A leptospirose é considerada a zoonose mais difundida do mundo, assim como uma doença reemergente. Esta enfermidade, causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira, possui altas taxas de infecção em países em desenvolvimento, ocasionando graves prejuízos econômicos e de saúde pública. Até o momento, não existem vacinas humanas licenciadas contra leptospirose. Após o seqüenciamento do genoma de três espécies de Leptospiras vários genes foram apontados como candidatos vacinais promissores. Uma categoria importante de genes candidatos são aqueles com possível atividade hemolítica. Neste trabalho, clonamos e expressamos diversas proteínas com possível atuação hemolítica. As proteínas recombinantes obtidas, no entanto, não exibiram atividade hemolítica. Uma destas proteínas, TlyC, foi investigada quanto à sua capacidade de interagir com os componentes da matriz extracelular (MEC). Os resultados obtidos indicam que TlyC liga-se com alta afinidade a diversos componentes da MEC, e que esta proteína é capaz de inibir competitivamente a adesão de Leptospiras à um material biológico que se assemelha à MEC. A transcrição e expressão destas proteínas foi detectada em cultura de Leptospira. Algumas das proteínas recombinantes foram utilizadas em um desafio animal contra leptospirose, mas nenhum delas foi protetora. Concluímos que estas proteínas não parecem ser bons candidatos vacinais e que TlyC é uma proteína que interage com componentes da MEC. / Leptospirosis is considered the most disseminated zoonosis of the world, and also a reemerging disease. This disease, caused by pathogenic bacteria of the genus Leptospira, has high rates of infection in developing countries, leading to severe economic and medical costs. There is not a licensed vaccine against leptospirosis for human use. After the genome sequencing of three species of leptospires, several genes were pointed to be promising vaccinal candidates. An important category of these candidates are those with putative hemolytic activity. In this work, we cloned and expressed some proteins with putative hemolytic activity. The recombinant proteins obtained, however, did not show hemolytic activity. One of these proteins, TlyC, was investigated with regard to its possible ability to interact to extracellular matrix (ECM) components. The results obtained indicate that TlyC binds with high affinity to several ECM components and that this protein can inhibit the Leptospira bind to a biological material that ressambles the ECM. The transcription and expression of these proteins were detected in leptospires cultures. Some of the recombinant proteins were used in an animal challenge against leptospirosis, but none of them were protective. We conclude that these proteins do not seem to be good vaccine candidates and that TlyC is a protein that interacts with the ECM and its components.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-04-07T13:44:32Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Sheila de Melo Barros.pdf: 1291445 bytes, checksum: db27132996d617b0597281f66a66672b (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-07T13:44:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Sheila de Melo Barros.pdf: 1291445 bytes, checksum: db27132996d617b0597281f66a66672b (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-02-29 / CAPES / Atualmente, um grande número de técnicas encontra-se disponível para a caracterização de polímeros sintéticos, tais como a cromatografia por exclusão molecular (CEM), ressonância magnética nuclear (RMN) e técnicas de caracterização por massa como a ionização/dessorção a laser assistida por matiz (MALDI-TOF). Para a maioria dos polímeros sintéticos com elevada polidispersidade, no entanto, estas técnicas necessitam de outros métodos complementares ou de um tratamento prévio da amostra. Recentemente, foi demostrado que poros de α-hemolisina podem ser usados como um espectrômetro de massas em solução para moléculas de polietilenoglicol (PEG), baseado na interação entre um poro de escala nanométrica e moléculas do analito, onde moléculas poliméricas de diferentes tamanhos no interior do nanoporo promovem diferentes estados de condutância com média característica