Diese Arbeit untersucht die Reaktion der Stieleiche auf pflanzenparasitären Nematoden mittels RNA-Sequenzierung und Analyse von stabilen Isotopen und Fettsäuren. Einblicke in Rhizosphäreninteraktionen wurden über mutualistische Partner (Ektomykorrhizapilze, Rhizosphärenhelferbakterien), fungivore Collembolen und multitrophische Gemeinschaften gewonnen. Die Struktur und Biomasse der Mikroorganismen sowie die Fitness der Eichen wurden erfasst. Die Effekte wurzelfressender Nematoden auf die Eiche wurden durch das endogene rhythmische Wachstum des Baumes reguliert. Die Nematoden lösten eine stärkere Reaktion während des Sprosswachstumsschubs aus, u.a. Aktivierung von Abwehrmechanismen und Hemmung der Photosynthese, wohingegen beim Wurzelwachstumsschub pathogen bezogene Signale unterdrückt waren. Die Anwesenheit des Pilzsymbionten schwächte die Pflanzenabwehr und verbesserte die Stresstoleranz, was indirekt das Wachstum der Mikroorganismen förderte. Die Helferbakterien begünstigten den Mykorrhizapilz, was wiederum das Pflanzenwachstum stimulierte und dem negativen Effekt der Nematoden entgegenwirkte. Parasitäre Nematoden und fungivore Collembolen beeinflussten die Verteilung des pflanzlichen Kohlenstoffes unabhängig voneinander; Nematoden verringerten und Collembolen verbesserten die Allokation von Photoassimilaten in Gram-postiven Bakterien. Zudem war steigende trophische Diversität der Bodenfauna in der Rhizosphäre entscheidend für die Balance innerhalb der mikrobiellen Gemeinschaft, welche das Pflanzenwachstum fördert. Diese Arbeit stellt die Bedeutung der endogenen Ressourcenzuteilung von Pflanzen für unterirdische biotische Wechselbeziehungen heraus. Diese Pflanzenstrategie als bedeutender Faktor für Rhizosphärenprozesse sollte in zukünftige Studien Berücksichtigung finden. Die Einbeziehung der Hauptakteure in der Rhizosphäre ermöglicht zudem ein realistischeres Bild von Nematoden-Pflanzen Interaktionen und damit ein effektiveres Management. / This thesis investigated the response of Pedunculate oak to the plant-parasitic nematode Pratylenchus penetrans, using RNA-sequencing, stable isotope labelling and fatty acid analyses. Insight into rhizosphere interactions was gained by employing beneficial biotic partners (ectomycorrhizal fungi, rhizosphere helper bacteria), fungal grazers (Collembola) and multitrophic environments. Microbial biomass and community structure as well as oak fitness were assessed. The effects of root-feeding nematodes on oak were largely governed by the endogenous rhythmic growth of the tree. The nematodes triggered a stronger response during shoot flush, e.g. activation of multi-layered defence mechanisms and repression of photosynthesis, as compared to root flush where pathogen-related signalling was repressed. With the presence of the mycorrhizal symbiont plant defence was attenuated and stress tolerance enhanced, indirectly promoting the growth of rhizosphere microorganisms. The helper bacteria fostered the ectomycorrhizal fungus, which in turn stimulated plant growth, counteracting the negative effects of nematodes. Plant-parasitic nematodes and Collembola grazers had independent roles in plant carbon allocation patterns, with nematodes hampering whilst Collembola enhancing the flux of recent photoassimilates to Gram-positive bacteria. Lastly, increasing trophic diversity of the soil fauna in the rhizosphere of oaks was crucial for the maintenances of a microbial community equilibrium that promotes plant growth. In sum, this study highlights the importance of endogenous resource allocation pattern of plants in determining the outcome of belowground biotic interactions. Therefore such plant traits should be considered as important drivers for rhizosphere processes in future studies. Moreover, taking into account the rhizosphere main players in studies on parasitic nematode-plant interactions will result in a more realistic picture and thus more effective nematode management.

