Multidrug Resistenz (MDR), die simultane Resistenz gegenüber strukturell und funktionell nicht-verwandten Zytostatika, stellt eine wesentliche Ursache für unzureichende Behandlungserfolge maligner Erkrankungen dar. Die inherente Resistenz bzw. Resistenzentwicklung gegenüber chemotherapeutischen Substanzen ist vor allem die Folge der Präsens und Regulation unterschiedlicher Transportproteine wie MDR1, MRP1, BCRP und MVP. In der Konsequenz kommt es zu alteriertem Influx und/oder Efflux von Zytostatika, verminderter Akkumulation und Effektivität von Chemotherapeutika. Sowohl Zytostatika als auch Zytokine zeigten modulierende Einflüsse auf die Expression der MDR-Gene MDR1, MRP1 und MVP (Kapitel 2-9). Zytostatika wie Adriamycin resultierten vorwiegend in induzierten MDR1-Expressionen, dem hauptsächlichen Interventionstarget zur Überwindung des klassischen MDR-Phänotyps. Zytokine wie TNFa führten, extern appliziert als auch durch Gentransfer, zur Chemosensitivierung der Tumorzellen, verbunden mit Down-Regulationen von MDR1 und MVP. Die Zytokin-vermittelte Überwindung des klassischen MDR-Phänotyps weist auf die Inklusion definierter Zytokine in etablierte Chemotherapieprotokolle hin, wie bereits angewendet bei der hyperthermen isolierten Extremitätenperfusion mit TNFa (Kapitel 13). Die Verwendung BCRP-spezifischer Ribozyme demonstrierte deren Potential zur Überwindung des BCRP-bedingten, atypischen MDR-Phänotyps. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Expression der ABC-Transporter als auch des MVP durch Hyperthermie temperatur- und zeitabhängig induzierbar ist (Kapitel 10-13). Diese Hyperthermie-Induktion wird für MDR1 und MRP1 über den Transkriptionsfaktor YB-1 zeitnah zum Stressereignis vermittelt. In der klinischen Situation konnte anhand verfügbarer Biopsien von Kolonkarzinomen, Sarkomen und Melanomen, jeweils mittels Hyperthermie im Kontext multimodaler Behandlungsregime behandelt, kein direktes, generelles Risiko einer MDR1- oder MRP1-vermittelten, Hyperthermie-bedingten Induktion/Verstärkung einer MDR beobachtet werden. Die Analyse der Promotoren MDR-assoziierter Gene wie MDR1 und MVP zeigte deren Induzierbarkeit durch unterschiedliche Therapie-relevante Faktoren wie Zytostatika und Hyperthermie in verschiedenen in vitro- und in vivo-Modellen (Kapitel 10,14-20). Spezifische Sequenzmotive sind für die Stressfaktor-induzierte Bindung von Transkriptionsfaktoren wie YB-1 verantwortlich; Mutationen in diesen Sequenzbereichen modulierten die Induzierbarkeit (Kapitel 14,15,20). Der Einsatz Therapie-induzierbarer Promotoren unterschiedlicher MDR-Gene wie MDR1 (Kapitel 14-18) und MVP (Kapitel 19,20) erlaubt somit generell die Anpassung an etablierte Behandlungsprotokolle verschiedener Tumorentitäten. In fortführenden Arbeiten bleibt die erfolgreiche Anwendung von Therapie-induzierbaren MDR-Promotorsequenzen zur Expression therapeutisch relevanter Gene im Kontext einer Gentherapie maligner Erkrankungen zu prüfen. / Multidrug resistance, the simultaneous resistance towards structurally and functionally unrelated cytostatic drugs, still represents a major cause of cancer treatment failure. Inherent or acquired resistance against a wide variety of chemotherapeutic drugs depends mainly on the presence and regulation of different transporter proteins, such as MDR1, MRP1, BCRP, and MVP. Thus, decreased uptake and/or increased efflux, lowered net accumulation, and in consequence, less efficiency of anti-cancer drugs is the clinical hurdle to struggle with. Cytostatics as well as cytokines showed modulating effects on the expression of the MDR-associated genes MDR1, MRP1, and MVP (chapter 2-9). Cytostatics such as adriamycin resulted mainly in increased expression of the MDR1 gene, the most prominent intervention target for the reversal of the classical MDR phenotype. Cytokines such as TNFa, externally applied or by gene transfer, led to chemosensitization of tumor cells, and to down regulation of MDR1 and MVP. This cytokine-mediated reversal of the classical MDR phenoype refer to the inclusion of defined cytokines into established chemotherapy protocols, as already realized by the hyperthermic isolated limb perfusion with TNFa (chapter 13). The employment of BCRP-specific ribozymes demonstrated their potential to reverse the BCRP-mediated atypical MDR phenotype. Furthermore it was shown, that the expression of the ABC transporters as well as of MVP was inducible by hyperthermia in a temperature and time-dependet manner (chapter 10-13). This hyperthermia-caused induction of MDR1 and MRP1 is mediated by the transcription factor YB-1 timely close to the stress event. However, no direct, general risk of a MDR1- or MRP1-mediated hyperthermia-caused induction/enhancement of the MDR phenotype was observed in clinical settings, analyzed by using biopsies available from colon carcinomas, sarcomas, and melanomas, which were treated with hyperthermia in the context of multimodal regimes. The analyses of promoters of the MDR-associated genes MDR1 and MVP revealed their inducibility by different therapy-related factors such as cytostatics and hyperthermia in several in vitro- and in vivo models (chapter 10,14-20). Specific sequence motifs were found to be responsible for the stress-induced binding of transcription factors; mutations within these sequence regions modulated their inducibility (chapter 14,15,20). Thus, the employment of therapy-inducible promoters of different MDR genes such as MDR1 (chapter 14-18) and MVP (chapter 19,20) allows the improvement of established treatment protocols for different tumor localizations. Based on this, the succesful use of therapy-inducible MDR promoter sequences for the expression of therapeutically relevant genes in the context of a gene therapy of cancer represents an ambitious goal for the future.

