και φωσφορυλίωση των κινασών FAK, Src, ERK, PI-3K και Akt εξαρτάται από τo στάδιο ανάπτυξης, ενώ το μέγιστο της έκφρασης και φωσφορυλίωσής τους παρατηρείται στο στάδιο της λευκής νύμφης, όπου σημειώνεται και το μέγιστο της απόπτωσης. Η απόπτωση φαίνεται να επηρεάζεται από τα σηματοδοτικά μονοπάτια των Ras/ERK, FAK/Src και PI-3K/Akt. Ενώ ακόμα, πειράματα αποσιώπησης του RNA της κινάσης των εστιών προσκόλλησης (FAK) έδειξαν ότι στη διαδικασία της αναπτυξιακά ρυθμιζόμενης απόπτωσης σημαντική είναι η συμμετοχή της FAK καθώς και των στόχων που έπονται αυτής (downstream), τα σηματοδοτικά μόρια Src, ERK, PI-3K p85a, και Akt. Η κυτταροφαγία είναι μία βασική ενδογενής ανοσολογική απόκριση των οργανισμών έναντι των παρασίτων και άλλων παθογόνων. Τα αιμοκύτταρα των εντόμων αναγνωρίζουν μία πληθώρα «ξένων» για τον οργανισμό βιοτικών και αβιοτικών παραγόντων και αποκρίνονται ενεργοποιώντας διάφορες σηματοδοτικές οδούς μέσω των επιφανειακών υποδοχέων τους με τελικό αποτέλεσμα την κυτταροφαγία. Πειράματα αποσιώπησης της έκφρασης της β υπομονάδας των ιντεγκρινών έδειξαν ότι στα αιμοκύτταρα της μύγας της Μεσογείου η κυτταροφαγία των βακτηρίων E. coli πραγματοποιείται μέσω των ιντεγκρινών, ενώ στη συνέχεια ενεργοποιείται το σηματοδοτικό μονοπάτι FAK/MAP. Επίσης προσδιορίστηκε ότι η FAK ρυθμίζει την κυτταροφαγία των βακτηρίων E. coli μέσω των MAP κινασών και της Src. Τα σηματοδοτικά μόρια των FAK, Src και ERK βρέθηκαν να συμμετέχουν σε κοινό πρωτεϊνικό σύμπλοκο. Τελικός αποδέκτης των παραπάνω μηχανισμών σηματοδότησης που διέπουν τις ενδογενείς ανοσοαποκρίσεις των αιμοκυττάρων φαίνεται να είναι ο μεταγραφικός παράγοντας Elk-1-like, ο οποίος φωσφορυλιώνεται κατά την κυτταροφαγία των βακτηρίων E. coli καθώς και των σφαιριδίων λάτεξ. Η φωσφορυλίωση του Elk-1-like πραγματοποιείται μέσω των FAK, Src και ΜΑΡ κινασών. Πειράματα οσμωτικής ένθεσης αντισωμάτων έναντι του Elk-1 έδειξαν ότι η έκφραση της Elk-1-like πρωτεΐνης στα αιμοκύτταρα ρυθμίζει την κυτταροφαγία των βακτηρίων της E. coli. Μετά την πιστοποίηση της λειτουργικής σχέσης μεταξύ της FAK και της Elk-1-like πρωτεΐνης κατά την κυτταροφαγία, βρέθηκε ότι ο Elk-1- like μεταγραφικός παράγοντας εντοπίζεται στους ίδιους υπo-κυτταρικούς χώρους με την FAK και ότι τα δύο παραπάνω μόρια συμμετέχουν σε κοινό πρωτεϊνικό σύμπλοκο. Ακολούθησε η διερεύνηση της σχέσης των δύο παραπάνω μηνυματοφόρων μορίων, FAK και Elk-1 στα HK-2 κύτταρα του ανθρώπου. Διαπιστώθηκε ότι τα δύο μηνυματοφόρα μόρια FAK και Elk-1 συνεντοπίζονται, σχηματίζοντας πρωτεϊνικό σύμπλοκο κοντά στην περιφέρεια του πυρήνα των HK-2 κυττάρων, παρουσία υψηλής συγκέντρωσης γλυκόζης (25mM). Αναστέλλοντας την έκφραση του Elk-1 στα HK-2 κύτταρα με την τεχνική αποσιώπησης γονιδίων σημειώθηκε αύξηση της απόπτωσης καθώς επίσης και σημαντική μείωση της έκφρασης των FAK και MAP κινασών. Τα παραπάνω ευρήματα συνηγορούν στο συμπέρασμα ότι ο Elk-1 ρυθμίζει την απόπτωση όπως επίσης φαίνεται να ρυθμίζει και την έκφραση των σηματοδοτικών μορίων των FAK/Src