Notre recherche porte sur la participation d’individus âgés fragilisés à un essai clinique destiné à prévenir les syndromes démentiels dégénératifs. 812 personnes âgées, dont 527 ayant accepté de participer à une étude destinée à prévenir la maladie d’Alzheimer et 285 ayant refusé de participer à ce même essai ont rempli un questionnaire comprenant des renseignements sociodémographiques et des échelles évaluant les variables psychologiques suivantes : le soutien social perçu, le lieu de contrôle de la santé, la facette anxiété du Névrosisme, la menace perçue de la maladie d’Alzheimer, les motifs d’acceptation et de refus de participer un une étude destinée à prévenir la maladie d’Alzheimer. Les résultats mettent en évidence que le niveau d’étude, l’âge, la menace perçue de la maladie d’Alzheimer, le contrôle interne et le contrôle externe «personnages puissants» participent à distinguer les « acceptants » et les « refusants ». Les «acceptants» ont un niveau d’étude plus élevé et sont plus jeunes que les «refusants». Les « acceptants » se sentent davantage menacés par la maladie d’Alzheimer et ont plus tendance à présenter un contrôle de la santé de type interne ou externe «personnages puissants» que les «refusants». Trois facteurs motivationnels d’acceptation de participer ont été mis en évidence : le facteur I «Bénéfices perçus», le facteur II «Influence sociale» et le facteur III «Orientation sur soi». Trois facteurs motivationnels de refus de participer ont émergé : le facteur I «Manque d’intérêt», le facteur II «Raisons médicales» et le facteur III «Contraintes perçues». La présente étude contribue à une meilleure compréhension des caractéristiques psychologiques des individus âgés acceptant ou refusant de participer à une étude préventive conduite dans le domaine de la maladie d’Alzheimer, ce qui pourrait notamment aider à la mise en place d’actions améliorant la participation des personnes âgées. / Our research deals with frail elderly persons participation in a dementia preventive study. 812 elderly persons: 527 which accepted and 285 which refused participation in an Alzheimer disease preventive program, completed a questionnaire which evaluated sociodemographic variables and psychological variables: social support, health locus of control, anxiety facet of Neuroticism, perceived threat about Alzheimer disease, motives to accept or to refuse to take part in an Alzheimer disease preventive study. Results show that level of education, age, threat about Alzheimer disease, internal control and external «powerful others» control, contribute to discriminate «acceptors» and «refusers». Persons who accepted participation have a higher level of education and are younger than people in the refusing-to-participate group. Persons who accepted to take part in the study showed an internal control, a «powerful others» control, and felt more threatened by Alzheimer disease than people in the refusing-to-participate group. Motivational factors to accept to take part in a dementia preventive study are: factor I «Perceived benefits», factor II «Social influence», factor III «Focus on self». Motivational factors to refuse to take part are: factor I «Lack of interest, factor II «Medical reasons», factor III «Perceived constraints». This study contributes to a better understanding of psychological characteristics of elderly people which accept or refuse to take part in an Alzheimer disease preventive study. This knowledge could help to develop actions improving elderly’s participation.

Orientador: Benito Pereira Damasceno / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T09:20:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dainez_ElisangelaCordtsLongo_M.pdf: 10128952 bytes, checksum: 5fac09888d865514f18ba1aad9694863 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O Comprometimento Cognitivo Leve amnésico (CCLa) é um déficit cognitivo de pequena intensidade enquadrado no estágio de transição entre o envelhecimento normal e fases iniciais da doença de Alzheimer (DA). Por sua ez, a DA leve caracteriza-se como uma morbidade neurodegenerativa progressiva, na qual há perda moderada da memória para eventos recentes, dificuldade nas orientações visuo-espaciais, comprometimento para resolução de problemas e no desempenho de atividades da vida diária (AVD¿s). Diante dessas morbidades, a intervenção clínica da pesquisa foi pautada na reabilitação neuropsicológica (RN) e na terapia cognitivo-comportamental (TCC). A finalidade da RN é reduzir do comprometimento cognitivo, como também capacitar o sujeito nas diversas áreas de sua vida. Por outro lado, o foco da TCC é direcionado para o tratamento de sintomas cognitivos, emocionais e comportamentais. O objetivo do projeto foi intervir cognitiva-afetiva-comportamentalmente em indivíduos que apresentam CCLa e Demência Leve devido a DA, de modo a aperfeiçoar a cognição do sujeito, ou reduzir, ou ainda estacionar as suas deficiências cognitivas, bem como melhorar seus estados emocionais e comportamentos. O estudo caracteriza-se como experimental (ensaio clínico) de abordagem quantitativa, com duração de 12 meses, 6 meses para RN e 6 meses para TCC. A população estudada refere-se aos pacientes do Ambulatório de Neurologia do Hospital das Clínicas UNICAMP. A