dos tempos de residência. Neste trabalho a interação entre a Polivinilpirrolidona (PVP) e canais de α-hemolisina na presença de elevada corrente iônica foi utilizada para o desenvolvimento de um novo modelo de espectrômetro de massas para polímeros em espaço confinado, baseado em poros de escala nanométrica. Em nossos experimentos, foi utilizada uma solução banhante de (4M KCl, Tris 5 mM, pH 7,5) e uma amostra polidispersa de PVP de peso médio de 10KDa como analito polimérico. A confecção da bicamada lipídica plana e a inserção do nanoporo unitário na membrana, bem como os registros de correntes iônicas através dos poros, foram obtidos em condições de fixação de voltagem. Os resultados demonstram que poros de α-HL são capazes de detectar a polidispersidade do PVP e discriminar as cadeias moleculares com diferentes tamanhos. Os resultados obtidos com o nanoporo sensor apresentaram dados similares aos obtidos nas análises com o MALDI-TOF convencional. Fornecendo as bases científicas para o desenvolvimento de um espectrômetro de massas a partir do canal unitário uma caracterização em tempo real de polímeros sintéticos em solução.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5239_1.pdf: 8842795 bytes, checksum: 5f857757d3d05774891768c2acb67ae4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / A interação do nanoporo protéico (canal iônico) formado pela α-hemolisina (α-HL) em suporte lipídico plano (membrana) com polímeros do etilenoglicol foi investigada sob dois aspectos: i) entender as bases físico-químicas do processo de transporte destas moléculas orgânicas via poros nanoscópicos e, ii) examinar a viabilidade do emprego do poro nanoscópico como elemento sensor, para detecção estocástica e monitoramento em tempo real de compostos orgânicos em sistemas aquosos. A escolha de duas formas de um mesmo polímero deve-se ao fato de que apesar deles serem quimicamente semelhantes e estáveis, geram estruturas com massa e configurações moleculares diferentes: circular, o éter de coroa (1,4,7,10,13,16-hexaciclooctano, 264 Da), e linear, polietilenoglicóis (PEGs, 200 a 3000 Da). A repulsão entrópica é o principal fator determinante da interação entre o nanoporo e estas moléculas em concentrações de KCl menores que 1 M. O aumento na concentração de KCl até 4 M, aumenta fortemente a força de interação entre o nanoporo e o polímero, tornando-a maior que a repulsão entrópica. O potencial transmembrana, a estrutura e a massa molecular do polímero também influem fortemente nesta interação. A presença destas moléculas orgânicas no lume aquoso do canal manifesta-se por decréscimo na condutância iônica média do nanoporo, e aumento no ruído de corrente iônica. Para o éter de coroa (264 Da) e PEGs com massas moleculares (200-400 Da) semelhantes, o ruído branco até 1 kHz, indica um rápido intercâmbio destas moléculas entre o canal e a solução banhante da membrana. Todavia contrariamente aos PEGs (200-400 Da), a redução de condutância (indicativo do particionamento do éter de coroa no canal), e a intensificação do ruído de corrente (relativo à dinâmica do polímero no nanoporo) dependem fortemente e de forma não monotônica do potencial transmembrana, demonstrando que o éter de coroa atua formando complexo com K+, enquanto que os PEGs menores, são neutros. Considerando o fenômeno de ocupação do canal pelo éter de coroa, descrito por um modelo Markoviano de dois estados, determinamos que o seu tempo de permanência no interior do canal, é máximo (~3 μs), na mesma voltagem (100 mV) em que ocorre a maior redução da condutância iônica. Por outro lado, PEGs de massa molecular maior (600, 1000, 1500, 2000 e 3000 Da) em concentrações salinas elevadas (>1 M KCl), interagem com o nanoporo, dependentemente do potencial transmembrana, indicando a presença de carga elétrica nas moléculas destes polímeros, nessas condições. Estas interações são muito mais fortes que àquelas observadas para o éter de coroa e PEGs de menor massa; conseqüentemente manifestam-se não só por aumento do ruído de corrente iônica, mas, principalmente, pela geração de assinaturas moleculares específicas, que correspondem a profundidade de bloqueio e o tempo de permanência de cada molécula do PEG, no lume aquoso do