TLR3 est un récepteur endosomal qui détecte les doubles brins d’ARN produits par HSV-1 lors de sa réplication. La majorité des patients déclarés portants des mutations dans le gène TLR3 ont souffert de l’encéphalite herpétique (EH) sans autre phénotype clinique majeur. Nous avons décrit trois patients présentant des mutations dans le gène TLR3. Ici, nous reportons trois nouvelles formes de défaut AD de TLR3: G743D+R811I et L360P, qui chez deux patients confèrent un défaut AD de TLR3 par dominance négative et haplo-insuffisance; et R867Q, qui confère à un patient un défaut partial AR de TLR3. Les fibroblastes des patients présentent une diminution des réponses médiées par TLR3 et sont plus susceptibles à l’infection par le HSV-1. Le défaut de TLR3 est donc présent chez six (5%) patients sur les 120 EH patients étudiés. De plus, de façon surprenante, nous avons identifé deux mutations dans le gène TLR3 chez deux patients présentant des pneumonies sévères dues au virus de l’influenza A (IAV). Deux patients sont hétérozygotes pour les mutations P554S et P680L dans le gène TLR3. Il a été reporté que P554S est délétère et exerte un effet dominant-négatif chez les patients d’EH. P680L est aussi délétère et cause un défaut AD de TLR3 par haplo-insuffisance. Les fibroblastes hétérozygotes pour la mutation P680L ainsi que les cellules épitheliales pulmonaires dérivées de iPSCs présentent une susceptibilité accrue à IAV. Ces résultats suggèrent que le défaut de TLR3 ne cause pas seulement l’EH mais aussi des pneumonies IAV sévères via une diminution des réponses immunitaires dépendantes de TLR3 et médiées par IFN intrinsèques au système nerveux central et aux poumons. / TLR3 is an endosomal receptor for dsRNA, an intermediate of viral replication. Most of the reported human TLR3 deficiency related to life-threatening HSV-1 encephalitis (HSE), in otherwise healthy children. To date, we have described 3 patients with TLR3 deficiency and 7 patients with TLR3 pathway gene deficiency. We herein report the three novel forms of TLR3 deficiency: G743D+R811I and L360P in two patients underlie AD TLR3 deficiency due to dominant negative (DN) and haploinsufficiency, respectively, and R867Q in one patient leads to a partial AR TLR3 deficiency. The patients’ fibroblasts display impaired TLR3 responses and enhanced HSV-1 susceptibility. TLR3 deficiency is therefore a relatively common in childhood HSE, as it is found in six (5%) of the 120 patients studied. In addition, we surprisingly found two TLR3 mutations in two patients with influenza A virus (IAV) pneumonitis. The pathogenesis of isolated severe influenza is largely unknown, until we recently reported a child with AR IRF7 deficiency. Two patients are each heterozygous for P554S and P680L in TLR3. P554S is previously found to be deleterious and DN in HSE patients. P680L is also deleterious and causes AD TLR3 deficiency by haploinsufficiency. We show that P680L heterozygous fibroblasts fail to produce IFN-β and -λ upon poly(I:C) and IAV infection. Furthermore, both P680L heterozygous and AR TLR3-deficient fibroblasts and iPSCs-derived lung epithelium display enhanced susceptibility to IAV, like IRF7-deficient cells. These findings suggest that TLR3 deficiency underlies not only HSE but also severe influenza due to impaired TLR3-dependent, IFN-mediated, CNS or lung-intrinsic antiviral immunity.

Polimorfismos em genes de receptores Toll-like (TLR) podem modular o risco de desenvolvimento de infecção, inflamação crônica e câncer. O objetivo deste estudo foi investigar a associação de polimorfismos em TLR ao risco aumentado de desenvolvimento de câncer de cabeça e pescoço, o carcinoma epidermóide (CEC) de boca e de laringe, e lesões bucais com potencial de transformação maligna, como o líquen plano oral (LPO), incluindo lesões idiopáticas e lesões liquenóides (LLO). Para tal foi conduzido um estudo caso-controle com 40 pacientes com CEC de boca, 35 com CEC de laringe, 175 com LPO (129 idiopático e 46 LLO) e 89 controles saudáveis, todos de origem basca. Oito SNP nos TLR1, TLR2, TLR4, TLR6, TLR9 e TLR10 foram genotipados por ensaios TaqMan® ou pirosequenciamento. A análise estatística por meio do teste qui-quadrado mostrou que a variante A, para o SNP TLR2-rs4696480 aumentou significativamente o risco para o desenvolvimento de CEC de boca (p=0.03) e LLO (p=0.0223). O genótipo AT representa risco de desenvolvimento de CEC de boca aumentado em 5.3 vezes quando comparado ao genótipo TT (OR=5.3, IC95%=1.19-13.63), e genótipo AA em 6.6 vezes (OR=6.6, IC95%=1.30-33.89). Quanto ao desenvolvimento de LLO, o genótipo AT representa um aumento no risco de 4.6 vezes comparado ao genótipo TT (OR=4.6, IC95%=1.55-13.38) e o genótipo AA em 4.1 vezes (OR=4.1, IC95%=1.33-12.88). Embora os genótipos AT e AA ocorram com significativa frequência no grupo LPO idiopático (p=0.045), este SNP não foi correlacionado estatisticamente à susceptibilidade de desenvolvimento deste. O SNP TLR2-rs4696480 pode ser relevante para o risco de desenvolvimento de CEC de boca e LLO nesta população, incentivando novos estudos sobre a possível associação destes grupos