1981 entwickelten Gerd Binnig und Heinrich Rohrer bei IBM in Zürich das "Scanning Tunneling Microscope". Damit wurde erstmalig das lokal hochaufgelöste Erfassen (bis in den atomaren Auflösungsbereich) von Objekteigenschaften im Nahfeld inerter Oberflächen möglich. Dies und insbesondere die Weiterentwicklung der Technologie und die spätere (1986) Etablierung der Rasterkraftmikroskopie (Atomic Force Microscopy - AFM), die diese Auflösungsmöglichkeiten der Rastersondenmikroskope auch an Non-Konduktoren (nicht leitende Untersuchungsoberflächen) realisieren konnte, stellte die Geburtsstunde einer neuen mikroskopischen Ära auf dem Gebiet der biomedizinischen Grundlagenforschung dar (Kapitel 1.3). Das Studium der umfangreichen Literaturquellen zu diesem Thema und der direkte wissenschaftliche Kontakt und Erfahrungsaustausch mit anderen AFM- Arbeitsgruppen ließen im Initialstadium dieser vorliegenden Arbeit bereits erkennen, dass in der kardiovaskulären Grundlagenforschung zunehmend rasterkraftmikroskopische Versuchsansätze bearbeitet und kardiologisch interessante Fragestellungen mittels dieser Methode begleitend untersucht wurden (Kapitel 1.4). Das Ziel dieser vorliegenden Arbeit bestand darin, kardiovaskulär relevante Zellen und Einzelproteine in vivo und interventionelle Materialien (Stents) rasterkraftmikroskopisch zu untersuchen, wobei die Etablierung und technisch aufwendige Optimierung dieser neuen mikroskopischen (Kapitel 3.1) und der zellspezifisch präparatorischen Methoden (Kapitel 3.2) an diesen Untersuchungsobjekten im Mittelpunkt stehen sollte. Die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten endothelialen Zellen und H9C2-Myozyten stammten aus, in unserem Forschungslabor etablierten, immortalen Kulturzelllinien. Die adulten und Kardiomyozyten neonataler Ratten, die kardial- fibrozytären Zellen sowie die Thrombozyten wurden primär isoliert und als Primärkulturzellen kultiviert (Kapitel 3.2.3 und 3.2.4). Außerdem wurden vitale aortale Endothelzellen unterschiedlicher Tiere (Ratte, Meerschwein, Kaninchen) im Gewebsverband der thorakalen Aorta untersucht (Kapitel 4.2). Die Zellen wurden initial, im Rahmen der Etablierungsphase mittels unterschiedlicher Methoden fixiert und nachfolgend rasterkraftmikroskopisch untersucht und dargestellt. Der Etablierungsprozess der Methodik begann mit der Abbildung luftgetrockneter Zellen (Kapitel 4.1.1) unter Raumbedingungen und setzte sich über verschiedene Modifikationen der Zellpräparation (z.B. Glutardialdehydfixation, Cryofixation), des Abbildungsmodus (Contact-, Non-Contact-, Tapping-Mode) und der Abbildungsbedingungen (Raumbedingungen, zellphysiologische Umgebung) fort, so dass schließlich die Abbildung vitaler Zellen (Kapitel 4.1.2 und Kapitel 4.2 - 4.5) in ihrer strukturellen und funktionellen Umgebung (z.B. aortale Endothelzellen im Gewebsverband) etabliert werden konnte und routinemäßig reproduzierbar war. An stabilen oder künstlich stabilisierten Strukturen der o.g. vitalen Zellen wurden erste orientierende Messungen der bioelastischen Eigenschaften (Kraft-Abstands-Kurven, Kapitel 4.1.2.1) durchgeführt. Außerdem haben wir im Einzelfall, wenn technisch und apparativ möglich, andere hochauflösende strukturanalytische Verfahren (z.B. TEM) als mikroskopische Referenzuntersuchungen herangezogen (Kapitel 4.1.2; 4.4.1; 4.6), wobei z.T. erstaunliche Übereinstimmung zwischen den AFM- Daten und den strukturanalytischen Daten der Referenzmethoden nachweisbar waren. Ein strukturell durch Elektronenmikroskopie und Röntgendiffraktionsanalyse sehr gut beschriebenes komplexes Funktionsprotein, das 20-S-Proteasom, wurde mittels der Rasterkraftmikroskopie abgebildet und vermessen und die so gewonnenen strukturanalytischen Daten mit den bekannten strukturellen Abmessungen des Proteins verglichen (Kapitel 4.6). Die hierbei detektierten dimensionalen Abweichungen zwischen den AFM- assoziierten Daten und den bekannten strukturanalytischen Daten der Elektronenmikroskopie wurden im Kontext der