Thesis (Ph. D.)--Miami University, Dept. of Chemistry and Biochemistry, 2008. / Title from second page of PDF document. Includes bibliographical references.

Thesis (MSc.(Medical Microbiology)--Faculty of Health Sciences)-University of Pretoria, 2008. / Summary in English and Afrikaans. Includes bibliographical references.

Thesis (M. Med. Sc.)--University of Hong Kong, 2006.

The work described in this thesis focused on the use of nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) to study two classes of metallo enzymes - the Fe(II)- and 2oxoglutarate (2OG)-dependent dioxygenases and the metallo β-lactamases (MBLs). These enzymes are involved in clinically important biological processes, i.e. the hypoxic response and antimicrobial resistance, respectively. Both protein systems are interesting from an NMR perspective because they have dynamic regions involved in catalysis and ligand interactions. The work included mechanistic studies, protein-ligand interaction studies, and method development for inhibitor discovery. NMR was applied to study the human prolyl hydroxylase domain-containing protein 2 (PHD2), which is crucially involved in the chronic hypoxic response. The results reveal that binding of the C- and the N-terminus of the oxygen dependent degradation domains CODD and NODD, respectively, induce different interactions with PHD2. The substitution of a single amino acid, as occurs with PHD2 variants linked to erythrocytosis and breast cancer, can alter the selectivity of PHD2 towards its ODD substrates. Studies with the Trichoplax adhaerens PHD provide insights into the evolutionary substrate preference of the PHDs. Using ¹³C-labelled peptidyl-substrates; NMR was applied to investigate proposed 'alternative' PHD2 substrates/interaction partners. The product release mechanism of PHD2 was investigated using NMR; the results reveal that the presence of 2OG strongly discriminates between the binding of CODD and hydroxylated CODD to PHD2. NMR was also applied to monitor PHD2 kinetics and inhibition. Competition and displacement assays were designed and applied to investigate PHD inhibitor binding modes. Comparative studies on the activities and selectivities of PHD inhibitors in clinical trials should aid in the work on the therapeutic manipulation of the natural hypoxic response. Protein-observe ¹9F-NMR was used to study the São Paolo MBL (SPM-1). The results provide new structural insights into SPM-1 catalysis and the requirements for inhibitor development. They also reveal that the hydrolysed β-amino acid products of MBL catalysis can bind to SPM-1. They illustrate the utility of ¹⁹F-NMR for detecting metal chelation, which is not always readily tractable in studies on metallo enzyme inhibition, new binding modes, and stereoisomer binding/epimerisation in solution. The interaction of a cyclobutanone analogue, a broad-spectrum MBL inhibitor, with SPM-1 was investigated. A combination of ¹H, ¹⁹F, ¹³C-NMR and crystallographic analyses reveal that cyclobutanone binding may mimic formation of the oxyanion tetrahedral intermediate in β-lactam hydrolysis. The susceptibility of avibactam, the first clinically useful non-β-lactam β-lactamase inhibitor, to MBL-catalysed hydrolysis was studied. The results reveal that avibactam is not an MBL inhibitor and a poor substrate of most members of all three clinically relevant subclasses of MBLs. In some cases, avibactam undergoes slow hydrolysis in a process different from that observed with serine β-lactamases. Overall, the results illustrate the utility of NMR for studying dynamic aspects of enzyme catalysis and inhibitor binding.