amostragem classifica-se como aleatória simples, composta de 15 indivíduos distribuídos de forma randomizada em amostra experimental, composta de 10 sujeitos (grupo A = 6 e grupo B = 4), e amostra controle composta de 5 participantes. Os grupos A e B da amostra experimental passaram pelo processo de cross-over de abordagem (TCC e RN) após 6 meses de intervenção. Os sujeitos da pesquisa foram submetidos a uma bateriade testes neuropsicológicos e psicológicos antes da intervenção (pré-teste), após 6 meses (pós-teste 1) e após 12 meses (pós-teste 2) de intervenção. Os instrumentos selecionados foram para avaliação cognitiva, psicológica e funcional. Desse modo, obteve-se como resultados desempenhos positivos, estáveis, bem como houve evolução da doença, pórem ritmo mais lento do que o esperado da amostra experimental comparada com a amostra controle. Ademais, a pesquisa sugere iniciar a TCC com os indivíduos CCLa seguindo com aplicação da RN. Por sua vez, os pacientes DA o estudo propõe iniciar com a RN após esta intervir com a TCC / Abstract: The amnesic Mild Cognitive Impairment (aMCI) is a cognitive deficit of low intensity is framed in the boundaries of normal aging and early stage of Alzheimer disease (mild AD). On the other hand, mild AD characterizes as a progressive neurodegenerative illness, in which there is moderate loss of memory for recent events, difficult in visuospacial orientation, impairment to problems resolution and decreases of the performance in the activities of daily life (ADL¿s). Given these morbidities, the clinical intervention of the present research was based on neuropsychological rehabilitation (NR) and behavioral-cognitive therapy (BCT). The purpose of NR is decreasing the cognitive impairment, but also capacitating the subject in several areas of his life. Whereas the focus of BCT is directed to treatment of cognitive, emotion and behavioral symptoms. The objective of project was intervened behaviorally-affective-cognitive in individuals how show aMCI and mild AD in order to improve the cognition of the subject, or to decrease, or still to stop the cognitive disabilities, as also to better the emotion statusand behavior. The study is experimental (clinical analysis) of the quantitative approach, lasting 12 months, 6 months to 6 months NR and psychotherapy BCT 6 months to TCC and 6 months to NR. The sample of population was composed of the patients of Neurology Ambulatory of the UNICAMP Clinics Hospital. The sample is described how simple random made up of 15 subjects who were randomized in the experimental sample, which was composed for 10 individual (who were shared to group A = 6 subjects and group B = 4 subjects) and 5 individual were randomized to control sample. The groups A and B of the experimental sample were changed cross-over to approach (BCT and BCT) after 6 months. The subjects were submitted to neuropsychology and psychology tests batteries before the intervention (pre-test), after 6 months (post-test 1) and after 12 months (post-test 2) intervention. The instruments were selected to evaluate cognitive, psychology and functional evaluation. Thus, it obtained positive and stable performances as results, as well as evolution of the disease, but the disease¿s evolution of the experimental sample was slower than of the control sample. Furthermore, the research suggests starting the BCT with aMCI individual, after this to apply to the NR. On the other hand, first to apply the NR after this to follow to BCT for the mild AD patients / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestra em Ciências Médicas

Submitted by Rafael Santana (rafael.silvasantana@ufpe.br) on 2017-08-01T18:18:43Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) COLACAO - ANA LUISA.pdf: 1209695 bytes, checksum: 184cdc9986f800f5bdad5b9a826ae11f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-01T18:18:44Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) COLACAO - ANA LUISA.pdf: 1209695 bytes, checksum: 184cdc9986f800f5bdad5b9a826ae11f (MD5) Previous issue date: 2007-09-14 / OBJETIVO: Investigar uma possível associação entre nível de escolaridade e o risco de Desenvolver a Demência de Alzheimer (DA) clinicamente diagnosticada. MÉTODOS: Estudo tipo caso-controle retrospectivo. Foram obtidos dados referentes a 53 pacientes idosos (acima de 60 anos), que preencheram critérios para a DA clinicamente diagnosticada de três ambulatórios do serviço de saúde pública: Núcleo de Apoio ao Idoso (NAI)-UFPE; Ambulatório de Neurologia Cognitiva do Comportamento (ANCC) e Centro de Referência de Atendimento à Saúde do Idoso (CRASI) do hospital Universitário Osvaldo Cruz – UPE. No grupo controle foram averiguados 55 idosos (acima de 60 anos), 40 destes alunos da Universidade Aberta a Terceira Idade (UnATI)- UFPE; seis eram pacientes da policlínica Lessa de Andrade (SUS), e 9 eram pacientes dos Ambulatórios de Urologia e Oftalmologia do Hospital das Clínicas (HC) –UFPE. Os dados foram coletados através de um protocolo de pesquisa contendo Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), Questionário Sócio – Clínico- Demográfico e o Mini-Exame do Estado Mental (MEEM). RESULTADOS: Os grupos sob estudo foram pareados por idade e gênero. Variáveis como religião, estado civil, fumo e histórico