In den letzten Jahren hat sich das gemeinhin gültige Bild von Thrombozyten, in dem die Blutplättchen eine eher passive Rolle als Bestandteil der Koagulations-Kaskade inne hatten, hin zu einem Modell gewandelt, in dem ihnen eine aktive Rolle zugeschrieben wird. Diese ist von besonderer Bedeutung in Hinblick auf die Produktion humoraler Faktoren, die sowohl die Bildung von Blutgerinnseln als auch Entzündungsvorgänge potenzieren. Letzteres ist von besonderer Relevanz bei kardiovaskulären Erkrankungen, wie Myokardinfarkt, Schlaganfall und peripherer arterieller Verschlusskrankheit. Darüber hinaus wurden mittlerweile neue Eigenschaften der Thrombozyten beobachtet, die auf deren Beteiligung bei Krebserkrankungen, Infektionen und Morbus Alzheimer schließen lassen. In der Forschung – und im weitesten Sinne auch in klinischen Anwendungen – werden heute zur näheren Erforschung der Thrombozyten sowohl das Proteom betreffende Analysemethoden, als auch auf PCR basierende Techniken, wie SAGE und qRT-PCR eingesetzt. Für diese Techniken ist die Reinheit der verwendeten Thrombozyten-Präparationen von besonderer Wichtigkeit. Im Rahmen dieser Arbeit, entwickelte ich eine neue, effektive und effiziente Technik zur Aufreinigung humaner Thrombozyten. Ich erzielte hochreine Thrombozyten- Präparationen mit weniger als 1,5 kontaminierenden Leukozyten pro 108 Blutplättchen. Überdies erwiesen sich die aufgereinigten Thrombozyten-Präparationen als frei von kontaminierenden Erythrozyten und Plasma Proteinen. Zudem konnte die Funktionalität der auf der Oberfläche der hochreinen Blutplättchen vorhandenen Membranrezeptoren (z. B. P2Y12 und PGI2 Rezeptoren) mittels FACS Analyse bestätigt werden (Birschmann*, Mietner* et al. 2008). Zwei verschiedene Anwendungen dieser hochreinen Plättchen wurden im Rahmen dieser Arbeit gezeigt. Zum einen wurden sie in einer Studie zur Aufklärung der unterschiedlichen Beschaffenheit der in Thrombozyten vorkommenden Membrantypen verwendet. Hierzu wurden nach Lyse und Dichtegradienten der Plättchen zwei Fraktionen erhalten, welche anschließend sowohl anhand von Western-Blot- als auch durch Lipid-Analysen („Lipidomics“) charakterisiert wurden. Dabei stellte sich heraus, dass es sich bei einer Fraktion um Plasmamembranfragmente handelte und bei der anderen Fraktion um eine Anreicherung von Membranen des kanalikulären Systems. In Verbindung mit Genomics und Proteomics werden diese Techniken der Lipidomics dazu beitragen, die Lipidfunktionen in biologischen Systemen besser zu verstehen. Außerdem können sie einflussreiche Werkzeug für die Aufklärung des Mechanismus von lipid-basierenden Erkrankungen, für die Überwachung biologisch relevanter Lipide und für die pharmakologische Therapiekontrolle sein. Eine weitere Anwendung fanden die hochreinen Plättchen in Interaktions-Studien von Thrombozytenproteinen. In Zusammenarbeit mit dem Lehrstuhl für Bioinformatik wurde unter Verwendung von Proteom- und SAGE-Daten ein Protein-Interaktom erstellt. Daraus stellten wir ein Subnetzwerk mit dem IPP-Komplex (ILK-PINCHParvin) als Mittelpunkt dar. Dieser ternäre Komplex fungiert über eine Interaktion mit dem Aktin-Zytoskelett als eine Signalplattform für Integrine. Ausgehend von den einzelnen Proteinen ILK und PINCH ist es im Modell möglich, eine vollständige Signalkaskade zu erstellen, die die Aktin-Polymerisation zur Folge hat. Im Labor konnten wichtige Interaktionen in Thrombozyten mittels Immunopräzipitation und anschließender Western-Blot Analyse erstmals nachgewiesen werden. Das erstellte Thrombozyten-Interaktom kann somit effektiv für ein systematisches „target screening“ genutzt werden. Auf diese Weise wäre es möglich neue Rezeptoren, Proteine oder ganze Signalkaskaden zu identifizieren. Somit legt das Interaktom die Basis für die Generierung von komplexeren Modellen durch das Einbeziehen von neuen Daten. Dies ist auch in Zukunft von besonderer Wichtigkeit, wenn man die entscheidende Bedeutung dieser Interaktionen für die Signaltransduktionswege während der Hämostase in Thrombozyten berücksichtigt. / In recent years the role of platelets has changed from one of passive participation in the coagulation cascade, to one of active production of humoral factors that potentiate both clot formation and inflammation. In addition to platelet functions in cardiovascular disorders like myocardial infarction, stroke and peripheral vascular disease, new functions have been observed which play a role in cancer, infection and Alzheimers disease. For research and also for clinical applications proteomic methods as well as PCR-based techniques such as SAGE and qRT-PCR are mostly used today, especially in high-throughput analysis. For these methods the purity of the platelet sample is of significant importance.

Platelets are small anucleate cell fragments derived from bone marrow megakaryocytes (MKs) and are important players in hemostasis and thrombosis. Platelet granules store factors which are released upon activation. There are three major types of platelet granules: alpha-granules, dense granules and lysosomes. While dense granules contain non-proteinacious factors which support platelet aggregation and adhesion, platelet alpha-granules contain more than 300 different proteins involved in various functions such as inflammation, wound healing and the maintenanceof vascular integrity, however, their functional significance in vivo remains unknown. This thesis summarizes analyses using three mouse models generated to investigate the role of platelet granules in thrombosis, hemostasis, stroke and inflammation. Unc13d-/- mice displayed defective platelet dense granule secretion, which resulted in abrogated thrombosis and hemostasis. Remarkably, Munc13-4-deficient mice were profoundly protected from infarct progression following transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) and this was not associated with increased intracranial bleeding indicating an essential involvementof dense granule secretion in infarct progression but not intracranial hemostasis during acute stroke with obvious therapeutic implications. In the second part of this thesis, the role of platelet alpha-granules was investigated using the Nbeal2-/- mouse. Mutations in NBEAL2 have been linked to the gray platelet syndrome (GPS), a rare inherited bleeding disorder. Nbeal2-/- mice displayed the characteristics of human GPS, with defective alpha-granule biogenesis in MKs and their absence from platelets. Nbeal2-deficiency did not affect MK differentiation and proplatelet formation in vitro or platelet life span in vivo. Nbeal2-/- platelets displayed impaired adhesion, aggregation, and coagulant activity ex vivo that translated into defective arterial thrombus formation and protection from thrombo-inflammatory brain infarction in vivo. In a model of skin wound repair, Nbeal2-/- mice exhibited impaired development of functional granulation tissue due to severely reduced differentiation of myofibroblasts. In the third part, the effects of combined deficiency of alpha- and dense granule secretion were analyzed using Unc13d-/-/Nbeal2-/- mice. Platelets of these mice showed impaired aggregation and adhesion to collagen under flow ex vivo, which translated into infinite tail bleeding times and severely defective arterial thrombus formation in vivo. When subjected to in vivo models of skin or lung inflammation, the double mutant mice showed no signs of hemorrhage. In contrast, lack of platelet granule release resulted in impaired vascular integrity in the ischemic brain following tMCAO leading to increased mortality. This indicates that while defective dense granule secretion or the paucity of alpha-granules alone have no effect on vascular integrity after stroke, the combination of both impairs vascular integrity and causes an increase in mortality. / Thrombozyten sind kleine, kernlose Zellfragmente, die von Megakaryozyten (MKs) im Knochenmark gebildet werden und eine zentrale Rolle in Thrombose und Hämostase spielen. Thrombozytengranula speichern Faktoren, die nach Thrombozytenaktivierung freigesetzt werden. Die drei wichtigsten Thrombozytengranula sind alpha- und dichte Granula, sowie Lysosomen. Während dichte Granula vor allem anorganische Faktoren enthalten, welche die Thrombozytenaktivierung und -aggregation fördern, speichern alpha-Granula mehr als 300 verschiedene Proteine mit einer Vielzahl an Funktionen. Sie sind beispielsweise an Entzündungsprozessen, Wundheilung und der Aufrechterhaltung vaskulärer Integrität beteiligt. Die funktionelle Signifikanz dieser Faktoren, insbesondere in vivo, blieb bisher allerdings ungeklärt. Diese Doktorarbeit beschreibt die Analyse der Rolle von Thrombozytengranula in Thrombose, Hämostase, Schlaganfall und Entzündung unter Verwendung von drei Knockout-Mauslinien. Unc13d-/- Mäuse dienten als Modell, um die Rolle der dichten Granulasekretion in Thrombose, Hämostase, Schlaganfall und der Aufrechterhaltung der vaskulären Integrität nach Thromboinflammation zu untersuchen. Die fehlende Freisetzung des Inhalts dichter Granula aus Thrombozyten dieser Mäuse führte zu defekter Thrombose und Hämostase. Unc13d-/- Mäuse zeigten deutlich kleinere Infarkte im tMCAO (transient middle cerebral artery occlusion)-Modell des ischämischen Schlaganfalls. Gleichzeitig wurde jedoch keine erhöhte Blutungsneigung im Gehirn nach Schlaganfall festgestellt. Dies deutet auf eine Schlüsselrolle der Sekretion dichter Granula in der Infarktentwicklung hin, die jedoch nicht die intrakranielle H¨amostase w¨ahrend des akuten Schlaganfalls beeinflusst. Der zweite Teil dieser Doktorarbeit behandelt die Rolle von alpha-Granula unter Verwendung der Nbeal2-/- Maus. Vor Kurzem wurde gezeigt, dass Mutationen im NBEAL2-Gen das Gray Platelet Syndrome (GPS) hervorrufen. Das GPS ist eine seltene erbliche Blutungskrankheit mit Makrothrombozytopenie, defekter alpha-Granulabiogenese in MKs und dem Fehlen thrombozytärer alpha-Granula. Nbeal2-Defizienz führte zu unveränderter MK-Differenzierung, Proplättchenbildung in vitro und Thrombozytenlebensdauer in vivo. Nbeal2-defiziente Thrombozyten zeigten jedoch verringerte Adhäsion, Aggregation und Koagulation ex vivo, welche zu einer gestörten arteriellen Thrombusbildung und Schutz vor thromboinflammatorischem Schlaganfall nach zerebraler Ischämie führte. In einem Wundheilungsmodell der Haut zeigte sich bei Nbeal2-defizienten Mäusen eine verringerte Bildung von Granulationsgewebe während des Heilungsvorgangs. Die Ursache hierfür lag in der reduzierten Myofibroblastendifferenzierung aufgrund fehlender alpha-Granulaausschüttung. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass alpha-Granulabestandteile nicht nur für Thrombose und Hämostase, sondern auch für akute thromboinflammatorische Krankheitszust¨ande und Geweberegeneration nach Verletzung essentiell sind. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde der Effekt einer kombinierten Sekretionsdefizienz von alpha- und dichten Granula mithilfe von Unc13d-/-/Nbeal2-/- Mäusen untersucht. Thrombozyten dieser Mäuse zeigten verringerte Aggregation und Adhäsion an Kollagen unter Flussbedingungen ex vivo, sowie massiv verlängerte Blutungszeiten und defekte Thrombusbildung in vivo. Die defekte Granulafreisetzung in Unc13d-/-/Nbeal2-/- Mäusen führte zum Zusammenbruch der vaskulären Integrität im tMCAO-Modell des ischämischen Schlaganfalls und zu einer erhöhten Mortalitätsrate. Im Gegensatz dazu zeigten die doppeldefizienten Mäuse in in vivo Modellen der Haut- oder Lungenentzündung keine Einblutungen. Dies deutet darauf hin, dass die fehlende Sekretion dichter Granula oder die Abwesenheit von alpha-Granula für sich genommen keinen Einfluss auf die Aufrechterhaltung der vaskulären Integrität nach Schlaganfall hat. Die Kombination beider Defekte führt jedoch zum Zusammenbruch der zerebrovaskulären Integrität und erhöhter Mortalität nach Schlaganfall.

Nachdem sich in den verschiedenen Rio („Rimonabant in obesity“) -Studien bereits die Wirksamkeit des Cannabinoid-1-Rezeptorantagonisten Rimonabant durch Gewichtsreduktion und einer Verminderung des kardiovaskulären Risikos bei den untersuchten Patienten gezeigt hatte, stellte sich die Frage nach dem genauen Wirkprinzip. In unserer Arbeit konnten wir anhand von Versuchen an Ratten mit genetisch induzierter Glukosetoleranzstörung nachweisen, dass Rimonabant nicht nur eine Gewichtsreduktion, sondern auch eine Verbesserung des Lipidprofils bewirkt. Konkret fanden sich bei den behandelten Tieren nach zwei Wochen die atherogenetischen Triglyceride vermindert und das atheroprotektive HDL-Cholesterin im Vergleich zu den Kontrolltieren erhöht. Weiterhin konnten verminderte Mengen an Leukozyten, insbesondere der Neutrophilen und der Monozyten, als Zeugnis einer anti-inflammatorischen Wirkung nachgewiesen werden. Des Weiteren zeigte sich eine geminderte thrombozytäre Aktivität, verdeutlicht durch die reduzierte thrombozytäre Aktivierbarkeit durch Thrombin und die abgeschwächte Adhäsion an Fibrinogen-beschichteten Membranen. Auch lies sich eine Zunahme der VASP-Phosphorylierung als Marker einer gesteigerten Thrombozyten-Inhibition erkennen. Keine signifikanten Wirkungen fanden sich dagegen hinsichtlich des Blutglukosespiegels, des Gesamtcholesterins, der Gesamtzahl der Thrombozyten, und der pro-atherosklerotisch wirkenden Chemokine MCP-1 und RANTES. Schlussfolgernd lässt sich sagen, dass der selektive Cannabinoid-1-Rezeptorantagonist Rimonabant einen viel versprechenden Ansatzpunkt in der Behandlung von übergewichtigen Patienten mit Diabetes mellitus darstellt. Durch die Verbesserung des Lipidprofils, die anti-inflammatorische Wirkung und durch die reduzierte Thrombozytenaktivität, trägt es maßgeblich dazu bei, das kardiovaskuläre Risiko bei dieser Patientengruppe zu senken. / We investigated the effect of rimonabant, an cannabinoid receptor-1 antagonist, on inflammation and enhanced platelet activity in type 2 diabetic zucker rats, an experimental model of impaired glucose tolerance and the metabolic syndrome. Rimonabant was fed for 2 weeks to 3-month-old male obese zucker rats. We found, that rimonabant slowed weight gain in in rats with the metabolic syndrome and neutrophiles and monocytes were lowered by rimonabant. Platelet-bound-fibrinogen was also reduced by rimonabant. Platelets from obese rats were more sensitive to thrombin-induced aggregation and adhesion to fibrinogen, wich were both attenuated by rimonabnt theraby. But rimonabant shows no effect on the pro-inflammatory chemokines RANTES and MCP-1. In conclusion, rimonabant demonstrates positive modulation of circulating neutrophil and monocyte numbers and reduces platelet activation, wich may potentially contribute to a reduction of cardiovascular risk.

Die Adipositasprävalenz hat in den letzten Jahren in den Industrieländern signifikant zugenommen. Fettleibigkeit ist ein unabhängiger Risikofaktor für das Auftreten verschiedener Erkrankungen wie Schlaganfall, Lungenembolie, Myokardinfarkt und verschiedene Tumoren. Da kardiovaskuläre Erkrankungen in Industrieländern die häufigste Todesursache darstellen, stellt die Adipositas ein wachsendes Gesundheitsproblem dar und sollte Schwerpunkt intensiver Forschungsarbeit sein. Da die Adipositas in der Mehrzahl der Fälle von einer Hyperleptinämie begleitet ist, war das Ziel der vorliegenden Arbeit, die mögliche Rolle von Leptin als Thrombozytenagonist auf verschiedenen Ebenen zu analysieren. Die durchgeführten Experimente konnten eine Leptin-induzierte Aktivierung des Integrins αIIbβ3, dem thrombozytären Fibrinogenrezeptor, und eine Steigerung der Adhäsion von Thrombozyten an immobilisiertem Fibrinogen zeigen. Leptin ist weiterhin in der Lage, die ADP-induzierte Thrombozytenaggregation signifikant zu steigern. Das Adipokin führt ebenfalls zu einer Steigerung der Thromboxan-B2-Freisetzung aus Thrombozyten. Neben der Untersuchung des Einflusses von Leptin auf die Thrombozytenfunktion sollte in der vorliegenden Studie ebenfalls die thrombozytäre Signalkaskade unter Wirkung des Proteohormons beleuchtet werden. Zentrales Molekül in diesem Signalweg ist JAK2. Für diese Tyrosinkinase konnte eine biologische Relevanz mit Hilfe von in vitro Versuchen zu Adhäsion und Aggregation von Thrombozyten unter Einfluss von Leptin demonstriert werden. Auch STAT3 wird zeit- und dosisabhängig durch Leptinstimulation in Thrombozyten phosphoryliert, wobei seine Bedeutung für die Thrombozytenaktivierung noch ungeklärt ist. Weitere an der Signaltransduktion in Thrombozyten unter Wirkung von Leptin beteiligte Kinasen sind die Phosphatidylinositol-3-Kinase, AKT, Phospholipase Cγ2 und Proteinkinase C sowie die p42/44-MAP-Kinase, die p38 MAP-Kinase und die Phospholipase A2. Für die Aktivierung von PLCγ2, AKT und der p42/44-MPAK konnte eine Abhängigkeit von der Tyrosinkinase JAK2 gezeigt werden. Für diese intrazellulären Mediatoren konnte ebenfalls unter Verwendung von verschiedenen Tyrosinkinase-Inhibitoren die Bedeutung bei der Thrombozytenadhäsion an immobilisiertem Fibrinogen bzw. der Aggregation nachgewiesen werden. Die in dieser Studie aufgedeckten Kaskaden zeigen somit biologisch relevante Leptin-vermittelte Signalwege in Thrombozyten auf und sollen zu einem besseren Verständnis des Zusammenhangs von Hyperleptinämie und erhöhtem Thromboserisiko bei Adipositas beitragen.

Linksventrikuläre Herzunterstützungssysteme (LVAD) sind eine wichtige Behandlungsoption für Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz. Trotz einer progressiven Verbesserung der Lebensqualität und erhöhten Überlebensrate von LVAD-Patienten gehören nicht-chirurgisch bedingte Blutungen (NSB) wie gastrointestinale Blutungen immer noch zu den bedeutendsten LVAD-assoziierten Komplikationen. Die genaue Pathogenese der NSB ist jedoch bisher unzureichend bekannt und daher ein wichtiger Schwerpunkt der gegenwärtigen Forschung. Ein Vergleich der Ausprägung des erworbenen von Willebrand Syndroms (aVWS) bei Patienten mit HM 3™ und HVAD™ ist daher für das LVAD-Management von großem Interesse. Daher haben wir eine retrospektive Beobachtungsstudie durchgeführt, um die vWF Multimerstruktur sowie die damit verbundenen funktionellen Parameter bei Patienten mit implantierten HM 3™ und HVAD™ zu vergleichen. Unsere Ergebnisse zeigten einen geringeren Verlust der HMWMs des vWF, eine erhöhte vWF-Aktivität und Faktor-VIII-Plasmakonzentration bei HM 3™-Patienten im Vergleich zu Patienten mit HVAD™. Der verringerte Verlust der HMWMs nach HM 3™-Implantation könnte auf eine Reduktion des nicht-physiologischen Scherstresses (NPSS) zwischen dem vWF und den rotierenden Elementen der Pumpe zurückzuführen sein. Die daraus resultierende stabilere vWF Multimerstruktur könnte die Hämokompatibilität verbessern und damit die Komplikationsrate von LVAD-Patienten verringern. Der durch das LVAD induzierte NPSS hat nicht nur Auswirkungen auf die vWF Multimerstruktur, sondern auch auf die Aktivierung von Thrombozyten während der primären Hämostase. Um die durch NPSS-verursachten zellulären Veränderungen der Thrombozyten und deren Funktion zu untersuchen, wurde die Oberflächenexpression verschiedener Thrombozytenrezeptoren und der oxidative Stress mittels thrombozytärer ROS-Konzentration bei LVAD-Patienten mit und ohne Blutungskomplikationen untersucht. Die Ergebnisse zeigten eine verringerte Oberflächenexpression der Thrombozytenrezeptoren P-Selektin, GPIbα und PECAM-1 sowie erhöhten oxidativen Stress bei LVAD-Patienten mit NSB, unabhängig vom Zeitpunkt des Auftretens der Blutung. Wir vermuten, dass der Verlust des vWF-Rezeptors GPIbα und die gestörte Sekretion der P-Selektin- und PECAM-1-enthaltenden α-Granula die Thrombusbildung beeinträchtigen könnten und damit die Blutungsneigung der LVAD Patienten erhöhen. Trotz des ubiquitären LVAD-induzierten NPSS scheinen nicht alle Patienten dasselbe Risiko für NSB zu haben. Wir vermuten daher, dass sich Patienten mit zukünftigen Blutungskomplikationen bereits vor LVAD-Implantation von Patienten ohne NSB unterscheiden. Alle erfassten klinischen Parameter sowie die Oberflächenexpression der Thrombozytenrezeptoren wurde bei Patienten vor LVAD-Implantation und zum Zeitpunkt des ersten Auftretens einer Blutungskomplikation innerhalb eines Jahres nach LVAD-Implantation miteinander verglichen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Patienten mit zukünftigen Blutungskomplikationen bereits vor LVAD-Implantation eine reduzierte Oberflächenexpression der Thrombozytenrezeptoren P-Selektin und GPIIb/IIIa aufweisen. Die verringerte Expression von P Selektin und GPIIb/IIIa könnte die Adhäsions- und Aggregationsfähigkeit der Thrombozyten einschränken und damit die Blutungsneigung dieser Patienten erhöhen. Die frühzeitige kombinierte Messung klinischer Marker und die Überprüfung einer potenziellen Thrombozytenfunktionsstörung, die anhand der Oberflächenexpression von Thrombozytenrezeptoren nachgewiesen wurde, könnte zu einer verbesserten Bewertung des individuellen Blutungsrisikos bei Patienten, die für eine LVAD-Implantation evaluiert werden, beitragen.

Hantaviren sind einzelsträngige RNA-Viren, die zur Familie der Bunyaviridae gehören. In den letzten Jahren haben sie immer mehr Aufmerksamkeit als “emerging viruses” auf sich gezogen, welche zunehmend Relevanz als humanpathogene Erreger gewinnen. Sie verursachen, abhängig vom Hantavirustyp, zwei verschiedene Krankheitsbilder: das hämorrhagische Fieber mit renalem Syndrom (HFRS) und das kardiopulmonale Syndrom (HCPS). Beide Syndrome sind mit Veränderungen in der vaskulären Permeabilität, akutem Abfall der Blutplättchen (Thrombozytopenie) und Koagulationsdefekten verbunden. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind noch immer kaum verstanden. Hantaviren infizieren zwar Endothelzellen, bisher aber konnte kein zytopathischer Effekt nachgewiesen werden. Diese Doktorarbeit untersucht in vitro, ob und auf welche Weise Hantaviren mit Zellen des hämostatischen Systems interagieren. Zu diesen gehören insbesondere Megakaryozyten, die Thrombozyten generieren und die Thrombozyten selbst. Wir zeigen, dass das pathogene Hantaan Virus (HTNV), im Gegensatz zu dem weniger pathogenen Tula Virus (TULV) und Prospect Hill Virus (PHV), megakaryozytäre Zellen infiziert. Interessanterweise erhöht sich nach Induktion der Differenzierung in den infizierten megakaryozytären Zellen die Virusrepliaktion drastisch. Das Überleben der Zellen und der Verlauf der Differenzierung wird dadurch jedoch nicht beeinflusst. Ähnlich, wie bereits früher für Endothelzellen gezeigt, haben demnach pathogene Hantaviren keinen direkten zytopathischen Effekt auf Megakaryozyten. Weiterhin verdeutlicht die vorliegende Doktorarbeit, dass HTNV mit humanen Thrombozyten interagiert. Dies resultiert in einer Herunterregulation von essentiellen Oberflächenmarkern, die wichtig für die Aggregation und das Signalling sind. / Hantaviruses are single stranded (ss) RNA viruses belonging to the family Bunyaviridae. Over the past years they attracted more and more attention as “emerging viruses”, increasingly gaining relevance as human pathogens. Depending on the hantavirus type they cause haemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) or hantavirus cardiopulmonary syndrome (HCPS). Both syndromes are associated with changes in vascular permeability, acute thrombocytopenia, and defects in platelet function. The underlying mechanisms are still poorly understood. Although hantaviruses infect endothelial cells, no viral cytopathic effect after infection was observed. This thesis investigates in vitro whether and how hantaviruses target cells of the haemostatic system. In particular megakaryocytes (MKs), which generate platelets, and platelets themselves. We show that pathogenic Hantaan virus (HTNV), in contrast to less pathogenic Tula virus (TULV) and Prospect Hill virus (PHV), infects megakaryocytic cells. Intriguingly, after induction of differentiation megakaryocytic cells switch from low-level to high-level HTNV production without reduction in cell survival or alteration in differentiation. Thus, there is no direct viral pathogenic effect on megakaryocytic cells as previously observed for endothelial cells. Furthermore, this study demonstrates that HTNV interacts with human platelets, resulting in downregulation of essential adhesion markers, which are important for platelet aggregation and signalling.

Nasale Pathologien des Hundes, wie nasale Tumoren, idiopathische Rhinitiden, oronasale Defekte und sinonasale Aspergillosen, äußern sich in der klinischen Untersuchung meist mit ähnlichen lokalen Symptomen, wie chronischem Nasenausfluss, Niesen und nasalem Stridor. Für die Diagnose der Nasenhöhlenerkrankungen sind umfassende Untersuchungen in Narkose nötig. Bisher gibt es nur wenige Studien, in denen untersucht wird, ob und welche Veränderungen bei nasalen Erkrankungen im Blutbild und in blutchemischen Parametern nachweisbar sind. Um zu evaluieren, inwiefern Nasenhöhlenpathologien in Blutuntersuchungen detektiert werden können, wurden Serumentzündungsmarker und Blutratios bei den verschiedenen nasalen Erkrankungen untersucht und verglichen. Dazu sollten die Akute-Phase-Proteine C-reaktives Protein (CRP) und Haptoglobin, 25(OH)Vitamin D, die Neutrophilen-Lymphozyten-Ratio (NLR), Thrombozyten-Lymphozyten-Ratio (TLR) und Albumin-Globulin-Ratio (AGR) von Hunden mit verschiedenen nasalen Erkrankungen und gesunden Kontrolltieren bestimmt werden.

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1981 entwickelten Gerd Binnig und Heinrich Rohrer bei IBM in Zürich das "Scanning Tunneling Microscope". Damit wurde erstmalig das lokal hochaufgelöste Erfassen (bis in den atomaren Auflösungsbereich) von Objekteigenschaften im Nahfeld inerter Oberflächen möglich. Dies und insbesondere die Weiterentwicklung der Technologie und die spätere (1986) Etablierung der Rasterkraftmikroskopie (Atomic Force Microscopy - AFM), die diese Auflösungsmöglichkeiten der Rastersondenmikroskope auch an Non-Konduktoren (nicht leitende Untersuchungsoberflächen) realisieren konnte, stellte die Geburtsstunde einer neuen mikroskopischen Ära auf dem Gebiet der biomedizinischen Grundlagenforschung dar (Kapitel 1.3). Das Studium der umfangreichen Literaturquellen zu diesem Thema und der direkte wissenschaftliche Kontakt und Erfahrungsaustausch mit anderen AFM- Arbeitsgruppen ließen im Initialstadium dieser vorliegenden Arbeit bereits erkennen, dass in der kardiovaskulären Grundlagenforschung zunehmend rasterkraftmikroskopische Versuchsansätze bearbeitet und kardiologisch interessante Fragestellungen mittels dieser Methode begleitend untersucht wurden (Kapitel 1.4). Das Ziel dieser vorliegenden Arbeit bestand darin, kardiovaskulär relevante Zellen und Einzelproteine in vivo und interventionelle Materialien (Stents) rasterkraftmikroskopisch zu untersuchen, wobei die Etablierung und technisch aufwendige Optimierung dieser neuen mikroskopischen (Kapitel 3.1) und der zellspezifisch präparatorischen Methoden (Kapitel 3.2) an diesen Untersuchungsobjekten im Mittelpunkt stehen sollte. Die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten endothelialen Zellen und H9C2-Myozyten stammten aus, in unserem Forschungslabor etablierten, immortalen Kulturzelllinien. Die adulten und Kardiomyozyten neonataler Ratten, die kardial- fibrozytären Zellen sowie die Thrombozyten wurden primär isoliert und als Primärkulturzellen kultiviert (Kapitel 3.2.3 und 3.2.4). Außerdem wurden vitale aortale Endothelzellen unterschiedlicher Tiere (Ratte, Meerschwein, Kaninchen) im Gewebsverband der thorakalen Aorta untersucht (Kapitel 4.2). Die Zellen wurden initial, im Rahmen der Etablierungsphase mittels unterschiedlicher Methoden fixiert und nachfolgend rasterkraftmikroskopisch untersucht und dargestellt. Der Etablierungsprozess der Methodik begann mit der Abbildung luftgetrockneter Zellen (Kapitel 4.1.1) unter Raumbedingungen und setzte sich über verschiedene Modifikationen der Zellpräparation (z.B. Glutardialdehydfixation, Cryofixation), des Abbildungsmodus (Contact-, Non-Contact-, Tapping-Mode) und der Abbildungsbedingungen (Raumbedingungen, zellphysiologische Umgebung) fort, so dass schließlich die Abbildung vitaler Zellen (Kapitel 4.1.2 und Kapitel 4.2 - 4.5) in ihrer strukturellen und funktionellen Umgebung (z.B. aortale Endothelzellen im Gewebsverband) etabliert werden konnte und routinemäßig reproduzierbar war. An stabilen oder künstlich stabilisierten Strukturen der o.g. vitalen Zellen wurden erste orientierende Messungen der bioelastischen Eigenschaften (Kraft-Abstands-Kurven, Kapitel 4.1.2.1) durchgeführt. Außerdem haben wir im Einzelfall, wenn technisch und apparativ möglich, andere hochauflösende strukturanalytische Verfahren (z.B. TEM) als mikroskopische Referenzuntersuchungen herangezogen (Kapitel 4.1.2; 4.4.1; 4.6), wobei z.T. erstaunliche Übereinstimmung zwischen den AFM- Daten und den strukturanalytischen Daten der Referenzmethoden nachweisbar waren. Ein strukturell durch Elektronenmikroskopie und Röntgendiffraktionsanalyse sehr gut beschriebenes komplexes Funktionsprotein, das 20-S-Proteasom, wurde mittels der Rasterkraftmikroskopie abgebildet und vermessen und die so gewonnenen strukturanalytischen Daten mit den bekannten strukturellen Abmessungen des Proteins verglichen (Kapitel 4.6). Die hierbei detektierten dimensionalen Abweichungen zwischen den AFM- assoziierten Daten und den bekannten strukturanalytischen Daten der Elektronenmikroskopie wurden im Kontext der funktionellen Integrität des Proteins und hinsichtlich möglicher methodischer Fehlereinflüsse (Kapitel 3.1.4.3) diskutiert. Interventionelle Materialien (Stents), die in der täglichen kardiologischen Praxis Anwendung finden, sind hinsichtlich ihrer Ultrastruktur mittels dieser hochsensitiven Abbildungsmethode im Nahfeld von Objektoberflächen untersucht worden. Bezüglich ihrer nativen Oberflächenbeschaffenheit und ihrer mechanischen Alteration durch den Ballon- Dilatationsprozess wurden die Stents sehr detailliert qualitativ und quantitativ (Kapitel 4.7) beschrieben, wobei Prädilektionsstellen der prozedural- assoziierten mechanischen Beanspruchung der Stents durch die hier beschriebene, oberflächensensitive AFM- Methode sehr genau diskriminiert werden konnten. Die präparierten Stents wurden weiterführend mit humanen Thrombozytenkonzentraten inkubiert und die Zell- Stentoberflächenkontakte sowie mögliche Stentoberflächen- induzierte Veränderungen der Thrombozyten sind morphologisch ausführlich beschrieben worden. Letztendlich wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit die spezifische Aktivierung der vitalen Thrombozyten durch pharmakologische Stimulantien (z.B. ADP) mit der, durch den AFM-Abbildungsprozess induzierten Thrombozytenaktivierung (Kapitel 4.5) unter AFM-Bedingungen verglichen und diskutiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen, dass mit der AFM-Technologie und objektorientiert optimierten Mess- und Präparationsmethoden ein neues mikroskopisches Analyseverfahren vorliegt, dass zum einen real-dreidimensionale morphologische Bildgebung bis in den submolekularen Auflösungsbereich an vitalen Zellen und präparierten Proteinkomplexen, zum anderen aber gleichermaßen Funktionsanalytik in Form von Messungen zelldynamischer Prozesse wie Migrationsbewegungen und Kontraktionen sowie visko- elastische Quantifizierung von Zellmembranen erlaubt. Der Vorteil gegenüber den meisten gegenwärtig verfügbaren mikroskopischen Methoden liegt in der neu eröffneten Möglichkeit der seriellen, wiederholten und stabil reproduzierbaren Messung an vitalen Zellen und zellulären Substrukturen. Insofern könnte in Zukunft diese neue Technologie eine methodische Bereicherung der mikroskopisch-morphologisch und funktionell orientierten Analysetechnik darstellen. / In 1981 Binnig and Rohrer invented the "Scanning Tunneling Microscope". Thereby it became feasible to high-resolution record the surface-properties of specimens (up to atomic resolution) at the nearfield of inert surfaces. This and in detail the further development of this technology and the establishment of "Atomic Force Microscopy" (1986), that allows implementation of this resolution capabilities in non-conductors or insulating materials represent the birth of a new microscopic era in the field of biomedical basic research (chapter 1.3). The promise of atomic (scanning) force microscopy (AFM) for cardiovascular research is enormous. The perusal of the extensive literature concerning this topic and scientific contact with other researchers reveals initial the capabilities of this method in cardiovascular basic research. Intriguing questions of cardiology may investigate concomitantly with help of scanning-force-micoscopic approaches (chapter 1.4). The aim of this study was to investigate relevant cardiovascular cells and single proteins in-vivo and specific materials (coronary artery stents) with scanning-force-micoscopic setup. The establishment and expensive optimization of this new microscopic method (chapter 3.1) and of the cell specific preparatory methods (chapter 3.2) represented the center of interest of our inevestigations. The endothelial cells and H9C2-myocytes stem from established imortal cell culture lines. The adult cardiomyocytes and cardiomyocytes of neonatal rats, the fibrocytes and the thrombocytes were primarily cultivated (chapter 3.2.3 and 3.2.4). In addition we investigated aortic endothelial cells of intact aortic tissue of different animals (rat, guinea pig, rabbit - chapter 4.2). During the establish experiments cells underlied different methods of cell-fixation. The primary investigations was performed using air-dried cells (chapter 4.1.1) analyzed in room ambient conditions and were continued by different modifications of cell-preparation. (e.g. glutardialdehyde-fixation, cryo-fixation), of microscopic mode (contact-, non-contact-, tapping-mode) and of cell-specific environmental conditions (from room ambient to cellphysiological medium and temperature). As result we became enabled to investigate (reproducible and routinely) vital cells (chapter 4.1.2 and chapter 4.2 - 4.5) embedded in physiological normal structural und functional ambient conditions (e.g. endothelial cells of intact aortic tisue in-vivo). Additionally, we performed measurements of bio-elastic properties of stable or artificial stabilized structures of named cells (force-distances-curves - chapter 4.1.2.1). If posibble, depending of available technical equipment, we compared our microscopic results with other high-resolution analytical procedures of reference (e.g. TEM - Kapitel 4.1.2; 4.4.1; 4.6) and detected astonishing congruence between the data. Furthermore we analyzed the well-described (electron-microscopy and x-ray-diffraction data) complex 20-S-proteasome using a specific atomic force microscopic setup. Analytical and structural data of these AFM-scans and abovementioned methods were likened (chapter 4.6). The deviations concerning the detected proportions were discussed regarding functional integrity of the protein and with respect to potential methodically determined artifacts. (chapter 3.1.4.3). Assaying (qualitative and quantitative) the surface roughness properties of coronary artery stents, we found significant alterations of stent material induced by balloondilatation. We suppose, that changes in roughness of inner surface of coronary artery stents might induce clinical problems like acute stent-thrombosis and in-stent-restenosis. Finally these stents were coated with human thromboytes to investigate cell-stent-surface interactions. Surface-roughness correllated triggering of thrombocyte adhesion was evaluated by morphological analysis of AFM-scans. Finishing, we have investigated and concluding discussed the specific activation of vital thrombocytes by pharmacological substances (e.g. ADP) and by mechanical stimulation (due to AFM-associated tip-surface-interaction). The results of this work demonstrate, AFM-technology using optimized microscopic setup and object-specific adjusted measurement- and preparation- methods, is an new, powerful, microscopic technique, that allow real-3-dimensional morphological mapping up to submolecular range of resolution in vital cells and protein complexes. Moreover, this technology opens new dimensions in functional analytic of cell migration processes or cellular contractions and in evaluation of visco-elastic quantification of cell membranes. The advantage owed to the most currently available microscopic methods is the option of serial and reproducible measurement of vital cells and subcellular structures. In this respect, this new method might represent a methodical enrichment of the microscopic-morphological and functional oriented analysis-technique in future.