Objetivos: Avaliar o perfil de suscetibilidade, a prevalência da produção de AmpC, β-lactamase de espectro estendido (ESBL) e Metalo-β-lactamase (M-βla) em Pseudomonas aeruginosa obtidas de dois hospitais universitários distintos (ISCMPA e HCPA) em Porto Alegre. Em adição, tipagem molecular por PFGE foi realizada entre os isolados produtores de M-βla para avaliar a relação clonal. Métodos: Foi determinada a suscetibilidade de 238 isolados de P. aeruginosa para 8 agentes antimicrobianos, através do teste de disco-difusão, usando agar Müller-Hinton (MH) de acordo com “National Committee for Clinical Laboratory Standards” (NCCLS) . Todos isolados foram avaliados para produção de AmpC com o disco de imipenem (indutor) próximo ao disco de cefepima/ceftazdima (substrato). Um achatamento no halo de cefepime/ceftazidima pela indução da enzima pelo imipenem, indicava resultado positivo para AmpC. Todos isolados forma avaliados para a presença de ESBL através do teste de aproximação de disco com ceftazidima, cefepima, cefotaxima, ceftriaxona e ticarcilina-clavulanato como inibidor de β-lactamase. A produção de M-βla foi determinada através do teste de aproximação de discos de CAZ a discos impregnados com ácido2-mercatopropiônico (2-MPA). As taxas de resistência foram comparadas através do Teste Exato de Fisher. Valor de P<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Análise de macrorestrição com a enzima speI foi realizada em isolados produtores de M-βla. Resultados: As taxas de resistência para todos os agentes foram superiores entre os isolados obtidos na ISCMPA em relação aos do HCPA. A ceftazidima mostrou ser o antibiótico mais efetivo contra os isolados de ambos Hospitais (ISCMPA e HCPA) com taxa de resistência de 25,7% (ISCMPA) e 6,1% (HCPA). A expressão de AmpC foi observada em 190 isolados (83,7% HCPA e 77,1% ISCMPA). Não foi possível detectar a presença de ESBL entre todos as P. aeruginosa avaliadas em ambos hospitais. Foi observada a presença de M-βla em 28 isolados (20,0%) da ISCMPA. Mas não foi detectada M-βla em nenhuma P. aeruginosa do HCPA. A análise de macrorestrição mostrou que 14 de 16 P. aeruginosa Mβla positivas pertenciam a um clone (denominado clone A), e seus subclones. Apenas dois outros clones (B e C) foram identificados em um isolado cada. / Objectives: To evaluate susceptibility profile, the prevalence of extendedspectrum β-lactamases (ESBL) production, AmpC and Metallo-β-lactamases (M-βla) in Pseudomonas aeruginosa obtained from two distinct hospitals (ISCMPA and HCPA) in Porto Alegre, Brazil. In addiction, molecular typing by PFGE was perfomed among isolates producing M-βla in order to evaluate probably clonal relatedness. Methods: The susceptibility of 238 P. aeruginosa to 8 antimicrobial agents was determined by the disk diffusion method, using Müller-Hinton agar (MH) in accordance with “National Committee for Clinical Laboratory Standards” guidelines. All isolates were evaluated for AmpC production with the imipenem disk (strong inducer) near of the cefepime/ceftazidime disk (substrate). A blunting of the cefepime/ceftazidime zone by imipenem-induced enzyme, indicated positive result for AmpC. All isolates were evaluated for ESBL production by disk approximation test with ceftazdime, cefepime, cefotaxime, ceftriaxone plus ticarcillin-clavulanate as inhibitor. M-βla production was determined by disk approximation test with disks containing CAZ and 2-mercatopropionic acid (2-MPA). The results were compared by the Fisher’s Exact Test. Macrorestriction analysis by SpeI, followed by PFGE, was perfomed in isolates M-βla positive. The resistance rates were compared by The Fisher’s Exact Test. P values < 0.05 were considered to be statistically significant. Results: The resistance rates to all antimicrobial agents were higher among isolates obtained from ISCMPA than those obtained from HCPA. The ceftazidime was the more active antibiotic against the isolates in both hospitals with resistance rates of 25,7% (ISCMPA) and 6,1% (HCPA). The derepression of AmpC was observed in 190 isolates (83,7% HCPA and 77,1% ISCMPA). It was not possible to detect the presence of ESBL among all P. aeruginosa evaluated in both hospitals. Positive results for M-βla production were observed in 28 isolates (20,0%) from ISCMPA. But none M-βla production was identified in P. aeruginosa from HCPA. The macrorestriction analysis by PFGE, showed that 14 of 16 M-βla positive P. aeruginosa beloneed to one clone (named clone A) and its subclones.Only two others clones (B and C) were identified in one isolate each.