- / -

- / -

- / -

- / -

- / -

- / -

Η HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide) είναι ένας αυξητικός παράγοντας με Μ.Β. 18 kDa που ανήκει στην οικογένεια των αυξητικών παραγόντων που έχουν συγγένεια με την ηπαρίνη. Eμπλέκεται στην ανάπτυξη των νευριτών, την επούλωση πληγών και φαίνεται να παίζει σημαντικό επαγωγικό ρόλο στις διαδικασίες της ογκογένεσης, καθώς επάγει την αγγειογένεση και εμφανίζεται σε υψηλές συγκεντρώσεις τόσο σε καρκινικούς ιστούς, όσο και σε κυτταρικές σειρές καρκινικών κυττάρων. Στο πλαίσιο μελέτης της σχέσης δομής/δράσης του αυξητικού αυτού παράγοντα, χρησιμοποιούνται τόσο συνθετικά πεπτίδια, όσο και ανασυνδυασμένες τροποποιημένες μορφές του αυξητικού αυτού παράγοντα. Σε φυσιολογικές συνθήκες, η εκκρινόμμενη HARP πέπτεται από ένζυμα του κυτταρικού μικροπεριβάλλοντος και προκύπτουν πεπτίδια που παρουσιάζουν βιολογικές δράσεις παρόμοιες ή και αντίθετες από αυτές της HARP. Φαίνεται λοιπόν πως η δράση του αυξητικού αυτού παράγοντα ρυθμίζεται τόσο στο επίπεδο βιοσύνθεσης και έκκρισης, όσο και από τη δράση ενζύμων του εξωκυττάριου χώρου. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η δράση ενός συνθετικού πεπτιδίου το οποίο αντιστοιχεί στα αμινοξέα 65-97 που εντοπίζονται στην ΤSR περιοχή προς το καρβοξυτελικό άκρο της HARP. Με δεδομένο ότι τι πεπτίδιο αυτό εμφανίζει αντιαγγειογενετική δράση, πραγματοποιήθηκαν χρονοεξαρτώμενα και δοσοεξαρτώμενα πειράματα, με σκοπό τη μελέτη της δράσης του στον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την επούλωση πληγών. Στο πλαίσιο αυτών των μελετών, ελέγξαμε τη δράση του στην έκφραση των μεταλλοπρωτεϊνασών ΜΜP-2 και ΜΜP-9, των αναστολέων τους ΤΙMP-1 και ΤΙMP-2 καθώς και του κολλαγόνου και της ελαστίνης σε πρωτογενείς καλλιέργειες ενδοθηλιακών κυττάρων από ομφάλιο λώρο (HUVEC cells). Τα αποτελέσματα έδειξαν πως το συνθετικό αυτό πεπτίδιο καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό, την μετανάστευση αλλά και την επούλωση πλήγών των κυττάρων HUVEC με δοδοεξαρτώμενο και στατιστικώς σημαντικό τρόπο. Επιπλέον από τα πειράματά μας δεν παρατηρήθηκε μεταβολή στα πρωτεϊνικά επίπεδα έκφρασης των μεταλλοπρωτεϊνασών ΜΜP-2 και ΜΜP-9 καθώς και των αναστολέων τους ΤΙMP-1 και ΤΙMP-2. Ωστόσο, παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική μεταβολή στα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης των αναστολέων ΤΙMP-1 και ΤΙMP-2 όπως επίσης και της ελαστίνης και του κολλαγόνου IV. / Heparin affin regulatory peptide (HARP) is an 18-kDa secreted growth factor that has a high affinity for heparin and a potent role on tumor growth and angiogenesis. HARP was originally described as a neurite outgrowth promoting molecule, which appears to increases during recovery from injury and is thought to be involved in angiogenesis expression, playing a major role in the cell growth and differentiation that are associated with regeneration in several tissues. HARP is expressed in several human tumors and tumor cell lines and is also indicated in high serum levels of patients with different types of cancer. HARP contains two random coiled clusters of basic residues (N- and C-terminal) and two b-sheet domain. Each b-sheet domain contains a thrombospondin repeat I (TSR-I) motif, which have been suggested to be responsible for the interaction of HARP with heparin. Our project is based on C-TSR-I domain, corresponding to amino acids 65–97 of HARP peptide, respectively, required for the neurite outgrowth activity of HARP. In this study, we investigate the impact of C-TSR on basic biological functions of endothelial cells (HUVEC) such as proliferation, migration, the expression of MMP-2 and MMP-9 and their inhibitors (TIMP-1, TIMP-2) that contribute to the ECM remodeling. Time course and dose-response experiments revealed that CTSR reduces proliferation, migration and wound healing, without affecting the protein levels of MMP-2 and MMP-9 and their inhibitors (TIMP-1, TIMP-2). Moreover, CTSR inhibits the expression of TIMP-1 and TIMP-2 contributing to the ECM remodeling. Concluding, HARP could act as pro- or anti-angiogenic factor, depending on the system used and the cell microenvironment.