de traumatismo crânio-encefálico (TCE) não mostraram diferenças na distribuição entre os grupos. Diferenças significativas foram observadas entre os dois grupos com relação as variáveis Profissão (P= 0,043 e OR= 1,32 [0,95-5,76]) e Escolaridade (P= 0,001 e OR= 3,00 [1,67- 10,05]). CONCLUSÃO: Na amostra estudada a baixa escolaridade e Profissões com demandas físicas mostraram-se como fatores de risco associados ao desenvolvimento da demência de Alzheimer. / OBJECTIVE: Investigating a possible association between education level and the risk to clinically develop diagnosed Alzheimer Disease (AD). METHODS: retrospective control- case type study. Some data were collected referring to 53 aged patients (over 60), that fulfilled the criteria related to clinically diagnosed DA of three ambulatories of public health services: Nucleus of Supporting to the Aged (NAI_UFPE: Ambulatory of Behavior Cognitive Neurology (ANCC) and Attendance Reference Center to the aged health. (CRASH) of Hospital Universitário Oswaldo Cruz- UPE .In the control group 55 aged (over 60) were observed, 40 of them were from Universddade Aberta (Open University) and Third Age (Un ATI /UFPE; six of them were Lessa de Adrade polyclinic patients (SUS), and nine belonged to the Ambulatory of Urology And Ophthalmology of the Hospital das Clínicas (HC) – UFPE.The. Data were collected through research protocol including a Free and Clear Consent Term (TCLE). Socio-Clinic Demographic Questionnaire and the Mini-Exam of Mental State (MEEM).RESULTS: the groups submitted to study were classified according to age and gender. Variables such as religion, civil status, smoking, and history of brain-encephalon damage (TCE) do not featured differences in the distribution between the groups. However, relevantl differences were observed between the two groups in relation to the variables Profession (P= 0,043 and OR == 1,32 [0,95-5,76] and Education (P= 0,001 and OR= 3,00 [1,67- 10,05]. CONCLUSION: Considering the sample tat was studied the low education and Professions linked to physical demands were presented as risk factors associated with the development of Alzheimer Disease.

L’émergence de nouvelles technologies basées sur la microfluidique de gouttes offre l’espoir de développer des immuno-essais complexes consommant peu d’échantillon. Cette thèse est dédiée d’une part au développement d’une plateforme d’analyse qui consiste au fractionnement d’un mélange de peptides amyloïdes par focalisation isoélectrique (IEF) pour ensuite procéder à l’immuno-détection en gouttes des différentes fractions. Une méthode d’IEF en capillaire a été développée et a permis la séparation des peptides Aβ 1-40, Aβ 2-40 et Aβ 5-40 ainsi que leur collecte dans des solutions individuelles. Ces solutions de collectes ont été analysées par Elisa sur particules magnétiques. L’immuno-essais a permis de déterminer la distribution des peptides dans les différentes collectes. Ces analyses ont d’abord été réalisées en « batch » où les particules magnétiques sont en suspension dans une solution non-confinée. Ensuite, un dispositif permettant de réaliser des immuno-essais en gouttes a été utilisé. Cette plateforme a été adaptée et optimisée pour le dosage des peptides Aβ 1-40 et Aβ 1-42 standard en vue de doser ces peptides dans le LCR et d’étendre l’analyse aux autres peptides (Aβ 2-40 et Aβ 5-40). D’autre part, une partie de la thèse a été dédiée à un travail sur micro-puce en vue de la conception d’un microsystème d’analyse totale intégrant en ligne les trois étapes majeures (séparation, compartimentalisation, immuno-détection en gouttes) de la plateforme d’analyse recherchée. Pour cette partie nous avons choisi le THV Dyneon qui a déjà servi au transport de bio-molécules en gouttes. Une première étude a consisté pour la première fois à réaliser des séparations électrocinétiques de protéines et de fluorophores hydrophobes dans les puces en THV Dyneon en utilisant deux modes de séparation (ECZ et NACE, respectivement). Ceci a permis de démontrer que ce nouveau matériau constitue un candidat prometteur pour le futur microsystème couplant séparation et compartimentalisation en gouttes. Une dernière étude a consisté au développement d’une méthode de marquage des peptides amyloïdes par un nouvel agent fluorescent, le Chromeo P540, particulièrement adapté pour des analyses IEF. Cet agent de marquage permettra de détecter les peptides durant la conception de l’interface de couplage (IEF/gouttes). / Emerging droplet-based microfluidic platform provide new opportunities to develop complex immunoassay with low sample consumption. This manuscript is dedicated on the development of an analytical platform for isoelectric focusing of amyloid peptides followed by their detection by immunoassay droplet-based microfluidic platform. A capillary isoeletric focusing method was developed first and allowed separation and collection of Aβ 1-40, Aβ 2-40 and Aβ 5-40 peptides in individual solutions. The fractions collected were analyzed off-line by Elisa on magnetic beads in batch-wise. This immune-detection allows the determination of peptide distribution in the different fractions collected. Then, we used a droplet-based microfluidic platform for immunoassay on magnetic beads. This platform was adapted