de doenças e SNP no gene do TLR2, colaborando com a demonstração de polimorfismos de TLR como marcadores úteis do prognóstico e prevenção do câncer de boca. / Polymorphisms in toll-like receptor (TLR) genes may modulate the risk of infection, chronic inflammation and cancer. This study investigated whether TLR polymorphisms were associated with an increased risk of head and neck cancer, including oral (OSCC) and laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC); and oral premalignant disorders such as oral lichenoid disease (OLD), including oral lichen planus (OLP) and oral lichenoid lesions (OLL). This case-control study included 40 OSCC, 35 LSCC, 175 OLD (129 OLP and 46 OLL) patients and 89 healthy controls, all of them from the Basque Country. Genetic polymorphisms in TLR1, TLR2, TLR4, TLR6, TLR9, and TLR10 were genotyped by TaqMan® assays or pyrosequencing. Chi-square analysis showed that the variant A for the SNP TLR2-rs4696480 increased OSCC (p=0.03) and OLL (p=0.0223) risk significantly. AT genotype increases the risk of developing an OSCC by 5.3 times compared with TT genotype (OR=5.3, 95%CI=1.19-13.63), and the AA by 6.6 times (OR=6.6, 95%CI=1.30-33.89). AT genotype increases the risk of developing OLL by 4.6 times compared with TT genotype (OR=4.6, 95%CI=1.55-13.38) and the AA by 4.1 times (OR=4.1, 95%CI=1.33-12.88). Although these mutated genotypes were significantly frequent in the OLP group (p=0.045), this SNP was not correlated with OLP susceptibility. TLR2-rs4696480 polymorphism may be relevant to OSCC and OLL susceptibility in this population; encouraging further studies to assess the possible association of this group of potentially malignant disorders and oral cancer with TLR2 SNP, which may help to demonstrate that TLR polymorphisms may be useful markers to prognosis and cancer prevention.

A ulceração aftosa recorrente (UAR) é uma das lesões mais freqüentes da cavidade bucal, comprometendo a qualidade de vida de seus portadores muitas vezes de maneira importante. Embora sua etiopatogenia ainda não esteja esclarecida, vários fatores têm sido consistentemente relacionados ao surgimento da UAR, especialmente alterações imunológicas e genéticas, conduzindo grande parte da investigação científica para esses campos do conhecimento. Os receptores Toll-Like (TLR) reconhecem produtos moleculares derivados, principalmente, de microrganismos, desencadeando a resposta inflamatória protetora. Entretanto, anormalidades em sua função podem estar relacionadas ao desenvolvimento de doenças, pela ativação aberrante do sistema imunológico. A proposta desta investigação foi a de se avaliar a expressão dos receptores TLR-2, TLR-4 e TLR-7 através do RT-PCR em tempo real, a partir de amostras de sangue periférico e da mucosa bucal de população portadora de UAR e indivíduos controles sadios. Cinco pacientes UAR e quatro controles voluntários compuseram a casuística estudada, sendo submetidos à biópsia de lesões de UAR ou de mucosa de revestimento sadia. Na mesma sessão os pacientes tiveram sangue coletado por venopunção. Posteriormente, ambos os materiais foram submetidos aos procedimentos laboratoriais de extração do RNA e análise de expressão dos receptores TLR por meio da técnica de RT-PCR real time. Não houve diferença significativa na expressão destes receptores entre portadores de UAR e controles sadios, nos dois tipos de amostra. Estudos mais aprofundados são necessários a fim de se verificar a real participação destes receptores na UAR, visto que não há outros estudos nesta área e a amostra analisada foi pequena. / Recurrent aphthous stomatitis (RAS) is one of the most common oral mucosal diseases which may cause serious impairment on patients quality of life. Despite its still unknown pathogenesis, several factors have been consistently associated with RAS, especially genetic and immunological changes, which has driven a lot of research effort towards these issues. Toll-Like receptors (TLR) recognize molecular products, mainly derived from microorganisms, triggering the inflammatory response. However, abnormalities in their function may give rise to the development of diseases, through abnormal activation of the immune system. The purpose of this investigation was to evaluate the expression of receptors TLR-2, TLR-4 and TLR-7 in peripheral blood and tissue samples of RAS and healthy controls, through real time RT-PCR technique. Five UAR patients and four healthy volunteers with no RAS history composed the casuistic and were submitted to biopsy of their UAR lesions or normal oral mucosa. On that same session patients had a blood sample taken through venopuncture. Both samples (tissue and blood) were, afterwards, submitted to lab procedures of RNA extraction and toll-like receptors expression through real time RT-PCR. There were no significant differences in the expression of these receptors between RAS and healthy controls in the two sample types. Further studies are necessary to allow sound conclusions on the actual participation of these receptors in RAS, since the sample followed were small and there are no similar studies published.