Limnologische Charakterisierung ausgewählter Ackerhohlformen (Sölle) des nordostdeutschen Jungmoränengebietes als Grundlage von Schutzmaßnahmen* *) gefördert durch die Deutsche Bundesstiftung Umwelt und die FAZIT-Stiftung, Frankfurt a.M. 160 S.: 64 Abbn., 24 Tab., 3 gezeichnete Tafeln, 4 mikroskopische Tafeln Humboldt-Universität zu Berlin Institut für Biologie AG Ökologie Die Untersuchungen konzentrierten sich auf das Plankton von Söllen der Jungmorä nenlandschaft Nordostdeutschlands. Ziel war es, die qualitative und quantitative Phyto- und Zooplanktonstruktur verschiedener Sölle unter dem Gesichtspunkt der nterschiedlichen Landnutzung, des Wasserhaushaltes und des Stoffeintrages in zwei Untersuchungsgebieten zu erfassen, mit einem weitgehend ursprünglichen Forstsoll zu vergleichen und daraus Schlußfolgerungen für den Erhalt und den Schutz dieser Kleingewässer abzuleiten. Es wurden sieben repräsentative Sölle monatlich über drei Vegetationsperioden (1994-1997) untersucht. Neben dem Artenspektrum und dem Abun danzwechsel des Phyto- und Zooplanktons erfolgte eine Erfassung des Chlorophyll a -Gehaltes der Mikroalgenzellen, der hydrochemischen und physikalischen Grundparameter und der Pegelstände des Sollwassers. Trotz der großen Individualität der Untersuchungsgewässer konnten aus den Erg ebnissen die Sölle in drei Gruppen statistisch signifikant zusammengefaßt werden. Für deren Abgrenzung sind die Nährstoffverhältnisse (N oder P-Überschüsse, Nitrifikationsgrad), die Sauerstoffsättigungswerte und das Artenspektrum des Phyto- und Zooplanktons bedeutsam. Hohe Leitfähigkeit des Wassers besonders in den Söllen des Gebietes um Lietzen-Döbberin wird durch hohe Sulfat- und Chloridgehalte bedingt. Im Vergleich zu den Seen sind die Chlorophyll a -Konzentrationen als Biomasseäquivalent für die Mikroalgen in Relation zu den Phosphatgehalten auffallend gering. Aus den Ergebnissen lassen sich Maßnahmen zur Erhaltung und dem Schutz der Sölle ableiten. Es wird die konsequente Verminderung der externen Nährstoffeinträge durch die Schaffung und/ oder Pflege von Pufferzonen sowie gegebenenfalls die Umwidmung des Einzugsgebietes in Dauergrünland empfohlen. Weitere Maßnahmen, die auf die Reduzierung der internen Nährstoffreserven zielen, sind erst nach zusätzlichen Untersuchungen insbesondere zum Phosphorbindungsvermögen der Sedimente für die Sölle ableitbar. / Limnological characterization of selected ponded depressions of the north German young moraine site as a basis for conservation* *) sponsored by the Deutsche Bundesstiftung Umwelt and the FAZIT-Stiftung, Frankfurt a.M. 160 S.: 64 Abbn., 24 Tab., 3 graphic Tables, 4 microscope tables Humboldt-Universität zu Berlin Institut für Biologie AG Ökologie The main geographical feature of the ground and terminal moraines of northern Germany are the numerous small depressions, many of which are water-filled. They represent a typical geographical element of this region and in the German language are usually referred to as "Sölle" (Singular = "Soll"). These small bodies of water were created either glacially through the melting of dead-ice pieces (natural depressions or dead-ice depressions) or later (circa 12th or 13th century) in the course of the clearing of large tracts of forested land through the partial and permanent damming of depressions (pseudo depressions). The study concentrated on the plankton levels of ponded depressions in the recent moraines of northern Germany. The goal of the study was to record the qualitative and quantitative phytoplankton and zooplankton make-up of several different ponded depressions with consideration of the various land uses, management of water, and introduction of nutrients in two research areas and to compare these findings with a mostly unaltered forested ponded depression (ponded depression in a forested area) for the purpose of deriving conclusions about the preservation and protection of these small water ways. Seven representative ponded depressions were examined monthly over the span of three vegetation periods (1994-1997). In addition to the variety of vegetational species and the variation in amounts of phytoplankton and zooplankton, data about the amount of chlorophyll a in the micro algae cells, the hydro-chemical and physical ground parameters, and the water level of the ponds was recorded. In spite of the considerable uniqueness of each of the ponds under examination, the results of the study allowed for the classification of the ponded depressions into three statistically significant groupings.The proportions of nutrients (a surplus of N or P or the level of nitrification), the oxygen saturation values, and the vegetational spectrum of phytoplankton and zooplankton proved meaningful for the differentiation of the groupings. High conductivity of the water, especially in the ponds in the area around Lietzen-Döbberin, is caused by high levels of sulfate and chloride. In comparison to lakes, the concen trations of Chlorophyll a as a biomass equivalent for the micro algae are noticeably smaller in relation to the phosphate levels. The results of the research suggest measures for the preservation and protection of the ponded depressions. The intentional reduction of external nutrients through the creation of and/or care for buffer zones and, if necessary, the redesignation of areas zoned for development into permanent nature conservation zones is recommended. Further preservation measures, aimed at reducing the reserves of internal nutrients, will only be deduced after further study of the ponded depressions, especially in relation to the ability of the sediment to absorb phosphors.