nanoporo. Os decréscimos nas condutâncias do canal (bloqueios) induzidos por PEGs foram praticamente proporcionais as variações na condutividade da solução salina banhante da membrana, indicando que a água no lume do poro nanoscópico e na solução banhante da membrana, se comporta de maneira similar, e que a presença do polímero reduz a condutividade em ambos os meios por um mesmo mecanismo. A interação entre os PEGs e o nanoporo depende da massa molecular do polímero. Em 4 M de KCl, o tempo de ocupação do poro aumentou de ~0.04 ms, na presença do PEG 600 Da, para ~270 ms, no caso do PEG 3000 Da (uma diferença de ~6000 vezes), enquanto que o coeficiente de partição aumentou em ~250 vezes. A energia de interação entre o nanoporo e os PEGs (≥1000 Da) foi estimada em ~0.13 kT por monômero do polímero. Deste modo altas concentrações de cloreto de potássio na solução banhante da membrana, aumenta a energia da interação das moléculas poliméricas com o nanoporo, criando as condições favoráveis para detecção estocástica de PEGs (600 a 3000 Da). Outrossim, a viabilização do sistema nanoporomembrana como elemento sensor para o desenvolvimento de biossensores estocásticos é possível, porém, estudos adicionais referentes à sua estabilização físico-química, aquisição e automação da análise de assinaturas digitais de corrente, são necessários

A leptospirose é considerada a zoonose mais difundida do mundo, assim como uma doença reemergente. Esta enfermidade, causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira, possui altas taxas de infecção em países em desenvolvimento, ocasionando graves prejuízos econômicos e de saúde pública. Até o momento, não existem vacinas humanas licenciadas contra leptospirose. Após o seqüenciamento do genoma de três espécies de Leptospiras vários genes foram apontados como candidatos vacinais promissores. Uma categoria importante de genes candidatos são aqueles com possível atividade hemolítica. Neste trabalho, clonamos e expressamos diversas proteínas com possível atuação hemolítica. As proteínas recombinantes obtidas, no entanto, não exibiram atividade hemolítica. Uma destas proteínas, TlyC, foi investigada quanto à sua capacidade de interagir com os componentes da matriz extracelular (MEC). Os resultados obtidos indicam que TlyC liga-se com alta afinidade a diversos componentes da MEC, e que esta proteína é capaz de inibir competitivamente a adesão de Leptospiras à um material biológico que se assemelha à MEC. A transcrição e expressão destas proteínas foi detectada em cultura de Leptospira. Algumas das proteínas recombinantes foram utilizadas em um desafio animal contra leptospirose, mas nenhum delas foi protetora. Concluímos que estas proteínas não parecem ser bons candidatos vacinais e que TlyC é uma proteína que interage com componentes da MEC. / Leptospirosis is considered the most disseminated zoonosis of the world, and also a reemerging disease. This disease, caused by pathogenic bacteria of the genus Leptospira, has high rates of infection in developing countries, leading to severe economic and medical costs. There is not a licensed vaccine against leptospirosis for human use. After the genome sequencing of three species of leptospires, several genes were pointed to be promising vaccinal candidates. An important category of these candidates are those with putative hemolytic activity. In this work, we cloned and expressed some proteins with putative hemolytic activity. The recombinant proteins obtained, however, did not show hemolytic activity. One of these proteins, TlyC, was investigated with regard to its possible ability to interact to extracellular matrix (ECM) components. The results obtained indicate that TlyC binds with high affinity to several ECM components and that this protein can inhibit the Leptospira bind to a biological material that ressambles the ECM. The transcription and expression of these proteins were detected in leptospires cultures. Some of the recombinant proteins were used in an animal challenge against leptospirosis, but none of them were protective. We conclude that these proteins do not seem to be good vaccine candidates and that TlyC is a protein that interacts with the ECM and its components.