INTRODUÇÃO: Líquen plano (LP) é uma doença mucocutânea de natureza inflamatória crônica de etiologia ainda desconhecida. A estimulação da imunidade inata via os receptores Toll-like (TLRs) podem influenciar as células dendríticas e direcionar a resposta de células T CD4+ e CD8+ efetoras, assim como também favorecer o estado inflamatório do LP. OBJETIVOS: Avaliar o perfil fenotípico de células dendríticas mielóides (mDCs) e plasmocitóides (pDCs) e de linfócitos T CD4+ e CD8+ após estímulo com agonistas de TLRs no sangue periférico de pacientes com LP. Além disto, avaliar a frequência, perfil de maturação e os subtipos de células T CD4+ e TCD8+ reguladores. MÉTODOS: Foram selecionados 18 pacientes com LP (15 mulheres, 3 homens), com 41,57 ± 4,73 anos de idade e um grupo controle com 22 indivíduos sadios (18 mulheres, 4 homens), com 43,92 ± 7,83 anos de idade. As células mononucleares (CMNs) de sangue periférico foram avaliadas por citometria de fluxo quanto à: 1) Produção de TNF-? em mDCs e de IFN-? em pDCs em CMNs ativadas por agonistas de TLR 4, 7, 7/8 e 9; 2) Análise de células T CD4+ e CD8+ monofuncionais e polifuncionais após estímulo com agonistas de TLR 4, 7/8, 9 e enterotoxina B de Staphylococcus aureus (SEB); 3) Avaliação de células Th17 e Th22/Tc22 em CMNs após estímulo com SEB; 4) Frequência, perfil de maturação e subtipos de células T CD4+ e CD8+ reguladoras. RESULTADOS: 1) Nos pacientes com LP foi demonstrado um aumento na frequência de mDCs TNF-alfa+ após estímulo com agonistas de TLR4/LPS e TLR7-8/CL097, mas com imiquimode/TLR7 houve diminuição da expressão de CD83. Já nas pDCs do grupo LP, o imiquimode foi capaz de diminuir a expressão de CD80 e o CpG/TLR9 diminuiu a expressão de CD83 no LP. 2) As células T CD4+ secretoras de IL-10 mostraram aumento da frequência nos níveis basais, que diminuiu após estímulo com LPS e SEB. Em contraste, a produção de IFN-y aumentou em resposta ao LPS enquanto diminuiu para CpG. As células T CD4+ polifuncionais, secretoras de 5 citocinas simultâneas (CD4+IL-17+IL-22+TNF+IL-10+IFN-y+) diminuíram no LP após estímulo com CL097 e CpG. Entretanto, na ausência de IL-10, houve aumento da frequência de células CD4+IL-17+IL-22+TNF+IFN-y+ em resposta ao LPS. Um aumento na polifuncionalidade foi observado em células TCD4+ que expressam CD38, marcador de ativação crônica e na ausência de IL-10. Similarmente, às TCD4+, uma diminuição de células T CD8+ IFN-y+ e TNF+ foram detectadas após estímulo com CpG. 3) As células Th22/Tc22 nos níveis basais e após estímulo com SEB se mostraram aumentadas. As células Th17 não mostraram diferenças entre os grupos. 4) A frequência das células T CD4+ e CD8+ reg totais (CD25+Foxp3+CD127low/-) está elevada no LP. Quanto aos perfis de maturação, há aumento na frequência de células TCD4+ de memória efetora enquanto que para as células T CD8+ há predomínio das células de memória central. Quanto aos subtipos, há aumento nas células T CD4+ regs periféricas (pT reg). CONCLUSÕES: O estado de ativação das mDCs após ativação das vias de TLRs 4 e 7/8 pode influenciar na geração de resposta T efetoras no LP. O perfil de resposta monofuncional e polifuncional aos estímulos TLRs reflete a ativação destas células no sangue periférico. Além disso, o aumento de Th22/Tc22 e das células T regs indicam uma relação entre regulação e células efetoras no sangue periférico evidenciando que existem alterações extracutâneas no LP / BACKGROUND: Lichen planus (LP) is a mucocutaneous disease of chronic inflammatory course of unknown etiology. Stimulation of the innate immune system via Toll-like receptors (TLRs) may influence the dendritic cells and targeting the CD4+ and effector CD8+ T cell responses, as well as promoting inflammatory status of the LP. OBJECTIVES: To evaluate the phenotypic profile of myeloid dendritic cells (mDCs), plasmacytoid (pDCs) and CD4+ and CD8+ T lymphocytes after stimulation with TLR agonists in peripheral blood of patients with LP. Moreover, to evaluate the frequency, maturation profile and subtypes of CD4+ and CD8+ T regulators cells. METHODS: We selected 18 patients with LP (15 women, 3 men) with 41.57 ± 4.73 years old and a control group of 22 healthy subjects (18 women, 4 men), with 43.92 ± 7, 83 years old. Mononuclear cells from peripheral blood (PBMCs) were assessed by flow cytometry for: 1) mDC TNF-alfa production and pDCs IFN-alfa production in PBMCs activated by agonists of TLR 4, 7, 7/8 and 9; 2) Analysis of monofunctional and polyfunctional CD4+ and CD8+ T cells after stimulation with TLR 4 agonists, 7/8, 9 and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB); 3) Evaluation of Th17 and Th22/ Tc22 cells in PBMCs after stimulation with SEB; 4) Frequency, maturation profile and subtypes of regulatory CD4+ and CD8+ T cells. RESULTS: 1) Patients with LP showed an increased frequency of TNF-alfa+ mDCs after stimulation with agonists of TLR4/LPS and TLR7-8 /CL097, whereas with imiquimod /TLR7 induced a decreased CD83 expression. Already in the pDCs of LP group the imiquimod was able to decrease the CD80 expression and CpG/TLR9 decreased CD83 expression. 2) CD4+ T cells secreting IL-10 demonstrated an increased frequency at the baseline levels, which decreased after stimulation with LPS and SEB. In contrast, the production of IFN-y increased in response to LPS while decreased to CpG. Polyfunctional CD4+ T cells secreting simultaneously 5 cytokines (CD4+IL-17+IL-22+TNF+IL-10+IFN-y+) decreased in the LP after stimulation with CpG and CL097. However, in the absence of IL-10, occurred an increased frequency of CD4+IL-17+IL-22+IFN-y+TNF+ in response to LPS. An increase in the polyfunctional response was seems in CD4+ T cells expressing CD38, a chronic activation marker, in the absence of IL-10. Similarly to the CD4+ T cells, a decreased CD8+ T cells secreting IFN-? and TNF was observed in LP, after stimulation with CpG. Polyfunctional CD8+ T cells from LP group showed decreased response with 3 and 4 cytokines at baseline condition, and upon SEB and CL097 stimulations, occurred an increased frequency of these cells. In LP group, T cells CD8+CD38+ polyfunctional showed low capacity, such as CD4+CD38+ cells. 3) The Th22/Tc22 cells already at baseline and after stimulation with SEB showed increased frequency. The Th17 cells showed no differences between groups. 4) The frequency of CD4+ and CD8+ total reg (CD25+Foxp3+CD127low/-) is increased in LP. The profiles of maturity, an increase in the frequency of CD4+ effector cells whereas for memory CD8+ T cells there is a predominance of central memory cells. As for the subtypes, there is an increase in CD4+ peripheral T regs cells (pT reg). CONCLUSIONS: The activation state of mDCs after activation of the pathways of TLRs 4 and 7/8 can influence the response and generation of effector T cells in the LP. The monofunctional and polyfunctional response profile for TLRs stimuli reflects the activation of these cells in peripheral blood. Furthermore, the increase of Th22/Tc22 and T regs cells indicate a relationship between regulatory and effector cells in peripheral blood showing that there are extra-cutaneous alterations in the LP