funktionellen Integrität des Proteins und hinsichtlich möglicher methodischer Fehlereinflüsse (Kapitel 3.1.4.3) diskutiert. Interventionelle Materialien (Stents), die in der täglichen kardiologischen Praxis Anwendung finden, sind hinsichtlich ihrer Ultrastruktur mittels dieser hochsensitiven Abbildungsmethode im Nahfeld von Objektoberflächen untersucht worden. Bezüglich ihrer nativen Oberflächenbeschaffenheit und ihrer mechanischen Alteration durch den Ballon- Dilatationsprozess wurden die Stents sehr detailliert qualitativ und quantitativ (Kapitel 4.7) beschrieben, wobei Prädilektionsstellen der prozedural- assoziierten mechanischen Beanspruchung der Stents durch die hier beschriebene, oberflächensensitive AFM- Methode sehr genau diskriminiert werden konnten. Die präparierten Stents wurden weiterführend mit humanen Thrombozytenkonzentraten inkubiert und die Zell- Stentoberflächenkontakte sowie mögliche Stentoberflächen- induzierte Veränderungen der Thrombozyten sind morphologisch ausführlich beschrieben worden. Letztendlich wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit die spezifische Aktivierung der vitalen Thrombozyten durch pharmakologische Stimulantien (z.B. ADP) mit der, durch den AFM-Abbildungsprozess induzierten Thrombozytenaktivierung (Kapitel 4.5) unter AFM-Bedingungen verglichen und diskutiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen, dass mit der AFM-Technologie und objektorientiert optimierten Mess- und Präparationsmethoden ein neues mikroskopisches Analyseverfahren vorliegt, dass zum einen real-dreidimensionale morphologische Bildgebung bis in den submolekularen Auflösungsbereich an vitalen Zellen und präparierten Proteinkomplexen, zum anderen aber gleichermaßen Funktionsanalytik in Form von Messungen zelldynamischer Prozesse wie Migrationsbewegungen und Kontraktionen sowie visko- elastische Quantifizierung von Zellmembranen erlaubt. Der Vorteil gegenüber den meisten gegenwärtig verfügbaren mikroskopischen Methoden liegt in der neu eröffneten Möglichkeit der seriellen, wiederholten und stabil reproduzierbaren Messung an vitalen Zellen und zellulären Substrukturen. Insofern könnte in Zukunft diese neue Technologie eine methodische Bereicherung der mikroskopisch-morphologisch und funktionell orientierten Analysetechnik darstellen. / In 1981 Binnig and Rohrer invented the "Scanning Tunneling Microscope". Thereby it became feasible to high-resolution record the surface-properties of specimens (up to atomic resolution) at the nearfield of inert surfaces. This and in detail the further development of this technology and the establishment of "Atomic Force Microscopy" (1986), that allows implementation of this resolution capabilities in non-conductors or insulating materials represent the birth of a new microscopic era in the field of biomedical basic research (chapter 1.3). The promise of atomic (scanning) force microscopy (AFM) for cardiovascular research is enormous. The perusal of the extensive literature concerning this topic and scientific contact with other researchers reveals initial the capabilities of this method in cardiovascular basic research. Intriguing questions of cardiology may investigate concomitantly with help of scanning-force-micoscopic approaches (chapter 1.4). The aim of this study was to investigate relevant cardiovascular cells and single proteins in-vivo and specific materials (coronary artery stents) with scanning-force-micoscopic setup. The establishment and expensive optimization of this new microscopic method (chapter 3.1) and of the cell specific preparatory methods (chapter 3.2) represented the center of interest of our inevestigations. The endothelial cells and H9C2-myocytes stem from established imortal cell culture lines. The adult cardiomyocytes and cardiomyocytes of neonatal rats, the fibrocytes and the thrombocytes were primarily cultivated (chapter 3.2.3 and 3.2.4). In addition we investigated aortic endothelial cells of intact aortic tissue of different animals (rat, guinea pig, rabbit - chapter 4.2). During the establish experiments cells underlied different methods of cell-fixation. The primary investigations was performed using air-dried cells (chapter 4.1.1) analyzed in room ambient conditions and were continued by different modifications of cell-preparation. (e.g. glutardialdehyde-fixation, cryo-fixation), of microscopic mode (contact-, non-contact-, tapping-mode) and of cell-specific environmental conditions (from room ambient to cellphysiological medium and temperature). As result we became enabled to investigate (reproducible and routinely) vital cells (chapter 4.1.2 and chapter 4.2 - 4.5) embedded in physiological normal structural und functional ambient conditions (e.g. endothelial cells of intact aortic tisue in-vivo). Additionally, we performed measurements of bio-elastic properties of stable or artificial stabilized structures of named cells (force-distances-curves - chapter 4.1.2.1). If posibble, depending of available technical equipment, we compared our microscopic results with other high-resolution analytical procedures of reference (e.g. TEM - Kapitel 4.1.2; 4.4.1; 4.6) and detected astonishing congruence between the data. Furthermore we analyzed the well-described (electron-microscopy and x-ray-diffraction data) complex 20-S-proteasome using a specific atomic force microscopic setup. Analytical and structural data of these AFM-scans and abovementioned methods were likened (chapter 4.6). The deviations concerning the detected proportions were discussed regarding functional integrity of the protein and with respect to potential methodically determined artifacts. (chapter 3.1.4.3). Assaying (qualitative and quantitative) the surface roughness properties of coronary artery stents, we found significant alterations of stent material induced by balloondilatation. We suppose, that changes in roughness of inner surface of coronary artery stents might induce clinical problems like acute stent-thrombosis and in-stent-restenosis. Finally these stents were coated with human thromboytes to investigate cell-stent-surface interactions. Surface-roughness correllated triggering of thrombocyte adhesion was evaluated by morphological analysis of AFM-scans. Finishing, we have investigated and concluding discussed the specific activation of vital thrombocytes by pharmacological substances (e.g. ADP) and by mechanical stimulation (due to AFM-associated tip-surface-interaction). The results of this work demonstrate, AFM-technology using optimized microscopic setup and object-specific adjusted measurement- and preparation- methods, is an new, powerful, microscopic technique, that allow real-3-dimensional morphological mapping up to submolecular range of resolution in vital cells and protein complexes. Moreover, this technology opens new dimensions in functional analytic of cell migration processes or cellular contractions and in evaluation of visco-elastic quantification of cell membranes. The advantage owed to the most currently available microscopic methods is the option of serial and reproducible measurement of vital cells and subcellular structures. In this respect, this new method might represent a methodical enrichment of the microscopic-morphological and functional oriented analysis-technique in future.

Das Ubiquitin-Proteasom-System ist an der Degradation cytosolischer Proteine und der Generierung von Antigenen beteiligt, die über MHC Klasse I Moleküle CD8+ T Zellen präsentiert werden. Die Antigenprozessierung wird durch Typ I und II Interferone beeinflusst, welche die Formierung des Immunoproteasoms und des Proteasomen-Aktivators PA28 induzieren und so die katalytische Aktivität des Ubiquitin-Proteasom-Systems qualitativ verändern. In der vorliegenden Arbeit wurde im Zellkulturmodell unter dem Einfluss von IFN gamma die zunehmende Inkorporation der Immunountereinheiten in de novo assemblierende 20S Proteasomen und die daraus resultierende Veränderung der proteolytische Aktivität