and optimized to quantify standard Aβ 1-40 and Aβ 1-42 peptides. The next step will rely on the quantification of amyloid peptides on cerebrospinal fluid. In parallel, a study dedicated on microchip analyses to design a total-analysis-system has been performed. The final purpose is to integrate on-line three main steps; separation, compartmentalization and immune-detection in droplet. For this study, THV Dyneon has been chosen since this material was also used for the droplet-based microfluidic platform. A first study demonstrated for the first time electrokinetic separation, of biomolecules (proteins) and hydrophobic dyes in Dyneon THV chip using two separations modes (CZE and NACE respectively). This work highlighted the THV Dyneon micro-chip versatility. We can concluded that this new material is promising for further development dedicated to micro system combining separation and compartmentalization in droplet. A last work aimed to develop a labeling method for amyloid peptides with a new dye, the Chromeo P540, which is adapted for isoeletric focusing (IEF) analysis. This dye will allow peptides monitoring during the development of IEF/droplet interface.

The presence of amyloid plaques in the hippocampus highlights the incidence of Alzheimer’s disease. Manual segmentation of amyloid plaques is very time consuming and increases the time that can be used to monitor the distribution of amyloid plaques. Distribution carries significant information about disease progression and the impact of potential therapy. The automatic or semi-automatic segmentation method can lead to significant savings in the time which are required when the disease has rapid progression. The description of amyloid plaques and the computed tomography are included in this work. In this diploma thesis are three implemented algorithms, two of them are based on published articles and one’s own methodological solution. The conclusion of the thesis is a quantitative evaluation of the accuracy of implemented segmentation procedures.

The core aim of this paper is to present a business plan that aims to realize a private nursing home facility. Firstly does the author outlines the basis of current private social services environment in Czech Republic and the actual need of the project. The main part of the paper focuses on the practical execution of the plan. Several project possibilities are offered and evaluated with a supporting evidence of expected financial data. Thesis aims to present succinct yet coherent analysis on the real facility operation and differences to already existing competitors. Contrary to those, this project gives special attention to personnel (especially nurses and social nurses) who are a key success factor of the business as such.

La maladie d’Alzheimer est la démence sénile la plus répandue dans le monde. C’est une maladie neurodégénérative irréversible dont les principales caractéristiques neuropathologiques sont l’agrégation du peptide β-amyloïde et l’hyperphosphorylation de la protéine tau. Malgré de nombreux essais cliniques, la maladie d’Alzheimer reste incurable. En effet, cette pathologie est extrêmement complexe et implique de nombreux dysfonctionnements biologiques. C’est pourquoi, une des approches thérapeutiques récemment développée réside dans la conception de ligands multi-cibles. Ces molécules sont capables d’agir simultanément sur plusieurs cibles et constituent donc une approche innovante pour le traitement des maladies complexes telles que les maladies neurodégénératives. Au sein du laboratoire, un candidat médicament à double activité (inhibiteur d’acétylcholinestérase et agoniste des récepteurs 5-HT4), nommé donécopride, a récemment été décrit. Sur la base de résultats prometteurs obtenus avec le donécopride, une nouvelle série de composés à triple action a été synthétisée. En sus des activités du donécopride, cette nouvelle série possède une activité complémentaire qui réside dans le blocage des récepteurs 5-HT6. Cette thèse décrit la synthèse ainsi que l’évaluation in vitro et in vivo de ces nouveaux composés à triple action. / Alzheimer’s disease is the most common senile dementia in the world. It is an irreversible neurodegenerative disease whose main neuropathological hallmarks are β-amyloid peptide aggregation and hyperphosphorylation of tau protein. Despite numerous clinical trials, Alzheimer’s disease remains incurable. Indeed, this pathology is extremely complex and involves the dysfunction of multi-systems. That is why, one of the recently developed therapeutic approaches lays in the design of multi-target-directed ligands. These molecules are capable to simultaneously engage several targets and therefore represent an innovative approach to treat complex disease such as neurodegenerative disorders. Within the laboratory, a dual-activity drug candidate (acetylcholinesterase inhibitor and 5-HT4 receptor agonist) named donecopride was recently described. Thanks to the promising results obtained with donecopride, a new series of triple-activity compounds has been synthesized. This new series combines an additional activity that aims to block the 5-HT6 receptors. This thesis describes the synthesis and the in vitro and in vivo evaluation of these new triple-acting compounds.