A imaturidade do sistema imune adaptativo ao nascimento envolve alterações funcionais das células apresentadoras de antígenos. O objetivo foi avaliar a ativação via TLR-4 e resposta de monócitos de sangue de cordão umbilical de recém-nascidos (RN) pré-termo <34 semanas (Grupo 1), <font face=\"Symbol\">&#179;34 e <37 semanas (Grupo 2) e a termo (Grupo 3). Os resultados mostraram alta produção de IL-8, TNF-a, IL-1b e IL-6 e significativa menor produção de IL-10 por monócitos neonatais. O fator NF-kB apresentou ativação semelhante entre os neonatos e adultos. As moléculas p38, ERK-1/2 e IRAK-4 apresentaram-se mais ativadas em monócitos dos RN do Grupo 1 quando comparados aos RN do Grupo 3 e adultos. A capacidade fagocitária de monócitos e neutrófilos dos RN mostrou competência reduzida. A produção de H2O2 foi reduzida em monócitos e neutrófilos apenas dos RN pré-termo. Os resultados sugerem um perfil imunológico neonatal funcionalmente distinto, revelando um desequilíbrio da resposta imune inata, com uma menor eficiência no controle desta resposta, o que pode levar a uma predisposição à sepse. / The immaturity of the adaptive immune system at birth involves functional changes in antigen-presenting cells. The objective was to evaluate the activation via TLR-4 and response of monocytes from umbilical cord blood of preterm newborns (NB) < 34 weeks (Group 1), preterm NB <font face=\"Symbol\">&#179;34 and < 37 weeks (Group 2) and term NB (Group 3). The results show high production of IL-8, TNF-a, IL-1b and IL-6 and a significantly lower production of IL-10 by neonatal monocytes. NF-kB factor presented similar activation among neonates and adults. p38, ERK-1/2 and IRAK-4 molecules were more activated in monocytes of newborns from Group 1 as compared to newborns from Group 3 and adults. The phagocytic ability of monocytes and neutrophils from newborns showed a reduced competence. The H2O2 production was reduced in monocytes and neutrophils only in preterm newborns. The results suggest a functionally distinct neonatal immune profile, revealing an imbalance of the innate immune response, with a lower efficiency in the control of this response, which could lead to a predisposition to sepsis.

Submitted by Daniella Santos (daniella.santos@ufma.br) on 2017-11-23T14:52:48Z No. of bitstreams: 1 DanielGomesJúnior.pdf: 8247020 bytes, checksum: ccc1a51b78a0a368f50ca5393fa8d97c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-23T14:52:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DanielGomesJúnior.pdf: 8247020 bytes, checksum: ccc1a51b78a0a368f50ca5393fa8d97c (MD5) Previous issue date: 2017-08-25 / This research proposes a methodology for development of Virttual Reality (VR) and Augmented Reality (AR) aplications, using natural markers for industrial scenarios. The proposed methodology uses the object annotation concept and visualization proposals are presented both for development of VR as for AR environments. In VR environments, the methodology is applied for object detection step of the semi-automatic environment development. On the other hand, in AR environments, is presented the concept of georreferenced natural markers, which use the georreferenced data integrated with object detection process using image processing techniques. The energy substations scenarios were used as case study for both approaches. Architectures are presented for construction and data visualization in industrial environments. Both for VR as for AR approaches, this work proposes using 3D natural markers based in Haar-like features for object training and detection process. The results enable the equipment detection at different points of view, within the operating scenario. Besides that, in AR, it enables the pose estimation in real-time using ORB features, while in VR it enables the semi-automatic object detection, which are used as information points for inclusion of virtual information. Several industrial scenarios, and especially the energy sector, has a high degree of complexity in the information processing and visualization. In this sense, beyond the 3D natural markers methodology, this work presents new visualization applications for industrial scenario visualization in VR and AR approaches. / Esta pesquisa propõe uma metodologia para construção de aplicações de Realidade Virtual (RV) e Realidade Aumentada (RA) com uso de marcadores naturais em cenários industriais. A metodologia usa o conceito de anotação de objetos e são apresentadas propostas de visualização para ambientes industriais tanto em formato de RV quanto de RA. Nos ambientes de RV, a metodologia é aplicada através da detecção de objetos no processo de construção semiautomática dos ambientes. Por outro lado, nos ambientes de RA, apresenta-se o conceito de marcadores naturais georreferenciados, que associam dados georreferenciados ao processo de detecção de objetos com técnicas de processamento de imagens. O cenário de subestações de energia elétrica foi utilizado como estudo de caso para as duas abordagens. São apresentadas arquiteturas para construção e visualização de dados em ambientes industriais. Tanto sob a forma de RV quanto de RA, este trabalho propõe o uso de marcadores naturais 3D baseados em Haar-like features para o processo de treinamento e detecção de objetos. Os resultados permitem a detecção de equipamentos a partir de diferentes pontos de vista no cenário de operação. Além disso, em RA, esta abordagem permite a estimativa de pose em tempo real com uso de ORB features e permite, em RV, a detecção semiautomática de objetos que são utilizados como pontos de informação para adição de informações virtuais. Diversos cenários industriais, principalmente o setor elétrico, possuem grau elevado de complexidade no tratamento e visualização das informações. Nesse sentido, além da metodologia de marcadores naturais 3D, este trabalho apresenta novas aplicações de visualização no cenário industrial com abordagens em RV e RA.