untersucht. Die Inkorporation der Immunountereinheiten wurde mittels 2D Gelelektrophorese und Western Blots von 20S Proteasomen untersucht, die nach unterschiedlicher Stimulationsdauer mit IFN gamma aus HeLa Zellen isoliert wurden. Es konnte gezeigt werden, dass innerhalb der ersten 24h einer IFN gamma Stimulation die strukturelle Heterogenität des zellulären Proteasomenpools zunimmt, indem sowohl intermediäre als auch Immunoproteasomen assemblieren. In der Nativ-PAGE von Lysaten IFN gamma stimulierter Zellen wurde eine Zunahme des 20S Proteasoms als freier Komplex und in Assoziation mit PA28 beobachtet, während die Menge des zum ATP-abhängigen Abbau von polyubiquitinierten Proteinen notwendigen 26S Proteasoms unverändert blieb. Die Stimulation mit IFN gamma hatte eine Steigerung der gesamtproteasomalen Aktivität zur Folge, die unter Inhibition der Interaktion zwischen 20S Proteasom und PA28 verzögert erfolgte. Die katalytischen Eigenschaften isolierter Proteasomen wurden anhand der Generierung eines immunrelevanten Hepatitis C CTL Epitops des viralen Core Proteins in vitro untersucht. Im Verlauf der IFN gamma Stimulation de novo assemblierte Proteasomen wiesen jeweils unterschiedliche Präferenzen für die Generierung des untersuchten CTL Epitops auf. Eine weitere, proteasomen-spezifische Änderung der katalytischen Aktivität bewirkte die Assoziation des Proteasomen-Aktivators. Innerhalb der ersten zwölf Stunden einer IFN gamma Stimulation wurde das Epitop vermehrt mit der Unterstützung des Proteasomen-Aktivators generiert, nach 24 Stunden zunehmend durch freies 20S Proteasom. Die Ergebnisse der vorgestellten Arbeit zeigen, dass Strukturvarianten des Proteasoms zusammen mit PA28 redundant funktionieren und eine hohe proteolytische Plastizität des UPS gewährleisten. / The ubiquitin proteasome system is responsible for the degradation of cytosolic proteins and the processing of MHC class I restricted antigens. The generation of these antigens is influenced by type I and II interferons which induce the expression of immunoproteasomes and the proteasome activator PA28; and thereby impact the quality of peptides processed by the proteasome system. The adoption of the proteasome system to a proinflammatory environment has been investigated in a cell culture model by isolating proteasomes after different stages of IFN gamma stimulation. The composition of isolated proteasomes was analysed by 2D PAGE and western blot approach. The presented work shows that within 24h of IFN gamma stimulation an increasing heterogeneity of the cellular proteasome pool is observed, resulting from the assembly of both intermediate type proteasomes and immunoproteasomes at the early stage of IFN gamma stimulation. It could be shown by native PAGE of HeLa cell lysates that IFN gamma induces increasing amounts of 20S proteasomes and PA28 associated proteasomes without decreasing the amount of 26S proteasomes that are necessary for the ATP dependent degradation of ubiquitinated proteins; and resulting in an enhanced total proteasomal activity in vitro. This increase in activity was delayed when the interaction of 20S proteasomes and PA28 was inhibited. A comparative analysis of the ability of isolated 20S proteasomes to generate a known hepatitis C virus derived CTL epitope in vitro proved that during early IFN gamma stimulation de novo assembled proteasomes exhibited a structure specific preference to generate the HCV CTL epitope either alone or in combination with the proteasome activator PA28. Within the first 12h of IFN gamma stimulation the epitope was generated with higher efficiency by 20S proteasomes in association with PA28, whereas after 24h the impact of PA28 on the proteasome pool was less pronounced. The presented work shows that IFN gamma induces a heterogeneity of 20S proteasomes in the early stage of stimulation, acting in combination with the proteasome activator in a redundant manner; and provides a high proteolytic placticity of the proteasome system.