και ΜΑΡΚ μονοπατιών στα HK-2 κύτταρα. / Programmed cell death (apoptosis) is an evolutionary conserved process, crucial for the development and maintenance of multicellular organisms. Medfly hemocytes undergo apoptosis during larval-pupal transformation. Hemocytes also undergo apoptosis in response to external chemical or physical stimuli (cycloheximide, anisomycin, lipopolysaccharide, staurosporine and heat shock). Expression and phosphorylation of FAK, Src, ERK, PI-3K and Akt appear to be dependent upon developmental stages. The maximum expression and phosphorylation of the above signalling molecules appeared in hemocytes of the white pupal stage, which is also the peak of apoptosis levels. FAK/Src, Ras/ERK and PI-3K/Akt signalling pathways are involved in the regulation of apoptosis. Furthermore, FAK silencing experiments show that FAK, as well as, its downstream targets (Src, ERK, PI-3K, Akt) are involved in the developmentally regulated apoptosis. Phagocytosis is an important innate immune response against pathogens and parasites. Insect hemocytes, responsible for cellular defense responses, recognize a variety of foreign biotic and abiotic targets and respond by activating several intracellular signalling pathways via hemocyte surface receptors, leading to phagocytosis. Integrin beta-subunit silencing experiments demonstrated that the uptake of bacteria by insect hemocytes is regulated by integrins and results to the activation of FAK/MAPKs signalling pathways. Focal adhesion kinase and its downstream targets (MAPKs and Src) are also implicated in the process of phagocytosis. In addition, experimental results strongly support a physical association between FAK, Src and ERK. The above signalling cellular innate immune responses result to the phosphorylation of Elk-1-like transcription factor in E. coli/latex beads-challenged hemocytes. Elk-1-like protein is a downstream target for FAK/Src and MAPKs pathways, which is phosphorylated via activation of MAPKs. Osmotic loading experiments using Elk-1 antibodies demonstrated the dependence of phagocytosis from Elk-1-like protein. In light of the functional association of FAK with Elk-1-like protein, confocal microscopy analysis shows that these two signalling molecules are localized in the same subcellular compartments, where co-localization also occurs. In light of the functional and physical association of FAK with Elk-1-like protein in medfly hemocytes, we explored whether an analogous functional and physical association between these two essential molecules also exists in mammalian cell systems, in particular, in HK-2 human cells. Indeed, FAK and Elk-1 are co-localized in the periphery of the nuclear membrane in glucose activated cells. Elk-1 silencing in HK-2 cells increased apoptosis, whereas the levels of FAK and MAPKs were significantly decreased. The above results suggest that Elk-1 appears to affect apoptosis via regulating the expression of FAK and MAPKs.