La maladie d’Alzheimer (MA), la forme la plus répandue de démence, est caractérisée par une accumulation cérébrale de plaques amyloïdes formées de peptide beta-amyloïde, et d’enchevêtrements neurofibrillaires (NFT) de protéine tau anormalement phosphorylée (P-tau). Depuis plusieurs années, l’évidence d’une implication majeure d’altérations synaptiques dans la pathologie a émergée. De plus, il a été observé dans les cerveaux MA que les héparanes sulfates (HS), normalement extracellulaires, accumulent à l’intérieur des neurones, où ils co-localisent avec tau. Le laboratoire CRRET a mis en évidence que la 3-sulfotransferase 2 (HS3ST2), enzyme prédominante dans le cerveau où elle génère des HS 3-O-sulfatés (3S-HS) de rôle inconnu, est impliquée dans les mécanismes à l’origine de la tauopathie. Puisque la HS3ST2 et les 3S-HS n’ont jamais été caractérisés à la synapse où ils pourraient participer au développement de la tauopathie, les objectifs de ce travail sont : 1) déterminer si la HS3ST2 et les 3S-HS sont présents à la synapse et étudier des possibles rôles physiologiques ; 2) déterminer si les 3S-HS accumulent au niveau intracellulaire dans des cellules neuronales et/ou dans de synaptosomes issus d’un modèle murin de tauopathie ; et 3) examiner si les 3S-HS intracellulaires produits par la HS3ST2 sont impliqués dans le développement ou évolution de la tauopathie au niveau synaptique.Dans ce travail, nous avons montré la présence des 3S-HS et de la HS3ST2 à la synapse de cellules hippocampiques et accumulé des preuves de leur implication dans la stabilité et l’activité synaptique, toutes deux altérées par des peptides se liant aux 3S-HS ont pu bloquer cette activité. Nous avons implémenté et caractérisé le modèle murin de tauopathie rTg4510 et mise en place les cultures primaires de leur neurones hippocampiques. Dans ces cellules, nous avons montré l’accumulation intracellulaire des 3S-HS et une surexpression de la HS3ST2 corrélant avec l’accumulation de P-tau. La digestion enzymatique des HS dans les synaptosomes a résulté dans l’inhibition de la tauopathie.Ce travail révèle pour la première fois un rôle fondamental de la 3-O-sulfatation des chaines d’HS à la synapse, aussi bien dans des conditions physiologiques que pathologiques. Pour la première fois, l’enzyme HS3ST2 est décrite à la synapse. De plus, ce travail donne la preuve d’un lien fort entre l’expression d’HS3ST2, l’accumulation de 3S-HS et la tauopathie au niveau synaptique, ouvrant de nouvelles opportunités pour mieux comprendre la MA. / Alzheimer’s disease (AD), the main form of dementia in the world, is characterized by brain accumulation of amyloid plaques formed of amyloid beta, and neurofibrillary tangles (NFT) made of tau protein in an abnormally hyperphosphorylated form (P-tau). Strong evidences show that synaptic changes are central to the disease process. Moreover, previous observations in AD have shown that heparan sulfates (HS), typically present outside the cell , accumulate inside neurons of AD in where they interact with tau. Recently, the CRRET laboratory demonstrated that the neural 3-O-sulfotransferase 2 (HS3ST2), which generates 3-O-sulfated HS (3S-HS) of still unrevealed physiological roles, is involved in the mechanisms leading to tauopathy. Since it was unknown whether HS3ST2 and 3S-HS are expressed at the synapse and if there they participate to tauopathy development and/or evolution, the objectives of this work were: 1) to determine if HS3ST2 and 3S-HS are present at the synapse and to get insights on their physiological role; 2) to investigate whether 3S-HS accumulate intracellularly in hippocampal cells and/or in synaptosomes from a mice model of tauopathy; and 3) to investigate whether intracellular 3S-HS made by HS3ST2 are involved in tauopathy development and/or evolution at the synaptic level.We described here the presence of 3S-HS and HS3ST2 at the synapse and the role that may play 3S-HS in maintaining synaptic transmission and stability in primary cell culture from mice. These roles are the results of potential multiple implications of 3S-HS in various processes. Secondly, we implement and characterized the rTg4510 mice model of AD-related tauopathy and set primary cultures of hippocampal cells from these mice. In the tauopathic cells, we showed the intracellular accumulation of 3S-HS and HS3ST2 overexpression. Finally, we cleaned P-tau in synaptosomes from the rTg4510 mice aged of 2 months by digesting HS.The present work reveals, for the first time, the presence and a possible fundamental role of HS3ST2 and 3S-HS at the synapse. We give evidences of an interplay between 3S-HS, produced by HS3ST2, and tau and the synaptic level, leading to its abnormal phosphorylation. The results of these work open a new way to understand the phenomenon leading to synaptic impairment in AD patients and could reveal new targets to elaborate protection strategies against the AD pathological lesions.