Das Proteasomensystem der Zelle ist für die Degradation von Proteinen verantwortlich und spielt eine zentrale Rolle bei der Generierung von Epitopen, die auf MHC-Klasse-I Molekülen den cytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs) präsentiert werden. Die Stimulation von Zellen mit Interferon-gamma (IFNgamma) führt zu der Bildung von Immunoproteasomen, die im Vergleich zu den konstitutiven Proteasomen eine verbesserte Generierung vieler MHC-Klasse-I Epitope aufweisen. In gesunden Mäusen werden Immunoproteasomen vorwiegend in den lymphatischen Geweben exprimiert, wohingegen nicht-lymphatische Gewebe hauptsächlich konstitutive Proteasomen enthalten. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Listeria monocytogenes Infektion auf die aus der Leber, der Milz, dem Dünndarm und dem Colon stammenden murinen 20S Proteasomen untersucht. Die Struktur der isolierten 20S Proteasomen wurde mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese und Westernblot ermittelt, während die Funktion durch in vitro Prozessierung von drei oligomeren Peptidsubstraten analysiert wurde. Die Prozessierungsprodukte wurden mittels HPLC-ESI-Ionenfalle massenspektrometrisch identifiziert sowie quantifiziert. Die vorliegende Arbeit zeigt zum ersten Mal, dass nach einer Infektion die aus den nicht-lymphatischen Organen und Zellen isolierten 20S Proteasomen eine strukturelle und funktionelle Plastizität aufweisen: Nach der Infektion wurde die Bildung von Immunoproteasomen induziert, was mit der gesteigerten Generierung der immunrelevanten Fragmente korreliert werden konnte. Dies verlief unabhängig von der direkten Präsenz von Listeria monocytogenes in den Organen und wurde ausschließlich durch das Cytokin IFNgamma reguliert. Es konnte außerdem eine Zunahme der posttranslationalen Modifikation von Leberproteasomen mit dem Monosaccharid N-Acetylglucosamin nach der Infektion nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde eine detaillierte Analyse der massenspektrometrischen Daten hinsichtlich des Schnittverhaltens der konstitutiven und Immunoproteasomen etabliert. Die Auswertung ergab, dass die Immunoproteasomen nach der Infektion durch schnellere und veränderte Nutzung bestehender Spaltstellen an der verbesserten Epitoppräsentation beteiligt sind. / The proteasome system of the cell is responsible for the degradation of proteins and plays a central role in the generation of epitopes which are presented to cytotoxic T-lymphocytes (CTLs) on MHC-class-I molecules. The stimulation of cells by interferon-gamma (IFNgamma) leads to the formation of immunoproteasomes that show an improved generation of many MHC-class-I epitopes compared to constitutive proteasomes. In healthy mice, immunoproteasomes are mainly expressed in the lymphatic tissues, whereas the non-lymphatic organs predominantly contain constitutive proteasomes. In this project the effect of Listeria monocytogenes infection on murine 20S proteasomes derived from the liver, spleen, small intestine and colon were investigated. The structure of the isolated proteasomes was analyzed by two-dimensional gel electrophoresis and western blots while the function was studied by in vitro processing of three oligomeric peptide substrates. Identification and quantification of the processing products was performed by HPLC-ESI-ion trap mass spectrometry. The project showed for the first time, that after infection 20S proteasomes isolated from non-lymphatic organs as well as from non-lymphatic cells displayed structural and functional plasticity: immunoproteasomes were induced post infection which could be correlated with the enhanced generation of immuno-relevant fragments. This was independent of the direct presence of Listeria monocytogenes in the organs and solely controlled by the cytokine IFNgamma. In addition, an increased posttranslational modification with the monosaccharide N-acetylglucosamine could be detected in liver-derived proteasomes after infection. Furthermore, a detailed analysis of the mass spectrometry data was established according to the cleavage site usage of constitutive and immunoproteasomes. The result was that immunoproteasomes are involved in improved generation of the immuno-relevant fragments by the faster cleavage and the changed usage of existing cleavage sites after infection.

La fumée du tabac est un aérosol extrêmement complexe constitué de milliers de composés répartis entre la phase particulaire et la phase vapeur. Il a été démontré que les effets toxicologiques de cette fumée sont associés aux composés appartenant aux deux phases. Plusieurs composés biologiquement actifs ont été identifiés dans la fumée du tabac; cependant, il n’y a pas d’études démontrant la relation entre les réponses biologiques obtenues via les tests in vitro ou in vivo et les composés présents dans la fumée entière du tabac. Le but de la présente recherche est de développer des méthodes fiables et robustes de fractionnement de la fumée à l’aide de techniques de séparation analytique et de techniques de détection combinés à des essais in vitro toxicologiques. Une étude antérieure réalisée par nos collaborateurs a démontré que, suite à l’étude des produits de combustion de douze principaux composés du tabac, l’acide chlorogénique s’est avéré être le composé le plus cytotoxique selon les test in vitro du micronoyau. Ainsi, dans cette étude, une méthode par chromatographie préparative en phase liquide a été développée dans le but de fractionner les produits de combustion de l’acide chlorogénique. Les fractions des produits de combustion de l’acide chlorogénique ont ensuite été testées et les composés responsables de la toxicité de l’acide chlorogénique ont été identifiés. Le composé de la sous-fraction responsable en majeure partie de la cytoxicité a été identifié comme étant le catéchol, lequel fut confirmé par chromatographie en phase liquide/ spectrométrie de masse à temps de vol. Des études récentes ont démontré les effets toxicologiques de la fumée entière du tabac et l’implication spécifique de la phase vapeur. C’est pourquoi notre travail a ensuite été focalisé principalement à l’analyse de la fumée entière. La machine à fumer Borgwaldt RM20S® utilisée avec les chambres d’exposition cellulaire de British American Tobacco permettent l’étude in vitro de l’exposition de cellules à différentes concentrations de fumée entière du tabac. Les essais biologiques in vitro ont un degré élevé de variabilité, ainsi, il faut prendre en compte toutes les autres sources de variabilité pour évaluer avec précision la finalité toxicologique de ces essais; toutefois, la fiabilité de la génération de la fumée de la machine n’a jamais été évaluée jusqu’à maintenant. Nous avons donc déterminé la fiabilité de la génération et de la dilution (RSD entre 0,7 et 12 %) de la fumée en quantifiant la présence de deux gaz de référence (le CH4 par détection à ionisation de flamme et le CO par absorption infrarouge) et d’un composé de la phase particulaire, le solanesol (par chromatographie en phase liquide à haute performance). Ensuite, la relation entre la dose et la dilution des composés de la phase vapeur retrouvée dans la chambre d’exposition cellulaire a été caractérisée en utilisant une nouvelle technique d’extraction dite par HSSE (Headspace Stir Bar Sorptive Extraction) couplée à la chromatographie en phase liquide/ spectrométrie de masse. La répétabilité de la méthode a donné une valeur de RSD se situant entre 10 et 13 % pour cinq des composés de référence identifiés dans la phase vapeur de la fumée de cigarette. La réponse offrant la surface maximale d’aire sous la courbe a été obtenue en utilisant les conditions expérimentales suivantes : intervalle de temps d’exposition/ désorption de 10 0.5 min, température de désorption de 200°C pour 2 min et température de concentration cryogénique (cryofocussing) de -75°C. La précision de la dilution de la fumée est linéaire et est fonction de l’abondance des analytes ainsi que de la concentration (RSD de 6,2 à 17,2 %) avec des quantités de 6 à 450 ng pour les composés de référence. Ces résultats démontrent que la machine à fumer Borgwaldt RM20S® est un outil fiable pour générer et acheminer de façon répétitive et linéaire la fumée de cigarette aux cultures cellulaires in vitro. Notre approche consiste en l’élaboration d’une méthodologie permettant de travailler avec un composé unique du tabac, pouvant être appliqué à des échantillons plus complexes par la suite ; ex : la phase vapeur de la fumée de cigarette. La méthodologie ainsi développée peut potentiellement servir de méthode de standardisation pour l’évaluation d’instruments ou de l’identification de produits dans l’industrie de tabac. / Tobacco smoke is an extremely complex aerosol composed of thousands of constituents distributed amongst the particulate and vapor phases. Toxicological effects have been linked to compounds present in both of these phases. Many biologically active compounds have been identified within tobacco smoke; however, there is a lack of studies correlating specific in vitro or in vivo biological responses to components within whole tobacco smoke. The goal of this research was to develop reliable and robust smoke fractionation methods using analytical separation and detection techniques in combination with in vitro toxicological assays. In a previous study by our collaborators, toxicological assessment of the particulate phase combustion products of twelve individual tobacco components revealed that the combustion products of chlorogenic acid were the most cytotoxic using the in vitro micronucleus test. Therefore, a preparative liquid chromatography method was developed in this work to fractionate the combustion products of chlorogenic acid to assess the bioactivity of these fractions and to identify the compounds responsible for the toxicity observed. The sub-fraction responsible for the most cytotoxic response comprised catechol, which was identified by liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry. Emerging studies have highlighted the toxicological significance of whole tobacco smoke and specifically the vapor phase, which shifted our focus to whole smoke analyses. The Borgwaldt RM20S® smoking machine in combination with British American Tobacco’s in vitro cell exposure chamber allow for the generation of fresh cigarette smoke in various doses and delivery to cell cultures. In vitro biological assays have a high degree of variability, thus, all other sources of variability must be accounted for to accurately assess toxicological endpoints; however, the reliability of dose delivery of the instrument had not been assessed until now. We have determined the reliability (RSD from 0.7-12%) of smoke generation and dilution by quantifying two reference standard gases (CH4 by flame ionization detection and CO by infrared absorption) and the tobacco particulate phase marker, solanesol (by high performance liquid chromatography-ultraviolet absorption detection). The relationship between dose and diluted vapor phase components found within the exposure chamber was then characterized by developing a headspace stir-bar sorptive extraction-gas chromatography/mass spectrometry method. The method repeatability gave an RSD from 10-13% for five reference compounds identified in the vapor phase of cigarette smoke. The maximal peak area response was obtained using the following experimental conditions: exposure-to-desorption time interval of 10  0.5 min, desorption temperature of 200 °C for 2 min, and a cryofocussing temperature of -75 °C. The dilution precision was found to yield a linear response of analyte abundance and was observed to be a function of concentration (RSD from 6.2-17.2 %) with quantities of 6-450 ng for the reference compounds. The findings obtained suggest the Borgwaldt RM20S® is a reliable tool to generate and deliver repeatable and linear doses of cigarette smoke to in vitro cell cultures. Our approach began with designing the methodology to work with an individual tobacco component, which could then be applied to a more complex sample, e.g., the vapor phase of cigarette smoke. The methodology developed can potentially serve as standardized methods for the assessment of instrumentation or screening of products for the Tobacco Industry.

La fumée du tabac est un aérosol extrêmement complexe constitué de milliers de composés répartis entre la phase particulaire et la phase vapeur. Il a été démontré que les effets toxicologiques de cette fumée sont associés aux composés appartenant aux deux phases. Plusieurs composés biologiquement actifs ont été identifiés dans la fumée du tabac; cependant, il n’y a pas d’études démontrant la relation entre les réponses biologiques obtenues via les tests in vitro ou in vivo et les composés présents dans la fumée entière du tabac. Le but de la présente recherche est de développer des méthodes fiables et robustes de fractionnement de la fumée à l’aide de techniques de séparation analytique et de techniques de détection combinés à des essais in vitro toxicologiques. Une étude antérieure réalisée par nos collaborateurs a démontré que, suite à l’étude des produits de combustion de douze principaux composés du tabac, l’acide chlorogénique s’est avéré être le composé le plus cytotoxique selon les test in vitro du micronoyau. Ainsi, dans cette étude, une méthode par chromatographie préparative en phase liquide a été développée dans le but de fractionner les produits de combustion de l’acide chlorogénique. Les fractions des produits de combustion de l’acide chlorogénique ont ensuite été testées et les composés responsables de la toxicité de l’acide chlorogénique ont été identifiés. Le composé de la sous-fraction responsable en majeure partie de la cytoxicité a été identifié comme étant le catéchol, lequel fut confirmé par chromatographie en phase liquide/ spectrométrie de masse à temps de vol. Des études récentes ont démontré les effets toxicologiques de la fumée entière du tabac et l’implication spécifique de la phase vapeur. C’est pourquoi notre travail a ensuite été focalisé principalement à l’analyse de la fumée entière. La machine à fumer Borgwaldt RM20S® utilisée avec les chambres d’exposition cellulaire de British American Tobacco permettent l’étude in vitro de l’exposition de cellules à différentes concentrations de fumée entière du tabac. Les essais biologiques in vitro ont un degré élevé de variabilité, ainsi, il faut prendre en compte toutes les autres sources de variabilité pour évaluer avec précision la finalité toxicologique de ces essais; toutefois, la fiabilité de la génération de la fumée de la machine n’a jamais été évaluée jusqu’à maintenant. Nous avons donc déterminé la fiabilité de la génération et de la dilution (RSD entre 0,7 et 12 %) de la fumée en quantifiant la présence de deux gaz de référence (le CH4 par détection à ionisation de flamme et le CO par absorption infrarouge) et d’un composé de la phase