O TSPO (Translocator protein 18 KDa) é uma proteína intracelular localizada na membrana mitocondrial externa, mas também na membrana citoplasmática, e no núcleo. O TSPO está envolvido na biossíntese de esteroides, proliferação celular, apoptose, estresse oxidativo, e na modulação da inflamação, principalmente no sistema nervoso central, onde a proteína é considerada um marcador da neuroinflamação. Os neutrófilos representam células-chave no processo inflamatório sendo as primeiras células a chegarem no foco inflamatório onde exercem atividades fagocíticas, secretórias e microbicidas. O presente trabalho investigou os efeitos de diferentes ligantes de TSPO Diazepam, Ro5-4864 (agonistas parciais) e PK-11195 (antagonista) na ativação dos neutrófilos in vitro focando na via de ativação do Toll-like receptor (TLR) e de receptores transmembranas ligados a proteína G (GPCR). Neutrófilos obtidos da cavidade peritoneal de camundongos BalbC machos quatro horas após injeção do glicogênio de ostra (1%), foram tratados in vitro com meio de cultura, veículo, Diazepam, Ro5-4864, PK-11195 (10, 100, e 1000 nM), e estimulados ou não com Lipopolissacarídeo (LPS) ou Leucotrieno B4 (LTB4). Foram avaliados em condições basais e após estímulo: a expressão de TSPO e de moléculas de adesão por citometria de fluxo; a migração pelo ensaio de quimiotaxia em placa; a produção de citocinas e do óxido nítrico por ELISA e pela reação de Griess, respectivamente; e finalmente, a geração de espécies reativas de oxigênio por espectrofotômetro de fluorescência. Os resultados obtidos mostram que o TSPO é expresso em neutrófilos em condições basais, e que os estímulos inflamatórios com LPS ou LTB4 não alteram essa expressão. Os ligantes de TSPO não afetam as funções de neutrófilos ativados pelo LPS, salvo a acentuação da geração de espécies reativas (ROS) observada com Ro5-4864 em células estimuladas com LPS. Os neutrófilos estimulados pelo LTB4, quando pré-tratados com os ligantes de TSPO, apresentaram redução na clivagem da L-selectina, redução de quimiotaxia, e indução da geração de ROS. Baseado nestes resultados e nos dados da literatura, concluímos que os efeitos dos ligantes de TSPO sobre as funções neutrofílicas concentram-se na expressão de moléculas de adesão, no estresse oxidativo e na migração. Estes efeitos dependem da via de ativação e do tipo celular. / TSPO (Translocator protein 18 kDa) is an intracellular protein located on the out mitochondrial membrane, but also on the cytoplasmatic membrane and in the nucleus. TSPO is involved in endogen steroids substances biosynthesis, cellular proliferation, apoptosis, oxidative stress and in the modulation of inflammatory process, principally in the central nervous system where the protein is a marker of neuroinflammation. Neutrophils are key-cells in the inflammatory process, being the first cell line that reach the inflammatory focus, where they realize their phagocytic, secretory and microbicidal activities. This study assessed the effects of TSPO ligands Diazepam, Ro5-4864 (partial agonists) and PK-11195 (antagonist) on in vitro neutrophils activation, focusing on the Toll-like receptor (TLR) and G protein coupled receptors (GPCRs) pathways. Neutrophils obtained from de peritoneal cavity of male BalbC mouse after four hours of Oyster glycogen injection (1%), were treated in vitro with culture medium, vehicle, Diazepam, Ro5-4864, PK-11195 (10, 100, e 1000 nM) and stimulated or not with lipopolysaccharide (LPS) or Leukotriene B4 (LTB4). We assessed in basal conditions and after stimulus:The TSPO and adhesion molecules proteic expression by flow cytometry; the migration by a plate chemotaxis assay; Nitric oxide and cytokines production by ELISA and the Griess reaction, respectively; and finally the reactive oxygen species generation by a fluorescence spectrophotometer. The results show that TSPO is expressed in neutrophils in basal conditions, and that inflammatory stimulus with LPS and LTB4 did not alter this expression. We also show that TSPO ligands did not affect neutrophil function activated by LPS. However, neutrophils stimulated by LTB4, when pre-treated with TSPO ligands shown a reduced L-selectina cleavage, chemotaxis reduction and induction of ROS generation. Based on these data and in literature data, we concluded that the effects of TSPO ligands in neutrophilic functions is concentrated on adhesion molecules expression, on oxidative stress and on the migration. These effects depend to the activation pathways and to the cellular type.

