Μελετήθηκε η επίδραση ουραιμικού ορού στο σύστημα των μεταλλοπρωτεϊνασών MMP-2 και MMP-9 και των αναστολέων τους TIMP-1 και TIMP-2 καθώς και σε βασικές βιολογικές δράσεις των ενδοθηλιακών κυττάρων σε καλλιέργειες HUVEC. Ο ορός συλλέχθηκε από ασθενείς που υποβάλλονταν σε συνεδρίες αιμοκάθαρσης (πριν και μετά τις συνεδρίες). Διαπιστώθηκε πως ο ουραιμικός ορός μειώνει την ικανότητα πολλαπλασιασμού, μετανάστευσης και επούλωσης τρύματος, ενώ επάγει την απόπτωση. Επιπλέον, ο ουραιμικός ορός επάγει τις μεταλλοπρωτεϊνάσες MMP-2 και MMP-9, καταστέλλει τους αναστολείς τους TIMP-1 και TIMP-2 και μειώνει την παραγωγή κολλαγόνου τύπου IV και ελαστίνης. / -

Ένας από τους πιο σημαντικούς στόχους της φαρμακευτικής θεραπείας είναι η ανάπτυξη φορέων φαρμάκου που θα μεταφέρουν και θα παραδίδουν εκλεκτικά το φάρμακο στις θέσεις φαρμακολογικής δράσης του αλλά και με έναν ελεγχόμενο ρυθμό χορήγησης κατάλληλα προσαρμοσμένο για την κάθε ασθένεια. Για την ελεγχόμενη χορήγηση και στόχευση βιοδραστικών ουσιών έχουν αναπτυχθεί πολλοί φορείς, όπως πολυμερικά νανοσωματίδια και λιποσώματα. Μεταξύ των πολυμερών που έχουν χρησιμοποιηθεί για την παρασκευή νανοσωματιδιακών φορέων φαρμάκων ιδιαίτερη προσοχή συγκεντρώνουν τα βιοδιασπώμενα και βιοσυμβατά πολυμερή του πολυ(γαλακτικού-γλυκολικού) οξέος (PLGA). Τα νανοσωματίδια που παρασκευάζονται από τα συμπολυμερή αυτά απομακρύνονται ταχύτατα από τη συστηματική κυκλοφορία μετά από ενδοφλέβια χορήγηση, κυρίως μέσω της πρόσληψης τους από το δικτυοενδοθηλιακό σύστημα. Όταν όμως επικαλυφθούν με υδρόφιλα, μη ιονικά πολυμερή, όπως η πολυ(αιθυλενογλυκόλη), έχουμε στερεοχημική σταθεροποίηση των νανοσωματιδίων και παράταση του χρόνου παραμονής τους στην συστηματική κυκλοφορία. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση της διαλυτότητας του φαρμάκου στην φόρτωση και αποδέσμευση του από PLGAmPEG νανοσωματίδια διαφορετικής πολυμερικής σύστασης (αναλογία PLGA/PEG). Ως πρότυπα φάρμακα χρησιμοποιήθηκαν τα μέλη της τάξης των μεθυλοξανθινών καφεΐνη, θεοφυλλίνη και θεοβρωμίνη. Οι μεθυλοξανθίνες αποτελούν ικανοποιητικά πρότυπα ώστε να μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην μελέτη της επίδρασης της διαλυτότητας στις ιδιότητες φόρτωσης και απελευθέρωσης φαρμάκων από τα PLGAmPEG νανοσωματίδια, καθώς είναι μικρά μόρια με παραπλήσιο μοριακό βάρος και χημικές ιδιότητες ενώ η διαλυτότητα τους στο νερό είναι σημαντικά διαφορετική: καφεΐνη (1g/46 ml), θεοφυλλίνη (1 g/120 ml) και θεοβρωμίνη (1 g/2000 ml). Παρασκευάστηκαν έτσι τρεις διαφορετικές συνθέσεις νανοσωματιδίων με την μέθοδο του διπλού γαλακτώματος και χαρακτηρίστηκαν ως προς το μέγεθος και το ζ δυναμικό. Στην συνέχεια μελετήθηκαν οι ιδιότητες φόρτωσης των μεθυλοξανθινών καθώς και οι ιδιότητες απελευθέρωσής τους από τα νανοσωματίδια μέσα σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) και ανθρώπινο πλάσμα in vitro. Το μέσο μέγεθος των νανοσωματιδίων κυμαίνονταν από 130 έως 200 nm και το ζ δυναμικό από -7 έως -20 mV. Τα χαρακτηριστικά αυτά καθιστούν τα νανοσωματίδια κατάλληλα για εφαρμογές ελεγχόμενης αποδέσμευσης. Η φόρτωση και η ενκαψακίωση των PLGAmPEG νανοσωματιδίων βρέθηκε να εξαρτάται από την σχετική διαλυτότητα του φαρμάκου στην εξωτερική υδατική φάση και στην οργανική φάση που χρησιμοποιούνται κατά την παρασκευή των νανοσωματιδίων και όχι απλά από την υδατοδιαλυτότητά τους. Έτσι η φόρτωση των νανοσωματιδίων ήταν μεγαλύτερη στην περίπτωση της καφεΐνης απ’ ότι στην θεοβρωμίνη, και