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-25T23:32:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 294997.pdf: 3221362 bytes, checksum: 05c3e867a109c64c20174ece942ee493 (MD5) / Nas últimas duas décadas, índices crescentes de resistência têm minado a eficácia dos agentes antimicrobianos. Pseudomonas aeruginosa são importantes patógenos hospitalares e esta espécie é considerada um reservatório de genes determinantes de resistência, inclusive genes que codificam para as metalo-ß-lactamases (MßL). MßL são betalactamases capazes de hidrolisar os antimicrobianos betalactâmicos carbapenêmicos, os quais constituem o tratamento empírico de infecções causadas por bactérias Gram-negativas multirresistentes. Neste trabalho foram analisados 42 isolados clínicos de P. aeruginosa quanto à susceptibilidade aos principais antimicrobianos utilizados na clínica. Através da determinação das concentrações inibitórias mínimas, 41 desses não eram sensíveis a imipenem e meropenem e 31 se apresentaram simultaneamente resistentes a estes dois carbapenêmicos e às cefalosporinas ceftazidima e cefepima. Vinte e quatro isolados foram considerados produtores de MßL através do teste de sinergismo de disco duplo (DDST) utilizando ácido 2-mercaptopropiônico como inibidor seletivo de MßL. Trinta e cinco isolados (35/42) foram avaliados quanto à presença dos genes de MßL. Em dezessete dos isolados em que os testes fenotípicos se apresentaram positivos, quinze (15/17) corresponderam às subclasses SPM-1 (14/15) e IMP-1 (1/15). Nos demais isolados onde os testes fenotípicos se apresentaram negativos, também em quatro (4/18) deles pôde ser verificada a presença da subclasse SPM-1. A ocorrência de isolados produtores desta enzima naqueles isolados não sensíveis aos carbapenêmicos foi de 58,54% (24/41; . = 0,4322), no entanto, naqueles simultaneamente resistentes aos carbapenêmicos e cefalosporinas, aliados à observação de CIM elevadas, foi de 85,71% (24/28; . < 0,001), sugerindo que o isolamento de P. aeruginosa apresentando este último fenótipo é um indicativo mais apurado da presença de MßL. Os isolados desta amostragem também demonstraram uma associação positiva entre a presença de MßL e perfis de multirresistência. Foi observado que 81,5% (22/27) dos isolados sensíveis a, no máximo, colistina e aztreonam, produziam MßL. Assim, a correlação entre a presença dessa enzima e a observação de multirresistência foi de 91,67% (. < 0,001) e a uma razão 3,3 vezes superior à correlação obtida para os isolados não produtores de MßL. / In the last two decades, increasing rates of resistance have weakened the effectiveness of antimicrobial agents. Pseudomonas aeruginosa is an important nosocomial pathogen and the species is considered as a reservoir of resistant genes, including those coding for metallo-â-lactamases (MâL). MâL are enzymes able to hydrolyze the carbapenem beta-lactam antibiotics, which are the empirical treatment of infections caused by multiresistant Gram-negative bacteria. In the present work, 42 clinical isolates of P. aeruginosa with different susceptibility to the main antimicrobials used in the clinic were analyzed. By determining the minimum inhibitory concentrations, 41 of them were not sensitive to imipenem and meropenem, and 31 were simultaneously resistant to these carbapenems and to the cephalosporins ceftazidime and cefepime. Twenty-four isolates were considered as producers of MâL through double-disk synergy test (DDST) using the acid 2-mercaptopropionic as an MâL selective inhibitor. Thirty-five isolates (35/42) were evaluated for the presence of MâL genes. In seventeen of them, in which the phenotypic tests were positive, fifteen (15/17) corresponded to subclasses SPM-1 (14/15) and IMP-1 (1/15). In the other eighteen isolates where phenotypic tests were negative, four of them (4/18) also presented the SPM-1 gene. In the group of isolates resistant to carbapenems, the occurrence of producers of this enzyme was 58.54% (24/41; ñ = 0.4322). However, when the resistant isolates to both carbapenem and cephalosporin were combined with the observation of high MIC values, this value increased to 85.71% (24/28; ñ <0.001). This suggests that the occurrence of isolates of P. aeruginosa showing the latter phenotype is a reliable indicative of the presence of MâL. Isolates of this sample also showed a positive association between the presence of MâL and profiles of multidrug resistance. The results showed that 81.5% (22/27) of the isolates sensitive at least to colistin and aztreonam, produced MâL. The correlation between the presence of MâL and the observation of multidrug resistance was of 91.67% (ñ <0.001), in a rate 3.3 times greater than the risk obtained for the isolates that did not produce MâL.