EPEC atípicas (EPECa) são isoladas de surtos diarréicos em crianças, adultos e animais em países industrializados e em desenvolvimento. Hemolisinas são toxinas que atuam sobre a membrana de eritrócitos e de diversos tipos celulares. Tal grupo de toxinas é reconhecido como importante fator de virulência envolvido na patogênese bacteriana, por isso o objetivo foi avaliar a expressão de enterohemolisina em isolados de EPECa e analisar características fenotípicas como interferência do meio de cultivo e adesão a componentes de matriz extracelular. Observou-se prevalência de 5,4% de isolados enterohemolíticos, e variações na expressão da toxina foram associadas à concentrações de lactose e caseína nos meios de cultivo. Além disso, verificou-se forte associação entre produção de enterohemolisina e ligação à fibronectina celular. / Atypical EPEC (aEPEC) are isolated from diarrheal outbreaks in children, adults and animals in industrialized and developing countries. Hemolysins are toxins that act on the red cell membrane and various cell types. This group of toxins is recognized as an important virulence factor involved in the bacterial pathogenesis. The aim of this study was the evaluation of the enterohemolysin expression in aEPEC isolates as interference of the culture media and adhesion to components of extracellular matrix. The prevalence of enterohemolytic isolates was 5.4%, and variations in toxin expression were associated with lactose and casein concentrations in culture media. Moreover, it was found association between production of enterohemolysin and adhesion to cellular fibronectin.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-01Bitstream added on 2014-06-13T20:24:18Z : No. of bitstreams: 1 suhet_mi_dr_jabo.pdf: 911264 bytes, checksum: 71199b02b3ed48730d7b117d1868bb6d (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação para o Desenvolvimento da UNESP (FUNDUNESP) / A criação intensiva de peixes tem se tornado popular, mas a dependência de arraçoamento pode enriquecer o ambiente com nutrientes, comprometendo a qualidade da água e predispondo os peixes a doenças. Streptococcus e Aeromonas são bactérias que acometem peixe em criações intensivas, podendo ocasionar mortalidade. Nesse sentido, o presente trabalho objetivou avaliar a influência de uma criação de tilápias do nilo em tanques-rede nos parâmetros de qualidade da água e na ocorrência de Streptococcus spp. e Aeromonas spp. na água e nos peixes em uma lagoa na região Sudeste do Brasil. Foram definidos para as amostragens dois locais, a lagoa, para coleta de água e os tanques-rede, para coleta de água e peixes e dois períodos, seco e chuvoso. Os dados obtidos da qualidade da água foram avaliados por indicadores estabelecidos na Resolução Conama nº 357, para corpos de água doce de classe 2. A presença de Streptococcus spp. e Aeromonas spp. foi avaliada por identificação fenotípica e a identificação das espécies, por provas bioquímicas. Isolados foram avaliados para produção de hemolisina utilizando ágar sangue e teste de resistência a antimicrobianos conforme o método de difusão de discos. A atividade de criação intensiva de peixes aumentou a concentração de fósforo total da água no período seco, ocorrência de Streptococcus spp. no ambiente e a população de Aeromonas spp. na superfície dos peixes. No período chuvoso, houve maior isolamento das espécies potencialmente patogênicas, Aeromonas hydrophila na superfície e no rim dos peixes, A. caviae, A. sobria, A veronii, A. jandaei e Streptococcus agalactiae na superfície dos peixes, quando também ocorreu aumento da concentração de N-amoniacal e depleção acentuada da concentração de oxigênio dissolvido na água, e isso pode ter sido a causa da mortalidade de peixes nos tanquesrede... / Intensive fish farming is becoming more and more popular, but dependency on ration feeding increases nutrient load of the water, affects its quality and predisposes fish to diseases. Streptococcus and Aeromonas are bacteria that can affect fish in intensive farms and cause mortality. This study aims at evaluating the impact of a nile tilapia net-cage farm on the water quality parameters and the occurrence of Streptococcus spp. and Aeromonas spp. in the water