O TSPO (Translocator protein 18 KDa) é uma proteína intracelular localizada na membrana mitocondrial externa, mas também na membrana citoplasmática, e no núcleo. O TSPO está envolvido na biossíntese de esteroides, proliferação celular, apoptose, estresse oxidativo, e na modulação da inflamação, principalmente no sistema nervoso central, onde a proteína é considerada um marcador da neuroinflamação. Os neutrófilos representam células-chave no processo inflamatório sendo as primeiras células a chegarem no foco inflamatório onde exercem atividades fagocíticas, secretórias e microbicidas. O presente trabalho investigou os efeitos de diferentes ligantes de TSPO Diazepam, Ro5-4864 (agonistas parciais) e PK-11195 (antagonista) na ativação dos neutrófilos in vitro focando na via de ativação do Toll-like receptor (TLR) e de receptores transmembranas ligados a proteína G (GPCR). Neutrófilos obtidos da cavidade peritoneal de camundongos BalbC machos quatro horas após injeção do glicogênio de ostra (1%), foram tratados in vitro com meio de cultura, veículo, Diazepam, Ro5-4864, PK-11195 (10, 100, e 1000 nM), e estimulados ou não com Lipopolissacarídeo (LPS) ou Leucotrieno B4 (LTB4). Foram avaliados em condições basais e após estímulo: a expressão de TSPO e de moléculas de adesão por citometria de fluxo; a migração pelo ensaio de quimiotaxia em placa; a produção de citocinas e do óxido nítrico por ELISA e pela reação de Griess, respectivamente; e finalmente, a geração de espécies reativas de oxigênio por espectrofotômetro de fluorescência. Os resultados obtidos mostram que o TSPO é expresso em neutrófilos em condições basais, e que os estímulos inflamatórios com LPS ou LTB4 não alteram essa expressão. Os ligantes de TSPO não afetam as funções de neutrófilos ativados pelo LPS, salvo a acentuação da geração de espécies reativas (ROS) observada com Ro5-4864 em células estimuladas com LPS. Os neutrófilos estimulados pelo LTB4, quando pré-tratados com os ligantes de TSPO, apresentaram redução na clivagem da L-selectina, redução de quimiotaxia, e indução da geração de ROS. Baseado nestes resultados e nos dados da literatura, concluímos que os efeitos dos ligantes de TSPO sobre as funções neutrofílicas concentram-se na expressão de moléculas de adesão, no estresse oxidativo e na migração. Estes efeitos dependem da via de ativação e do tipo celular. / TSPO (Translocator protein 18 kDa) is an intracellular protein located on the out mitochondrial membrane, but also on the cytoplasmatic membrane and in the nucleus. TSPO is involved in endogen steroids substances biosynthesis, cellular proliferation, apoptosis, oxidative stress and in the modulation of inflammatory process, principally in the central nervous system where the protein is a marker of neuroinflammation. Neutrophils are key-cells in the inflammatory process, being the first cell line that reach the inflammatory focus, where they realize their phagocytic, secretory and microbicidal activities. This study assessed the effects of TSPO ligands Diazepam, Ro5-4864 (partial agonists) and PK-11195 (antagonist) on in vitro neutrophils activation, focusing on the Toll-like receptor (TLR) and G protein coupled receptors (GPCRs) pathways. Neutrophils obtained from de peritoneal cavity of male BalbC mouse after four hours of Oyster glycogen injection (1%), were treated in vitro with culture medium, vehicle, Diazepam, Ro5-4864, PK-11195 (10, 100, e 1000 nM) and stimulated or not with lipopolysaccharide (LPS) or Leukotriene B4 (LTB4). We assessed in basal conditions and after stimulus:The TSPO and adhesion molecules proteic expression by flow cytometry; the migration by a plate chemotaxis assay; Nitric oxide and cytokines production by ELISA and the Griess reaction, respectively; and finally the reactive oxygen species generation by a fluorescence spectrophotometer. The results show that TSPO is expressed in neutrophils in basal conditions, and that inflammatory stimulus with LPS and LTB4 did not alter this expression. We also show that TSPO ligands did not affect neutrophil function activated by LPS. However, neutrophils stimulated by LTB4, when pre-treated with TSPO ligands shown a reduced L-selectina cleavage, chemotaxis reduction and induction of ROS generation. Based on these data and in literature data, we concluded that the effects of TSPO ligands in neutrophilic functions is concentrated on adhesion molecules expression, on oxidative stress and on the migration. These effects depend to the activation pathways and to the cellular type.