Τα TPRs (Tetratricopeptide Repeats) είναι πρωτεϊνικά μοτίβα επαναλήψεων με μήκος πεπτιδικής αλυσίδας 34 αμινοξικών κατάλοιπων. Περισσότερα από 10000 TPRs έχουν εντοπι-στεί έως σήμερα σε διάφορες πρωτεϊνες, από τα αρχαιοβακτήρια έως τον άνθρωπο. Τα TPRs συμμετέχουν σε πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις. Δομικά, κάθε TPR παρουσιάζει τη διαμόρφωση έλικα-στροφή-έλικα σε σχήμα φουρκέτας ενώ διαδοχικά πακεταρισμένα TPRs σχηματίζουν στο χώρο δεξιόστροφη υπερέλικα, στην οποία διακρίνονται μία κυρτή και μία κοίλη επιφάνεια. Το σύμπλοκο πρωτεϊνών Ssn6-Tup1 είναι ένας γενικός συγκαταστολέας της μεταγραφής στη ζύμη. Ομόλογα σύμπλοκα έχουν επίσης βρεθεί σε πολλούς οργανισμούς. Η πρωτεϊνη Ssn6 περιέχει δέκα διαδοχικά TPRs. Η αλληλεπίδραση των δύο πρωτεϊνών πραγματοποιείται μέσω των τριών πρώτων TPRs της Ssn6 και του Ν-τελικού τμήματος (αμινοξικά κατάλοιπα: 1-72) της Tup1. Σε προηγούμενη εργασία της η ερευνητική μας ομάδα έδειξε με πειράματα μεταλλαξιγένεσης και με δομική μοντελοποίηση, ότι η δομική ακεραιότητα του TPR 1 και η σωστή τοποθέτησή του σε σχέση με το TPR 2 είναι κρίσιμες για τη δέσμευση της Tup1. Στην παρούσα διατριβή διερευνήθηκε για πρώτη φορά η δομική σταθερότητα του τμήμα-τος της πρωτεϊνης Ssn6 που αλληλεπιδρά με την Tup1, και η σημασία που έχει για την αλληλε-πίδραση το Ν-τελικό άκρο της Ssn6, το οποίο περιλαμβάνει μία εκτεταμένη περιοχή πολυγλου-ταμίνης. Για τη μελέτη εφαρμόστηκαν χαρτογράφηση της πρωτεϊνης Ssn6 με περιορισμένη πρωτεόλυση καθώς και βιοχημικός χαρακτηρισμός και φασματοσκοπία κυκλικού διχρωισμού σε επιλεγμένα τμήματα των πρωτεϊνών Ssn6 και Tup1 και στα σύμπλοκά τους. Επιπρόσθετα πραγματοποιήθηκαν, in silico, σύγκριση των TPRs της Ssn6 με άλλα γνωστά TPRs, προβλέψεις της δομικής αστάθειας των TPRs και προσομοίωση μοριακής δυναμικής στο δομικό μοντέλο των TPRs 1-3. Ο συνδυασμός των παραπάνω έδειξε πως όταν απουσίαζει η Tup1 τα TPRs 1 και 2 της Ssn6 βρίσκονται μερικώς αδίπλωτα. Ειδικά η έλικα Β του TPR1 φαίνεται ότι είναι ιδιαίτερα ευκίνητη και ότι εκθέτει μία έντονα υδρόφοβη επιφάνεια στο περιβάλλον μέσo του μορίου. Αντίθετα, όταν τα ίδια τμήματα της Ssn6 συμμετέχουν σε σύμπλοκα με την Tup1 παρουσιά-ζουν την αναμενόμενη δευτεροταγή διαμόρφωση δομικού τμήματος TPR. Παράλληλα, υπάρ-χουν ισχυρές ενδείξεις ότι η μετάβαση από την κατάσταση του τυχαίου σπειράματος προς τη διαμόρφωση α-έλικας συνοδεύεται από τη διευθέτηση των α-ελίκων σε δεμάτια. Τέλος, η παρουσία του Ν-τελικού άκρου της Ssn6 εμποδίζει τη συσσωμάτωση του τμήματος που αποτε-λείται από τα TPRs 1-4 όταν απουσιάζει η Tup1. Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα της εργασίας προτείνεται ότι η Ssn6 ανήκει στις φυσικές μερικώς αδίπλωτες πρωτεϊνες. Η έλλειψη δομικής διαμόρφωσης και η δομική ευκαμψία στο TPR1 της πρωτεΐνης εξυπηρετεί την αναγνώριση της πρωτεϊνης Tup1. Ο σχηματισμός συμπλόκου με την πρωτεΐνη Tup1 οδηγεί σε δίπλωμα τα TPRs 1 και 2, σε αντιστοιχία με το μοντέλο συζευγμένου διπλώματος και σύνδεσης του προσδέματος που έχει παρατηρηθεί σε άλλες πρωτεϊνες. Ο σχηματισμός του συμπλόκου πραγματοποιείται με υδρόφοβες αλληλεπι-δράσεις μεταξύ των δύο πρωτεϊνών και από την πλευρά της Ssn6 συμμετέχει κατά κύριο λόγο η κυρτή επιφάνεια της TPR-υπερέλικας. Τα δύο τελευταία συμπεράσματα αναδεικνύουν ένα νέο μηχανισμό TPR-αλληλεπιδρά-σεων, ο οποίος δεν είχε αναγνωριστεί έως τώρα στα TPR-πρωτεϊνικά σύμπλοκα. / The tetratrico peptide repeat (TPR) is a 34 amino acid protein motif. Over 10000 TPRs have been identified in several species from archeobacteria to human. TPRs are protein-protein interaction mediators. Each TPR adopts a helix-turn-helix conformation in the form of α hairpin. Tandem TPRs stack together producing a right handed curved superhelix, with a convex and a concave surface. The Ssn6-Tup1 protein complex is a general transcriptional co-repressor in yeast. Homologous complexes have been identified in many organisms. The Ssn6 protein contains 10 tandem TPRs. TPRs 1-3 interact with the N-terminus (aa: 1-72) of Tup1 to form the complex. Using 3D-modeling and mutagenesis data, our group has previously shown that the structural integrity of TPR 1 and its correct positioning relatively to TPR 2 are crucial for Tup1 binding. In the present study we investigate the structural stability of the Tup1-binding domain of Ssn6 and the importance of the Ssn6 N-terminus, which contains a polyglutamine sequence. For the purpose of the study we used limited proteolysis mapping of Ssn6 and biochemical characterization and circular dichroism spectroscopy of specific Ssn6 and Tup1 segments and their complexes, followed by order/disorder predictions and molecular dynamics simulations. Our data suggest that TPRs 1 and 2 of Ssn6 are partially unfolded with the helix B of TPR 1 being highly dynamic, exposing an apolar surface to the solvent. However, TPRs 1-3 seem to adopt the TPR-typically expected secondary structure when the Ssn6 segment is in association with Tup1. In addition there are strong evidence that a conformational change occurs upon complex formation, consisting of acquisition of a-helical structure with simultaneous stabilization of coiled coil configuration. The presence of the Ssn6 N-terminus prevents the aggregation of the TPR 1-4 segment in the absence of Tup1. According to the above we propose that: Ssn6 is a member of the partially unfolded proteins group. The lack of typical conformation and the structural flexibility of TPR 1 serve the Tup1 recognition and binding. Complex formation followed by TPR 1 and 2 folding is consistent with the coupled folding to binding mechanism, reported on other binding proteins. The Ssn6-Tup1 complex formation is driven by hydrophobic interactions, in which mainly the convex surface of the TPR-superhelix takes part. The later two points reveal a novel interaction mechanism of the TPR motives.

- / -

- / -