and on the fish, in a pond in Southeastern Brazil. Two sampling sites were defined, one in the pond and another in the net cages to collect water, and water and fish, respectively. Sampling took place during two periods, dry and rainy. Water quality data were analyzed according to standards set by Conama resolution nº 357, for freshwater bodies class 2. Streptococcus spp. and Aeromonas spp. were determined by phenotypic and species identification using biochemical tests. Isolates were evaluated for hemolysin production using blood agar and antimicrobial resistance test according to disk diffusion method. Intensive fish farming increased the amount of phosphorus in water, Streptococcus spp. occurrence in the environment and Aeromonas spp. population on fish surface as well, during dry periods. During the rainy season, more potentially pathogenic bacteria were isolated such as, Aeromonas hydrophila on fish surface and kidneys, A. caviae, A. sobria, A veronii, A. jandaei and Streptococcus agalactiae on fish surface. An increase of N-ammoniacal was also observed together with severe depletion of dissolved oxygen, which may have caused fish mortality in the net-cages. Production of b-hemolysis was greater for aeromonas species isolated from the water and fish kidneys, while for streptococci it was higher in isolates from fish surface. The species Aeromonas veronii, A. hydrophila, A. jandaei, A. sobria A. caviae and Streptococcus agalactiae... (Complete abstract click electronic access below)

Submitted by Luiz Felipe Barbosa (luiz.fbabreu2@ufpe.br) on 2015-04-17T12:53:01Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Annielle Silva.pdf: 4594171 bytes, checksum: 51d05b433109819b0c9846edafc2af58 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T12:53:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Annielle Silva.pdf: 4594171 bytes, checksum: 51d05b433109819b0c9846edafc2af58 (MD5) Previous issue date: 2013-02-28 / CAPES CNPq INAMI / O nanoporo formado pela incorporação da α-hemolisina em bicamadas lipídicas planas é considerado modelo de nanoporo proteico para elucidação do mecanismo de transporte de moléculas e no desenvolvimento de dispositivos analíticos - biossensores, espectrômetros de massa e sequenciadores moleculares. O conhecimento da interação de nucleotídeos com o nanoporo da α-hemolisina é de especial interesse, pois, alguns estudos sugerem varias metodologias para a utilização deste nanoporo como sequenciador de DNA em tempo real. Apesar de todos os avanços, a principal dificuldade operacional para obtenção de um sequenciador baseado na tecnologia “nanopore sensing”, é a rapidez na translocação do DNA através do nanoporo; dificultando a discriminação adequada das bases. Neste contexto é imprescindível fazer adaptações moleculares no nanoporo visando o aumento do tempo de permanência do DNA e da energia de interação deste com o nanoporo. As principais estratégias disponíveis para produção de nanoporos adaptados são: mutações sítio dirigidas e funcionalização química. Ambas são de elevado custo e tempo de experimentação. Neste trabalho utilizamos técnicas de simulação computacional para obtenção, a nível atomístico, a interação do DNA com o nanoporo da α-hemolisina na sua forma nativa e adaptada em posições estratégicas previamente selecionadas por modelagem molecular. As técnicas utilizadas baseiam-se na dinâmica molecular fora do equilíbrio e na Relação de Jarzynski, na qual a média do trabalho realizado ao deslocar o DNA ao longo do nanoporo proteico é estatisticamente relacionada à energia livre do processo. As informações sobre as interações do DNA-nanoporo obtidas podem predizer, teoricamente, os nanoporos mais promissores para serem testados experimentalmente. Realizou-se a seleção das mutantes que foram usadas e foram obtidos dados importantes sobre a parametrização das dinâmicas usando a relação de Jarzynski, como velocidade e constante de força que devem ser aplicadas ao sistema. Além disso, foram obtidas informações sobre a trajetória e contato do DNA com o interior do poro mutado e na forma selvagem, o que mostra a efetividade do sistema.