Malária é uma das principais causas de doença e morte no mundo, principalmente de crianças. É considerada a força de seleção evolucionária mais forte que se conhece na história recente do genoma humano. Além dos fatores ambientais e do próprio parasito, fatores genéticos do hospedeiro têm um papel fundamental tanto na suscetibilidade como na evolução clínica da infecção. O sistema imune inato reconhece os plasmódios através de um número limitado de receptores de reconhecimento padrão (PRRs) e inicia vários mecanismos de defesa que resultam no desenvolvimento de inflamação e resistência do hospedeiro à infecção. Mas, a eliminação completa do parasito requer respostas imunes adaptativas que são amplificadas pela ativação do sistema imune inato. As manifestações clínicas de malária são dependentes dos níveis de citocinas próinflamatórias circulantes produzidas, as quais em níveis altos contribuem para a imunopatologia da doença. O balanço entre respostas pró e antiinflamatórias dirigidas contra o parasito é considerado crítico para a proteção clínica, assim a resposta imune inata pode contribuir tanto para proteção da malária como para modular a resposta imune adaptativa. Neste estudo, nós investigamos polimorfismos de um único nucleotídeo (SNP) dos genes de três PRRs: TLR, MBL e CR1 de indivíduos infectados por Plasmodium e residentes em áreas endêmicas de malária no Brasil. Os SNPs TLR1 (I602S), TLR4 (D229G), TLR6 (S249P), TLR9 (T-1237C/ -1486C), MBL [exon 1 nos códons 52, 54, e 57 (MBL2*A ou D, A ou B e A ou C, respectivamente); na região do promotor na posição -221 (*X ou *Y); e na posição +4 da região não traduzida (*P ou *Q)] e CR-1(C5507G) foram determinados por PCR-RFLP. Nós observamos associações entre os polimorfismos TLR1 I602S, TLR6 S249P e da região não traduzida +4 (*Q) e manifestações clínicas de malária e entre os polimorfismos TLR9 T-1486C, TLR T-1237C, MBL*D (códon 52) e do diplótipo de produção insuficiente de MBL (XA+O/O) e parasitemias mais altas. Nenhuma associação foi observada entre o polimorfismo CR-1 C5507G e manifestações clínicas de malária ou com parasitemia. Ao analisarmos juntos os polimorfismos de MBL e TLR, observamos que indivíduos com diplótipo de produção suficiente de MBL (YA/YA+YA/XA+YA/O+XA/XA) TLR1 I602S tinham menos manifestações clínicas de malária e indivíduos com diplótipo de produção suficiente de MBL e não carreadores do alelo TLR9 -1486C tinham parasitemias mais baixas do que os indivíduos com diplótipo de produção insuficiente de MBL e carreadores dos alelos variantes de TLR1 I602S e TLR9 -1486C, respectivamente. Juntos, nossos dados indicam que polimorfismos do promotor de TLR-9 e os diplótipos de produção insuficiente de MBL (XA+O/O) devem de algum modo controlar o nível de parasitemia por plasmódios enquanto a deficiência de TLR1 parece predispor para a presença de manifestações clínicas de malária. Também, podemos sugerir que existe uma cooperação entre TLR1, TLR9 e MBL na ativação da resposta imune inata na malária. Estes achados genéticos devem contribuir para o entendimento da patogênese da malária e levantar uma questão potencialmente interessante que é digna de investigações posteriores em outras populações a fim de validar a contribuição genética destes loci na patogênese da malária / Malaria is one of the major causes of disease and death worldwide, mainly of children. It is also the strongest known force for evolutionary selection in the recent history of the human genome. Besides environmental and parasite factors, host genetic factors play a major role in determining both susceptibility to malaria and the course of infection. Innate immune mechanisms directed against Plasmodium parasites both contribute to protection from malaria and modulate adaptive immune responses. The innate immune system recognizes Plasmodium via a limited number of pattern-recognition receptors (PRRs) and initiates a broad spectrum of defense mechanisms that result in the development of inflammation and host resistance to infection. But, the complete control of the infection requires adaptive immune responses; and the innate immune system is also very efficient in instructing the cellular mediators of adaptive immunity to lead a powerful additional strike force against the parasite. Clinical malaria is characterized by high levels of circulating proinflammatory cytokines, which are thought to contribute to the immunopathology of the disease. The balance between pro- and anti-inflammatory responses toward the parasite is considered critical for clinical protection. The innate immune system initiates and thus sets the threshold of immune responses. In this study, we investigated single nucleotide polymorphisms (SNP) in the genes of three PRRs: TLR, MBL and CR1 in Plasmodium-infected individuals living in endemic areas of Brazil. The SNPs TLR1 (I602S), TLR4 (D229G), TLR6 (S249P), TLR9 (T-1237C/ -1486C), MBL [in the coding sequence of exon 1 at codons 52, 54, and 57 (MBL2*A or D, A or B, and A or C, respectively); in the promoter region at position -221 (*X or *Y); and in the untranslated sequence at position +4 (*P or *Q)] and CR-1(C5507G) were determined by PCR-RFLP. We observed associations of the TLR1 I602S, TLR6 S249P and untranslated sequence at position +4 MBL (*Q) variants with clinical manifestations of malaria and of the TLR9 T-1486C, TLR9 T-1237C, MBL2*D and MBL-insufficient diplotype (XA+O/O) with higher parasitemias. No association was observed to the CR-1 C5507G ) and clinical manifestations of malaria or parasitemia. Also, we observed that individuals with MBLsufficient haplotype (YA/YA+YA/XA+YA/O+XA/XA) and not bearing the allele TLR1 I602S had less clinical manifestations of malaria and individuals with MBL-sufficient haplotype and not bearing TLR9 -1486C had lower parasitemias when compared to individuals with MBL-insufficient diplotype and bearing the variant alleles TLR1 I602S and TLR9 -1486C, respectively. Altogether, our data indicate that TLR-9 promoter and MBL-insufficient haplotype (XA+O/O) polymorphisms to some extent may control the level of Plasmodium parasitemia while TLR1 deficiency seems to predispose to mild malaria. Also, they could suggest cooperation among TLR1, TLR9 and MBL in the immune response against malaria. These genetic findings may contribute to the understanding of the pathogenesis of malaria and raise a potentially interesting issue that is worthy of further investigation in other population in order to validate the genetics contribution of these loci to the pathogenesis of malaria

