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Rindermann, Jan
12 December 2012
(has links)
CDG-Ia ist eine genetisch bedingte
Stoffwechselstörung, die eine fehlerhafte Synthese von
Glykoproteinen zur Folge hat. Ursache sind Mutationen in der
genetischen Information für das Enzym Phosphomannomutase II (PMM2).
Inhalt dieser Arbeit ist die Generierung von zwei
Gene-Targeting-Vektoren (GTV) und den entsprechenden transgenen
embryonalen Maus-Stammzellen, welche jeweils die beiden häufigsten
Mutationen R141H und F119L (R137H und F115L im Maus-Genom) tragen.
Ausgangsprodukt ist ein Teil des murinen Pmm2-Gens, welcher in
einen pBlueScript-Vektor subkloniert wird. Mit gezielter
in-vitro-Mutagenese erfolgt das Einbringen der jeweiligen Mutation.
Als Selektionsmarker für beide GTV dient ein von zwei loxP-
Sequenzen flankiertes Neomycin-Resistenz-Gen (Neo). Die beiden
derart konstruierten GTV, welche jeweils die Mutation F115L bzw.
R137H beinhalten, werden als linearisiertes Konstrukt durch
Elektroporation in embryonale Mausstammzellen transferiert. Nach
Überprüfung der erfolgreichen homologen Rekombination wird je ein
Stammzell-Klon mit dem Genotyp F115L/WT und R137H/WT mit einem
Cre-Rekombinase-Gen transfiziert und die erfolgreiche Entfernung
des Neo-Gens überprüft. Mit diesen transgenen Stammzellen sollen
hypomorphe Mausmodelle für CDG-Ia generiert werden.
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