Die biologischen Grundlagen und sozioökonomischen Auswirkungen der Alzheimerschen Erkrankung (Alzheimer‘s Disease; AD) sind ein aktuelles Thema unserer immer älter werdenden Gesellschaft. Doch bis heute sind nicht alle pathophysiologischen Vorgänge erforscht, um diese Erkrankung in ihrer Ursache zu verstehen und damit Ansätze für eine adäquate Therapie zu ermöglichen. Eine weit verbreitete Theorie zur Krankheitsentstehung ist die Amyloid-Kaskaden-Hypothese, die ß-Amyloid (Aß)-Peptiden eine zentrale Rolle bei der Alzheimer-Pathogenese zuspricht. Diese Aß-Peptide entstehen durch proteolytische Prozessierung des Amyloidvorläuferproteins (amyloid precursor protein; APP) und sind auch im Gehirn von nicht-dementen älteren Menschen nachweisbar. Neue Forschungsergebnisse legen nahe, dass bestimmte posttranslationale Modifikationen des Aß-Peptids zu verringertem Abbau, erhöhter Aggregation und gesteigerter Neurotoxizität beitragen. Eine solche besonders pathogene Aß-Variante ist Pyroglutamat-Aß (pE-Aß). Es entsteht durch N-terminale Verkürzung von Aß um zwei Aminosäuren und folgende Zyklisierung des N-terminalen Glutamats zu Pyroglutamat (pE). Eine Möglichkeit die Bildung, den Transport und die Ablagerung von pE-Aß im Gehirn verstorbener Alzheimer-Patienten und im Gehirn von Versuchstieren mit Amyloid-Pathologie zu untersuchen, ist die Verwendung spezifischer Antikörper. Ziel dieser Arbeit war es, vier neue monoklonale Antikörper hinsichtlich ihrer Eignung zur immunhistochemischen Darstellung von pE-Aβ im Gehirn transgener Mäuse mit Aß-Pathologie zu untersuchen. Für diese Untersuchungen wurden transgene Mäuse des Stammes Tg2576 verwendet. Diese exprimieren humanes APP der neuronalen Isoform mit 695 Aminosäuren mit der sogenannten schwedischen Doppelmutation KM670/671NL. Diese Mutation sorgt dafür, dass APP ein besseres Substrat für die amyloidogene Prozessierung ist und verstärkt Aß gebildet wird. Tg2576-Mäuse entwickeln ab einem Alter von 11 bis 13 Monaten Alzheimer-typische Amyloidablagerungen im Neokortex und im Hippocampus. In der vorgelegten Arbeit wurden Mäuse im Alter von 16, 18 und 21 Monaten untersucht, um zu prüfen ob mit den neuen pE-Aß-Antikörpern die in anderen Arbeiten beschriebene Zunahme der Aß-Pathologie im Alterungsprozess dargestellt werden kann. Als Kontrollen wurden gleichaltrige Wurfgeschwister, die das Transgen nicht exprimieren, verwendet. Pro Altersstufe wurden zwei transgene Mäuse und ein Wildtyp-Tier untersucht. Die vier neuen zu charakterisierenden monoklonalen pE-Aß-Antikörper wurden von der Firma Probiodrug AG, Halle/Saale zur Verfügung gestellt. Sie wurden durch Immunisierung von C57Bl6-Mäusen mit einem Hexapeptid aus dem N-Terminus von pE-Aß (Sequenz pEFRHDS) generiert. Diese vier monoklonalen Antikörper besaßen verschiedene IgG-Subtypen: Klon K6 (IgG1), Klon K17 (IgG2b), Klon K24 (IgG1), Klon F8 (IgG3). Vergleichend wurde ein pE-Aß-Antikörper der Firma Synaptic Systems (Klon 2-48) vom Subtyp IgG1 verwendet. Auswahl der untersuchten Gehirne – „Gefäßhintergrund“. Durch ungleichmäßige Perfusion und Fixierung der Gehirne kann es zu einer unerwünschten Färbung von Blutgefäßen kommen, wodurch die Quantifizierung von Plaques erschwert wird. Um dies zu vermeiden wurden die Gehirne von 13 Mäusen hinsichtlich dieses Kriteriums mittels Immunhistochemie mit dem pE-Aß-Antikörper von Synaptic Systems untersucht und anschließend ausschließlich Tiere ohne oder mit sehr geringem Gefäßhintergrund verwendet. Eignung der neuen monoklonalen primären pE-Aß-Antikörper. Es wurde eine Versuchsreihe angefertigt, um die immunhistochemischen Färbungen der vier neuen monoklonalen pE-Aß-Antikörper an Mäusegewebe zu testen und diese mit dem etablierten