particulaire, le solanesol (par chromatographie en phase liquide à haute performance). Ensuite, la relation entre la dose et la dilution des composés de la phase vapeur retrouvée dans la chambre d’exposition cellulaire a été caractérisée en utilisant une nouvelle technique d’extraction dite par HSSE (Headspace Stir Bar Sorptive Extraction) couplée à la chromatographie en phase liquide/ spectrométrie de masse. La répétabilité de la méthode a donné une valeur de RSD se situant entre 10 et 13 % pour cinq des composés de référence identifiés dans la phase vapeur de la fumée de cigarette. La réponse offrant la surface maximale d’aire sous la courbe a été obtenue en utilisant les conditions expérimentales suivantes : intervalle de temps d’exposition/ désorption de 10 0.5 min, température de désorption de 200°C pour 2 min et température de concentration cryogénique (cryofocussing) de -75°C. La précision de la dilution de la fumée est linéaire et est fonction de l’abondance des analytes ainsi que de la concentration (RSD de 6,2 à 17,2 %) avec des quantités de 6 à 450 ng pour les composés de référence. Ces résultats démontrent que la machine à fumer Borgwaldt RM20S® est un outil fiable pour générer et acheminer de façon répétitive et linéaire la fumée de cigarette aux cultures cellulaires in vitro. Notre approche consiste en l’élaboration d’une méthodologie permettant de travailler avec un composé unique du tabac, pouvant être appliqué à des échantillons plus complexes par la suite ; ex : la phase vapeur de la fumée de cigarette. La méthodologie ainsi développée peut potentiellement servir de méthode de standardisation pour l’évaluation d’instruments ou de l’identification de produits dans l’industrie de tabac. / Tobacco smoke is an extremely complex aerosol composed of thousands of constituents distributed amongst the particulate and vapor phases. Toxicological effects have been linked to compounds present in both of these phases. Many biologically active compounds have been identified within tobacco smoke; however, there is a lack of studies correlating specific in vitro or in vivo biological responses to components within whole tobacco smoke. The goal of this research was to develop reliable and robust smoke fractionation methods using analytical separation and detection techniques in combination with in vitro toxicological assays. In a previous study by our collaborators, toxicological assessment of the particulate phase combustion products of twelve individual tobacco components revealed that the combustion products of chlorogenic acid were the most cytotoxic using the in vitro micronucleus test. Therefore, a preparative liquid chromatography method was developed in this work to fractionate the combustion products of chlorogenic acid to assess the bioactivity of these fractions and to identify the compounds responsible for the toxicity observed. The sub-fraction responsible for the most cytotoxic response comprised catechol, which was identified by liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry. Emerging studies have highlighted the toxicological significance of whole tobacco smoke and specifically the vapor phase, which shifted our focus to whole smoke analyses. The Borgwaldt RM20S® smoking machine in combination with British American Tobacco’s in vitro cell exposure chamber allow for the generation of fresh cigarette smoke in various doses and delivery to cell cultures. In vitro biological assays have a high degree of variability, thus, all other sources of variability must be accounted for to accurately assess toxicological endpoints; however, the reliability of dose delivery of the instrument had not been assessed until now. We have determined the reliability (RSD from 0.7-12%) of smoke generation and dilution by quantifying two reference standard gases (CH4 by flame ionization detection and CO by infrared absorption) and the tobacco particulate phase marker, solanesol (by high performance liquid chromatography-ultraviolet absorption detection). The relationship between dose and diluted vapor phase components found within the exposure chamber was then characterized by developing a headspace stir-bar sorptive extraction-gas chromatography/mass spectrometry method. The method repeatability gave an RSD from 10-13% for five reference compounds identified in the vapor phase of cigarette smoke. The maximal peak area response was obtained using the following experimental conditions: exposure-to-desorption time interval of 10  0.5 min, desorption temperature of 200 °C for 2 min, and a cryofocussing temperature of -75 °C. The dilution precision was found to yield a linear response of analyte abundance and was observed to be a function of concentration (RSD from 6.2-17.2 %) with quantities of 6-450 ng for the reference compounds. The findings obtained suggest the Borgwaldt RM20S® is a reliable tool to generate and deliver repeatable and linear doses of cigarette smoke to in vitro cell cultures. Our approach began with designing the methodology to work with an individual tobacco component, which could then be applied to a more complex sample, e.g., the vapor phase of cigarette smoke. The methodology developed can potentially serve as standardized methods for the assessment of instrumentation or screening of products for the Tobacco Industry.