Submitted by Luciana de Cenço Correa Lacerda (lulacerda2@yahoo.com.br) on 2018-06-21T19:31:05Z No. of bitstreams: 1 TESE Luciana 21.06.18 PRONTA.pdf: 1525467 bytes, checksum: a6d6df3286d60500baf769d3035234e1 (MD5) / Approved for entry into archive by Neli Silvia Pereira null (nelisps@fcav.unesp.br) on 2018-06-25T18:40:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lacerda_lcc_dr_jabo.pdf: 1525467 bytes, checksum: a6d6df3286d60500baf769d3035234e1 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-25T18:40:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lacerda_lcc_dr_jabo.pdf: 1525467 bytes, checksum: a6d6df3286d60500baf769d3035234e1 (MD5) Previous issue date: 2018-05-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Lesões na pele podem resultar em feridas que, dependendo do tempo de reparação tissular podem ser classificadas como agudas ou crônicas, sendo crônicas aquelas que não apresentaram cicatrização dentro do período de quatro semanas. A ferida é contaminada por diferentes espécies bacterianas, sendo o sistema imunológico da pele o responsável por impedir que tais contaminações evoluam para infecções. No entanto, muitas vezes o quadro infeccioso é instalado, havendo necessidade de tratamento com antimicrobianos. Tendo em vista que o mau uso de antimicrobianos provoca resistência a multidrogas em estirpes bacterianas potencialmente patogênicas, este trabalho teve como objetivo identificar as bactérias prevalentes em feridas agudas e crônicas de cães por meio de sequenciamento da região 16S rRNA e testar a sensibilidade dos isolados a diferentes antimicrobianos. Para tanto, foram amostradas 20 feridas, sendo cada uma de um cão atendido no Hospital Veterinário da UNESP, Câmpus de Jaboticabal. De cada ferida foram obtidos dez isolados, os quais foram selecionados para o sequenciamento de DNA por meio de comparação entre os perfis genéticos obtidos pelo emprego de marcador molecular randômico. Foram sequenciados 74 isolados identificados como pertencentes a oito gêneros de bactérias gram-negativas, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp., Acinetobacter baumannii, Klebsiella spp., Kluyvera georgiana e Providencia stuartii, e três de gram-positivas, Enterococcus sp., Staphylococcus spp. e Bacillus spp. Casos de cães com feridas agudas ou crônicas, associadas a mais de um gênero bacteriano, foram de 85,7% e 30,7%, respectivamente. Isolados da espécie S. aureus apresentaram amplificação para quatro genes codificadores das enterotoxinas sea, seh, see e hlg, enquanto um isolado de B. cereus foi positivo para a presença dos genes hblA, hblC, hblD, nheA, nheB, nheC e entFM. Dois dos isolados de E. coli (6%) apresentaram o gene blaCTX-M-2 e provaram ser resistentes à cefotaxima, um antibiótico do grupo dos β-lactâmicos. Todos os isolados avaliados apresentaram resistência a pelo menos um dos antimicrobianos testados, sendo metronidazol, cefalexina e cefazolina, aqueles pelos quais os isolados mostraram maior resistência. Cinco pacientes que estavam sob antibioticoterapia no momento da coleta possuíam estirpes resistentes aos antimicrobianos pelos quais estavam sendo tratados. Tendo em vista que há uma grande diversidade bacteriana resistente à multidrogas colonizando feridas cutâneas agudas e crônicas de cães, a implantação de antibiogramas previamente à recomendação de antimicrobianos é prática imprescindível e deve ser implantada para preservação da saúde animal e, consequentemente, pública. / Skin lesions can result in cutaneous wounds that may be classified as acute or chronic depending on the period of time spent in tissue repairment. Wounds that have not healed within four weeks are generally classified as chronic. The wound is contaminated by different bacterial species and the immune system of the skin is responsible for preventing infections. Nonetheless, the infectious process is often developed and antimicrobial treatment become necessary. Considering that the misuse of antimicrobials provokes multidrug resistance in potentially