Synaptic Systems Antikörper zu vergleichen. Die Testreihe zeigte erwartungsgemäß, dass der Synaptic Systems pE-Aß-Antikörper, aber auch die neuen Antikörper K6, K17 und F8 eine gute, jedoch auch unterschiedlich intensive Plaquefärbung erbrachten. Der Antikörper K24 wurde aus den weiteren Versuchsreihen ausgeschlossen, da keine Plaquefärbung nachweisbar war. Verdünnungsreihen der primären pE-Aß-Antikörper. Die verwendete Konzentration eines Antikörpers kann die Intensität der spezifischen Färbung, aber auch die Hintergrundfärbung stark beeinflussen. Deshalb galt es festzulegen, in welchen Verdünnungen die neuen primären pE-Aß-Antikörper zur Quantifizierung der Plaquefläche im Gehirn transgener Tg2576-Mäuse eingesetzt werden sollten. Für jeden einzelnen Antikörper wurde eine Verdünnungsreihe (1:100; 1:250; 1:500) angefertigt und die Verdünnung bestimmt, welche die beste immunhistochemische Visualisierung der Aß-Ablagerungen ermöglicht. Dies war für den Klon K6 1:100, für Klon K17 1:250 und für Klon F8 1:250. Verwendung geeigneter Sekundär-Antikörper. Kommerziell verfügbare Sekundär-Antikörper gegen Maus-IgGs erkennen entweder alle IgG-Subytpen, oder sind gegen einzelne IgG-Subtypen gerichtet. Um geeignete Sekundär-Antikörper zum Nachweis der pE-Aß-Antikörper für die Plaque-Darstellung zu identifizieren, wurden verschiedene Verdünnungen (1:200 und 1:400) von nicht-Subtyp-spezifischen und von Subtyp-spezifischen biotinylierten Esel-anti-Maus IgGs getestet. Dabei zeigte sich, dass in jedem Fall die biotinylierten subtypspezifischen sekundären Esel anti-Maus Antikörper in einer Verdünnung von 1:200 die geringste Hintergrundfärbung und das deutlichste Signal erbrachten. Deshalb wurden nur diese für die folgenden Versuchsreihen eingesetzt. Quantifizierung der Plaque-Beladung im Gehirn transgener Tg2576-Mäuse. Um die Plaque-Beladung in definierten Hirnstrukturen APP-transgener Tg2576-Mäuse zu quantifizieren, wurden für jeden der vier untersuchten pE-Aß-Antikörper (Synaptic Systems, K6, K17 und F8) in drei Altersstufen (16, 18 und 21 Monate) in neun verschiedenen koronalen Schnittebenen immunhistologische Färbungen durchgeführt. Die Schnittebenen befanden sich auf Ebenen, die folgende Strukturen enthalten: 1 Präfrontaler Kortex, 2 Basales Vorderhirn, 3 anteriore Kommissur, 4 Nucleus basalis, 5 Hippocampus anterior, 6 Hippocampus posterior, 7 Locus coeruleus anterior, 8 Locus coeruleus posterior, 9 kaudaler Hirnstamm. Dies ermöglichte es, in verschiedenen Hirnregionen die Ablagerung von pE-Aβ während des Alterungsprozesses zu untersuchen. Es wurden für jede Hirnregion die aufeinanderfolgenden Schnitte für die vier primären Antikörper ausgewählt, sodass ein Maximalabstand von 120 µm zwischen den Färbungen der pE-Aß-Antikörper besteht, da jeder Schnitt eine Dicke von 30 µm aufwies. Da je Altersstufe zwei Tiere analysiert wurden, ergeben sich pro Antikörper und Altersstufe 18 gefärbte und quantifizierte Schnitte, demzufolge resultiert pro untersuchtem Antikörper eine Gesamtzahl von 54 Schnitten. Die Gesamtzahl der ausgewerteten Schnitte dieser Arbeit beträgt 224. Die Quantifizierung erfolgte mit Hilfe des Computerprogramms BZ-II-Analyzer, einer Analysesoftware des Digitalmikroskops Keyence. Durch eine Aufnahme des kompletten Hirnschnitts und Markierung der Plaquefläche konnte deren prozentualer Anteil an der Hirnschnittfläche bestimmt werden. Betrachtet man die vier Antikörper untereinander, wird erkennbar, dass der pE-Aß-Antikörper von Synaptic Systems in jeder Altersstufe die größte Plaquefläche darstellt. Die pE-Aß-Antikörper K17 und F8 zeigen eine geringere und untereinander ähnliche Plaquefläche. Der K6 Antikörper weist die geringste Plaquefläche nach. Im