Die Hypertrophe Kardiomyopathie (Hypertrophic Cardiomyopathy, HCM) ist eine Erkrankung des Herzens, die durch eine Hypertrophie des Myokards und einem erhöhten Risiko für den plöztlichen Herztod charakteriziert ist. Die Erkrankung wird autosomal-dominant vererbt. Neun HCM-assozierte Genen wurden bisher beschrieben, die alle für Sarkomer-Proteine kodierend. Mutationen in den Genen für die essentielle (ELC) und regulatorische (RLC) leichte Myosin-Kette sind für ca. 1% bzw. 1-7% aller HCM-Fälle verantwortlich. Bisher gibt es nur wenige Informationen zum Krankheitsverlauf und zur Prognose bei HCM-Formen, die durch Mutationen in diesen Genen verursacht werden. Ziel dieser Studie war daher, das ELC- bzw. RLC-Gen in einem Kollektiv klinisch gut charakterisierter HCM-Patienten hinsichtlich möglicher krankheitsverursachender Mutationen zu analysieren. Darüber hinaus sollte untersucht werden, ob die hier identifizierten Mutationen mit einem malignen bzw. benignen Phönotyp assoziiert sind. Methoden: 71 unverwandete Patienten mit primärer HCM wurden mittels körperlicher Untersuchung, EKG und Echokardiographie evaluiert. Die aus Blutlymphozyten extrahierte DNA wurde mittels exonspezifischer PCR-Amplifikation und Single-strand-conformation-polymorphism (SSCP) Analyse auf Mutationen in den 6 Exons des ELC- und 7 Exons des RLC-Gens untersucht. Proben mit auffälligen Bandenmustern wurden direkt sequenziert. Ergebnisse: Die systematische Analyse ergab zwei krankheitsassoziierte Mutationen im RLC-Gen, die zu einem Aminosäurenaustausch führen. Im ELC-Gen wurden keine Mutationen gefunden. Die erste Mutation im RLC-Gen ist ein G zu A-Basenaustausch an Position c.64 im Exon 2, der zu einem Austausch von Glutamat durch Lysin im Codon 22 führt. Die zweite Variante verursacht eine Argininsubstitution durch Glutamin im Codon 58 aufgrund eines Basenpaaraustausches an Position c.173 im Exon 4 (G zu A). Beide Mutationen betreffen hoch-konservierte Aminosäuren in der amino-terminalen Domöne des RLC in der Nähe von möglichen Phosphorylierungs- bzw. Kalcium-Bindungsstellen. Zusätzlich wird die elektrische Ladung dieser Proteinregion durch den Aminosäurenaustausch verändert. Die Glu22Lys-Mutationen konnte in sieben Individuen der Familie K identifiziert werden und ist mit einer geringen septalen Hypertrophie, einer späten klinischen Manifestation sowie einem benignen Verlauf und einer guten Prognose assoziiert. Die Arg58Gln-Mutation ist ebenfalls mit einer moderaten Septumhypertrophie aber mit einem frühen Krankheitsbeginn und einem vorzeitigen Auftreten eines plätzlichen Herztodes in der Familie B assoziiert. Zusätzlich wurden mehrere Abweichungen von der Referenz-Sequenz, eine stumme Mutation sowie zwei "Single Nucleotide Polymorphisms" (SNPs) während des Screenings in beiden Genen identifiziert. Die SNPs verursachen keinen Aminosäureaustausch und beeinflussen nicht den Splei§vorgang, soweit dies durch ihre Lokalisation vorhersagbar ist. Schlussfolgerung: Zwei missense Mutationen konnten in der regulatorischen leichten Myosinkette identifiziert und sowohl mit einem benignen als auch einem malignen HCM-Phänotyp assoziiert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Genotypisierung wertvolle Informationen für die Risikostratifizierung, die genetische Beratung sowie für Therapiestrategien in der Hypertrophe Kardiomyopathie liefern kann. / Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is a heart disorder characterized by unexplained ventricular myocardial hypertrophy and a high risk of sudden cardiac death. The disease is inherited as an autosomal-dominant trait. Nine disease-causing genes have been described all encoding for sarcomeric proteins. Mutations in the ventricular myosin essential (ELC) and regulatory (RLC) light chain genes are responsible approximately for 1% and 1 - 7% of all HCM cases, respectively. Limited data are available on the disease course and prognosis in HCM caused by mutations in these genes. Therefore, the present study was aimed to analyse the ELC and RLC genes for disease-causing mutations in a group of clinically well-characterized HCM patients. Further purpose was to assess whether the detected mutations are associated with malignant or benign phenotype in the respective families. Methods: 71 unrelated patients with HCM and 14 family members were evaluated using physical examination, ECG and echocardiography. DNA was extracted from blood lymphocytes. Screening of the 6 exons of the ELC gene and the 7 exons of the RLC gene was done by using PCR and single strand conformation polymorphism analysis (SSCP). Samples with aberrant band patterns were directly sequenced. Results: Systematic analysis revealed no mutation in the ELC gene but two disease-associated mutations leading to an amino acid exchange in the RLC gene. The first mutation was found in exon 2 of the RLC gene: a G>A nucleotide substitution at position c.64 caused a replacement of glutamic acid by lysine at codon 22. The second mutation was in exon 4 of the RLC gene: a G>A substitution at nucleotide c.173 led to a change of arginine to glutamine at codon 58. Both mutations affected highly conserved amino acids and were located in the amino terminal half of the RLC close to the putative phosphorylation and calcium-binding sites. They also changed overall electrical charge of this protein region. The Glu22Lys mutation was identified in seven individuals of family K and was associated with moderate septal hypertrophy, a late onset of clinical manifestation, benign disease course, and good prognosis. The mutation Arg58Gln showed also moderate septal hypertrophy, but, in contrast, it was associated with an early onset of clinical manifestation and premature sudden cardiac death in family B. Additionally, a number of sequence differences from reference genomic sequences, one silent mutation, and two single nucleotide polymorphisms (SNPs) were identified while screening the ELC and RLC genes. Detected SNPs did not cause an amino acid exchange and did not affect splicing process proceeding from their localisation. Conclusions: Two missense mutations were identified in the ventricular myosin regulatory light chain gene and associated with either benign or malignant HCM phenotypes. These findings show that genotyping could give valuable information for risk stratification, genetic counselling, and treatment strategies in hypertrophic cardiomyopathy.

In dieser retrospektiven Studie wurden die Befunde von 88 Kindern ausgewertet, die wegen eines Vesikoureteralen Refluxes in der Klinik und Poliklinik für Kinderchirurgie der Charité zwischen 1980 und 1995 einem diagnostischen oder operativen Eingriff unterzogen wurden. Es wurden drei Gruppen hinsichtlich des Diagnosezeitpunktes des Refluxes (pränatal-im ersten Lebensjahr-nach dem ersten Lebensjahr) gegenübergestellt und jeweils der primäre und sekundäre Reflux getrennt betrachtet. Das Ziel der Studie war, einerseits statistisch signifikante Unterschiede zwischen Indikationen, Komplikationen und Ergebnissen der konservativen und operativen Therapie herauszufinden, andererseits sollte der Stellenwert der pränatalen Diagnostik erläutert werden. Hinsichtlich der Therapiemöglichkeiten zeigten sich keine signifikanten Unterschiede, d.h. retrospektiv konnten nur Tendenzen gezeigt werden. Vom Operationszeitpunkt her wurde ein primärer Reflux statistisch signifikant früher opereriert, als ein sekundärer Reflux. Generell sollte ein Reflux zunächst konservativ behandelt werden und bei Komplikationen eine Korrekturoperation erfolgen. Bei einem sekundären Reflux muß zuerst die Grunderkrankung behoben werden. In der pränatalen Diagnostik stellt die Hydronephrose kein spezifisches Korrelat des Reflux dar, der Reflux ist aber immer eine wichtige Differentialdiagnose. Hinsichtlich des postnatalen Vorgehens bei pränatalem Verdacht auf einen Reflux schließen wir uns der Konsensgruppe (Beetz 2002) an. / This retrospective study analysed the results off 88 children, who got a diagnostic procedure or were operated because of a vesicoureteral reflux in the Klinik und Poliklinik für Kinderchirurgie der Charité between 1980 and 1995. Regarding the time of diagnosis three groups were opposed (prenatal-in the first year of life-after the first year of life) and in each group the primary and secondary reflux was separately regarded. The aim of the study was on the one hand to find statistical differences concerning indications, complications and results comparing the conservative and operative therapy, on the other hand the importance of the prenatal diagnostic should be discussed. The results showed no significant differences regarding the possibilities of therapy, only tendencies were retrospective shown. Concerning the time of operation a primary reflux was operated significant earlier than a secondary reflux. In general a reflux should be treated first conservative and if complications appear the reflux should be operated. In the case of a secondary reflux first the underlying disease should be eliminated. The hydronephrosis in the prenatal ultrasound is not specific for the reflux, but the reflux is an important differential diagnosis. Regarding the postnatal procedure in the case of prenatal suspicion of a reflux, we agree with the study of Beetz 2002.

HINTERGRUND: Der selektive Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib inhibiert das Wachstum von bcr/abl positiven Zellen und stellt somit eine neue Therapieoption in der Behandlung der CML dar. Mittlerweile sind verschiedene Mutationen innerhalb der abl Sequenz beschrieben worden, die eine adäquate Imatinibbindung verhindern und zu einer zellulären Resistenz der CML Zellen führen. METHODE: Wir untersuchten 69 Patienten unter Behandlung mit Imatinib im Rahmen von laufenden klinischen Studien. Bei Studieneinschluss waren 37 Patienten in chronischer Phase, 21 Patienten in akzelerierter Phase und 11 Patienten in Blastenkrise. Mittels Real-time PCR wurden bcr/abl, WT1, MDR1 und AGP RNA Traskripte aus peripheren Leukozyten quantifiziert. AGP Proteinlevel wurden turbidimetrisch bestimmt. Ausserdem entwickelten wir eine neue, hochsensitive Technik zur Detektion bekannter Mutationen innerhalb der bcr/abl Domäne, indem wir das DNA-Clamping mittels Peptidnukleinsäure (PNA) mit einem Hybridisationssonden-Assay kombinierten. ERGEBNISSE: 1. Unsere Resultate bestätigen die hämatologische Effizienz von Imatinib in Übereinstimmung mit bereits publizierten Daten. 2. Eine komplette molekulare Remission konnte bei einem Patienten erzielt werden. 3. Wir konnten die bcr/abl Mutationen Thr315Ile, Glu255Lys and Tyr253His mit hoher Sensivität nachweisen. In einem Falle konnte die Gly255Lys Mutation vor der Behandlung detektiert werden. SCHLUSSFOLGERUNG: Bcr/abl und WT1 mRNA stellen in der Behandlung der CML Verlaufs- und Prognosemarker dar. Ein Zusammenhang zwischen MDR1 mRNA bzw. AGP mRNA und einer Resistenzentwicklung gegenüber Imatinib konnte nicht bestätigt werden. Durch den PNA-Clamping Assay konnten präexistente und sich entwickelnde bcr/abl Mutationen mit ungünstiger Prognose sicher und frühzeitig detektiert werden. Diese Tatsache ermöglicht eventuell eine Risikostratifizierung der CML und könnte als Model zum individuellen molekularen Monitoring und zur therapeutischen Strategie in anderen malignen Erkrankungen dienen. / BACKROUND: The selective tyrosine kinase inhibitor imatinib inhibits growth of bcr/abl positive cells and, thus, has become a novel therapeutic option for the treatment of Ph+ leukaemic patients. Various mutations within the abl sequence have been described that prevent adequate imatinib binding to bcr/abl resulting in cellular resistance of CML cells. METHODS: We investigated 69 CML patients under treatment with imatinib as part of an ongoing clinical trial. At recruitment 37 patients were in chronic phase, 21 patients in accelerated phase and 11 patients in blast crisis. Bcr/abl, WT1, MDR1and AGP RNA transcripts were quantified in peripheral leucocytes by real time PCR. AGP protein levels in plasma were measured by turbidimetric analysis. By combining peptide nucleic acid (PNA) based DNA clamping with a fluorescence hybridisation probe assay we developed a new and highly sensitive technique for the detection of known mutations within the bcr/abl kinase domain. RESULTS: 1. Our results demonstrate efficacy of imatinib on the haematological level in accordance with previously published data. 2. Complete molecular remission could be achieved in one patient. 3. We could effectively enhance the detection sensitivity (0,2%) for the BCR/ABL mutations Thr315Ile, Glu255Lys and Tyr253His. In one case the Gly255Lys mutation was detectable before treatment. CONCLUSION: Bcr/abl and WT1 mRNA are predictive marker in the treatment of CML. Our investigation could not confirm any relation between MDR1 mRNA nor AGP mRNA and a resistance to imatinib. By the PNA clamping assay pre-existing and evolving bcr/abl mutations associated with an unfavorable prognosis could be safely detected. This may facilitate risk stratification in CML and may serve as a model for individualized molecular monitoring and therapeutic strategies in other malignant diseases.

Ziel: Eine Optimierung medizinischer Bilddatenkompression. Evaluation des Einflusses unterschiedlicher Filter auf die Bildqualität waveletkomprimierter Röntgenbilder. Material und Methode: Im Rahmen von Vorstudien Optimierung der digitalen Bildbefundung anhand von ROC-Analysen. Auswahl geeigneter Kompressionsverfahren durch methodischen und ROC-gestützten Vergleich von Wavelet- mit fraktaler und JPEG-Kompression. Im Rahmen der Hauptstudie ROC-basierter und statistischer Vergleich von 4 unterschiedlichen Waveletfiltern verschiedener Komplexität mittels Prüfkörper für niedrigfrequente, gemischt-frequente und hochfrequente Bildinformation im schwellenwertnahen Bereich. Ergebnisse: Durch Einsatz unterschiedlicher Filter insbesondere im Niedrigfrequenzbereich entstehen signifikante Unterschiede des Rekonstruktionsergebnisses der Röntgenbilder. Trotz eines partiell uneinheitlichen Ergebnisses der visuellen Analyse fanden sich Vorteile für komplexere Filter. Für Details im hochfrequenten Bereich finden sich kaum signifikante Unterschiede. Schlußfolgerungen: Die durch die ROC-Analyse erhobenen Ergebnisse korrelierten in keiner Weise mit den gleichzeitig mathematisch erhobenen PSNR-Werten. Ursache hierfür ist, daß die Reduktion des Bildrauschens durch die Waveletkompression in der PSNR als negative Einflußgröße abgebildet wird. Bei medizinischen Röntgenbildern führt jedoch die Minimierung des Bildrauschens zu einer erhöhten Erkennbarkeit von Details insbesondere im schwellenwertnahen Bereich. Entsprechend verbesserten sich die Ergebnisse der schwellenwertnah durchgeführten ROC-Analyse ungleichsinnig zu den PSNR-Werten. Eine detaillierte Beschreibung des Einflusses der Komplexität von Waveletfiltern auf die Rekonstruktionsqualität medizinsicher Bilder findet sich im Diskussionsteil der Studie. / Aim: Optimisation of medical image compression. Evaluation of wavelet-filters for wavelet-compression. Materials and methods: Optimisation of image review applying ROC analysis. Analysis of medical image compression methods comparing wavelet-compression, fractal compression and JPEG by ROC analysis. Evaluation of 4 different wavelet-filters with different complexity applying phantoms for low frequency, high and mixed frequency information. Results: Application of filters with different complexity results in significant variations in the quality of image reconstruction after compression specifically in low frequency informatiin. Filters of high complexity proved to be advantagous despite of heterogenous results during visual analysis. For high frequency details, complexity of filters did not prove to be of significant impact on image quality after reconstruction. Conclusions: Results of ROC analysis did not correspond with PSNR values. Reduction of image noise in reconstructed images by wavelet-filtering is expressed negatively in PSNR values. In medical images, reduction of image noise enhances detection specifically of low contrast details. A detailed discussion of the influence of filter complexity on the reconstruction quality of medical images can be found in the discussion section of the study.

Myelin-assoziierte Epitope können Ziel destruktiver T-Zell Antworten während autoimmuner Erkrankungen wie der Multiplen Sklerose oder der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis werden. Dagegen reagieren selbstspezifische T-Zellen nach axonaler Degeneration nicht mit destruktiver Autoimmunität, obwohl die entsprechenden Epitope durch Myelin-phagozytierende Mikroglia präsentiert werden. Im Modell der entorhinalen Kortexläsion von Ratte und Mause zeigten wir, daß Autoimmunität nach solchen Läsionen durch die Expression des Todesliganden CD95L (FasL, Apo1L) auf Astrozyten verhindert wird, da hochaktivierte T-Zellen durch CD95L apoptotisch eliminiert werden. Myelin-phagozytierende Mikroglia reguliert MHC-II und B7-2 hoch, nicht aber das kostimulatorische B7-1 Moleküle, das mit Autoimmunität im Gehirn assoziiert ist. In Zonen retrograder Degeneration, wo Axone am Sproutingprozess beteiligt sind, zeigen Mikrogliazellen bis mindestens 90 Tage nach Läsion einen MHC-II und B7-2 positiven Immunphänotyp. Trotz Anwesenheit von CD4/B7-2 positiven a/b T-Zellen, behält Mikroglia ihre ramifizierte, ruhende Morphologie. Im Gegensatz zu autoimmunen Erkrankungen im Gehirn, erfolgt die Antigenpräsentation nach axonaler Läsion durch Mikroglia also nicht über das B7-1 Molekül. Dies kann der Grund für das Ausbleiben destruktiver Autoimmunität nach axonaler Schädigung sein. / Myelin-associated epitopes are targets of destructive T cell responses during autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). On the other hand, autoimmune T cells do not respond in a destructive way to mechanically-induced axonal degeneration despite myelin phagocytosis and presentation by local microglia. Using entorhinal cortex lesion, a model of axonal degeneration and reactive sprouting, we showed that autoimmunity in the brain is prevented by the expression of the death Ligand CD95L expressed on astrocytes lading to apoptosis of highly activated T cells. Moreover, myelin phagocytosing microglia upregulate MHC-II and B7-2, but lack expression of B7-1, a costimulatory molecule related to destructive immunity. In zones of retrograde axonal degeneration, where axons undergo secondary damage and later contribute to the sprouting response, MHC-II/B7-2 positive microglia are still found at 90 days post lesion. These cells exhibit the ramified morphology of resting microglia in the presence of CD4/B7-2 positive a/b T cells. Thus, in contrast to autoimmune brain disease, axonal degeneration is lacking a signal to induce B7-1 on microglial cells and the recruited T cells do not induce microglial activation. Differences in B7-phenotype of local antigen-presenting cells might provide an explanation for the important finding that autoimmune T cells elicit protective rather than destructive effects following axonal degeneration in the CNS.

Um die Qualität von Blutprodukten nach GMP zu überprüfen, wurden 72 Blutspenden bzw. ihre Folgeprodukte Erythrozytenkonzentrat in PAGGS-M, gefiltertes Erythrozytenkonzentrat und Fresh Frozen Plasma untersucht. Zusätzlich wurden an jeweils 12 Blutderivaten, die z.T. nicht zum Routineprogramm des Blutspendedienstes der Abteilung für Klinische Hämostaseologie und Transfusionsmedizin in Homburg/Saar gehören, Messungen durchgeführt, um ihre Qualität am Herstellungstag und am Ende der Haltbarkeit zu bestimmen. Als letztes wurden schließlich auch rheologische Parameter an 21 Erythrozytenkonzentraten in PAGGS-M und Fresh Frozen Plasma über einen Zeitraum von 28 Tagen gemessen und dokumentiert. Die Messung der Parameter, sowohl hämatologische als auch hämostaseologische und hämorheologische, erfolgte nach Standardmethoden. Die Ergebnisse waren insgesamt nicht zufriedenstellend. Ausschlaggebende Grundlage der Untersuchung sind die GMP-Richtlinien, die sich an den europäischen Normen orientieren. Zwar zeigten die Produkte, die routinemäßig hergestellt werden, wie auch die, die nur für diese Untersuchung produziert wurden, in vielen Bereichen ein Übereinstimmen mit den Vorschriften. Speziell auch die Qualität der gefilterten Erythrozytenkonzentrate, die besonders für Immunsupprimierte wegen ihres niedrigen Gehalts an Leukozyten verwendet werden, war in vielen Fällen gut. Die Ergebnisse der rheologischen Messungen glichen denen anderer Studien: so wurde ein Abfall der Fließfähigkeit über den Meßzeitraum hinweg beobachtet, was auf ein leichtes Schwellen der Zellen und eine Zunahme der Rigidität zurückzuführen ist. Fast durchgängig wich der Meßwert für den Hämatokrit der EK von der Richtlinie ab, am stärksten in PAGGS-M. Als Grund hierfür wurde eine Meßungenauigkeit des elektronischen Zellzählers bzw. die Methode der Bestimmung angesehen, so daß eine echte Abweichung als unwahrscheinlich anzusehen ist. Jedoch wurde die vorgeschriebene maximale Hämolyserate mit Ablauf der Haltbarkeit häufig überschritten, ebenso wie die gemessenen Leukozytenzahlen. Eine Vielzahl der Plasmen war durch Erythrozyten und Leukozyten kontaminiert. Durch häufige Waschvorgänge beim Auftauen von tiefgefrorenen EK wurde ein erhöhter Hb-Überstand erzeugt, das geforderte Mindestvolumen wurde dabei unterschritten. Daher ist festzuhalten, daß für jede untersuchte Produktgruppe Abweichungen festgestellt wurden, die in diesem Maße nicht tolerabel sind. Damit ist die Qualität der Produkte insgesamt als unzureichend zu bezeichnen. Der hier geführte Nachweis dieser Abweichungen ermöglichte die Einführung geänderter Herstellungsverfahren, so daß die heute erzeugten Produkte den Qualitätsvorschriften entsprechen. / 72 blood donations and their follow-up products (red blood cell concentrates resuspended in PAGGS-M, leukocyte-reduced red cell concentrates and fresh frozen plasma) were investigated to check their quality. Additionally, tests were performed on blood components of which most were not part of the routine program in the Department of Hemostaseology and Transfusion Medicine in Homburg/Saar. Finally, rheological parameters of red blood cell concentrates in PAGGS-M and of fresh frozen plasma were measured and documented over a period of 28 days. The results were not satisfying. Both the routine products and the blood components which were only produced for this study met the GMP-guidelines in many cases. Especially the quality of leukocyte-reduced red blood cell concentrates which are used especially for the transfusion for immunocompromised patients was good. The results of the rheological measurements were similar to those of other studies: decreasing flow over a period of time which was put down to slight swelling of the cells and to a rise in erythrocyte rigidity. The average hematokrit of red cell concentrates was generally too low especially in PAGGS-M. The reason for this was thought to be the electronic cell counter or rather the method of measuring. Hemolysis after storage and mean leucocyte count often exceeded the official dates. Many samples of the FFP were contaminated with red and white blood cells. Repeated washing after thawing of frozen red blood cell concentrates caused an excess of extracellular haemoglobin and low concentrate volumes. Any deviation from the guidelines is not tolerable. After this study adjustments in the production could be made so blood products now meet all of the requirements.

Plasmalemmale Kalzium- und Kaliumkanäle sind wichtige Regulatoren der kontraktilen Kraft glatter Gefäßmuskelzellen. Bei Untersuchungen an einer Vielzahl nicht humaner glatter Muskelzellen wurden verschiedene Kalzium- und Kaliumkanaltypen identifiziert. Allerdings ist über das Vorkommen, die biophysikalisch-pharmakologischen Eigenschaften, Regulation, Bedeutung und differentielle Expression von spannungsabhängigen Kalzium- und Kaliumkanälen in humanen arteriellen Gefäßmuskelzellen noch wenig bekannt. In dieser Arbeit wurden spannungsabhängige Kalzium- und Kaliumkanalströme in frisch-isolierten Gefäßmuskelzellen humaner Koronararterien analysiert. Die wichtigsten Ergebnisse waren: (1) Gefäßmuskelzellen humaner Koronararterien exprimieren funktionell aktive spannungsabhängige L-Typ-Kalziumkanäle. (2) Die hohe Permeationsrate von L-Typ-Kanälen in Lösungen mit physiologischer Ca2+-Konzentration wird durch die (1- Kanaluntereinheit bestimmt. (3) L-Typ-Kanäle der C-Klasse werden durch G-Proteine und Proteinkinase C moduliert. (4) Die Expression von L-Typ-Kanälen in Gefäßmuskelzellen wird differentiell reguliert. (4) Vier diverse Kaliumkanalströme kommen in Gefäßmuskelzellen humaner Koronararterien vor: IK(dr), IBK(Ca), IK(ATP) und STOCs. (5) Spontane transiente Auswärtsströme (STOCs) werden durch Ca2+-Sparks ausgelöst. (6) Ca2+-Sparks entstehen durch Öffnung von Ca2+-Freisetzungskanälen (Ryanodinrezeptoren) des sarkoplasmatischen Retikulums. (7) KATP-Kanäle fungieren als Zielstruktur für diverse endogene und synthetische Vasodilatatoren. (8) Ca2+-Sparks und STOCs bewerkstelligen die Feineinstellung des myogenen Gefäßtonus. (9) Der Ca2+-Spark/STOC-Signalweg stellt potenziell ein neuartiger Angriffsort für Hormone und Pharmaka dar, über den der Gefäßtonus von geringlumigen Arterien beeinflusst werden kann. Diese Ergebnisse tragen zum Verständnis der Bedeutung von plasmalemmalen Ionenkanälen bei chronischen Gefäßerkrankungen wie Atherosklerose und Hypertonie bei und eröffnen möglicherweise neue therapeutische Möglichkeiten. / Plasmalemmal calcium- and potassium channels represent important regulators of the contractile force of smooth muscle. Studies on various human smooth muscle cells have identified different calcium and potassium channels. However, relatively little is known on the presence, biophysical and pharmacological properties, regulation, function, and differential expression of voltage-dependent calcium and potassium channels in human coronary arteries. In this study, voltage-depedent calcium and potassium channels in human coronary arteries were studied. The main findings are: (1) Smooth muscle cells of human coronary arteries exhibit functional voltage-dependent, L-type calcium channels. (2) The high permeation rate of L-type channels in solutions with physiological calcium concentrations is determined by the (1 channel subunit. (3) C-class L-type channels are modulated by G proteins and protein kinase C. (4) The expression of L-type channels in vascular smooth muscle cells is differentially regulated. (4) Four diverse potassium channel currents are present in smooth muscle cells from human coronary arteries: IK(dr), IBK(Ca), IK(ATP) and STOCs. (5) Spontaneous transient outward currents (STOCs) are induced by Ca2+ sparks. (6) Ca2+ sparks are generated by the opening of calcium release channels (ryanodine receptors) in the sarcoplasmic reticulum. (7) KATP channels function as target for diverse endogeneous and synthetic vasodilators. (8) Ca2+ sparks and STOCs control the myogenic tone of arterial vessels. (9) The Ca2+ spark/STOC signaling pathway represents a novel target for hormones and drugs to regulate the diameter of small, resistance-sized arteries. These results contribute to a better understanding of the role of plasmalemmal ion channels in chronic vascular disease, such as atherosclerosis and hypertension. They may open novel therapeutic possibilites in the treatment of chronic vascular disease.

Die vorliegende Untersuchung sollte die kontraktile Funktion von humanen Vorhoftrabekeln und linksventrikulären Papillarmuskeln der Ratte während Hypoxie / Reoxygenierung als Hauptkomponenten von Ischämie / Reperfusion charakterisieren. Weitere Merkmale der Ischämie wurden durch erhöhte extrazelluläre K+-Konzentration und Azidose simuliert. Einblicke in die zelluläre Ca2+-Regulation ergaben sich aus Aktionspotential-(AP)-messungen, der SR- Ca2+-ATPase-Aktivität und Kraft-Intervall- Beziehungen. Die Rolle des Energiestoffwechsels und der endogenen antioxidativen Kapazität für die kontraktile Funktion von infarktbedingt hypertrophiertem Rattenmyokard während Hypoxie / Reoxygenierung ist durch Messung der Kreatinkinase-(CK)-Aktivität, ihrer Isoenzymverteilung und der Aktivitäten von Superoxiddismutase (SOD) und Glutathionperoxidase (GSH-Px) charakterisiert worden. Der Einsatz der Radikalfänger Histidin und Butylhydroxytoluen während Hypoxie und schneller Reoxygenierung an Rattenpapillarmuskeln sollte zur Protektion gegen den toxischen Effekt unterschiedlicher reaktiver Sauerstoffspezies dienen. In den durchgeführten Experimenten zeigte sich eine geringere Empfindlichkeit des humanen Vorhofmyokards gegenüber reduzierter O2-Versorgung und Reoxygenierung als im Rattenmyokard. Die während simulierter Ischämie im humanen Myokard auftretende Azidose hat einen günstigen Effekt auf die Wiederherstellung der isometrischen Kontraktionskraft nach Reoxygenierung, was jedoch mit einer gestörten Regulation der kontraktilen Funktion verbunden ist. Hypertrophiertes Myokard in der chronischen Phase nach Infarkt zeigt eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Hypoxie / Reoxygenierung, was auf adaptive Veränderungen im Energiestoffwechsel (erhöhte CK-MB und CK-BB Isoenzyme mit kleinerem Km-Wert für Kreatinphosphat), in der endogenen antioxidativen Kapazität (Erhöhung der Aktivitäten von SOD und GSH-Px um 40% bzw. 50%) und in der Regulation der kontraktilen Funktion (verminderte SR Ca2+-ATPase-Aktivität und Isomyosinverschiebung von V1 nach V3) zurückgeführt werden kann. Eine bessere Erholung der kontraktilen Funktion nach Reoxygenierung kann durch schnellen pO2- Wiederanstieg erreicht werden. Der Einsatz von Pharmaka mit verschiedenen Angriffspunkten im Radikalstoffwechsel und besonders deren Kombination während Hypoxie / Reoxygenierung ermöglicht zusätzlich eine verbesserte Kardioprotektion. / This study characterizes the contractile function of human atrial trabeculae and rat left ventricular papillary muscles during hypoxia / reoxygenation as the major components of ischemia / reperfusion. Further characteristics of ischemia were simulated by increased extracellular K+ concentration and acidosis during hypoxia. Insights into the cellular Ca2+ regulation were obtained from action potential recordings, from measurements of sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ transport, and from force-interval relations. We examined changes in SR calcium transport, creatine kinase (CK) system, the antioxidant enzymes glutathionperoxidase (GSH-Px) and superoxiddismutase (SOD) 6 wks. after infarction (MI) due to coronary ligation in rats. Phenotypic modifications vs. sham operation (SHAM) were related to the contractile response of hypertrophied papillary muscle to hypoxia / reoxygenation. The oxygen radical scavengers histidine and butylhydroxytoluene were applied during hypoxia and rapid reoxygenation to protect the myocardium against oxygen radical damage. Generally, human atrial trabeculae were less sensitive to reduced oxygen supply and reoxygenation when compared to rat papillary muscles. In human atrial trabeculae, isometric peak force development recovered better after simulated ischemia than after hypoxia but the regulation of contractile function was clearly disturbed. In rat papillary muscles, rapid reoxygenation caused a better recovery of contractile function after hypoxia. Application of the oxygen radical scavengers histidine, butylhydroxytoluene, and especially their combination during hypoxia / reoxygenation had additional cardioprotective effects. In MI vs. SHAM we observed under aerobic control conditions: decreses in isometric contraction and relaxation rate, a reduced Vmax-equivalent of sarcomeric shortening, a faster twitch-to- twitch decay of post-rest potentiation (PRC) which correlated closely to the decrease in SR Ca2+ uptake (-25%), a decrease in CK activity (-20%), reduced CK-MI and CK-MM, increased CK-MB and CK-BB, and enhanced activities of SOD (+40%) and GSH-Px (+50%). During hypoxia, an initial increase in peak force (PF) was followed by a slower PF decline in MI vs. SHAM. During reoxygenation, rates of contraction and relaxation recovered better in MI. In SHAM but not MI, twitch-to-twitch decay of PRC was accelerated after reoxygenation vs. aerobic control. The results suggest that adaptive changes in SR Ca2+ handling, CK isoenzymes, and antioxidant enzymes may contribute to higher resistance against reduced O2 supply and reoxygenation in hypertrophy due to MI.

Einleitung - Die ethische Rechtfertigung von Tierversuchen ist in unserer Gesellschaft höchst umstritten. Es ist in zunehmendem Maße Gegenstand von wissenschaftlichen Bemühungen, Alternativmethoden zu Tierversuchen zu etablieren. Fragestellung - In dieser Arbeitsgruppe wurde ein Modell zur isolierten Vollblutperfusion kältekonservierter Schlachthoforgane entwickelt. Es wurde anhand von Experimenten mit vasoaktiven Pharmaka der hämodynamische Funktionszustand der isoliert reperfundierten Schweineniere evaluiert. Methoden - 21 Nieren wurden nach einer warmen Ischämiephase von 16,5 min ± 4,3 min und einer Kältekonservierung von 6,6 h ± 1,9 h für insgesamt 150 Minuten normotherm reperfundiert, wovon eine Zeitspanne von 45 Minuten nach einer einstündigen Äquilibrierungsphase bei allen Nieren als interne Kontrolle diente. Daraufhin wurde ohne Pharmakongabe bei 6 Nieren (Gruppe 1, Kontrolle), unter Dauerinfusion von Nitroprussid-Natrium (NN) bei 8 Nieren (Gruppe 2) und von Noradrenalin (NA) bei 7 Nieren (Gruppe 3) für weitere 45 Minuten mit der Perfusion fortgefahren. In 15-minütigen Abständen wurden Blut- und Urinproben entnommen, und so wurden die renalen Funktionsparameter bestimmt sowie der Urin per Gelelektrophorese qualitativ auf Proteinurie untersucht. Anschließend an die Perfusion wurden die Nieren einer pathologisch-histologischen Begutachtung unterzogen, die mittels eines selbstentwickelten Scores quantifiziert wurde. Ergebnisse - Die beiden vasoaktiven Pharmaka entfalteten in der Interventionsphase die ihnen normalerweise zugeschriebenen Primärwirkungen: NA konstringierte die Hauptwiderstandsgefäße der Niere. Der renale Widerstand stieg von 0,61 auf 0,80 mmHg*min/(ml*100gNG). NN dilatierte die Hauptwiderstandsgefäße. Der Perfusionswiderstand sank von 0,74 auf 0,65 mmHg*min/(ml*100gNG). Umgekehrt verhielt sich der Perfusionsplasmafluß. Er sank unter NA von 104,74 auf 87,45 ml/(min*100gNG), während er unter NN von 107,20 auf 121,98 ml/(min*100gNG) stieg. Das Harnzeitvolumen stieg unter NA von 3,01 auf 3,33 ml/(min*100gNG) und sank unter NN von 1,62 auf 1,10 ml/(min*100gNG). Die Kreatininclearance sank sowohl unter NA (von 11,02 auf 9,48 ml/(min*100gNG)), als auch unter NN (von 10,89 auf 6,31 ml/(min*100gNG)). Während die Filtrationsfraktion unter NA konstant blieb, sank sie unter NN von 11,66 auf 6,30 %. Der Natriumtransport sank unter beiden Pharmaka, und zwar unter NA von 1,34 auf 1,14 mmol/(min*100gNG) und unter NN von 1,43 auf 0,84 mmol/(min*100gNG).Die Elektrophorese zeigte qualitativ eine selektive, im späteren Perfusionsverlauf unselektiver werdende Proteinurie bei allen untersuchten Nieren. In der Histologie zeigte sich in der Referenzgruppe tendentiell ein geringer ausgeprägter Ischämie-Reperfusionsschaden als nach Perfusion mit den verwendeten Pharmaka. Unter NN ließ sich hauptsächlich eine vermehrte Vakuolenbildung ausmachen, unter NA eine Dilatation der proximalen Tubuli. Diskussion - An den gemessenen Funktionsparametern konnte eine bevorzugte Wirkung beider Substanzen an den postglomerulären Arteriolen abgelesen werden, wie dies auch von der Literatur fast einhellig bestätigt wird. Die Ergebnisse der Elektrophorese lassen auf einen glomerulären Ischämieschaden schließen. Auch durch die histologische Begutachtung konnte diese Aussage des Ischämie-Reperfusionsschadens mit Ausdehnung auf eine tubuläre Komponente des Schadens bekräftigt werden. Sie steht in direktem Zusammenhang mit den Ergebnissen der Evaluation der Funktionsparameter. Die Ischämie bewirkte in erster Linie eine Erhöhung des renalen Gefäßwiderstandes. Die Verwendung des Kalziumantagonisten Verapamil sollte diesen Effekt einschränken und führte zu einer aufgehobenen Autoregulation. Die Experimente liefern als ein Modell des ischämisch induzierten Nierenversagens reproduzierbare und signifikante Ergebnisse. / Introduction - Ethical justification of vivisection is subject to controverse discussion. It is an issue of scientific effort to establish alternative methods. In this study a model of normothermic reperfusion was established including organs from slaughterhouse animals undergoing cold ischemia before reperfusion. Vasoactive agents were used to determine the state of function of the isolated reperfused pig kidney. Methods - 21 kidneys were reperfused for 150 minutes after a cold ischemia of 6.6 h ± 1.9 h and a warm ischemia of 16.5 min ± 4.3 min. Normothermic conditions were established. After a time span of an hour that served as an equilibration time, 45 minutes of untreated perfusion followed (internal control). After that, 6 kidneys remained untreated for another 45 minutes (group 1), 8 kidneys were continuously treated with sodium nitroprusside (SN) and 7 kidneys with norepinephrine (NE). In intervals of 15 minutes, blood and urine samples were taken. Thus parameters of renal function were determined and the urine was examined with gel electrophoresis. After the perfusion, all kidneys underwent a histopathological examination which was quantified using a self-established score. Results - Both pharmacological substances revealed their primary effects on renal vasculature. NE constricted the main renal resistance vessels. Renal resistance raised from 0.61 to 0.80 mmHg*min/(ml*100g renal weight). SN dilated the main resistance vessels. Perfusion resistance was reduced from 0.74 to 0.65 mmHg*min/(ml*100g renal weight). Perfusion plasma flow was reduced from 104.74 to 87.45 ml/(min*100g renal weight) under NE. It was raised from 107.20 to 121.98 ml/(min*100grenal weight) under SN. Under NE, urine time volume was raised from 3.01 to 3.33 ml/(min*100g renal weight) and it was reduced from 1.62 to 1.10 ml/(min*100g renal weight) under SN. Creatinine clearance was reduced rom 11.02 to 9.48 ml/(min*100g renal weight) under NE as well as under SN (from 10.89 to 6.31 ml/(min*100g renal weight)). Filtration fraction remained constant during infusion of NE, but it was reduced from 11.66 to 6.30 % under SN. Sodium transport was reduced under both substances. NE reduced it from 1.34 to 1.14 mmol/(min*100g renal weight) and from 1.43 to 0.84 mmol/(min*100g renal weight) under SN. Electrophoresis revealed qualitatively selective proteinuria in all examined kidneys, becoming more unselective in the course of the experiment. Histopathological findings revealed a smaller reperfusion injury in the control group than in both other groups (P>0.05). SN led to a vacuolisation in proximal tubular epithelium, NE was mainly responsible for a dilation of the proximal tubuli. Discussion - All measured function parameters revealed that the main effect of both substances was located in the postglomerular sphincter, which is also postulated by most of the literature. The results of urine electrophoresis lead to the assumption that there is a glomerular ischemic injury. Histological findings show also a tubular aspect of the reperfusion injury. It can be seen in direct context with the parameters of renal function. Ischemia was mainly responsible for a raise in renal vascular resistance. The calcium antagonist verapamil hydrochloride was used to diminish this effect and prevented autoregulation. Being defined as a model of ischemically induced renal failure, the experiments reveal reproducible and significant results.