pathogenic bacterial strains, this work aimed to identify prevalent bacteria in acute and chronic wounds of dogs by 16S rRNA sequencing and to test the sensitivity of the isolates to different antimicrobials. For that, 20 wounds were sampled, each one from a dog admitted at the Veterinary Hospital of UNESP, Jaboticabal, São Paulo, Brazil. From each wound ten isolates were obtained, which were selected for DNA sequencing through genetic profiles comparison by applying a random molecular marker. Seventy-five isolates were identified as belonging to eight Gram-negative bacteria genera, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp., Acinetobacter baumannii, Klebsiella spp., Kluyvera georgiana and Providencia stuartii, and to three gram-positive bacteria genera, Enterococcus sp., Staphylococcus spp. and Bacillus spp. Cases of dogs with acute or chronic wounds associated to more than one bacterial genus were 85.7% and 30.7%, respectively. Staphylococcus aureus isolates presented amplification to four enterotoxin encoding the genes sea, seh, see and hlg, whereas a B. cereus isolate was positive for hblA, hblC, hblD, nheA, nheB, nheC and entFM genes. Two of the E. coli isolates (6%) presented the blaCTX-M-2 gene and proved to be resistant to cefotaxime, a β-lactam antibiotic. All isolates evaluated were resistant to at least one of the antimicrobials tested, being metronidazole, cephalexin and cefazolin the ones for those the isolates showed to be more resistant. Five patients undergoing antibiotic therapy at the same period of sampling presented resistants bacterial strains to the antibiotics by which the patients were being treated. Considering that there is great multidrug resistant bacterial diversity colonizing acute and chronic cutaneous wounds of dogs, the implantation of antibiograms prior to the antimicrobials recommendation is a practice to be implemented in order to preserve animal and, consequently, public health.

Objetivos: Padronizar uma técnica molecular, Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para detectar os genes blaSPM-1 , blaVIM-2 e blaIMP-1 que conferem a Pseudomonas aeruginosa resistência a carbapenêmicos (imipenem e meropenem) através da produção das metalo-β-lactamases (MBL) SPM-1, VIM-2 e IMP-1. Comparar os resultados obtidos com a técnica de PCR com os obtidos através de uma técnica fenotípica para detecção desse mecanismo enzimático de resistência. Descrever a prevalência dos genes de MBL. Metodologia: Utilizando 48 amostras clínicas de P. aeruginosa resistentes a ceftazidima e/ou imipenem sendo 37 caracterizadas como produtoras de MBL através de uma técnica fenotípica (aproximação de disco) e 11 como não produtoras pela mesma técnica. Esses isolados foram testados com três primers específicos para os seguintes genes: blaSPM-1 , blaVIM-2 e blaIMP-1 Resultados e Discussão: Dos 37 isolados produtores de metalo-β-lactamase, 29 tiveram resultado positivo na PCR sendo 27 positivos para o gene blaSPM-1 e 2 positivos para o gene blaIMP-1 . Em nenhum isolado foi detectado o gene blaVIM-2 .Oito isolados caracterizados como produtores de MBL não tiveram nenhum produto amplificado com os três pares de primers. Os 11 isolados caracterizados como não produtores de MBL não tiveram produto amplificado. Assim, a sensibilidade da técnica molecular foi de 78,40% e a especificidade 100,0% considerando a técnica fenotípica de aproximação de disco como padrão ouro Conclusões: Foi possível a padronização da técnica de PCR para a detecção dos genes blaSPM-1 , blaVIM-2 e blaIMP-1 bem como foi possível a comparação entre a técnica de PCR e a técnica fenotípica, sendo que a metodologia molecular apresentou 100% de especificidade e 78,40% de sensibilidade. O gene de MBL mais prevalente foi blaSPM-1 encontrado em 27/29 amostras de P. aeruginosa resistentes ao imipenem. O gene blaIMP-1 foi detectado em apenas 2/29 amostras de P. aeruginosa resistentes ao imipenem. O gene blaVIM-2 e não foi detectado nas amostras de P.aeruginosa analisadas neste estudo.