Genetisch kodierte Photorezeptoren in Modellorganismen begründen die Optogenetik. Sie ermöglicht die nicht-invasive, reversible und räumlich-zeitlich präzise Perturbation von zellulären und physiologischen Signalprozessen durch Licht. Natürliche photoaktivierte Adenylylzyklasen (PACs) steigern die intrazelluläre Konzentration des Botenstoffs zyklischen Adenosinmonophosphats (cAMP) durch Blaulicht. Damit erlauben sie die optogenetische Analyse von cAMP-abhängigen Signalwegen. Diese Arbeit komplementiert PACs durch die synthetische rotlichtaktivierte Phosphodiesterase LAPD zur Degradation von cAMP und zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP). LAPD ist eine Chimäre aus dem photosensorischen Modul von Deinococcus radiodurans Bakteriophytochrom (DrBPhy) und der Effektordomäne der cAMP/cGMP-spezifischen H. sapiens Phosphodiesterase 2A (HsPDE2A). Die Fusionsstelle wurde von den helikalen Linkern zwischen Sensor- und Effektormodulen durch strukturelle Überlagerung abgeleitet. LAPD inkorporierte den Chromophor Biliverdin (BV) nach Expression in E. coli und Reinigung vollständig und entsprach spektral und photochemisch dem Wildtyp-DrBPhy. Durch Bestrahlung mit Rot- und Fernrotlicht (R bzw. FR) wurde LAPD in die metastabilen photochemischen Zustände Pfr (fernrot) bzw. Pr (rot) umgewandelt. Vollständig aktivierte LAPD katalysierte die Hydrolyse von cGMP und cAMP in derselben Größenordnung wie Wildtyp-HsPDE2A. LAPD degradierte cGMP und cAMP bei 6- bzw. 4-facher Steigerung von vmax unter R im Vergleich zu dunkeladaptiertem Enzym. Die Aktivität von R-adaptierter LAPD wurde durch FR reduziert. Die enzymatische Aktivität und Lichtregulation von LAPD-Linkervarianten waren abhängig von der Linkerlänge. LAPD degradierte lichtabhängig cGMP in einer PDE-Reporterzelle. Dabei genügte die endogene BV-Konzentration der Säugerzelle zur Sättigung des Lichteffekts. / Genetically encoded photoreceptors in model organisms establish optogenetics. It enables non-invasive, reversible, and spatio-temporally precise perturbation of cellular and physiological signalling by light. Natural photoactivated adenylate cyclases (PACs) increase the intracellular concentration of the second messenger cyclic adenosine monophosphate (cAMP) under blue light. Hence, PACs allow the optogenetic analysis of cAMP-dependent signalling. This work complements PACs with the synthetic red-light-activated phosphodiesterase LAPD for degradation of cAMP and cyclic guanosine monophosphate (cGMP). LAPD is a chimera made up of the photosensory module of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome (DrBPhy) and the effector domain of cAMP/cGMP-specific H. sapiens Phosphodiesterase 2A (HsPDE2A). The fusion site was derived from the helical linkers between sensor and effector modules via structural superposition. LAPD incorporated the chromophor biliverdin (BV) after expression in E. coli and purification quantitatively, and spectrally and photochemically resembled the wildtype DrBPhy. Upon irradiation with red and far-red light (R and FR, resp.), LAPD was converted to the metastable photochemical states Pfr (far-red) and Pr (red), respectively. Fully activated LAPD catalized the hydrolysis of cGMP and cAMP with rates similar to wildtype HsPDE2A. LAPD degraded cGMP and cAMP with 6- and 4-fold increase of vmax under R, respectively, as compared to the dark state. The activity of R-adapted LAPD was reduced upon irradiation with FR. Enzymatic activity and light regulation of LAPD linker variants depended on the linker length. LAPD light-dependently degraded cGMP in a PDE reporter cell line. Endogenous BV concentrations were sufficient to saturate the light effect in the mammalian cell, which enables a true optogenetic approach.

Die einzellige Grünalge C. reinhardtii dient als Modellorganismus und ist aufgrund des GRAS-Status, des schnellen, kostengünstigen Wachstums und der Möglichkeit posttranslationaler Modifikationen im Kerngenom, als Expressionssystem für beispielsweise orale Impfstoffe sehr interessant. Herausforderungen sind die im Vergleich zu konventionell verwendeten Expressionssystemen sehr geringen Expressionsraten im Kerngenom. Daher sollten in dieser Arbeit neuartige, teils induzierbare, Promotorkonstrukte verwendet und mittels Luciferase-Reporter auf ihre Expressionssteigerung hin getestet werden. Zunächst wurden ausgewählte Promotoren des Chlorella-Virus-1 (PBCV-1) gewählt, diese führten allerdings zu keiner Expression. Außerdem wurden synthetische, aneinandergereihte Hitzeschockelemente mit dem endogenen RBCS2-Promotor fusioniert und die Expressionsraten analysiert. Dabei ergab sich bei der Kombination aus dem synthetischen Hitzeschockelement in achtfacher Wiederholung (HSE8x) mit RBCS2 nach der Hitzeinduktion eine Steigerung der Expressionsrate um das bis zu dreifache. Die Basalexpression war hierbei bei HSE1x-RBCS2 am höchsten und erreichte Expressionslevels, welche um das fünffache höher lagen als die Positivkontrolle HSP70A-RBCS2. Mittels Chromatinimmunopräzipitation mit dem Antikörper gegen HSF1 konnte gezeigt werden, dass eine Bindung an das synthetische Hitzeschockelement vorliegt und deshalb die Expression über die konventionelle Hitzeschockantwort in Chlamydomonas reinhardtii funktioniert. Im Gegensatz zur Luciferase benötigen Fluoreszenzproteine als Reporter kein Substrat. Infolge dieses Vorteils und der Möglichkeiten der FACS-Analyse und Fluoreszenzmikroskopie wurde tagRFP als neuer Reporter in C. reinhardtii etabliert. Die Erhöhung der Expressionsrate durch neue Promotorkombinationen und die Anwendung von tagRFP als neuen Fluoreszenzreporter bedeuten wichtige Schritte in der Etablierung von C.reinhardtii als Expressionssystem für Produkte in der Biotechnologie. / The unicellular green alga C.reinhardtii which is used as a model organism could be an interesting expression system for oral vaccines. This is because the alga is generally regarded as safe, it shows fast growth rates and culturing is cheap. Furthermore it offers the possibility of posttranslational modifications. Challenges lie in the low expression rates in the nuclear genome when compared to other expression systems. Therefore the first step in this work was to test whether selected Chlorella virus PBCV-1 promoters, do lead to enhanced expression rates, but there was no detectable expression. Furthermore synthetic repeats of heat shock elements were used in combination with the endogenous RBCS2-promoter and analysed for expression rates via reporter measurements. The combination of synthetic heat shock elements in eightfold repeats in combination with RBCS2 enhanced expression rates of luciferase after heat shock up to threefold in comparison with the up to now strongest known promoter combination HSP70A-RBCS2. Basalexpression turned out to be best for the HSE1x-RBCS2 promoter and reached expression levels fivefold higher compared to HSP70A-RBCS2. To examine if the artificial heat shock elements (HSEs) are bound by the heat shock factor 1 in C. reinhardtii a ChIP assay with HSE8x-RBCS2 and the antibody of HSF1 of C. reinhardtii was done. It could be shown that HSF1 binds HSEs and therefore one can explain the heat shock inducibility of HSEs is regulated via the conserved heat shock response. In contrast to luciferase fluorescence reporters do not need substrate. Because of this advantage and the possibility of FACS analyses and fluorescence microscopy tagRFP was established as new reporter in C.reinhardtii. Enhancement of expression rates through new constitutive and inducible promoter combinations and the possible use of tagRFP as new fluorescence reporter are significant steps in establishing C.reinhardtii as expression system for products in biotechnology.