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-04-20T12:24:13Z No. of bitstreams: 1 Gesilda Florenco das Neves.pdf: 2617368 bytes, checksum: 173578dfacb441e6db1e2b5fca6fbc1c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-20T12:24:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gesilda Florenco das Neves.pdf: 2617368 bytes, checksum: 173578dfacb441e6db1e2b5fca6fbc1c (MD5) Previous issue date: 2017-06-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Statistical tools of nonlinear dynamics are widely used in the analysis and proper description of phenomena in the areas of chemistry, physics and biology. The increase in computational processing capacity, together with the development of programming languages and algorithms, enabled the availability of programs capable of simulation and prediction in phenomena that for some years would be impracticable. In this work, we used: Detrended Flutuation Analysis (DFA), Markov Modeling, Approximate Entropy (ApEn), Lempel Ziv Complexity (CLZ) and Recurrence Plot (RP) in the analysis of time series resulting from the blocking or unlocking in the chain Ionization through the individual nanopore of the alpha-hemolysin of Staphylococcus aureus (alpha-hemolysin), caused by the entry or translocation of monodisperse polyethylene glycol (PEG1294). All experiments were performed on lipid bilayers formed by diftanyl phosphatidylcholine at room temperature (25°C) and voltage clamping conditions employing a patch clamp amplifier. The aqueous solution was 4M KCl, pH 7.5, with the PEG at the concentrations of 400, 1000 or 2000M and the time series with a duration of at least 30 seconds were obtained for each of the PEG concentrations and in the potential transmembrane: 20, 40, 60, 80 and 100 mV. Each of the time series was segmented originating the series called TP's and TA's. The TP's and TA's series were composed respectively by the residence times or absence of PEG within the nanopore. . These events did not present correlation (αDFA = 0.5), followed a Markovian stochastic pattern, modeled by a two state process, presented high complexity (CLZ ~ 1 and ApEn ~ 2) and randomness as showed through RP (DET <100) and RQA. These theoretical results corroborate with the literature that affirm to be the kinetics of the analyte-nanopore interaction a stochastic phenomenon. / Ferramentas estatísticas de dinâmica não linear são amplamente empregadas na análise e descrição adequada de fenômenos nas áreas de química, física e biologia. O aumento na capacidade de processamento computacional, juntamente com o desenvolvimento de linguagens de programação e algoritmos possibilitaram a disponibilização de programas capazes de simulação e previsão em fenômenos que há alguns anos seriam inexequíveis. Neste trabalho empregaram-se: Análise de Flutuação Destendenciada (DFA), Modelagem de Markov, Entropia Aproximada (ApEn), Complexidade de Lempel Ziv (CLZ) e Gráfico de Recorrência (GR) na análise de séries temporais resultantes do bloqueio ou desbloqueio na corrente iônica através do nanoporo individual da alfa-hemolisina do Staphylococcus aureus (alfa-hemolisina), causado pela entrada ou translocação do polietilenoglicol (PEG1294) monodisperso. Todos os experimentos foram realizados em bicamadas lipídicas formadas por diftanoil fosfatidilcolina, a temperatura ambiente (25 °C) e condições de fixação de voltagem empregando um amplificador de patch clamp. A solução aquosa foi de KCl 4M, pH 7,5, com o PEG nas concentrações de 400, 1000 ou 2000 M e as séries temporais com duração de no mínimo 30 segundos foram obtidas para cada uma das concentrações de PEG e nos potenciais transmembrana: 20, 40, 60, 80 e 100 mV. Cada uma das séries temporais foi segmentada originando as séries denominadas TP’s e TA’s. As series TP’s e TA’s eram compostas respectivamente, pelos tempos de permanência ou ausência do PEG no interior do nanoporo. Esses eventos não apresentaram correlação de longo alcance (αDFA = , seguiram um padrão estocástico Markoviano, modelado por um processo de dois estados, apresentaram alta complexidade (CLZ e ApEn ) e se mostraram aleatório quando analisado através do GR (DET e do RQA. Os resultados teóricos corroboram com a literatura que afirma ser a cinética da interação analito-nanoporo um fenômeno estocástico.

Orientadores: Arnaldo Yoshiteru Kuaye, Maria de Fátima Borges / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-17T19:34:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fujimoto_Graciela_M.pdf: 2012969 bytes, checksum: 0410bde829c4461172a6ed4e7332f4dc (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Enterococcus spp são bactérias conhecidas pela sua natureza ambígua, uma vez que podem promover características de interesse tecnológico em produtos fermentados, mas também, estão entre os principais patógenos nosocomiais. São bactérias onipresentes e sua prevalência ocorre principalmente em queijos de produção artesanal, como o queijo de coalho, produto bastante consumido na região nordeste do Brasil. Assim, o presente estudo objetivou: avaliar os principais determinantes fenotípicos (_-hemólise e gelatinase) e genotípicos (ace, as, cylA, cylB, cylM, efaA, esp, gelE e vanA) de virulência; verificar a atuação do gênero como cultura iniciadora no queijo de coalho (produção de diacetil, proteólise, lipólise e perfil em leite tornassolado); avaliar a produção de atividade antimicrobiana por isolados sem potencial de patogenicidade. A avaliação de determinantes de virulência foi realizada com 150 Enterococcus spp isolados de 14 amostras de queijos de coalho provenientes de duas regiões de produção artesanal do estado do Ceará. Utilizando-se a técnica molecular da PCR (Reação em Cadeia da Polimerase), identificou-se a presença de 90% (135/150) de E. faecium, 2,7% (4/150) de E. faecalis e 7,3% (11/150) de Enterococcus spp. Entre os determinantes genotípicos avaliados por PCR, apenas o gene as, foi negativo para todos os 150 isolados. Todos os E. faecalis apresentaram pelo menos um determinante genotípico de virulência, com 25% (1/4) para ace e gelE, 50% (2/4) e 100% (4/4), para efaA e esp, respectivamente. Entre os E. faecium também se observou que 16,3% (22/135) foram positivos para os genes efaA e esp. A atividade _-hemolítica foi observada em 36,3% (49/135) dos E. faecium e 50,0% (2/4) dos E. faecalis, destes, apenas, 1 E. faecium apresentou todos os genes do operon da citolisina (cylA, B, M). Outros 12 E. faecium apresentaram um ou dois genes cyl, mas não expressaram atividade _-hemolítica. A atividade da gelatinase foi observada para 2,9% (4/135) dos E. faecium, no entanto, o gene gelE, foi confirmado para apenas 2 desses E. faecium. O gene gelE foi confirmado por sequenciamento para 25% (1/4) dos E. faecalis e 20% (27/135) dos E. faecium que não expressaram a atividade gelatinase. A resistência a antibióticos foi determinada para 129 enterococos. Para os isolados de E. faecium 17,5 % (20/114) foram resistentes a eritromicina, 10,5 % (12/114) a tetraciclina e 0,9 % (1/114) a teicoplanina e a vancomicina (que não apresentou o gene vanA). O gene vanA foi observado em 6 E. faecium que foram sensíveis a vancomicina. Para os isolados de E. faecalis, 75 % (3/4) foram resistentes a tetraciclina. O perfil de características tecnológicas de 43 E. faecium e 2 E. faecalis, demonstrou que tanto isolados que não apresentaram determinantes de virulência quanto os que apresentaram múltiplos determinantes de virulência, foram capazes de produzir ácido lático, diacetil e atividade lipolítica. Apenas 1 isolado de E. faecium foi capaz de produzir atividade antimicrobiana contra L. monocytogenes. A presença de pelo menos um fator de virulência ou resistência a antibióticos foi observada em 82% dos enterococos, alertando sobre a necessidade de estudos cuidadosos quanto ao uso destes no processamento de alimentos / Abstract: Enterococcus spp bacteria are known for their ambiguous nature, since they can promote features of technological interest in fermented products, but also are among the leading nosocomial pathogens. They are ubiquitous and their prevalence occurs mainly in artisanal cheeses production, like ¿Coalho¿ cheese, product pretty consumed in the northeastern region of Brazil. Thus, this stud aimed to evaluate the major phenotypic (_-hemolysin and gelatinase) and genotypic (ace, as, cylA, cylB, cylM, efaA, esp, gelE e vanA) virulence determinants; check