αυτής από την φόρτωση στην περίπτωση της θεοφυλλίνης. Η φόρτωση και η ενκαψακίωση των μεθυλοξανθινών σε PLGAmPEG νανοσωματίδια επηρεάζεται από την αρχική φόρτωση των νανοσωματιδίων σε φάρμακο (drug input). Για όλα τα φάρμακα που δοκιμάστηκαν, αύξηση της αρχικής ποσότητας του φαρμάκου είχε σαν αποτέλεσμα την αύξηση της φόρτωσης των νανοσωματιδίων με φάρμακο. Αντίθετα η επίδραση της αρχικής φόρτωσης στην ενκαψακίωση βρέθηκε να εξαρτάται από την υδατοδιαλυτότητα του φαρμάκου. Έτσι η αύξηση της αρχικής φόρτωσης είχε σαν αποτέλεσμα την ελάττωση της ενκαψακίωσης στην περίπτωση της καφεΐνης, δεν είχε κανένα αποτέλεσμα στην ενκαψακίωση της θεοφυλλίνης ενώ οδήγησε σε μικρή αύξηση της ενκαψακίωσης της θεοβρωμίνης. Η φόρτωση και η ενκαψακίωση των φαρμάκων που δοκιμάστηκαν δεν επηρεάστηκε σημαντικά από τη σύνθεση του PLGAmPEG συμπολυμερούς από το οποίο παρασκευάστηκαν τα νανοσωματίδια. Ανεξάρτητα από την πολυμερική σύνθεση των νανοσωματιδίων, ο ρυθμός απελευθέρωσης των εγκλωβισμένων στα νανοσωματίδια μεθυλοξανθινών ήταν, τόσο στο PBS όσο και στο ανθρώπινο πλάσμα in vitro, ανάλογος της υδατοδιαλυτότητας του φαρμάκου. Έτσι ο ρυθμός αποδέσμευσης ήταν μεγαλύτερος στην περίπτωση της καφεΐνης απ’ ότι στην θεοφυλλίνη, και αυτής από την θεοβρωμίνη. Με όλες τις πολυμερικές συνθέσεις που δοκιμάστηκαν, ο εγκλωβισμός των μεθυλοξανθινών στα νανοσωματίδια είχε ως αποτέλεσμα την ελάττωση του ρυθμού αποδέσμευσης των φαρμάκων in vitro, τόσο σε PBS όσο και σε ανθρώπινο πλάσμα. Η ελάττωση του ρυθμού αποδέσμευσης αυξάνονταν με ελάττωση της υδατοδιαλυτότητας του φαρμάκου. Ο ρυθμός απελευθέρωσης και των τριών μεθυλοξανθινών ήταν μεγαλύτερος στο PBS σε σύγκριση με το ανθρώπινο πλάσμα. Η απόδειξη της ελεγχόμενης αποδέσμευσης των φαρμάκων από τα νανοσωματίδια στο ανθρώπινο πλάσμα είναι σημαντική καθώς καταδεικνύει την καταλληλότητα των PLGAmPEG σωματιδίων για εφαρμογές ελεγχόμενης χορήγησης φαρμάκων. Πάντως η χρησιμότητα των PLGAmPEG νανοσωματιδίων σε ελεγχόμενη χορήγηση φαρμάκων φαίνεται να περιορίζεται στις περιπτώσεις των φαρμάκων με μικρή σχετικά υδατοδιαλυτότητα. / The rapid removal of conventional polymeric nanoparticles from the bloodstream limits their potentional in controlled drug delivery and targeting. Surface engineering, however, may lead to nanoparticles capable of evading their uptake from the mononuclear phagocyte system (MPS), which exhibit prolonged residence in blood. Thus, coating the nanoparticle surface with a hydrophilic polymer such as poly(ethylene glycol) (PEG) has been shown to confer long circulation properties to PLGA (poly(lactide-co-glycolide) nanoparticles. Although the basic physicochemical and biological properties of these nanoparticles have been studied, there is currently a luck of studies dealing in a systematic way with their drug incorporation and release properties. In this work the effect of three different PLGAmPEG copolymer composition on drug loading and release properties, was studied using the members of the methyl-xanthine class of drugs, i.e. caffeine, theophylline, theobromine, as model drugs. This way, the effect of drug solubility on drug loading and release from the nanoparticles can be evaluated in a more scientifically sound way than applying more common practices, such as the study of a drug and its salt. PLGAmPEG copolymers were synthesized from dl-lactide (LE), glycolide (GE) and mPEG(5000) by a melt polymerization process. The synthesized