Η FAK, οι MAPKs και ο μεταγραφικός παράγοντας Elk-1 έχει αναφερθεί ότι εμπλέκονται στις ίδιες κυτταρικές διαδικασίες, παρ’ όλα αυτά, η άμεση ή έμμεση αλληλεπίδρασή τους και οι ενδεχόμενες λειτουργίες τους δεν έχουν ακόμα τεκμηριωθεί. Σκοπός αυτής της διατριβής ήταν η περαιτέρω διερεύνηση των σηματοδοτικών μονοπατιών που ρυθμίζουν τη διαδικασία της κυτταροφαγίας και ειδικότερα την αποκάλυψη της φυσικής διασύνδεσης των παραπάνω σηματοδοτικών μορίων. Αρχικά, μελετήσαμε την υποκυτταρική κατανομή των FAK, ERK και Elk-1 στα αιμοκύτταρα της μύγας της Μεσογείου, παρουσία ή απουσία E. coli. Πειράματα ανοσοφθορισμού έδειξαν ότι οι FAK, MAPΚs και Elk-1 κατανέμονται ομοιόμορφα σε όλο το κύτταρο, όμως παρουσία E. coli, φωσφορυλιώνονται και σταδιακά εισέρχονται στον πυρήνα. Στη συνέχεια, με συνεστιακή μικροσκοπία δείχθηκε ότι παρουσία E. coli, οι FAK και ERK φωσφορυλιώνονται και συνεντοπίζονται στην περιφέρεια του κυττάρου. Βιοχημική προσέγγιση επιβεβαίωσε ότι μόνο οι φωσφορυλιωμένες FAK και ERK συμπλοκοποιούνται. Ακολούθως, η φυσική διασύνδεση της FAK και του Elk-1 διερευνήθηκε με ανοσοσυγκατακρήμνιση, αντίστροφη ανοσοσυγκατακρήμνιση, ανάλυση κατά Western και ανοσοφθορισμό. Από τα πειράματα αυτά φάνηκε συμπλοκοποίηση μεταξύ του Elk-1 ή του pSer383Elk-1 και της FAK όχι όμως και της pTyr397FAK. Το σύμπλοκο FAK/Elk-1 εντοπίζεται, κυρίως, στον πυρήνα. Τέλος, πειράματα συνεστιακής μικροσκοπίας έδειξαν ότι η ERK συν-εντοπίζεται με τον Elk-1 σε μικρό βαθμό, όμως ανοσοσυγκατακρήμνιση, αντίστροφη ανοσοσυγκατακρήμνιση και ανάλυση κατά Western δεν αποκάλυψαν κάποια φυσική διασύνδεση μεταξύ της ERK και του Elk-1. / Focal adhesion kinase (FAK), mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and the nuclear transcription factor Elk-1 have been reported to be implicated in the same cellular processes, however, their direct or indirect interaction and potential function(s) has not been documented. The goal of this study was to explore further the signaling pathways that regulate the process of phagocytosis and specifically to show the physical association of the above signaling molecules. Initially, we explored the subcellular distribution of FAK, ERK and Elk-1 in medfly haemocytes, treated in the presence or absence of E. coli. Immunofluorescence analysis demonstrated that FAK, MAP kinases and Elk-1 appear to localize throughout the cytoplasm but in the presence of E. coli they are phosphorylated and gradually imported in the nucleus. Furthermore, confocal analysis showed that in the presence of E. coli, FAK and ERK are phosphorylated and co-localized in the periphery of the cell. Biochemical approaches confirmed that only phosphorylated FAK and ERK are physical associated. Moreover, the physical association of FAK and Elk-1 was explored, using co-immunoprecipitation, reciprocal co-immunoprecipitation, Western blot and immunofluorescence analysis. These experiments revealed an association between Elk-1 or pSer383Elk-1 and FAK but not with pTyr397FAK. The FAK/Elk-1 complex is found, mainly, in the nucleus. Finally, confocal analysis demonstrated that ERK co-localizes with Elk-1 at a low level but co-immunoprecipitation, reciprocal co-immuno-precipitation and Western blot did not reveal a physical association between ERK and Elk-1.

Η κυτταροφαγία βακτηρίων από τα πολυμορφοπύρηνα κύτταρα του αίματος του ανθρώπου επιτυγχάνεται με την ενεργοποίηση διαφόρων σηματοδοτικών μονοπατιών. Η σηματοδότηση ξεκινάει με την προσκόλληση των βακτηρίων στην πλασματική μεμβράνη των κυττάρων και καταλήγει στην αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, στο σημείο επαφής, για τη δημιουργία του φαγοσώματος. Διάφορες μορφές δραστικού οξυγόνου, όπως το Η2Ο2, παράγονται παρουσία βακτηρίων, και δρουν ως σηματοδοτικά μόρια. Στην εργασία αυτή μελετήθηκε η παραγωγή και η συμμετοχή του Η2Ο2 στην κυτταροφαγία E.coli από τα ανθρώπινα πολυμορφοπύρηνα κύτταρα. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκε το εξειδικευμένο φθορίζον μόριο, διυδροροδαμίνη (DHR) - που οξειδώνεται από το Η2Ο2 - καθώς και φθορίζοντα βακτήρια E. coli. Πειράματα κυτταρομετρίας ροής έδειξαν ότι τα πολυμορφοπύρηνα παράγουν Η2Ο2 παρουσία E. coli, ενώ παράλληλα δείχτηκε με έμμεσο τρόπο, με ανοσοαποτύπωση, η μετατόπιση της κυτταροπλασματικής υπομονάδας p47 για την συγκρότηση μεμβρανικής NADPH οξειδάσης. Το ένζυμο αυτό παράγει υπεροξεικά ιόντα τα οποία μετατρέπονται, στη συνέχεια, σε Η2Ο2 από τη δεσμουτάση SOD. Ο ενεργός ρόλος του Η2Ο2 στη ρύθμιση της κυτταροφαγίας, επιβεβαιώθηκε με τη χρήση εξειδικευμένων αναστολέων για τα ένζυμα της σύνθεσής του, N-εθυλμαλειμίδιο (N-ethylmaleimide - nem) για τη NADPH οξειδάση και διεθυλδιθειοκαρβαμικό (diethyldithiocarbamate – ddc) για την δεσμουτάση του υπεροξεικού ανιόντος. Οι αναστολείς αυτοί μείωσαν και την παραγωγή του Η2Ο2 και την κυτταροφαγία βακτηρίων σε καλλιέργεια λευκών αιμοσφαιρίων. Ανοσοαποτυπώματα για τις ΜΑΡ κινάσες, p38 και ΕΡΚ1/2, από εκχύλισμα λευκών αιμοσφαιρίων, μετά από καλλιέργεια παρουσία των παραπάνω αναστολέων, έδειξαν ότι κατά την κυτταροφαγία E. coli, μόνο η φωσφορυλίωση της ERK1/2 μειώνεται όταν μειώνεται η παραγωγή Η2Ο2. Είναι γνωστό ότι το Η2Ο2 απενεργοποιεί φωσφατάσες πρωτεϊνικών τυροσινών (PTPs). Από τα αποτελέσματα μπορεί να υποτεθεί ότι το Η2Ο2 που παράγεται κατά την κυτταροφαγία, απενεργοποιεί τις PTPs, ενισχύοντας τη δράση κινασών τη φωσφορυλίωση της ERK1/2 και να ολοκληρωθεί η διαδικασία της κυτταροφαγίας. Αναστολή της παραγωγής του Η2Ο2 αυξάνει τη δράση των PTPs, την αποφωσφορυλίωση της pERK1/2 και τελικά να μειώνει την κυταροφαγία. / Phagocytosis by human polymorphonuclear blood cells, is achieved by the activation of several signaling pathways. Signaling is initiated with the attachment of the bacteria on the plasma membrane of the cells and is completed with the remodeling of actin on that sight leading to the formation of the phagosome. Certain reactive oxygen species, such as Η2Ο2, which are produced in the presence of bacteria, have been referred to act as signaling molecules. In the present work, we investigated the production and participation of Η2Ο2 in the phagocytosis of E. coli by the human polymorphonuclear cells. For this purpose specific fluorescent probe dihydrorhodamine (DHR) - which is oxidised by H2O2 - and fluorescent E. coli were used. Flow cytometry analysis revealed the production of Η2Ο2 by polymorphonuclears, during phagocytosis of E. coli, while in parallel, it was indirectly shown with immunoblotting, the translocation of cytoplasmic p47 subunit for the assembly of the membrane NADPH oxidase. This enzyme produces superoxide ions which are then converted in H2O2 by superoxide dismutase (SOD). The active role of Η2Ο2, in the regulation of phagocytosis, was confirmed with the use of specific enzyme inhibitors of its synthesis, N-ethylmaleimide (nem) for the NADPH oxidase and diethyldithiocarbamate (ddc) for superoxide dismutase. These inhibitors decreased E. coli phagocytosis in polymorphonuclear cells cultures along with the decrease of Η2Ο2 production. Immunoblot analysis of ΜΑΡ kinases p38 and ERK1/2, from crude extracts of cultured white blood cells, in the presence of the above inhibitors, showed that the phosphorylation of ERK1/2 was reduced when H2O2 was blocked. On the other hand, p38 phosphorylation was not influenced at all. It is known that the target molecules of Η2Ο2 are a family of protein tyrosin phosphatases (PTPs) which are getting inactivate. From the above data, it may be assumed that Η2Ο2, which is produced by the polymorphonuclear blood cells, during phagocytosis, inactivates these enzymes, in order to promote the activity of kinases enhancing the phosphorylation of ERK1/2, among others, so that phagocytosis to be completed. Thus, when the H2O2 production is inhibited, the activity of the PTPs increases, leading to the dephosphorylation of pERK1/2 and the observed decrease of bacterial uptake.