the performance of the genre as starter culture in Coalho cheese (production of proteolysis, diacetyl, lipolysis and profile on Litmus Milk); evaluate the production of antimicrobial activity by isolated without potential for pathogenicity. The assessment of virulence determinants was made with 150 strains of enterococci obtained from 14 samples of Coalho cheese made by artisanal production from two different regions in the state of Ceara. Using molecular technique of PCR (Polymerase Chain Reaction), it was identified the presence of 90% (135/150) E. faecium, 2.7% (4/150) E. faecalis and 7.3% (11/150) Enterococcus spp. Among genotypic determinants evaluated by PCR only as gene was negative for all 150 isolates. All E. faecalis showed at least one genotypic virulence determinant, with 25% (1/4) to ace and gelE, 50% (2 / 4) and 100% (4/4), respectively for efaA and esp. Amongst E. faecium was also noted that 16.3% (22/135) were positive for efaA and esp. genes _-hemolytic activity was observed in 36.3% (49/135) of E. faecium and 50.0% (2/4) of E. faecalis, however only one E. faecium strains, showed all cytolysin genes (cylA, B, M). Another 12 E. faecium showed one or two cyl genes but haven¿t expressed _-hemolysin. Gelatinase activite was observed in 2.9% (4/135) of E. faecium, however gelE gene was observed in only two of these strains. The gelE gene was confirmed by sequencing for 25% (1/4) of E. faecalis and 20% (27/135) E. faecium that haven¿t expressed gelatinase activite. Antibiotic resistance was determined in 129 enterococci. For E. faecium strains, 17.5% (20/114) were resistant to erythromycin, 10.5% (12/114) to tetracycline and 0.9% (1/114) to teicoplanin and vancomycin (that haven¿t had vanA gene). About E.faecalis strains, 75% (3/4) were resistant to tetracycline. The vanA gene was observed in 6 E. faecium that were susceptible to vancomycin. Technological characteristics of 43 E. faecium and 2 E. faecalis were observed in nonpathogenic strains and in strains that showed multiple virulence determinants. All of this groups produced lactic acid, dyacetil and lypolisis. Only one E.faecium has showed antimicrobial activit against L. monocytogenes. The presence of at least a factor of virulence determinants or antibiotic resistence was observed in 82 % of Enterococcus strains, alerting about the necessity of careful studies regarding the use of enterococci in food processing / Mestrado / Engenharia de Alimentos / Mestre em Tecnologia de Alimentos

EPEC atípicas (EPECa) são isoladas de surtos diarréicos em crianças, adultos e animais em países industrializados e em desenvolvimento. Hemolisinas são toxinas que atuam sobre a membrana de eritrócitos e de diversos tipos celulares. Tal grupo de toxinas é reconhecido como importante fator de virulência envolvido na patogênese bacteriana, por isso o objetivo foi avaliar a expressão de enterohemolisina em isolados de EPECa e analisar características fenotípicas como interferência do meio de cultivo e adesão a componentes de matriz extracelular. Observou-se prevalência de 5,4% de isolados enterohemolíticos, e variações na expressão da toxina foram associadas à concentrações de lactose e caseína nos meios de cultivo. Além disso, verificou-se forte associação entre produção de enterohemolisina e ligação à fibronectina celular. / Atypical EPEC (aEPEC) are isolated from diarrheal outbreaks in children, adults and animals in industrialized and developing countries. Hemolysins are toxins that act on the red cell membrane and various cell types. This group of toxins is recognized as an important virulence factor involved in the bacterial pathogenesis. The aim of this study was the evaluation of the enterohemolysin expression in aEPEC isolates as interference of the culture media and adhesion to components of extracellular matrix. The prevalence of enterohemolytic isolates was 5.4%, and variations in toxin expression were associated with lactose and casein concentrations in culture media. Moreover, it was found association between production of enterohemolysin and adhesion to cellular fibronectin.