Researches from different fields around the world are searching for both new sources of biomaterials and potential hepatocytes in order to supply drug tests, cell therapies, and cell transplantation as alternative therapeutic support to liver diseases and injuries. Placenta may be eligible as a new model in tissue engineering due to its rich extracellular matrix (ECM) and availability after birth. Placental scaffolds were produced by decellularization with 0.01, 0.1 and 1% SDS, and 1% Triton X-100 which were valued by means of structure and composition. Afterwards, placental scaffolds were co-cultured with mouse embryonic fibroblasts in a tridimensional (3D) rotating system. Placental scaffolds presented a well-preserved acellular ECM containing 9.42 &#177; 5.2 ng dsDNA per mg of ECM. Weak collagen I of the natives clearly appears in decellularized ECM while the collagen III, once well observed in native placenta, it was absent on scaffolds. This interesting observation may have been due to the solubilization SDS-induced of the collagen III fibrils during decellularization. Fibronectin was well-observed in placental scaffolds whereas laminin and collagen IV were strongly stained. Recellularized with fibroblasts by a 3D culture system, placental scaffolds showed potential for repopulation, with cells adhered throughout its acellular ECM. Placental scaffolds were then newly recellularized, aiming now for differentiation of mouse embryonic stem cells into hepatic cells. In a protocol of 23 days, it was simulated major events of liver embryonic development by adding growth factors. As result, a high index of cells adhered, proliferated and migrated throughout outer and inner scaffolds ECM surface. Absence of Oct4 and Nanog showed that Activin A and Wnt3a (d0-6) induced primitive endoderm fate, and negative label for Foxa2 and Sox17 representing BMP4 and FGF2 (d6-10) differentiation-induced generating definitive endoderm cells. Also, FGF1, FGF4 and FG8b (d10-14) induced hepatoblast phenotype cells, that were observed positive for AFP and CK7 markers. Finally, HGF and FS-288 (d14-23) induced to hepatocyte-like cells, positive for CK18 and Alb markers. The hepatocyte-like cells functional aspects were observed by glycogen storage. Though a heterogeneous cell hepatic lineage was confirmed, mouse placental scaffolds shown a useful model to support recellularization with simultaneous differentiation into hepatic fate simulating phases of embryonic development. / Pesquisas de diferentes campos ao redor do Mundo estão em busca de novas fontes tanto de biomateriais, quanto de potenciais hepatócitos, a fim de suprir testes de drogas, terapias celulares e transplante de células, como suporte terapêutico alternativo para doenças e lesões hepáticas. Placentas podem ser elegíveis como um novo modelo em Engenharia Tecidual em decorrência de sua rica matriz extracelular (ECM), e disponibilidade após o nascimento. Os scaffolds placentários foram produzidos por decelularização com SDS 0,01, 0,1 e 1% e Triton X-100 1%, os quais foram avaliados por meio da estrutura e composição. Posteriormente, os scaffolds placentários foram co-cultivados com fibroblastos embrionários de camundongos em um sistema rotativo tridimensional (3D). Os scaffolds placentários apresentaram uma MEC acelular bem conservada, contendo 9,42 &#177; 5,2 ng/dsDNA/mg/MEC. O fraco colágeno I nos nativos aparece claramente na MEC descelularizada, enquanto o colágeno III bem visível na placenta nativa estava ausente nos scaffolds. Esta observação interessante pode decorrido da solubilização das fibrilas de colágeno III, induzida pelo SDS durante a decelularização. A fibronectina foi bem observada nos scaffolds placentários, enquanto a laminina e o colágeno IV estiveram fortemente marcados. Recelularizados com fibroblastos por um sistema de cultura 3D, os scaffolds placentários mostraram potencial para repovoamento, com células aderidas ao longo de sua MEC acelular. Os scaffolds placentários foram então novamente recelularizados, visando agora a diferenciação de células tronco-embrionárias de camundongos em células hepáticas. Em um protocolo de 23 dias, foram simulados os grandes eventos do desenvolvimento embrionário do fígado, pela adição de fatores de crescimento. Como resultado, um alto índice de células aderiu, proliferou e migrou através das superfícies externa e interna dos scaffolds. A ausência de Oct4 e Nanog demostraram que o Activin A e o Wnt3a (d0-6) induziram o destino endoderma primitivo, e a marcação negativa para Foxa2 e Sox17 representaram a geração de células endodermais definitivas pela diferenciação induzida por BMP4 e FGF2 (d6-10). Ainda, FGF1, FGF4 e FG8b (d10-14) induziram células do fenótipo hepatoblasto, que foram observadas positivas para os marcadores AFP e CK7. Finalmente, HGF e FS-288 (d14-23) induziram as células hepatocyte-like, positivas para os marcadores CK18 e Alb. The hepatocyte-like cells functional aspects were observed by glycogen storage. Though a heterogeneous cell hepatic lineage was confirmed, mouse placental scaffolds shown a useful model to support recellularization with simultaneous differentiation into hepatic fate simulating phases of embryonic development. Os aspectos funcionais das células hepatocyte-like foi observada pelo armazenamento de glicogênio. Embora uma linhagem hepática formada por células heterogêneas tenha sido confirmada, os scaffolds placentários de camundongos se mostraram um modelo útil para sustentar a recelularização com simultânea diferenciação em destino hepático, simulando fases do desenvolvimento embrionário.