Cette thèse traite de la résistance du VIH-1 aux antirétroviraux, en particulier de l'activité antivirale de plusieurs inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNTI) ainsi que des inhibiteurs de protéase (IP). Nous avons exploré l’émergence et la spécificité des voies de mutations qui confèrent la résistance contre plusieurs nouveaux INNTI (étravirine (ETR) et rilpivirine (RPV)) (chapitres 2 et 3). En outre, le profil de résistance et le potentiel antirétroviral d'un nouvel IP, PL-100, est présenté dans les chapitres 4 et 5. Pour le premier projet, nous avons utilisé des sous-types B et non-B du VIH-1 pour sélectionner des virus résistants à ETR, et ainsi montré que ETR favorise l’émergence des mutations V90I, K101Q, E138K, V179D/E/F, Y181C, V189I, G190E, H221H/Y et M230L, et ce, en 18 semaines. Fait intéressant, E138K a été la première mutation à émerger dans la plupart des cas. Les clones viraux contenant E138K ont montré un faible niveau de résistance phénotypique à ETR (3,8 fois) et une diminution modeste de la capacité de réplication (2 fois) par rapport au virus de type sauvage. Nous avons également examiné les profils de résistance à ETR et RPV dans les virus contenant des mutations de résistance aux INNTI au début de la sélection. Dans le cas du virus de type sauvage et du virus contenant la mutation unique K103N, les premières mutations à apparaître en présence d’ETR ou de RPV ont été E138K ou E138G suivies d’autres mutations de résistance aux INNTI. À l’inverse, dans les mêmes conditions, le virus avec la mutation Y181C a évolué pour produire les mutations V179I/F ou A62V/A, mais pas E138K/G. L'ajout de mutations à la position 138 en présence de Y181C n'augmente pas les niveaux de résistance à ETR ou RPV. Nous avons également observé que la combinaison de Y181C et E138K peut conduire à un virus moins adapté par rapport au virus contenant uniquement Y181C. Sur la base de ces résultats, nous suggérons que les mutations Y181C et E138K peuvent être antagonistes. L’analyse de la résistance au PL-100 des virus de sous-type C et CRF01_AE dans les cellules en culture est décrite dans le chapitre 4. Le PL-100 sélectionne pour des mutations de résistance utilisant deux voies distinctes, l'une avec les mutations V82A et L90M et l'autre avec T80I, suivi de l’addition des mutations M46I/L, I54M, K55R, L76F, P81S et I85V. Une accumulation d'au moins trois mutations dans le rabat protéique et dans le site actif est requise dans chaque cas pour qu’un haut niveau de résistance soit atteint, ce qui démontre que le PL-100 dispose d'une barrière génétique élevée contre le développement de la résistance. Dans le chapitre 5, nous avons évalué le potentiel du PL-100 en tant qu’inhibiteur de protéase de deuxième génération. Les virus résistants au PL-100 émergent en 8-48 semaines alors qu’aucune mutation n’apparaît avec le darunavir (DRV) sur une période de 40 semaines. La modélisation moléculaire montre que la haute barrière génétique du DRV est due à de multiples interactions avec la protéase dont des liaison hydrogènes entre les groupes di-tétrahydrofuranne (THF) et les atomes d'oxygène des acides aminés A28, D29 et D30, tandis que la liaison de PL-100 est principalement basée sur des interactions polaires et hydrophobes délocalisées à travers ses groupes diphényle. Nos données suggèrent que les contacts de liaison hydrogène et le groupe di-THF dans le DRV, ainsi que le caractère hydrophobe du PL-100, contribuent à la liaison à la protéase ainsi qu’à la haute barrière génétique contre la résistance et que la refonte de la structure de PL-100 pour inclure un groupe di-THF pourrait améliorer l’activité antivirale et le profil de résistance. / This thesis focuses on HIV-1 drug resistance and on the antiviral activity of several non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs) and protease inhibitors (PIs). We have explored the mutational pathways and resistance patterns of several new NNRTIs (etravirine (ETR) and rilpivirine (RPV)) (Chapters 2 and 3). In addition, the drug resistance profile and potential of a novel protease inhibitor (PI) PL-100 is presented in Chapters 4 and 5. In the first project, we used both B and non-B subtypes of HIV-1 to select for ETR resistance and showed that ETR selected for mutations at positions V90I, K101Q, E138K, V179D/E/F, Y181C, V189I, G190E, H221H/Y and M230L within 18 weeks of commencing drug pressure. Interestingly, E138K was the first mutation to emerge in most instances. Viral clones containing E138K displayed low-level phenotypic resistance to ETR (3.8-fold) and modestly impaired replication capacity (2-fold) compared to wild-type virus. We also examined resistance patterns to ETR and RPV in viruses containing NNRTI mutations at baseline. In wild-type (wt) viruses and viruses containing K103N alone, E138K or E138G mutations were observed in the presence of either ETR or RPV drug pressure followed by the appearance of other NNRTI resistance mutations. Alternatively, subtype B viruses containing Y181C generated V179I/F or A62V/A on exposure to ETR or RPV drug pressure, respectively, but not E138K. The addition of mutations at position 138 to Y181C did not significantly enhance levels of resistance to ETR or RPV. We also observed that the combination of Y181C and E138K may lead to a less fit virus compared to virus containing Y181C alone. Based on these findings, we suggest that Y181C may be antagonistic to E138K. The tissue culture drug resistance analysis of PL-100 in subtype C and CRF01_AE viruses is described in Chapter 4. PL-100 selected for PI resistance mutations along either of two distinct pathways, one of which involved resistance mutations at positions V82A and L90M while the other involved a mutation at position T80I, with other mutations being observed at positions M46I/L, I54M, K55R, L76F, P81S and I85V. An accumulation of at least three mutations in the protease flap and enzyme active sites were required in each case for high-level resistance to occur, demonstrating that PL-100 has a high genetic barrier against the development of drug resistance. In Chapter 5, we evaluated the potential of PL-100 as a second generation HIV-1 protease inhibitor. PL-100 resistant variants emerged within 8-48 weeks while darunavir (DRV) did not select for resistance mutations over a period of 40 weeks. Structural modeling demonstrated that the high genetic barrier of DRV is due to numerous interactions with protease that include hydrogen-bonding to PR backbone oxygens at amino acid positions A28, D29 and D30 via di-tetrahydrofuran (THF) groups, while binding of PL-100 was predominantly based on polar interactions and delocalized hydrophobic interactions through its diphenyl groups. Our data suggest that hydrogen bonding contacts and the di-THF group in DRV, as well as the hydrophobic nature of PL-100, contribute to PI binding and a high genetic barrier for resistance and that redesigning the structure of PL-100 to include a di-THF group might improve it antiviral potency and drug resistance profile.

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Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est l’agent étiologique du SIDA, un rétrovirus complexe encodant les protéines accessoires : Nef, Vif, Vpr et Vpu. La fonction principale de ces protéines est de moduler l’environnement cellulaire afin de promouvoir la réplication virale. Les travaux présentés dans cette thèse portent sur la protéine virale Vpr, une protéine bien connue pour son activité d’arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M dans les cellules en division et pour l’avantage réplicatif qu’elle confère au virus durant l’infection de cellules myéloïdes. Les évènements sous-jacents à ces deux activités restent pour l’heure mal compris. Le but des travaux regroupés dans cet ouvrage est d’identifier de nouveaux facteurs cellulaires pouvant éventuellement expliquer les activités de Vpr précédemment décrites. Pour ce faire, nous avons utilisé une approche d’identification des partenaires de proximité par biotinylation, appelée BioID. L’avantage du BioID est de permettre un marquage in cellulo des protéines à proximité de la protéine d’intérêt. La mise en place et la caractérisation de cette approche font l’objet de la première section de cette thèse. En utilisant cette approche, nous avons défini un réseau de 352 partenaires cellulaires de la protéine Vpr. Parmi ces partenaires de Vpr, plusieurs sont organisés sous forme de complexes ou réseaux protéiques incluant notamment le complexe promoteur de l’anaphase/cyclosome (APC/C) et les centrosomes. Étant donné que le complexe APC/C est l’un des principaux régulateurs du cycle cellulaire, nous avons décidé d’analyser sa relation avec Vpr. Nous avons découvert que Vpr formait un complexe non seulement avec APC1, une sous-unité essentielle du complexe APC/C, mais aussi avec les coactivateurs (CDH1 et CDC20) de ce complexe. Nous avons par la suite démontré que Vpr induisait la dégradation d’APC1 et que celle-ci pouvait être prévenue par une double-mutation N28S-G41N de Vpr. Cette dégradation d’APC1 ne semblerait pas être reliée aux activités précédemment décrites de Vpr. Ces travaux font l’objet de la seconde section de cette thèse. Enfin, dans une troisième section, des travaux effectués en collaboration et analysant la relation entre les centrosomes et Vpr sont présentés. Cette thèse identifie 200 nouveaux partenaires de Vpr, ouvrant la porte à l’exploration de nouvelles cibles et activités de Vpr. Elle décrit également une nouvelle cible de Vpr : le complexe APC/C. Globalement nos résultats contribuent à une meilleure compréhension de la façon dont le VIH-1 manipule l’environnement cellulaire de l’hôte à travers la protéine virale Vpr. / Human immunodeficiency virus (HIV-1) is the AIDS causal agent. This complex retrovirus encodes several accessory proteins; namely Nef, Vif, Vpr and Vpu; whose functions are to manipulate the cellular host environment in order to favor HIV-1 viral replication. This thesis focused on Vpr whose main activities are to induce a cell cycle arrest in the G2/M phase in dividing cells and to provide a replicative advantage to HIV-1 during infection of myeloid cells such as macrophages. The cellular mechanisms underlying these two activities are up to now misunderstood. The main goal of the work presented in this thesis is to identify new cellular factors that could potentially explain the previously described Vpr activities. To do so, we used the proximity labelling approach called BioID. The main strength of BioID is to tag in cellulo partners of the protein of interest. The development as well as optimization of the BioID approach is presented in the thesis first section. Using BioID, we defined a network containing 352 cellular partners in close proximity with the viral protein Vpr. Amongst these cellular partners, several were organized into protein complexes or networks such as the anaphase promoting complex/cyclosome (APC/C) or the centrosome. Given that APC/C is a cell cycle master-regulator, we analyzed the interplay governing Vpr and APC/C interactions. We first demonstrated that Vpr could form a complex containing the scaffolding subunit APC1. APC/C coactivators, namely CDH1 and CDC20, could also be found in association with Vpr. We next showed that Vpr was inducing APC1 degradation and that Vpr residues N28 and G41 were essential to this activity. Surprisingly, the APC1-Vpr interplay does not relate to previously described Vpr activities. This work is presented in the second section of this thesis. Lastly, in the third section, a work done in collaboration analyzed the interplay between Vpr and the centrosomes. In this thesis we identified 200 new potential partners of Vpr, opening the doors to discover novel Vpr targets and activities. This thesis also defined APC/C as new Vpr target. Taken together our results allow a better understanding on how HIV-1 modulates the cellular environment by using the viral accessory protein Vpr.

Les personnes qui vivent avec le VIH (PVVIH) doivent prendre un traitement d’antirétroviraux combinés (ART) pour contrôler la réplication virale et empêcher le développement d’une immunodéficience dont l’issue est fatale. Les ART protègent les cellules saines de l’infection et permettent ainsi de rendre la charge virale plasmatique indétectable. Cependant, l’arrêt des ART entraine presque inévitablement un rebond de la charge virale, puisque le virus n’est jamais complètement éliminé par le système immunitaire. En effet, de multiples cellules infectées, où le virus s’est intégré et demeure dans un état de latence, restent présentes tout au long de la vie des PVVIH. Une partie de ces cellules infectées forme le réservoir compétent pour la réplication. Les provirus responsables du rebond de la charge virale possèdent trois caractéristiques : ils gardent la capacité d’être réactivés (sortie de latence), ils sont génétiquement intacts, et ils peuvent produire de nouvelles particules virales infectieuses. Afin de guérir les PVVIH de l’infection, il faut donc cibler les quelques rares cellules portant un provirus intact et inductible. Pour ce faire, il est impératif de comprendre comment ces cellules sont maintenues pendant les années de ART, de les localiser dans tout l’organisme, et d’identifier ce qui peut les distinguer des autres. Ce sont ces trois aspects que nous avons abordés au cours des travaux de recherche présentés dans cette thèse, autant à l’échelle de la cellule unique que de l’organisme entier. Nos résultats montrent que les provirus compétents pour la réplication persistent dans des lymphocytes T CD4+ mémoires exprimant l’intégrine VLA-4 en grande quantité, que les provirus intacts peuvent subsister au sein de différents compartiments anatomiques, que les provirus inductibles et compétents pour la traduction de la protéine virale p24 sont majoritairement défectifs, et que l’expansion clonale est un mécanisme important qui favorise le maintien du réservoir viral dans le sang et dans les tissus tout en favorisant la diversité phénotypique de ces cellules. / People with HIV (PWH) must take combinational antiretroviral therapy (ART) to control viral replication and avoid developing fatal immunodeficiency. ART allows achieving undetectable plasma viral load, and thus protects uninfected cells from HIV. However, ART interruption will almost inevitably result in a viral rebound since HIV is never completely cleared by the immune system. Indeed, a group of infected cells, where the virus has integrated and remains in a latent state, persists throughout the life course of PWH, and some of these cells form the replicationcompetent reservoir. Proviruses responsible for viral rebound have three characteristics: they can be induced to exit their latent state, they are genetically intact, and they are able to produce new infectious viral particles. Therefore, in order to cure PWH, it is essential to target the few cells with intact and inducible provirus, and to be able to do so, it is imperative to understand how these cells are maintained during years of ART, to localize them throughout the body, and to identify what distinguishes them from other cells. These three aspects are the focus of the work presented in this thesis, whether at the single-cell level or looking through the whole body. Our results show that replication-competent proviruses persist in memory CD4+ T cells expressing high levels of the integrin VLA-4, that intact proviruses can persist among various anatomical compartments, that inducible and translation-competent proviruses are predominantly defective, and that clonal expansion is an important mechanism that favors the maintenance of reservoir cells both in the blood and in deep tissues in addition to diversify phenotypically those cells.