Σα αρνητικά και θετικά κατά Gram βακτήρια E. coli και S. αureus αντίστοιχα αναγνωρίζονται και δεσμεύονται στην επιφάνεια των αιμοκυττάρων της C. capitata. Η πρόσδεση των βακτηρίων ενεργοποιεί τόσο τις β1 ιντεγκρίνες, όσο και σηματοδοτικά μονοπάτια που περιλαμβάνουν τα μόρια μεταγωγής σήματος Ras, Raf, MEK, ERK, FAK, Src, και GRB2. Οι παραπάνω ενεργοποιήσεις, σε συνδυασμό με τη συμμετοχή του κυτταροσκελετού της ακτίνης και της τουμπουλίνης, καταλήγουν στην επαγωγή της έκκρισης μορίων απαραίτητων για την κυτταροφαγία των βακτηρίων που είναι και το τελικό αποτέλεσμα των παραπάνω διαδικασιών. Σα συνθετικά πολυμερή σφαιρίδια, αλλά και πιθανόν και άλλοι αβιοτικοί παράγοντες, παρότι δεν έχουν καμία προηγούμενη εξελικτική σχέση με τα αιμοκύτταρα, ως σύγχρονο προϊόν της ανθρώπινης γνώσης, αναγνωρίζονται και δεσμεύονται στην επιφάνεια των αιμοκυττάρων από άγνωστους μέχρις στιγμής υποδοχείς. Η κυτταροφαγία τους προωθείται μέσω ενεργοποίησης σηματοδοτικών μονοπατιών που περιλαμβάνουν την ενεργοποίηση των μορίων FAK, Src και MAP κινασών καθώς και με τη συμμετοχή του κυτταροσκελετού της ακτίνης και της τουμπουλίνης. Ο LPS αναγνωρίζεται και δεσμεύεται στην επιφάνεια των αιμοκυττάρων, ενεργοποιεί άγνωστους μέχρις στιγμής υποδοχείς και διαμέσου σηματοδοτικών μονοπατιών που περιλαμβάνουν τις Ras, ενεργοποιεί τις MAP κινάσες και το σύστημα της έκκρισης. Αν και ενεργοποιεί και τις τρεις MAP κινάσες, μόνο η ERK και η p38 απαιτούνται τόσο στη διαδικασία της έκκρισης, όσο και στη διαδικασία της ενδοκυττάρωσής του. Η FAK, αν και ενεργοποιείται από τον LPS, δεν εμπλέκεται στην διαδικασία της ενδοκυττάρωσής του. Σα παραπάνω δείχνουν ότι τα αιμοκύτταρα έχουν αναπτύξει διακριτούς μηχανισμούς για την κυτταροφαγία των παθογόνων, των μικρομορίων και των αβιοτικών παραγόντων, γεγονός που δείχνει την ικανότητα εξέλιξης των εντόμων έτσι ώστε να καλύπτουν τις ανάγκες της επιβίωσή τους. / Gram negative and Gram positive bacteria, E. coli and S. αureus respectively, are recognized and they are bound on the C. capitata hemocyte surface. After binding, they activate β1 integrins and intracellular signalling pathways, involving the kinases Ras, Raf, MEK, ERK, FAK, Src, and GRB2. This signal transduction, with the participation of the cytoskeleton of actin and tuboulin filaments, leads to a regulated secretion, that is a prerequisite for phagocytosis. Latex beads and probably other abiotic factors, despite having no previous evolutionary relation to the hemocytes, being a new product of human knowledge, are recognized and they are bound on the hemocyte surface, by hitherto unknown receptors. They activate intracellular signalling pathways that involves FAK, Src and MAP kinases and they promote, with the participation of actin and tuboulin cytoskeleton, their phagocytosis. LPS is recognized and bound on the hemocyte surface and activates so far unknown receptors and through unknown intracellular signalling pathways involving Ras, activates the MAP kinases and the regulated secretion. Although it activates all three MAPKs, only the ΕRΚ and p38 are required not only for the secretion, but also for its internalization. Although FAK is activated by LPS, it does not get involved in the process of its internalization. All of the above mentioned results indicate that the hemocytes have developed distinct mechanisms for phagocytosis of pathogens, micromolecules and abiotic factors, a fact that underlines insects evolutionary adaptations, so that they can survive.