A presença de Pseudomonas aeruginosa resistentes a antimicrobianos no esgoto hospitalar contribui para sua disseminação em corpos d´água e possibilita o estabelecimento de reservatórios ambientais de resistência bacteriana. Os objetivos deste estudo foram comparar isolados de P. aeruginosa de amostras de esgoto hospitalar e água superficial quanto ao perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos, a presença e diversidade de genes de metalo β-lactamases (MBLs) e a similaridade genética entre os isolados. Para isso, as amostras de esgoto hospitalar foram coletadas de cinco hospitais, localizados em Passo Fundo e Porto Alegre, RS, Brasil. As amostras de água superficial foram coletadas dos corpos d´água que recebem os esgotos de dois hospitais estudados. Os isolados foram identificados por provas bioquímicas clássicas e pela amplificação de um fragmento do rDNA 16S. O perfil de susceptibilidade foi avaliado pela técnica de disco-difusão. Os genes blaSPM-1, blaVIM e blaIMP foram pesquisados por PCR. A relação clonal entre os isolados foi avaliada pela ERIC-PCR e PFGE. A diversidade nos genes de MBLs encontrados foi avaliada pela DGGE. Foram analisados 614 isolados de P. aeruginosa, dos quais somente 5,0% apresentaram o gene blaSPM-1. Todos os isolados com este gene apresentaram fenótipo de multirresistência. A análise de similaridade genética pela ERIC-PCR e PFGE não mostrou relação clonal entre isolados de água superficial e esgoto hospitalar ou entre isolados provenientes de amostras de diferentes esgotos hospitalares. A presença de isolados resistentes e com o gene blaSPM-1, em amostras de esgoto hospitalar, atenta para o risco de disseminação ambiental de resistência bacteriana. / The presence of Pseudomonas aeruginosa resistant to antimicrobials in hospital sewage contributes to its dissemination into water bodies and may lead to the establishment of environmental reservoirs of bacterial resistance. The objectives of this study were to compare P. aeruginosa strains isolated from hospital sewage and superficial water samples, about the susceptibility profile to antimicrobials, the presence and diversity of the metallo β-lactamases (MBLs) genes and the genetic similarity among the strains. For this purpose, hospital sewage samples were collected from five hospitals located in Passo Fundo and Porto Alegre, RS, Brazil. The superficial water samples were collected from the water bodies where the sewage from two of the analyzed hospitals were discharged. The isolates were identified by classical biochemical tests and amplification of 16S rDNA fragment. The susceptibility was determined by the disk-diffusion method. The blaSPM-1, blaVIM e blaIMP genes were screened by PCR. The clonal relationship among the strains was evaluated by ERIC-PCR and PFGE. The diversity on MBL genes found was analyzed by DGGE. A total of 614 P. aeruginosa strains were analyzed, of which only 5,0 % showed the blaSPM-1 gene. All isolates with this gene showed the multirresistance phenotype. The genetic similarity analysis by ERIC-PCR and PFGE didn´t show clonal relationship between the strains from superficial water and hospital sewage or between the strains from samples of different hospital sewages. The presence of resistant isolates and isolates with the blaSPM-1 gene in hospital sewage samples call attention to the risk of environmental dissemination of bacterial resistance.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-03-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo principal desse estudo foi avaliar os mecanismos de resistência aos agentes β-lactâmicos em isolados clínicos de P. aeruginosa procedentes de dois hospitais, localizados no Brasil e nos Estados Unidos da América (EUA). Foram avaliadas 145 amostras bacterianas de P. aeruginosa recuperadas de hemoculturas, sendo 84 isolados obtidos no período de janeiro de 2000 a maio de 2002 do Hospital São Paulo - HSP (Brasil) e 61 isolados obtidos no período de janeiro de 1996 a dezembro de 2003 do Medical College of Virginia - MCV (EUA). Todas as amostras bacterianas foram submetidas ao teste de sensibilidade aos antimicrobianos, avaliado pela técnica de diluição em ágar. A atividade enzimática das carbapenemases foi avaliada pelo método de hidrólise com inibição pelo EDTA. A pesquisa de genes que codificam ESBL e carbapenemases foi realizada pela técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR), seguido por sequencimento. A transcrição dos genes mexB, mexD, mexF e mexY, que codificam os sistemas de efluxo ABM, CDJ, EFN, XY, respectivamente, da β-lactamase cromossomal ampC e da porina oprD foi avaliada pela técnica de PCR quantitativo em tempo real (qRTPCR), sendo os resultados da