In Chloroplasten durchlaufen primäre Transkripte eine großen Anzahl von bzw. Reifungsprozesse. Diese Ereignisse spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genexpression und sind im Wesentlichen durch Proteinfaktoren, insbesondere RNA-Bindeproteine, reguliert. Der plastidäre Spleißfaktor MatK zählt zu den prokaryotischen Gruppe-II-Intron. MatK aus Nicotiana tabacum interagiert mit seinem Heimatintron trnK und sechs weiteren Gruppe IIA Introns. In dieser Untersuchung, MatK-Bindestellen konnten unterschiedlichen Regionen der Gruppe-II-Introns zugewiesen werden mit RIP-seq in Nicotiana tabacum. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass MatK im Vergleich zu seinen bakteriellen Vorfahren an Vielseitigkeit in der RNA-Erkennung gewonnen hat. MatK zeigt somit beispielhaft, wie eine Maturase die Fähigkeit erworben haben könnte, in trans auf mehrere Introns zu wirken. Quantitative Untersuchung und mathematische Modellierung der Expression von MatK und dessen Zielen offenbart ein komplexes Muster möglicher regulatorischer Feedback-Mechanismen. In dieser Studie konnte ein möglicher Feedback- Mechanismus durch Analyse von polysomal gebundenen Transkripten ausgeschlossen werden. Stabile Bindung von Proteinen an spezifische RNA-Bindestellen und anschließender Abbau der ungeschützten RNA kann zu Akkumulation von kleinen RNAs (sRNAs) führen. Solche Footprints von RNA-Bindeproteinen wurden durch die Untersuchung von Datensätzen kleiner RNAs in Chlamydomonas reinhardtii identifiziert. Zwei der sRNAs entsprechen den 5'' Enden der reifen psbB und psbH mRNAs. Beide sRNAs sind abhängig von Mbb1, einem TPR (Tetratrico-peptide repeat) Protein. Die beiden sRNAs besitzen eine hohe Ähnlichkeit in ihrer Primärsequenz und fehlen in der mbb1 Mutante. Dies legt nahe, dass auch andere der hier identifizierten sRNAs an 5'' Enden plastidärer mRNAs Protein-Bindestellen repräsentieren, die für die korrekte RNA-Prozessierung und RNA-Stabilisierung in Chlamydomonas Chloroplasten erforderlich sind. / In chloroplasts, primary transcripts are subjected to a number of processing events. These events play important roles in the regulation of gene expression and are extensively controlled by protein factors, especially by RNA-binding proteins. Chloroplast splicing factor MatK is related to prokaryotic group II intron maturases. Nicotiana tabacum MatK interacts with its home intron trnK and six additional group IIA introns. In this study, binding sites of MatK were narrowed down to varying regions of its group II targets by RIP-seq in Nicotiana tabacum. The results obtained demonstrate that MatK has gained versatility in RNA recognition relative to its bacterial ancestors. MatK thus exemplifies how a maturase could have gained the ability to act in trans on multiple introns during the dispersion of the group II introns through the eukaryotic genome early in the eukaryote evolution. Quantitative investigation and mathematical modeling of the expression of MatK and its targets revealed a complex pattern of possible feedback regulatory interactions. In this study, one possible feedback regulation mechanism was ruled out by the analysis of polysome associated transcripts. Stable binding of proteins to specific RNA sites and subsequent degradation of the unprotected RNA regions can result in small RNA, footprint of the RNA binding protein. Such footprints were identified by examining small RNA datasets of Chlamydomonas reinhardtii. Two of the sRNAs correspond to the 5’ ends of mature psbB and psbH mRNAs. Both sRNAs are dependent on Mbb1, a nuclear-encoded TPR (Tetratrico-peptide repeat) protein. The two sRNAs have high similarity in primary sequence, and both are absent in the mbb1 mutant. This suggests that sRNAs at the 5’ ends of chloroplast mRNAs identified here generally represent the binding sites of proteins, which function in RNA processing and RNA stabilization in Chlamydomonas chloroplast.

