No description available.

In dieser Arbeit wurde die Chitinsynthase von Manduca sexta untersucht. Wie alle Insekten besitzt Manduca zwei Chitinsynthase-Gene, die als MsCHS-1 und MsCHS-2 bezeichnet werden. Mittels Northern-Blots konnte gezeigt werden, dass MsCHS-1 in den ektodermalen Zellen der Epidermis und der Tracheen exprimiert wird, während MsCHS-2 ausschließlich in den entodermalen Zellen des Mitteldarms exprimiert wird. Die Untersuchung der entwicklungsabhängigen Regulation der Chitinsynthase zeigte, dass MsCHS-1 nur in den Häutungsstadien exprimiert wird, einer Phase, bei der es zur Synthese der neuen Kutikula sowie zum Wachstum der Tracheen kommt. MsCHS-2 wird hingegen nur in den Zwischenhäutungsstadien exprimiert, einer Phase, die mit der Synthese der Chitin-haltigen peritrophischen Matrix einhergeht. Die Chitinsynthese des Mitteldarms wird vermutlich vornehmlich auf transkriptioneller Ebene reguliert, da während der larvalen Entwicklung die Mengen an Chitinsynthase-mRNA und -Protein, als auch die Aktivität der Chitinsynthase weitgehend korrelieren. Diskrepanzen zwischen den getesteten Parametern weisen auf zusätzliche, posttranslationale Regulationsmechanismen hin. Bei der Analyse der Trypsin-vermittelten Aktivierung der Manduca Mitteldarm-Chitinsynthese wurde deutlich, dass die Chitinsynthase nicht direkt durch Trypsin aktiviert wird, sondern dass ein löslicher Faktor prozessiert wird, der die Chitinsynthese stimuliert. Möglicherweise handelt es sich dabei um eine Chymotrysin-ähnliche Protease, wie andere Untersuchungen des Labors gezeigt haben. Die Etablierung eines Chitinsynthase-Aktivitäts-Assays sowie eines Reinigungsprotokolls ermöglichte es die Chitinsynthase aus dem Mitteldarm zu isolieren. Das Enzym konnte dabei als aktiver, trimerer Komplex gereinigt wurde. Dieser bestand aus fünf Proteinen, bei denen es sich um Fragmente der Chitinsynthase handelt, die wahrscheinlich durch proteolytische Prozessierung entstehen.

No description available.

No description available.

Peptides play pivotal roles in the regulation of various physiological processes. As neuropeptides or peptide hormones, they can bind to a range of receptors and thereby trigger the activation of different pathways, including insulin signaling. Another central functionality is facilitated by the action of the as regulins summarized transmembrane micropeptides. By binding to the sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase (SERCA), the regulins control Ca2+ homeostasis and muscle contraction. With the ongoing identification of novel modulatory micropeptides encoded by small open reading frames, the urgency to understand peptide-dependent regulatory networks rises. In this regard, especially impact and physiological relevance exerted by the enzymatic inactivation of the mature, biologically active peptides are far from completely understood. Neprilysins are metalloendopeptidases expressed throughout the animal kingdom. Based on their broad substrate specificity, the activity of neprilysins is crucial for the modulation of multiple peptide-dependent processes. This work aimed to identify new peptide substrates of the Drosophila melanogaster Neprilysin 4 (Nep4) and investigate the enzyme's physiological impact on the affected regulatory mechanisms. The first part of the work could identify 16 novel Nep4 peptide substrates that play essential roles in insulin signaling and the regulation of food intake: allatostatin A1-A4, adipokinetic hormone, corazonin, diuretic hormone 31, drosulfakinin 1 and 2, leucokinin, two short neuropeptide F peptides, and tachykinin 1-4. Thereby, aberrant expression of Nep4 leads to severe phenotypes linked to misregulation of insulin signaling, including reduced body size and weight, compromised food intake, and a characteristic shift in metabolomic composition. To further investigate and understand the complex functionality of the newly discovered Nep4 substrates, these peptides were tested for their ability to modulate the Drosophila heartbeat. A combined in vitro/in vivo screen revealed that the tested substrates exert chronotropic as well as inotropic effects, rendering the peptides as essential novel modulators of the heartbeat in Drosophila. The main project of this thesis was based on the initial finding that animals with Nep4 overexpression exhibit severe impairments of body wall muscle and heart functionality. By applying various experiments, including analyses of muscle and heart contraction, measurement of Ca2+ transients, pull-down studies, STED super-resolution microscopy, and mass spectrometry, Neprilysin 4 was identified as a novel modulator of SERCA activity. The molecular underpinning of this regulatory mechanism is the Nep4 mediated cleavage and inactivation of Drosophila SERCA-inhibitory Sarcolamban micropeptides SCLA and SCLB. Strikingly, cleavage experiments using the mammalian neprilysin and apparent colocalization of Neprilysin and SERCA in human heart tissue indicate evolutionary conservation of this mechanism. In summary, this work could identify a range of so far unknown Nep4 substrates and thereby point out the critical roles these class of enzymes plays in insulin signaling as well as the physiology of muscle and heart contraction.

No description available.

No description available.

No description available.

No description available.

No description available.