copolymers were identified by the moral ratio of (LE +GE)/mPEG determined by 1H-NMR. PLGAmPEG nanoparticles loaded with caffeine, theophylline and theobromine were prepared by a double emulsion (w1/o/w2) method, where w1: aqueous solution of drug, o: a dichloromethane (dcm) solution of the polymer and w2: an aqueous solution of sodium cholate (12mM). The size and æ potential of the nanoparticles, were determined by photon correlation spectroscopy and microelectrophoresis respectively. The size of the nanoparticles ranged approximately from 130 to 200nm depending on the type of PLGAmPEG copolymer used and the formulation. All nanoparticle formulations exhibited low negative æ potential in the range -7 to -20. Drug loading was determined using direct method in which the samples were dissolved in NaOH and the drug in the solution was assayed by a High Performance Liquid Chromatography method (HPLC). The release experiments were performed in phosphate buffered saline and in human plasma in vitro. The nanoparticles were enclosed in a dialysis bag and incubated in PBS (pH=7.4, 37oC) and in human plasma under mild agitation. At predetermined time intervals, samples were withdrawn and assayed for the drug by HPLC. The drug loading and encapsulation values increased and decreased respectively when the drug/polymer ratio increased, by increasing drug input (initially present drug) while keeping polymer input constant. Due to the relatively high aqueous solubility of the three methylxanthines low nanoparticle loadings were generally obtained. Caffeine, despite its higher aqueous solubility, exhibited a little higher encapsulation and loading than theophylline and theobromine. This may be attributed to the much higher partition coefficient K (dcm/water) of caffeine compared to theophylline and theobromine, which would decrease to a higher extend in the case of caffeine the tendency of the drug to pass from the dcm droplets, formed during the second emulsification step of nanoparticle preparation, to the surrounding aqueous phase. As a result, higher drug retention in the nanoparticles was observed in the case of caffeine. Drug release from the nanoparticles was sustained and depended on the aqueous solubility of the drugs. For instance, the more water-soluble caffeine was released relatively faster than the less water-soluble theophylline and the even less water-soluble theobromine, from all PLGAmPEG compositions both in PBS and in human plasma. Drug release from the nanoparticles did not appear to depend on the composition of the PLGAmPEG copolymer used to prepare the nanopaparticles. Drug release rate in plasma was lower than that in PBS, probably due to the binding of the drug molecules to plasma proteins. Drug encapsulation of methylxanthines in the PLGAmPEG nanoparticles depended on the solubility properties of the drugs. The organic/aqueous phase partition coefficient of the drug may be crucial with regard to the incorporation efficiency of the drug in these nanoparticles. Drug release from the nanoparticles was sustained in both PBS and human plasma, but only for the relatively hydrophobic theobromine in a satisfactory extent. The rate of drug release was affected by the aqueous solubility of the drug and the release medium. It appears that PLGAmPEG nanoparticles can be applied for controlled drug delivery applications only in the case of relatively water-insoluble drugs.