Altersgang ist für alle untersuchten pE-Aß-Antikörper eine Zunahme der markierten Plaquefläche nachweisbar. Die untersuchten Gehirnschnittebenen sind unterschiedlich stark von pE-Aß-Ablagerungen betroffen. Die am weitesten rostral gelegene Schnittebene mit präfrontalem Kortex weist besonders viele pE-Aß-Ablagerungen auf, während die darauf folgende Schnittebene deutlich weniger pE-Aß-Ablagerungen zeigt. Danach gibt es Richtung kaudal wieder eine Zunahme der pE-Aß-Ablagerungen. In den Schnittebenen 7, 8 und 9 wurden keine pE-Aß-Ablagerungen nachgewiesen. Doppelmarkierungen von pE-Aß-Antikörpern verschiedener IgG-Subtypen und mit dem pan-Aß-Antikörper 4G8. Um nachzuweisen, ob alle untersuchten pE-Aß-Antikörper dieselben Strukturen darstellen, wurde eine Versuchsreihe mit Immunfluoreszenz-Doppelmarkierungen angefertigt. Obwohl die primären monoklonalen pE-Aß-Antikörper alle in der Maus generiert wurden, erlaubten die verschiedenen IgG-Subtypen eine Doppelmarkierung mit Subtypen-spezifischen Sekundärantikörpern. Dabei zeigte sich, dass alle pE-Aß-Antikörper dieselben Anteile von Aβ-Ablagerungen erkennen. Um nachfolgend zu zeigen, welche Anteile der Aβ-Ablagerungen von den pE-Aβ-Antikörpern erkannt werden, wurden Doppelmarkierungen der verschiedenen pE-Aß-Antikörper mit dem pan-Aß-Antikörper 4G8 angefertigt. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich die pE-Aβ-Peptide im Zentrum der Aβ-Ablagerungen befinden. In dieser Arbeit konnten vier neue monoklonale Antikörper bezüglich ihrer Eignung zur immunhistochemischen Darstellung von pE-Aβ im Hirn transgener Mäuse mit Aß-Pathologie charakterisiert werden. Während der Klon K24 für die Plaquedarstellung ungeeignet ist, wurden für die Klone K17 und F8 vergleichbare, wenn auch geringere Plaqueflächen nachgewiesen als für den kommerziell verfügbaren Antikörper von Synaptic Systems. Der pE-Aß-Antikörper K6 markierte die geringste Plaquefläche. Dies könnte auf eine höhere Spezifität oder auf eine geringere Sensitivität von K17, F8 und K6 gegenüber dem Synaptic Systems Antikörper zurückzuführen sein. Mit Hilfe monoklonaler Antikörper gegen pE-Aß könnte es möglich sein, einen Impfstoff zu entwickeln, der gegen eine besonders toxische Aβ-Peptid-Variante gerichtet ist. Eine Immunisierung im Frühstadium der AD würde zwar nicht die Erkrankung in ihrem Ursprung heilen, könnte aber deren Verlauf verlangsamen. Zudem ist es denkbar, spezifische Antikörper gegen besonders neurotoxische pE-Aß-Varianten für die klinische Diagnosestellung zu etablieren.

(anglický jazyk) The most common senile dementia, Alzheimer disease (AD), is characterized by a decline of memory and high cognitive functions. Typical post-mortem brain lesions are extracellular amyloid deposits, intracellular neurofibrilary tangles and ruined cholinergic and other neurotransmitters systems. Connection between damaged central cholinergic system and beta-amyloid accumulation remains obscure. We examined parietal cortex of young adult (7- month-old) female APPswe/PS1dE9 double transgenic mice which develope beta-amyloid fragments at high rate. Cholinergic synapses of these mice demonstrate functional presynaptic (stimulated acetylcholine release) as well as postsynaptic (muscarinic receptor-induced G- protein activation) deficits and reduction of cholinergic markers. The mRNA levels of choline acetyltransferase, vesicular acetylcholine transporter and M1 to M4 subtypes of muscarinic receptors were determined in transgenic and littermate controls using qPCR. Obtained experimental data does not show any changes in measured mRNA levels. These observations indicate that reduction of cholinergic synaptic markers and function is due to posttranscriptional events.