Der Eintritt löslicher oder membranständiger Proteine in den Sekretionsweg beginnt mit dem Transport der Proteine durch die Membran des Endoplasmatischen Retikulums (ER). Die Translokationspore wird durch den heterotrimeren Sec61-Komplex gebildet. Homologe Membranproteine der alpha- und gamma-Untereinheit dieses Komplexes sind bislang in allen daraufhin untersuchten prokaryotischen und eukaryotischen Organismen gefunden worden. Es handelt sich somit um einen entwicklungsgeschichtlich hoch konservierten Mechanismus des Proteintransports durch Membranen. Zahlreiche Untersuchungen in den letzten Jahren haben uns mittlerweile ein komplexes Bild des Translokationsgeschehens vermittelt. Die vorliegende Arbeit beleuchtet einen völlig neuen Aspekt der Proteintranslokation: Es zeigt sich, daß Gene, die für Komponenten des Sec61-Komplexes kodieren, in sehr unterschiedlichen eukaryotischen Organismen unabhängig voneinander dupliziert wurden und sich im folgenden nebeneinander weiterentwickelten. Die Untersuchung dieser sog. paralogen Gene und ihrer Genprodukte zum einen in Säugerzellen und zum anderen in der Hefe Saccharomyces cerevisiae ist Gegenstand der Arbeit. In Säugerzellen finden sich zwei sehr ähnliche SEC61a-Gene (knapp 80% Identität auf Nukleinsäureebene, etwa 94% auf Aminosäureebene), deren Expression in verschiedenen Organen und Embryonalstadien der Maus analysiert wurde. In allen bislang getesteten Geweben wurden beide Gene exprimiert. Deutliche Unterschiede zeigten sich allerdings in der Stärke der Expression: Während die Expressionshöhe des bereits bekannten SEC61a-I-Gens relativ konstant war, variierte die des paralogen SEC61a-II-Gens zwischen den einzelnen Organen. Der selektive Vorteil zweier paraloger SEC61a-Gene für den Säugerorganismus liegt somit möglicherweise in der unterschiedlichen Regulierbarkeit ihrer Expression. In Saccharomyces cerevisiae finden sich paraloge Proteine und dafür kodierende Gene sowohl für die alpha-Untereinheit Sec61p als auch für die beta-Untereinheit Sbh1p des heterotrimeren Sec61p-Komplexes. Der Grad der Identität liegt mit 32% zwischen Sec61p und Ssh1p (Sec sixty-one homolog 1) allerdings erheblich niedriger als in Säugerzellen. Sbh1p und Sbh2p (Sec sixty-one beta homolog 2) sind zu etwa 50% identisch. Für die gamma-Untereinheit Sss1p wurde kein paraloges Protein gefunden. Es konnte gezeigt werden, daß die beiden, hier neu beschriebenen Proteine Ssh1p und Sbh2p zusammen mit Sss1p einen eigenständigen, heterotrimeren Komplex, den Ssh1p-Komplex, bilden, der ebenfalls in der ER-Membran lokalisiert ist und eine Funktion beim Proteintransport durch diese Membran hat. Im Gegensatz zu SEC61 ist SSH1 nicht essentiell, wenn auch das Ssh1p für normale Wachstumsraten erforderlich ist. Die Deletion des SBH2-Gens zeigt keinen Phänotyp, was allerdings für die des SBH1-Gens ebenfalls gilt. Erst das Fehlen beider Proteine führt zu einem temperatur-abhängigen Wachstumsphänotyp und zu Defekten in der Translokation. Der entscheidende Unterschied zwischen dem Sec61p- und dem Ssh1p-Komplex scheint darin zu bestehen, daß der Sec61p-Komplex modulartig einsetzbar ist: als trimerer Komplex bei der kotranslationalen Translokation und im heptameren Sec-Komplex beim posttranslationalen Proteintransport. Demgegenüber deuten die Untersuchungen des Ssh1p-Komplexes darauf hin, daß dieser nicht mit dem tetrameren Sec62p-Sec63p-Komplex zum heptameren Sec-Komplex assoziieren kann. Vielmehr läßt er sich in Assoziation mit membrangebundenen Ribosomen nachweisen, was auf eine ausschließliche Funktion des Ssh1p-Komplexes bei der kotranslationalen Translokation schließen läßt. / Soluble or membrane proteins entering the secretory pathway are first translocated across the endoplasmic reticulum (ER) membrane. The proteins move through a channel formed by the heterotrimeric Sec61-complex. Homologues of the alpha- and gamma-subunit of this complex have been found in a wide variety of procaryotic and eucaryotic organisms indicating an evolutionary highly conserved mechanism for translocating proteins across membranes. Several recent investigations contributed to a complex understanding of this process. The work presented here sheds light on a completely new aspect of protein translocation across the ER-membrane: Interestingly genes coding for components of the Sec61-complex are found to have been duplicated independently in diverse eucaryotic organisms giving rise to so called paralogous genes (= intraspecies homologues) co-evolving after duplication. These paralogous genes and their gene products in mammalian cells as well as in the yeast Saccharomyces cerevisiae have been analyzed in detail. Mammalian cells possess two very similar SEC61a-genes (about 80% identity on nucleic acid level, about 94% on protein level). Their expression has been analyzed for several murine organs and embryonic stages. All tissues tested so far showed expression of both genes though the level of expression differed significantly: whereas expression of the already known SEC61a-I-gene seemed to be more or less constant across different tested organs, expression levels of the paralogous SEC61a-II-gene were not. Consequently the ability to differentially regulate the expression of the two paralogous SEC61a-genes may be of selective advantage for the mammalian organism. In the yeast Saccharomyces cerevisiae paralogous proteins of the alpha-subunit Sec61p as well as for the beta-subunit Sbh1p of the heterotrimeric Sec61p-complex can be found. The paralogous alpha-subunits Sec61p and Ssh1p (Sec sixty-one homolog 1) are less well conserved (32% identity) than the mammalian paralogues. Sbh1p and Sbh2p (Sec sixty-one beta homolog 2) are 50% identical. No paralogous protein was found for the gamma-subunit Sss1p. Instead, it could be shown that the new proteins Ssh1p and Sbh2p together with Sss1p are found in a heterotrimeric complex, the Ssh1p-complex, which like the Sec61p-complex localizes to the ER-membrane and has a function in translocating proteins across this membrane. In contrast to Sec61p Ssh1p is not essential for cell viability but it is required for normal growth rates. Sbh1p and Sbh2p individually are also not essential, but cells lacking both proteins are impaired in their growth at elevated temperatures and show translocation defekts in vivo as well as in vitro. The most intriguing difference between the Sec61p-and the Ssh1p-complex might be that the Sec61p-complex has a role in both co- and post-translational translocation pathways, as a separate entity and as part of the heptameris Sec-complex, respectively. However, there was no evidence for the Ssh1p-complex being part of an heptameric complex together with the tetrameric Sec62p-Sec63p-complex, but association of the trimeric Ssh1p-complex with membrane-bound ribosomes could be shown, making it likely that the Ssh1p-complex functions exclusively in the co-translational pathway of protein transport.

Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Validierung geeigneter Methoden zur selektiven qualitativen und quantitativen Bestimmung aller relevanten Zersetzungsprodukte von Natriumthiosulfat-Injektionslösungen. Die Besonderheit liegt in der Analytik der schwefelhaltigen Verbindungen neben einem großen Überschuss an Thiosulfat. Neben der Etablierung analytischer Verfahren konnte Aussagen zu stabilitätsrelevanten Parametern getroffen und die Zersetzungsprodukte unterschiedlich stabilisierter Injektionslösungen charakterisiert werden. Als wichtigste Ergebnisse dieser Arbeit: (i) sind der Nachweis und quantitative Bestimmung von Sulfit, Sulfat und erstmals von Sulfid und Polythionaten (Tetrathionat, Pentathionat, Hexathionat) in Natriumthiosulfat-Injektionslösungen durch Einsatz der DPP, IPC, IC und CZE erfolgt, (ii) sind der Nachweis und erstmals die quantitative Bestimmung von Schwefel nach Flüssig-/Flüssig-Extraktion und mittels RP-HPLC in Natriumthiosulfat-Injektionslösungen vorgenommen worden, (iii) ist erstmals die Trennung von Polysulfiden unterschiedlicher Kettenlänge durch Einsatz der CZE gelungen, (iii) ist der Nachweis der Beteiligung von Sulfid und Polythionaten am Zersetzungsgeschehen von Natriumthiosulfat-Injektionslösungen erbracht worden, (iv) ist eine Einschätzung stabilitätsrelevanter Parameter (pH, Pufferkapazität, Disulfit-Zusatz, EDTA, thermische Belastung) erfolgt (v) ist eine Erklärung des beobachteten pH-Wert-Abfalls aus dem System erbracht worden, (vi) wurden methodische Fortschritte bezüglich Nachweisgrenze und Selektivität erreicht und (vii) ist ein direkten Vergleich aller Methoden bezüglich Nachweisgrenze, Präzision, Richtigkeit, Selektivität, Robustheit und immanenter Anfälligkeit bei großem Überschuss einer Komponente möglich. / The present thesis was focused on development and validation of several analytical methods in order to detect and to determine relevant degradation product of sodium thiosulphate injection solutions with certain selectivity. The exceptional matter is the determination of small amount of sulphur containing compounds beneath a large amount of thiosulphate. In addition parameters which influence the stability of the injection solutions were investigated. Furthermore different degradation products of instable injection solutions were characterised. The main results of these thesis are the following: (i) the detection and quantitative determination of sulphite, sulphate and first of sulphide and polythionates (tetrathionate, pentathionate, hexathionate) in sodium thiosulphate injection solutions by use of DPP, IPC, IC und CZE, (ii) the detection and first the quantitative determination of sulphur after liquid- / liquid-extraction and RP-HPLC analysis in sodium thiosulphate injection solutions, (iii) the first separation of polysulphides with different chain length by use of CZE, (iii) the evidence that sulphide and polythionates are involved in degradation of in sodium thiosulphate injection solutions (iv) an evaluation of the influence of pH, buffer capacity, sodium disulphite, EDTA, sterilisation (v) the explanation of the observed pH-depression , (vi) advantages in detection limits and selectivity (vii) comparison of detection limits, accuracy, precision, selectivity and robustness in presence of sample overload.

Das moderne Therapiekonzept der Hochdosischemotherapie von soliden Tumoren und hämatologischen Neoplasien erfordert die prätherapeutische Sammlung, die extrakorporale Reinigung und die nachfolgende Tieftemperaturlagerung von menschlichen Blutstammzellen zur späteren Retransplantation. Stammzellpräparate (Transplantate) von 22 Patienten wurden durch extrakorporale Trennung von peripheren Blut hergestellt. Von jedem Patienten wurde eine Probe mit Dimethylsulfoxid (DMSO) versetzt, bei - 196 oC gelagert und nach ca. 3 Wochen aufgetaut. Eine Vergleichsprobe jedes Patienten wurde ohne den Zusatz von DMSO und ohne einen Einfrierschritt untersucht. Die Exposition von DMSO, das Frieren und Auftauen der Zellen zeigte eine geringfügige des Zell- und Kerndurchmessers, eine konstante Anzahl an Mitochondrien und eine Reduktion der Vesikel. Ein markantes Merkmal der Schädigung nach Tieftemperaturlagerung war das Auftreten von Flüssigkeitseinlagerungen in die Kerndoppelmembran und die Ausbildung von zisternenartigen Erweiterungen des endoplasmatischen Retikulums. Regelmäßig konnten Mitochondrien von verringerter Größe und randständig kondensierter Cristae gefunden werden. Insgesamt konnten keine schwerwiegenden zellulären Schäden beim Vergleich der unbehandelten und der DMSO- versetzten , eingefrorenen und wieder aufgetauten Proben festgestellt werden. Die morphologischen Ergebnisse korrespondieren mit der vollständigen Restitution aller hämatopoetischer Zelllinien nach Transplantation. / The modern therapeutic concept of high-dose chemotherapy of solid tumors and hematologic neoplasias demands a pretherapeutic harvest, an extracorporal purification and an consecutive deep temperature storage of human blood stem cells which will be retransplanted later. Stem cell preparates (transplants) of 22 patients were produced by extracorporal separation of peripheral blood. From each patient a stem cell specimen was mixed with dimethylsulfoxide (DMSO), storaged at - 196 °C and thawed after about 21 days. A corresponding specimen of each patients material was investigated without DMSO addition and without freezing under native conditions. The DMSO exposed, frozed and again defrosted cells showed a mild increase of total cell and nucleus diameters, a constant number of mitochondrias and a reduction of vesicles. A markedly feature of deep temperature damage was the occurance of liquide storages in the nucleus double membrane and the forming of cisterne-like enlargement of the endoplasmatic reticulum. Persistantly we found mitochondrias with reduced size and marginal condensed cristae. Alltogether there were no severe cellular damages in the comparative investigated overlifed specimen cells of the same patient with and without DMSO and deep temperature storage. The morphological results correspond with clinical investigations of a sufficient restitution of all hematopoietic cell lineages in transplanted patients.

Die von T-Helfer (Th) -Zellen produzierten Zytokine spielen eine entscheidende Rolle bei der Einleitung, der Aufrechterhaltung und der Regulation von Immunantworten. Bei der Untersuchung von Immunantworten hat sich eine vereinfachte Einteilung der Th-Zellen in zwei Klassen als hilfreich erwiesen: Th1 und Th2. Stabil differenziell exprimierte Oberflächenmoleküle werden benötigt, um lebende Th1- und Th2-Zellen identifizieren, auf Einzelzellebene charakterisieren und möglicherweise die von ihnen erzeugten Immunantworten modulieren zu können. Auf der Suche nach solchen Molekülen wurde in Zusammenarbeit mit der Firma Millennium Pharmaceuticals das Oberflächenmolekül TIM-3 entdeckt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegen, dass TIM-3 nicht nur von CD4+ Th-Zellen, sondern auch von CD8+ T-Zellen, gamma/delta-T-Zellen, sowie einigen Makrophagen und der Mehrheit der dendritischen Zellen in der Milz von Mäusen auf der Zelloberfläche exprimiert wird. Die Expression von TIM-3 auf Th-Zellen ist klar mit einem aktivierten Phänotyp assoziiert. TIM-3 wird unter polarisierenden Bedingungen in vitro im Vergleich zu Th2-Zellen bevorzugt, jedoch nicht ausschließlich von Th1-Zellen exprimiert. Erstmals wurde auf Einzelzellebene die Zytokinproduktion TIM-3 exprimierender Th-Zellen untersucht. Die Analyse von Th0-Zellen, welche unter nichtpolarisierenden Bedingungen in vitro hergestellt wurden, ergab keine bevorzugte Produktion von Th1-Zytokinen und keine verminderte Expression von Th2-Zytokinen durch TIM-3 exprimierende Th-Zellen. Aufgrund der in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse erlaubt die Expression von TIM-3 allein daher nicht die Identifizierung von Th1-Zellen. Nach einer Infektion mit Toxoplasma gondii lag jedoch eine bevorzugte Assoziation zwischen der Expression von TIM-3 und der pathogenspezifischen Produktion von Interferon (IFN)-gamma, Interleukin (IL)-2 und Tumor Nekrose Faktor (TNF)-alpha vor. Somit korreliert die TIM-3 Expression auf Th-Zellen nur unter bestimmten Bedingungen mit einem Th1-Phänotyp. / The cytokines that are produced by T helper (Th) cells are decisive for the initiation, the maintenance and the regulation of immune responses. A simplified classification of Th cells has proven to be useful for the analysis of immune responses: Th1 and Th2. Stably and differentially expressed surface molecules are required for the identification of live Th1- and Th2-cells, their characterisation at the single cell level and the possible modulation of the immune responses that they induce. On the search for such molecules the surface molecule TIM-3 was discovered in collaboration with Millennium Pharmaceuticals. The present work shows that TIM-3 protein is not only expressed on the cell surface by CD4+ Th cells but also by CD8+ T cells and gamma/delta T cells as well as by some macrophages and the majority of the dendritic cells in the murine spleen. TIM-3 expression on Th cells is clearly associated with an activated phenotype. Under polarising conditions in vitro TIM-3 is expressed preferentially albeit not exclusively by Th1 cells compared to Th2 cells. For the first time, the cytokine production of TIM-3 expressing Th cells has been analysed at the single cell level. The analysis of Th0 cells, generated under non-polarising conditions in vitro showed no preferential production of Th1-cytokines and no diminished production of Th2-cytokines by TIM-3 expressing Th-cells. The results obtained in this work lead to the conclusion that expression of TIM-3 does not permit the identification of Th1-cells. However upon infection with Toxoplasma gondii a positive association between the expression of TIM-3 and the pathogen-specific production of Interferon (IFN)-gamma, Interleukin (IL)-2 and Tumor Necrosis Factor (TNF)-alpha was observed. Therefore the expression of TIM-3 on Th-cells only correlates under specific conditions with a Th1-phenotype.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle des Zytokins IFN-gamma in einer Th1-vermittelten Entzündungsreaktion untersucht. Ausgangspunkt war die Beobachtung, dass die Blockade des als proinflammatorisch beschriebenen Zytokins IFN-gamma zu einer chronischen Entzündung führte. Ziel war also das Erkennen und Verstehen der Regulationsmechanismen, sowie die Identifizierung beteiligter Zelltypen und beteiligter Moleküle. Mit Hilfe von Knochenmarkschimären konnte gezeigt werden, dass die Zelle, die von Th1-Zellen sekrektiertes IFN-gamma erkannte, haematopoietischen Ursprungs war. Zum weiteren Verständnis der Regulationsmechanismen wurden Tiere unter IFN-gamma-Blockade mit Tieren, die einen Kontrollantikörper erhielten, verglichen. Mittels Immunhistochemie konnte in Kontrolltieren eine starke Expression von iNOS am Ort der Entzündung nachgewiesen werden, während in Tieren, in denen IFN-gamma blockiert wurde, keine iNOS Expression nachzuweisen war. Mit Hilfe von iNOS-defizienten Mäusen konnte gezeigt werden, dass NO tatsächlich funktionell essentiell in der IFN-gamma abhängigen Selbstlimitation der Th1-vermittelten Entzündungsreaktion war. Weitere Charakterisierung der iNOS-exprimierenden Zellen mittels FACS-Analyse ergab, dass iNOS-produzierende Zellen den Oberflächenmarker CD11b exprimierten. Diese iNOS-produzierenden Zellen waren fast ausschließlich am Ort der Entzündung zu finden. Die funktionelle in vitro Charakterisierung dieser Zellen nach ex vivo Isolierung ergab, dass diese Zellen die Proliferation von CD4+ T-Zellen supprimierten und deshalb als Myeloide-Suppressor-Zellen bezeichnet werden können. Der hier untersuchte IFN-gamma vermittelte Regulationsmechanismus scheint auf andere T-Zell-Systeme übertragbar zu sein, da IFN-gamma Blockade in einer durch CD8+ Effektor-T-Zellen vermittelten Entzündung auch zu einer Verlängerung der Entzündung führte. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass das Zytokin IFN-gamma während der Effektorphase einer Immunreaktion wichtig für die Selbstlimitation ist. / The aim of the work was to understand the role of the cytokine IFN-gamma in a Th1 dependent inflammation. Starting point was the observation that the blockade of IFN-gamma, which is generally regarded as a proinflammatory cytokine, led to a more severe inflammation. We were therefore aiming at a better understanding of the mechanism of regulation, the identification of important cell types and downstream effector molecules. With the help of bone marrow chimeras we could show that the host cell which recognises IFN-gamma is of haematopoietic origin. For further understanding we compared animals under IFN-gamma neutralisation with control animals. Immunohistochemical staining revealed a strong expression of the enzyme iNOS in control animals whereas iNOS was merely detectable under IFN-gamma neutralisation. With the help of iNOS deficient animals we could show, that NO is indeed essential as downstream effector molecule. Further characterisation via FACS analysis showed that iNOS production was only observed among CD11b+ cells, roughly half of the iNOS expressing cells were also positive for GR-1. iNOS expression could only be detected at the site of inflammation. Functional in vitro characterisation of these cells after ex vivo isolation revealed that they suppressed the proliferation of CD4+ T cells. They can therefore be regarded as myeloid suppressor cells. To study whether the observed mechanisms of regulation are of any general importance, we looked at a DTH response mediated by CD8+ effector T cells and indeed we could observe a more severe inflammation under IFN-gamma neutralisation, although the effect was not quite as strong as in the Th1 mediated inflammation. In summary we could show, that the cytokine IFN-gamma is important in the limitation of the effector phase of an ongoing immune response.