Εισαγωγή: Ο καρκίνος του λάρυγγα, ιδιαιτέρως σε προχωρημένα στάδια, είναι μία καταστροφική νόσος η οποία χαρακτηρίζεται από αυξημένη διηθητικότητα και μεταστατικότητα. Η ανεύρεση ενός δείκτη πρώιμης διάγνωσης, παρακολούθησης και πρόγνωσης της νόσου θα ήταν ιδιαίτερα ευπρόσδεκτη. Συνεχώς αυξανόμενα δεδομένα στη βιβλιογραφία υποστηρίζουν την προγνωστική αξία των ζελατινασών και τον πιθανό ρόλο τους ως μοριακών δεικτών μεταξύ άλλων και στον καρκίνο του λάρυγγα. Σκοπός: Η διαπίστωση μεταβολών στα επίπεδα ορού των ζελατινασών Α και Β σε ασθενείς με καρκίνο του λάρυγγα μετά από εφαρμογή θεραπείας, καθώς και η πιθανή συσχέτιση με διάφορες κλινικοπαθολογικές παραμέτρους πριν και μετά τη θεραπευτική παρέμβαση. Υλικό και μέθοδος: Σαράντα εννέα ασθενείς και 8 υγιείς μάρτυρες συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη. Ελήφθησαν προεγχειρητικά και μετεγχειρητικά δείγματα ορού τα οποία στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ζυμογραφία ζελατίνης. Η παρουσία ζελατινασών επιβεβαιώθηκε με την τεχνική western blotting. Οι ζώνες λύσης ποσοτικοποιήθηκαν με τη χρήση Scion Image PC. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με το πρόγραμμα SPSS 17 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA). Αποτελέσματα: Στα ζυμογραφήματα αποτυπώθηκαν μόνο οι λανθάνουσες μορφές των ενζύμων (προένζυμα). Τα προ της θεραπείας επίπεδα και των δύο ζελατινασών στον ορό του αίματος των ασθενών με καρκίνο του λάρυγγα ήταν σημαντικά υψηλότερα σε σχέση με αυτά των υγιών μαρτύρων. Ασθενείς με υπεργλωττιδικό καρκίνωμα και ενεργοί καπνιστές είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα proMMP-2 σε σχέση με ασθενείς που έπασχαν από γλωττιδικό καρκίνωμα και με πρώην καπνιστές αντίστοιχα. Ασθενείς με πρωτοδιαγνωσμένη νόσο και ασθενείς με λεμφαδενικές μεταστάσεις είχαν σημαντικά χαμηλότερα προ της θεραπείας επίπεδα proMMP-9 σε σχέση με ασθενείς που προσήλθαν με υποτροπή και με ασθενείς στους οποίους δεν διαπιστώθηκε επιχώρια νόσος αντίστοιχα. Κατά τη διάρκεια της συστηματικής παρακολούθησης τα επίπεδα της proMMP-2 στον ορό παρουσίασαν σημαντική αύξηση τις πρώτες 10 με 15 ημέρες μετά την εφαρμογή θεραπείας, για να μειωθούν σταδιακά εντός των επόμενων μηνών. Οι ενεργοί καπνιστές παρουσίασαν σημαντική μείωση των επιπέδων της proMMP-2 κατά την περίοδο παρακολούθησης, σε αντίθεση με τους πρώην καπνιστές οι οποίοι εμφάνισαν σημαντική αύξηση κατά το ίδιο χρονικό διάστημα. Οι ασθενείς σταδίου ΙΙ είχαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα proMMP-2 σε σχέση με ασθενείς προχωρημένων σταδίων πέντε με οκτώ μήνες μετά τη θεραπεία, όπως και οι ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε συντηρητική αντιμετώπιση σε σχέση με τους χειρουργημένους ασθενείς. Τα επίπεδα της proMMP-9 στον ορό επίσης παρουσίασαν σημαντική πτώση μετά την εφαρμογή θεραπείας. Διαφορές στο ρυθμό μείωσης των επιπέδων της proMMP-9 παρατηρήθηκαν μεταξύ των διαφόρων ομάδων ως προς το στάδιο, τη διαφοροποίηση, την εντόπιση, τον τύπο της νόσου (πρωτοδιαγνωσμένη ή υποτροπή), τις λεμφαδενικές μεταστάσεις, τον τρόπο αντιμετώπισης και την κατανάλωση αλκοόλ. Ωστόσο αυτή η διαφορά δεν διατηρήθηκε πέντε με οκτώ μήνες μετά την εφαρμογή θεραπείας, με εξαίρεση την ομάδα των χειρουργημένων ασθενών, οι οποίοι διατήρησαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα ενζύμου στον ορό. Αύξηση των ζελατινασών παρατηρήθηκε στον ορό ασθενών που εκδήλωσαν υποτροπή μετά από αντιμετώπιση πρωτοδιαγνωσμένης νόσου σε σχέση με αυτούς που δεν υποτροπίασαν. Ωστόσο εξαιτίας του μικρού δείγματος δεν είναι δυνατόν να εξαχθούν ασφαλή συμπεράσματα. Συμπεράσματα: Αν και δεν υφίστανται φυσιολογικές τιμές, το πρότυπο μεταβολής των επιπέδων της proMMP-9 στον ορό μετά από θεραπεία καταδεικνύει πιθανές ιδιότητες μοριακού δείκτη. Ωστόσο υπάρχουν ενδείξεις ότι και οι δύο ζελατινάσες θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την εξατομικευμένη παρακολούθηση ασθενών με καρκίνο του λάρυγγα. Περαιτέρω έρευνα απαιτείται για την αποσαφήνιση του ζητήματος. / Introduction: Laryngeal cancer, especially in the advanced stages, is a highly devastating disease, characterized by increased invasiveness and high rates of metastasis. The identification of reliable tumour marker for prompt diagnosis, surveillance and prognosis would be highly desirable. There is a growing body of evidence with regard to the prognostic value of gelatinases and their possible role as tumour markers. Aim: To identify the pattern of alteration of serum gelatinases A and B in patients with laryngeal cancer following treatment, and a possible correlation with various clinicopathological parameters prior to and past treatment. Materials and methods: Forty nine patients and 8 healthy controls were included in the study. Pre-treatment and post-treatment serum samples were collected and processed by gelatin zymography. The presence of gelatinases was verified by western blotting. The zymograms were scanned by a digital scanner and the lysis bands were quantified by Scion Image PC. Analysis of the quantitative results was performed by using SPSS 17 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA). Results: Only the latent forms of MMP-2 and -9 (proforms) were identified. Both gelatinases were increased in the serum of laryngeal cancer patients compared to healthy individuals. Patients with supraglottic tumours and active smokers had significantly higher pre-treatment levels of proMMP-2 than patients with glottic tumours and ex-smokers, respectively. Patients with primary disease and patients with lymph node involvement showed lower proMMP-9 pre-treatment levels than patients with recurrence and patients without neck disease, respectively. During the follow-up period the proMMP-2 serum levels increased significantly in the first ten to fifteen days after treatment, gradually decreasing over the following months. Smokers showed a very high decrease rate of proMMP-2 levels during the follow-up period, whereas in ex-smokers proMMP-2 levels significantly increased. Stage II patients showed significantly lower levels of circulating enzyme compared to patients with more advanced disease five to eight months past treatment. Similarly, conservative management was associated with lower levels of serum proMMP-2 compared to surgical management five to eight months following treatment. The proMMP-9 serum levels also showed a gradual decrease after treatment, which was statistically significant. Significant alterations in the rate of decrease developed among groups with regard to stage, grade, location, type of disease (primary or recurrence), regional disease, treatment modality and alcohol consumption. Nevertheless those differences were not maintained five to eight months past treatment, with the exception of patients who underwent surgery and who maintained higher levels of proMMP-9. An increase to the levels of both gelatinases were observed in patients with recurrent disease after having been treated for a primary compared to patients who did not develop a recurrence. However, the small sample of patients with recurrent disease during the follow-up period does not allow extrapolating sound conclusions. Conclusions: Although as yet normal values have not been established in the literature, the post-treatment alteration pattern of proMMP-9 serum levels indicates that this enzyme might play a role as a tumour marker. Nevertheless this study provides evidence that both gelatinases might be useful for surveillance on strictly individual basis in laryngeal cancer patients. Further research is necessary to clarify the contribution of both gelatinases to the disease progress and determine their role as prognostic factors and tumour markers.