transcrição comparados com a cepa referência PA01. Nossos resultados demonstraram que os isolados procedentes do HSP apresentaram taxas de sensibilidade inferiores aos antimicrobianos testados comparado àquelas apresentadas pelos isolados do MCV, exceto para a ciprofloxacina. Sete isolados clínicos de P. aeruginosa do HSP apresentaram atividade carbapenemase, sendo amplificado os genes blaIMP-1 (n=1), blaIMP-16 (n=1) e blaSPM-1 (n=5). Adicionalmente, foi identificada a produção de GES-5 por uma amostra do HSP. Nenhum isolado proveniente do MCV apresentou atividade carbapenemase pela técnica espectrofotométrica ou qualquer amplificação dos genes codificadores de ESBL ou carbapenemases pesquisados. O aumento da transcrição dos genes que codificam os sistemas de efluxo avaliados foi mais frequente entre os isolados clínicos de P. aeruginosa procedentes do HSP (71,4%), em comparação com os isolados do MCV (52,4%). Os sistemas XY (41,6%) e ABM (24,6%) foram os mais frequentes entre os isolados do HSP e do MCV, respectivamente. Adicionalmente, foi avaliada a transcrição dos diferentes genes que codificam esses sistemas simultaneamente com a expressão de outros mecanismos de resistência. Entre os isolados do HSP, a associação desses diferentes determinantes de resistência foi maior que entre os isolados do MCV. A redução da transcrição de oprD foi semelhante entre os dois grupos amostrais, sendo observada em 91,6% e 91,8% dos isolados do HSP e do MCV, respectivamente. O aumento da transcrição de ampC foi observado em 30,9% e 5,0% dos isolados do HSP e MCV. O aumento da transcrição dos genes que codificam os sistemas de efluxo e/ou a redução da transcrição de oprD parecem aumentar as CIMs dos β-lactâmicos, embora a associação destes mecanismos com a produção de β-lactamases seja mais significante para o aumento da CIM. Isso pode sugerir que tais mecanismos podem favorecer a sobrevivência da P. aeruginosa sob pressão seletiva, aumentando, assim, a chance de adquirir outros determinantes de resistência aos agentes β-lactâmicos no ambiente hospitalar, e contribuindo para o surgimento de cepas altamente resistentes a esta classe de antimicrobianos. / The aim of this study was evaluate the mechanisms of β-lactams resistance in P. aeruginosa clinical isolates from two hospitals, located in Brazil and United States of America (USA). We have selected 145 P. aeruginosa isolated in blood cultures. Of those, 84 and 61 isolates were recovered from patients hospitalized in Hospital São Paulo – HSP (Brazil), and in Medical College of Virginia – MCV (USA), respectively. All strains were submitted to antimicrobial susceptibility testing by agar dilution. Investigation of carbapenemase activity of crude extracts was performed by UV spectrophotometric assays. Detection of ESBL- and MBL-encoding genes was conducted by PCR, followed by amplicon sequencing. The hyperexpression of efflux systems (ABM, CDJ, EFN and XY), AmpC chromosomal β-lactamase, as well as reduced OprD expression was evaluated by quantitative real time PCR (qRT-PCR), compared to that of PA01 reference strain. Isolates from HSP showed decreased susceptibility rates for most antimicrobials tested compared to those of MCV isolates, except for ciprofloxacin. Carbapenemhydrolysis was detected in seven P. aeruginosa from HSP, in which we have identified the MBL- encoding genes blaIMP-1 (n=1), blaIMP-16 (n=1) and blaSPM-1 (n=5). In addition, the production of GES-5 was observed in a single isolate from this hospital. In contrast, neither MBL- nor ESBL-encoding genes were observed in isolates from MCV. Efflux hyperexpression was more frequently observed in P. aeruginosa clinical isolates from HSP (71.4%) than from MCV (52.4%). The efflux systems XY (41.6%) and ABM (24.6%) were more frequently hyperexpressed in isolates from HSP and MCV, respectively. The simultaneous expression of different resistance determinants in one isolate was also evaluated. This association was more frequent among HSP isolates. Reduced OprD expression was similar among isolates from HSP and MCV, 91.6% and 91.8%, respectively. The hyperexpression of AmpC was 30.9% among HSP isolates and 5.0% among MCV isolates. The efflux hyperexpression and/or porin loss might increase β-lactam MICs, although not as effectively as do β-lactamases associated with other resistant determinants. This finding suggests that such mechanisms may favor P. aeruginosa survival under selective pressure, increasing its possibility to acquire other β-lactam resistance determinants in the hospital environment, contributing to the emergence of strains highly resistant to this class of antimicrobials. / FAPESP: 06/55937-3 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações