A melatonina (MEL) é uma indolamina lipofílica com conhecida ação antioxidante por via direta, através da formação e ação de seus metabólitos, dentre eles o N1-acetil- N2- formil-5 metoxikinuramina (AFMK), ou por ação via receptores de membrana (MT1 e MT2). No entanto, não se sabe a dose ideal para utilização e sua estabilidade nos diferentes sistemas de cultivo in vitro (CIV) embrionário bovino. Neste trabalho, para avaliar se há perda de MEL para o sistema de CIV, determinou-se pela técnica de HPLC a concentração real de melatonina no meio CIV em sistema com e sem óleo mineral após a adição de diferentes doses iniciais de MEL (DM; 0, 25, 50, 100ng/ml), e assim, avaliadas em diferentes tempos de incubação (0, 24, 72 e 144 horas). Em seguida, avaliou-se a ação e consumo da melatonina no CIV de embriões submetidos ao estresse oxidativo induzido. A CIV foi realizada em atmosfera controlada (38,5ºC, 5% O2, 5% CO2 e 90% N2). No quinto dia de cultivo embriões, que apresentavam no mínimo 16 células, foram divididos aleatoriamente entre os grupos 0, 25, 50 e 100ng/ml de MEL, e todos receberam indução com 5&micro;M de menadiona durante 24 horas. Após este período, o meio foi coletado para análise de HPLC (MEL e AFMK) e os embriões foram cultivados apenas com as DM até D8. Os blastocistos (D8) foram destinados para avaliação de espécies reativas de oxigênio (ROS), contagem de blastômeros (nBLAST), detecção de atividade de caspase-3 e -7 (CASP) através de microscopia confocal de epifluorescência, e expressão gênica (GRP78, SOD1 e HSP60). Foi também analisada a taxa de blastocisto (TXBL). Constatou-se que não há migração para o óleo, ou degradação da MEL ao longo do tempo de CIV. Na utilização da dose de 50ng/ml de MEL no cultivo de embriões com estresse oxidativo induzido há consumo da melatonina no meio e formação de AFMK (p&lt;0.05), maior TXBL (45,93 vs. 33,06%, p&lt;0.05) e nBLAST (143 vs. 93,1, p&lt;0.05), e redução de ROS (0,84 vs. 1,66 pixels, p&lt;0.05) e CASP (0,91 vs. 1,54 pixels, p&lt;0.05), se comparado ao grupo sem MEL. Contudo, não houve alteração na expressão gênica. Conclui-se que a melatonina mostrou comportamento estável nas condições de cultivo, podendo ser usada em sistemas com e sem óleo e possui ação antioxidante na dose de 50ng/ml, aumentando a produção e qualidade de embriões in vitro submetidos ao estresse oxidativo induzido. A melatonina (MEL) é uma indolamina lipofílica com conhecida ação antioxidante por via direta, através da formação e ação de seus metabólitos, dentre eles o N1-acetil- N2- formil-5 metoxikinuramina (AFMK), ou por ação via receptores de membrana (MT1 e MT2). No entanto, não se sabe a dose ideal para utilização e sua estabilidade nos diferentes sistemas de cultivo in vitro (CIV) embrionário bovino. Neste trabalho, para avaliar se há perda de MEL para o sistema de CIV, determinou-se pela técnica de HPLC a concentração real de melatonina no meio CIV em sistema com e sem óleo mineral após a adição de diferentes doses iniciais de MEL (DM; 0, 25, 50, 100ng/ml), e assim, avaliadas em diferentes tempos de incubação (0, 24, 72 e 144 horas). Em seguida, avaliou-se a ação e consumo da melatonina no CIV de embriões submetidos ao estresse oxidativo induzido. A CIV foi realizada em atmosfera controlada (38,5ºC, 5% O2, 5% CO2 e 90% N2). No quinto dia de cultivo embriões, que apresentavam no mínimo 16 células, foram divididos aleatoriamente entre os grupos 0, 25, 50 e 100ng/ml de MEL, e todos receberam indução com 5µM de menadiona durante 24 horas. Após este período, o meio foi coletado para análise de HPLC (MEL e AFMK) e os embriões foram cultivados apenas com as DM até D8. Os blastocistos (D8) foram destinados para avaliação de espécies reativas de oxigênio (ROS), contagem de blastômeros (nBLAST), detecção de atividade de caspase-3 e -7 (CASP) através de microscopia confocal de epifluorescência, e expressão gênica (GRP78, SOD1 e HSP60). Foi também analisada a taxa de blastocisto (TXBL). Constatou-se que não há migração para o óleo, ou degradação da MEL ao longo do tempo de CIV. Na utilização da dose de 50ng/ml de MEL no cultivo de embriões com estresse oxidativo induzido há consumo da melatonina no meio e formação de AFMK (p<0.05), maior TXBL (45,93 vs. 33,06%, p<0.05) e nBLAST (143 vs. 93,1, p<0.05), e redução de ROS (0,84 vs. 1,66 pixels, p<0.05) e CASP (0,91 vs. 1,54 pixels, p<0.05), se comparado ao grupo sem MEL. Contudo, não houve alteração na expressão gênica. Conclui-se que a melatonina mostrou comportamento estável nas condições de cultivo, podendo ser usada em sistemas com e sem óleo e possui ação antioxidante na dose de 50ng/ml, aumentando a produção e qualidade de embriões in vitro submetidos ao estresse oxidativo induzido / Melatonin (MEL) is a lipophilic indolamine with well-known antioxidant properties, by an scavenger action, producing its metabolites such as N1-acetil- N2- formil-5 metoxykinuramin (AFMK) or through a membrane receptor pathway (MT1 and MT2). Although, little is known about its stability and ideal dose on in vitro bovine embryo culture (IVC). In this work, to evaluate if there is any loss of MEL to the IVC systems, we determinate by HPLC, the real concentration of MEL in each system, with and without mineral oil, after the addition of different initial doses of MEL (DM; 0, 25, 50, 100ng/ml), and then analyzed at different incubation period (0, 24, 72 e 144 hours). Then, it was evaluated the action and consumption of MEL in IVC of embryos submitted to induced oxidative stress. The IVC was done in controlled atmosphere (38,5ºC, 5% O2, 5% CO2 e 90% N2). At Day 5, embryos over 16 cells were randomly divided in the treatments 0, 25, 50 and 100 ng/ml of MEL, and all received the induction with 5&microM of menadione during 24 hours. After incubation, the media was collected for HPLC analysis (MEL and AFMK) and embryos returned for culture with DM until Day8 (D8). The blastocysts (D8) were designated to Reactive oxygen species (ROS) evaluation, total number of cell (nBLAST), detection of caspase-3 and -7 activity (CASP) and gene expression (GRP78, HSP60 and SOD1). Blastocyst rate (TXBL) was also assessed. Result show that there is no loss of MEL to the oil, or degradation over incubation time. At 50ng/ml there was a consumption of melatonin in the media and formation of AFMK (p&lt;0.05), higher TXBL (45,93 vs. 33,06%, p&lt;0.05) and nBLAST (143 vs. 93,1, p&lt;0.05), lower ROS (0,84 vs. 1,66 pixels, p&lt;0.05) and CASP (0,91 vs. 1,54 pixels, p&lt;0.05), when in contrast with the group without MEL. However, there was no difference in gene expression. In conclusion, melatonin has a stable behavior in IVC system, which allows the use in system with and without oil. Also, at the dose of 50ng/ml has an antioxidant effect, improving quality and production of embryos culture in vitro at induced oxidative stress

A melatonina (MEL) é uma indolamina lipofílica com conhecida ação antioxidante por via direta, através da formação e ação de seus metabólitos, dentre eles o N1-acetil- N2- formil-5 metoxikinuramina (AFMK), ou por ação via receptores de membrana (MT1 e MT2). No entanto, não se sabe a dose ideal para utilização e sua estabilidade nos diferentes sistemas de cultivo in vitro (CIV) embrionário bovino. Neste trabalho, para avaliar se há perda de MEL para o sistema de CIV, determinou-se pela técnica de HPLC a concentração real de melatonina no meio CIV em sistema com e sem óleo mineral após a adição de diferentes doses iniciais de MEL (DM; 0, 25, 50, 100ng/ml), e assim, avaliadas em diferentes tempos de incubação (0, 24, 72 e 144 horas). Em seguida, avaliou-se a ação e consumo da melatonina no CIV de embriões submetidos ao estresse oxidativo induzido. A CIV foi realizada em atmosfera controlada (38,5ºC, 5% O2, 5% CO2 e 90% N2). No quinto dia de cultivo embriões, que apresentavam no mínimo 16 células, foram divididos aleatoriamente entre os grupos 0, 25, 50 e 100ng/ml de MEL, e todos receberam indução com 5&micro;M de menadiona durante 24 horas. Após este período, o meio foi coletado para análise de HPLC (MEL e AFMK) e os embriões foram cultivados apenas com as DM até D8. Os blastocistos (D8) foram destinados para avaliação de espécies reativas de oxigênio (ROS), contagem de blastômeros (nBLAST), detecção de atividade de caspase-3 e -7 (CASP) através de microscopia confocal de epifluorescência, e expressão gênica (GRP78, SOD1 e HSP60). Foi também analisada a taxa de blastocisto (TXBL). Constatou-se que não há migração para o óleo, ou degradação da MEL ao longo do tempo de CIV. Na utilização da dose de 50ng/ml de MEL no cultivo de embriões com estresse oxidativo induzido há consumo da melatonina no meio e formação de AFMK (p&lt;0.05), maior TXBL (45,93 vs. 33,06%, p&lt;0.05) e nBLAST (143 vs. 93,1, p&lt;0.05), e redução de ROS (0,84 vs. 1,66 pixels, p&lt;0.05) e CASP (0,91 vs. 1,54 pixels, p&lt;0.05), se comparado ao grupo sem MEL. Contudo, não houve alteração na expressão gênica. Conclui-se que a melatonina mostrou comportamento estável nas condições de cultivo, podendo ser usada em sistemas com e sem óleo e possui ação antioxidante na dose de 50ng/ml, aumentando a produção e qualidade de embriões in vitro submetidos ao estresse oxidativo induzido. A melatonina (MEL) é uma indolamina lipofílica com conhecida ação antioxidante por via direta, através da formação e ação de seus metabólitos, dentre eles o N1-acetil- N2- formil-5 metoxikinuramina (AFMK), ou por ação via receptores de membrana (MT1 e MT2). No entanto, não se sabe a dose ideal para utilização e sua estabilidade nos diferentes sistemas de cultivo in vitro (CIV) embrionário bovino. Neste trabalho, para avaliar se há perda de MEL para o sistema de CIV, determinou-se pela técnica de HPLC a concentração real de melatonina no meio CIV em sistema com e sem óleo mineral após a adição de diferentes doses iniciais de MEL (DM; 0, 25, 50, 100ng/ml), e assim, avaliadas em diferentes tempos de incubação (0, 24, 72 e 144 horas). Em seguida, avaliou-se a ação e consumo da melatonina no CIV de embriões submetidos ao estresse oxidativo induzido. A CIV foi realizada em atmosfera controlada (38,5ºC, 5% O2, 5% CO2 e 90% N2). No quinto dia de cultivo embriões, que apresentavam no mínimo 16 células, foram divididos aleatoriamente entre os grupos 0, 25, 50 e 100ng/ml de MEL, e todos receberam indução com 5µM de menadiona durante 24 horas. Após este período, o meio foi coletado para análise de HPLC (MEL e AFMK) e os embriões foram cultivados apenas com as DM até D8. Os blastocistos (D8) foram destinados para avaliação de espécies reativas de oxigênio (ROS), contagem de blastômeros (nBLAST), detecção de atividade de caspase-3 e -7 (CASP) através de microscopia confocal de epifluorescência, e expressão gênica (GRP78, SOD1 e HSP60). Foi também analisada a taxa de blastocisto (TXBL). Constatou-se que não há migração para o óleo, ou degradação da MEL ao longo do tempo de CIV. Na utilização da dose de 50ng/ml de MEL no cultivo de embriões com estresse oxidativo induzido há consumo da melatonina no meio e formação de AFMK (p<0.05), maior TXBL (45,93 vs. 33,06%, p<0.05) e nBLAST (143 vs. 93,1, p<0.05), e redução de ROS (0,84 vs. 1,66 pixels, p<0.05) e CASP (0,91 vs. 1,54 pixels, p<0.05), se comparado ao grupo sem MEL. Contudo, não houve alteração na expressão gênica. Conclui-se que a melatonina mostrou comportamento estável nas condições de cultivo, podendo ser usada em sistemas com e sem óleo e possui ação antioxidante na dose de 50ng/ml, aumentando a produção e qualidade de embriões in vitro submetidos ao estresse oxidativo induzido / Melatonin (MEL) is a lipophilic indolamine with well-known antioxidant properties, by an scavenger action, producing its metabolites such as N1-acetil- N2- formil-5 metoxykinuramin (AFMK) or through a membrane receptor pathway (MT1 and MT2). Although, little is known about its stability and ideal dose on in vitro bovine embryo culture (IVC). In this work, to evaluate if there is any loss of MEL to the IVC systems, we determinate by HPLC, the real concentration of MEL in each system, with and without mineral oil, after the addition of different initial doses of MEL (DM; 0, 25, 50, 100ng/ml), and then analyzed at different incubation period (0, 24, 72 e 144 hours). Then, it was evaluated the action and consumption of MEL in IVC of embryos submitted to induced oxidative stress. The IVC was done in controlled atmosphere (38,5ºC, 5% O2, 5% CO2 e 90% N2). At Day 5, embryos over 16 cells were randomly divided in the treatments 0, 25, 50 and 100 ng/ml of MEL, and all received the induction with 5&microM of menadione during 24 hours. After incubation, the media was collected for HPLC analysis (MEL and AFMK) and embryos returned for culture with DM until Day8 (D8). The blastocysts (D8) were designated to Reactive oxygen species (ROS) evaluation, total number of cell (nBLAST), detection of caspase-3 and -7 activity (CASP) and gene expression (GRP78, HSP60 and SOD1). Blastocyst rate (TXBL) was also assessed. Result show that there is no loss of MEL to the oil, or degradation over incubation time. At 50ng/ml there was a consumption of melatonin in the media and formation of AFMK (p&lt;0.05), higher TXBL (45,93 vs. 33,06%, p&lt;0.05) and nBLAST (143 vs. 93,1, p&lt;0.05), lower ROS (0,84 vs. 1,66 pixels, p&lt;0.05) and CASP (0,91 vs. 1,54 pixels, p&lt;0.05), when in contrast with the group without MEL. However, there was no difference in gene expression. In conclusion, melatonin has a stable behavior in IVC system, which allows the use in system with and without oil. Also, at the dose of 50ng/ml has an antioxidant effect, improving quality and production of embryos culture in vitro at induced oxidative stress

Em trabalho anterior verificamos que neutrófilos oxidam o hormônio melatonina a N1-acetil-N2-formil-5-metoxiquinuramina (AFMK), numa reação catalisada por mieloperoxidase e dependente de ânion superóxido. Neste trabalho acompanhamos a cinética de formação de AFMK e de seu produto de deformilação N1-acetil-5-metoxiquinuramina (AMK) quando neutrófilos foram ativados por diferentes estímulos. No sentido de obtermos informações sobre a relevância biológica destas reações, avaliamos o efeito de melatonina, AFMK e AMK sobre a formação de HOCl, sobre a liberação de citocinas pró-inflamatórias (TNF-&#945 e IL-8) e sobre a apoptose de neutrófilos. Uma forte inibição da liberação de HOCl foi observada em concentrações de melatonina igual ou superior a 0,05 mM. Embora menos efetivo, AMK também inibiu a formação de HOCl, enquanto AFMK não teve efeito. Adicionalmente mostramos que todos estes compostos inibiram a produção de TNF-&#945; e IL-8 por neutrófilos ativados e que AFMK foi o mais potente deles. Por exemplo, enquanto 1µM de AFMK inibiu eficientemente a liberação de TNF-&#945;, efeito similar foi obtido com melatonina apenas a partir de 1mM. O mesmo padrão de resposta foi observado na morte celular. AFMK e AMK (1mM), mas não melatonina, inibiram significativamente (aproximadamente 25%) a morte celular de neutrófilos. Nossos dados sugerem que neutrófilos são um alvo importante para AFMK e que a rota de metabolização da melatonina pode ser útil no controle da intensidade do processo inflamatório através do consumo de ERO, controle da liberação de citocinas e da sobrevida dos neutrófilos. Este conjunto de dados associados com o fato de que células mononucleares ativadas sintetizam melatonina e que o foco inflamatório é uma fonte de espécies reativas de oxigênio (ERO), levou-nos a verificar se a oxidação de melatonina ocorreria in vivo em situações inflamatórias. Para isso, analisamos amostras de liquor de pacientes com meningite viral. AFMK foi detectado em 16 das 20 amostras de liquor de pacientes com meningite viral e em nenhuma das 8 amostras controle. Das 16 amostras nas quais AFMK foi detectado, ele pôde ser quantificado em 6 (concentrações variando de 50 a 500 nM). Adicionalmente analisamos a correlação entre a presença de AFMK com alguns parâmetros inflamatórios como: celularidade, concentração de proteínas totais, TNF-&#945;, IL-8 e IL-1&#946;. Verificamos que todos estes parâmetros diminuíram nas amostras de liquor onde a concentração de AFMK era maior. Em conjunto, nossos resultados mostram que pelo menos parte dos efeitos antiinflamatórios descritos para melatonina pode ser originado da ação de seus produtos de oxidação. Nossos resultados contribuem significativamente para a compreensão do papel biológico da melatonina e seus produtos de oxidação na imunomodulação durante a inflamação. / In a previous study we described that activated neutrophils are able to oxidize the pineal hormone melatonin to N1-acetyl-N2-formyl-5-methoxykynuramine (AFMK) in a reaction dependent on myeloperoxidase and superoxide anion. Here we followed the formation of AFMK and its deformylated product N1-acetil-5-metoxiquinuramina (AMK) when neutrophils were activated by different stimuli. The biological significance of this reaction has been one of our research interests, therefore we study the effect of melatonin, AFMK and AMK on the HOCl formation, on the release of pro-inflammatory cytokines (TNF&#945;- and IL-8) and on the apoptosis process. Melatonin caused an almost complete inhibition of HOCl formation at concentrations up to 0.05 mM. Although less effective, AMK also inhibited HOCl formation, while AFMK had no effect. Additionally all the compounds assayed efficiently inhibited the production of TNF-&#945; and IL-8 by activated neutrophils. Moreover, the inhibitory activity of AFMK was stronger than that of melatonin and could be observed already at 1µM. A significant inhibition of neutrophil death (approximately 25 %) was triggered by AFMK and AMK (1 mM) but not by melatonin. Our data suggest that neutrophils are an important target for AFMK and that the route of melatonin metabolism may be useful in controlling the intensity of the inflammatory process by the consumption of reactive oxygen species, control of cytokine production and neutrophils life span. These findings, associated with the efficient synthesis of melatonin by activated-mononuclear cells and the presence of reactive oxygen species in the inflammatory focus, led us to verify if inflammation triggers the oxidation of melatonin in vivo. In this way we analyzed the cerebrospinal fluid (CSF) of patients with meningitis. AFMK was detected in 16 CSF from 20 samples of patients with viral meningitis and in none of 8 control samples. From the 16 samples in which AFMK was detected, it was quantified in 6 (at the concentration range of 50 500 nM). We also analyzed the correlation between the presences of AFMK with some inflammatory parameters like: cellularity and concentration of total proteins, TNF-&#945;, IL-8 and IL-1&#946;. We verify that all these parameters were decreased in samples in which AFMK was in higher concentrations. Our results show that, at least part of the antiinflammatory effects described for melatonin is indeed caused by its oxidation product. These findings add a new insight in the comprehension of the biological role of melatonin and its oxidation products in immunomodulation and during inflammation.

Em trabalho anterior verificamos que neutrófilos oxidam o hormônio melatonina a N1-acetil-N2-formil-5-metoxiquinuramina (AFMK), numa reação catalisada por mieloperoxidase e dependente de ânion superóxido. Neste trabalho acompanhamos a cinética de formação de AFMK e de seu produto de deformilação N1-acetil-5-metoxiquinuramina (AMK) quando neutrófilos foram ativados por diferentes estímulos. No sentido de obtermos informações sobre a relevância biológica destas reações, avaliamos o efeito de melatonina, AFMK e AMK sobre a formação de HOCl, sobre a liberação de citocinas pró-inflamatórias (TNF-&#945 e IL-8) e sobre a apoptose de neutrófilos. Uma forte inibição da liberação de HOCl foi observada em concentrações de melatonina igual ou superior a 0,05 mM. Embora menos efetivo, AMK também inibiu a formação de HOCl, enquanto AFMK não teve efeito. Adicionalmente mostramos que todos estes compostos inibiram a produção de TNF-&#945; e IL-8 por neutrófilos ativados e que AFMK foi o mais potente deles. Por exemplo, enquanto 1µM de AFMK inibiu eficientemente a liberação de TNF-&#945;, efeito similar foi obtido com melatonina apenas a partir de 1mM. O mesmo padrão de resposta foi observado na morte celular. AFMK e AMK (1mM), mas não melatonina, inibiram significativamente (aproximadamente 25%) a morte celular de neutrófilos. Nossos dados sugerem que neutrófilos são um alvo importante para AFMK e que a rota de metabolização da melatonina pode ser útil no controle da intensidade do processo inflamatório através do consumo de ERO, controle da liberação de citocinas e da sobrevida dos neutrófilos. Este conjunto de dados associados com o fato de que células mononucleares ativadas sintetizam melatonina e que o foco inflamatório é uma fonte de espécies reativas de oxigênio (ERO), levou-nos a verificar se a oxidação de melatonina ocorreria in vivo em situações inflamatórias. Para isso, analisamos amostras de liquor de pacientes com meningite viral. AFMK foi detectado em 16 das 20 amostras de liquor de pacientes com meningite viral e em nenhuma das 8 amostras controle. Das 16 amostras nas quais AFMK foi detectado, ele pôde ser quantificado em 6 (concentrações variando de 50 a 500 nM). Adicionalmente analisamos a correlação entre a presença de AFMK com alguns parâmetros inflamatórios como: celularidade, concentração de proteínas totais, TNF-&#945;, IL-8 e IL-1&#946;. Verificamos que todos estes parâmetros diminuíram nas amostras de liquor onde a concentração de AFMK era maior. Em conjunto, nossos resultados mostram que pelo menos parte dos efeitos antiinflamatórios descritos para melatonina pode ser originado da ação de seus produtos de oxidação. Nossos resultados contribuem significativamente para a compreensão do papel biológico da melatonina e seus produtos de oxidação na imunomodulação durante a inflamação. / In a previous study we described that activated neutrophils are able to oxidize the pineal hormone melatonin to N1-acetyl-N2-formyl-5-methoxykynuramine (AFMK) in a reaction dependent on myeloperoxidase and superoxide anion. Here we followed the formation of AFMK and its deformylated product N1-acetil-5-metoxiquinuramina (AMK) when neutrophils were activated by different stimuli. The biological significance of this reaction has been one of our research interests, therefore we study the effect of melatonin, AFMK and AMK on the HOCl formation, on the release of pro-inflammatory cytokines (TNF&#945;- and IL-8) and on the apoptosis process. Melatonin caused an almost complete inhibition of HOCl formation at concentrations up to 0.05 mM. Although less effective, AMK also inhibited HOCl formation, while AFMK had no effect. Additionally all the compounds assayed efficiently inhibited the production of TNF-&#945; and IL-8 by activated neutrophils. Moreover, the inhibitory activity of AFMK was stronger than that of melatonin and could be observed already at 1µM. A significant inhibition of neutrophil death (approximately 25 %) was triggered by AFMK and AMK (1 mM) but not by melatonin. Our data suggest that neutrophils are an important target for AFMK and that the route of melatonin metabolism may be useful in controlling the intensity of the inflammatory process by the consumption of reactive oxygen species, control of cytokine production and neutrophils life span. These findings, associated with the efficient synthesis of melatonin by activated-mononuclear cells and the presence of reactive oxygen species in the inflammatory focus, led us to verify if inflammation triggers the oxidation of melatonin in vivo. In this way we analyzed the cerebrospinal fluid (CSF) of patients with meningitis. AFMK was detected in 16 CSF from 20 samples of patients with viral meningitis and in none of 8 control samples. From the 16 samples in which AFMK was detected, it was quantified in 6 (at the concentration range of 50 500 nM). We also analyzed the correlation between the presences of AFMK with some inflammatory parameters like: cellularity and concentration of total proteins, TNF-&#945;, IL-8 and IL-1&#946;. We verify that all these parameters were decreased in samples in which AFMK was in higher concentrations. Our results show that, at least part of the antiinflammatory effects described for melatonin is indeed caused by its oxidation product. These findings add a new insight in the comprehension of the biological role of melatonin and its oxidation products in immunomodulation and during inflammation.

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Neste estudo avaliamos a ativação de macrófagos por: (i) neutrófilos e (ii) melatonina e seus produtos de oxidação N1-acetil-N2-formil-5-metoxiquinuramina (AFMK) e N1-acetil-5-metoxiquinuramina (AMK). Para estudarmos o papel dos neutrófilos na ativação de macrófagos utilizamos um modelo experimental onde camundongos C57BL/6 receberam anticorpo anti-granulócitos (i.v.) e após 36 horas receberam o mitógeno Con A. Verificamos que a depleção dos neutrófilos diminuiu a atividade do sistema NADPH oxidase e a capacidade fagocítica e microbicida dos macrófagos, entretanto não comprometeu a atividade das enzimas mieloperoxidase (MPO) e óxido nítrico sintase (iNOS). Para estudarmos o efeito de melatonina, AFMK e AMK sobre a ativação de macrófagos, avaliamos a produção de citocinas e a atividade microbicida destas células. Primeiramente, acompanhamos a liberação de citocinas em cultura de células mononucleares humanas. Melatonina, AFMK e AMK inibiram a liberação de TNF-&#945;, IL-12 e IFN-&#947;, mas não afetaram a liberação de IL-10. Num estudo posterior, macrófagos murino ativados com IFN-&#947; e infectados com T. cruzi foram incubados com melatonina, AFMK e AMK. Esta incubação resultou na diminuição de NO e aumento da replicação intracelular do parasita T. cruzi. Em conclusão, mostramos duas maneiras nas quais a ativação de macrófagos pode ser modulada. A primeira mostra que a interação de neutrófilos com macrófagos, no foco inflamatório parece ser um fator determinante para a atividade microbicida de macrófagos. E a segunda mostra que a interação da melatonina e seus produtos de oxidação com macrófagos contribui para a desativação do processo inflamatório, ampliando o conhecimento sobre o papel imunomodulador descrito para melatonina. / This study we evaluate macrophage activation by (i) neutrophils and (ii) melatonin and its oxidation products N1-acetyl-N2-formyl-5-methoxykynuramine (AFMK) and N1-acetyl-5-methoxykynuramine (AMK). Neutrophils role in macrophage activation was studied by an experimental model when mice C57BL/6 was injected with antigranulocyte antibody and 36 hours later they received the mitogenic ConA. We verified that neutrophil depletion decreased NADPH oxidase system activity, macrophage phagocytic and microbicide capacity. However, mieloperoxidase (MPO) and nitric oxide sintase (iNOS) activity was not compromised. Melatonin, AFMK and AMK effect in macrophage activation was evaluated by the cytokines production and microbicide activity of theses cells. We verified cytokines release in human mononuclear cells culture. Melatonin, AFMK and AMK inhibited TNF-&#945;, IL-12 and IFN-&#947; release, but IL-10 was not affected. After that, IFN-&#947;-activated murine macrophage was infected with T. cruzi and incubated with melatonin, AFMK and AMK. We verify NO decrease and that intracellular replication of the parasite T. cruzi increased. In conclusion, we showed that there is two modulation ways for macrophage activation. First, neutrophil -macrophage interaction in inflammatory site seems to be a determinant factor to macrophage microbicide activity. And second, macrophage interaction with melatonin hormone and its oxidation products leads to deactivation of the inflammatory process, raising knowledge of immunomodulatory role described to melatonin.

Neste estudo avaliamos a ativação de macrófagos por: (i) neutrófilos e (ii) melatonina e seus produtos de oxidação N1-acetil-N2-formil-5-metoxiquinuramina (AFMK) e N1-acetil-5-metoxiquinuramina (AMK). Para estudarmos o papel dos neutrófilos na ativação de macrófagos utilizamos um modelo experimental onde camundongos C57BL/6 receberam anticorpo anti-granulócitos (i.v.) e após 36 horas receberam o mitógeno Con A. Verificamos que a depleção dos neutrófilos diminuiu a atividade do sistema NADPH oxidase e a capacidade fagocítica e microbicida dos macrófagos, entretanto não comprometeu a atividade das enzimas mieloperoxidase (MPO) e óxido nítrico sintase (iNOS). Para estudarmos o efeito de melatonina, AFMK e AMK sobre a ativação de macrófagos, avaliamos a produção de citocinas e a atividade microbicida destas células. Primeiramente, acompanhamos a liberação de citocinas em cultura de células mononucleares humanas. Melatonina, AFMK e AMK inibiram a liberação de TNF-&#945;, IL-12 e IFN-&#947;, mas não afetaram a liberação de IL-10. Num estudo posterior, macrófagos murino ativados com IFN-&#947; e infectados com T. cruzi foram incubados com melatonina, AFMK e AMK. Esta incubação resultou na diminuição de NO e aumento da replicação intracelular do parasita T. cruzi. Em conclusão, mostramos duas maneiras nas quais a ativação de macrófagos pode ser modulada. A primeira mostra que a interação de neutrófilos com macrófagos, no foco inflamatório parece ser um fator determinante para a atividade microbicida de macrófagos. E a segunda mostra que a interação da melatonina e seus produtos de oxidação com macrófagos contribui para a desativação do processo inflamatório, ampliando o conhecimento sobre o papel imunomodulador descrito para melatonina. / This study we evaluate macrophage activation by (i) neutrophils and (ii) melatonin and its oxidation products N1-acetyl-N2-formyl-5-methoxykynuramine (AFMK) and N1-acetyl-5-methoxykynuramine (AMK). Neutrophils role in macrophage activation was studied by an experimental model when mice C57BL/6 was injected with antigranulocyte antibody and 36 hours later they received the mitogenic ConA. We verified that neutrophil depletion decreased NADPH oxidase system activity, macrophage phagocytic and microbicide capacity. However, mieloperoxidase (MPO) and nitric oxide sintase (iNOS) activity was not compromised. Melatonin, AFMK and AMK effect in macrophage activation was evaluated by the cytokines production and microbicide activity of theses cells. We verified cytokines release in human mononuclear cells culture. Melatonin, AFMK and AMK inhibited TNF-&#945;, IL-12 and IFN-&#947; release, but IL-10 was not affected. After that, IFN-&#947;-activated murine macrophage was infected with T. cruzi and incubated with melatonin, AFMK and AMK. We verify NO decrease and that intracellular replication of the parasite T. cruzi increased. In conclusion, we showed that there is two modulation ways for macrophage activation. First, neutrophil -macrophage interaction in inflammatory site seems to be a determinant factor to macrophage microbicide activity. And second, macrophage interaction with melatonin hormone and its oxidation products leads to deactivation of the inflammatory process, raising knowledge of immunomodulatory role described to melatonin.

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Agradecemos a compreensão. on 2017-11-30T18:53:31Z (GMT) / Submitted by TIALFI BERGAMIN DE CASTRO null (tialfi@gmail.com) on 2017-12-04T10:30:00Z No. of bitstreams: 1 Tese de Doutorado - Tialfi Bergamin de Castro.pdf: 17135465 bytes, checksum: 7e68f8d98ca4ec7d64be1f324b5e48d7 (MD5) / Submitted by TIALFI BERGAMIN DE CASTRO null (tialfi@gmail.com) on 2017-12-04T14:43:24Z No. of bitstreams: 1 Tese de Doutorado - Tialfi Bergamin de Castro.pdf: 17135465 bytes, checksum: 7e68f8d98ca4ec7d64be1f324b5e48d7 (MD5) / Approved for entry into archive by Elza Mitiko Sato null (elzasato@ibilce.unesp.br) on 2017-12-04T16:10:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 castro_tb_dr_sjrp.pdf: 17135465 bytes, checksum: 7e68f8d98ca4ec7d64be1f324b5e48d7 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-04T16:10:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 castro_tb_dr_sjrp.pdf: 17135465 bytes, checksum: 7e68f8d98ca4ec7d64be1f324b5e48d7 (MD5) Previous issue date: 2017-10-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O câncer de mama é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em mulheres e pesquisas têm sido focadas em identificar e validar biomarcadores que podem ser utilizados para confirmar o diagnóstico e determinar o prognóstico. Mudanças no ritmo circadiano podem contribuir para o desenvolvimento do câncer e sendo assim, a melatonina, um hormônio sintetizado pela glândula pineal à noite, na ausência de luz e seus metabolitos AFMK e AMK são sugeridos como potenciais biomarcadores. A melatonina pode atuar através do receptor MT1 regulando cinases e a expressão de genes específicos relacionados a proliferação, angiogênese, diferenciação celular e transporte de glicose. A expressão elevada de GLUT1 (Glucose Transporter-1) está associada ao prognóstico ruim no câncer. Os objetivos deste estudo foram comparar os níveis de melatonina, AFMK e AMK em mulheres recentemente diagnosticadas com câncer de mama, mulheres em quimioterapia adjuvante, enfermeiras que trabalham à noite em comparação com mulheres saudáveis e hábitos normais e avaliou-se a expressão do receptor MT1 e GLUT1 em tumores de mama e correlacionou com os subtipos moleculares, características patológicas e prognóstico. Foi coletado sangue de 53 mulheres com câncer de mama sendo 47 sem tratamento e 6 em quimioterapia adjuvante, 19 mulheres saudáveis sendo 1 O enfermeiras de turno noturno e 9 mulheres de hábitos normais. Os compostos foram quantificados por espectrometria de massas. Para a expressão de MT1 e GLUT1 foi realizada imunohistoquímica em 42 tumores de mama. Os resultados mostraram que mulheres com câncer de mama tiveram níveis menores de melatonina em comparação com mulheres de hábitos normais (p< 0.01 ), níveis ainda mais baixos em enfermeiras que trabalham no período noturno e em pacientes em quimioterapia adjuvante (p<0.01). Não houve diferença significativa nos níveis de AFMK e AMK entre os grupos (p>0.05). Além disso, pacientes com metástase apresentaram níveis elevados de melatonina e AFMK (p=0.02 e p=0.01, respectivamente) e altos níveis de AFMK estavam presentes quando linfonodos estavam acometidos (p=0.04), pacientes com tumores maiores que 20mm e que dormem com luz à noite (p=0.02 e p=0.007, respectivamente). Na análise imunohistoquímica, alta expressão do MT1 foi associada ao subtipo Luminal A, melhor prognóstico (p<0.05) e em tumores RE+ (p=0.002), enquanto que a expressão elevada de GLUT1 foi associada ao triplo­negativo, pior prognóstico (p<0.05), tumores maiores que 20mm 9p=0.004) e baixa em tumores RE+ (p=0.003). Em conclusão, nossos resultados mostram menores níveis de melatonina em pacientes com câncer de mama e apontam para o benefício da suplementação de melatonina como proteção para mulheres que trabalham à noite o que poderia reduzir o risco de desenvolvimento de câncer de mama. Os resultados da imunohistoquímica indicam que o MT1 e o GLUT1 podem ser utilizados como marcadores prognósticos e são potenciais alvos para o tratamento do câncer de mama. De acordo com os resultados pode­se concluir que a quebra do ciclo circadiano e, portanto, alterações nos níveis de melatonina e a expressão de MT1 e GLUT1 podem estar relacionadas com o risco de desenvolvimento e prognóstico do câncer de mama. / Breast cancer is the Jeading cause of cancer-related deaths in women and researches has been focused on identify and validate biomarkers that can be used to confirm the diagnosis and determine the prognosis. Changes in circadian rhythm may contribute to the development of cancer and thus melatonin, a hormone synthesized by the pineal gland at night, in the absence of light and its metabolites AFMK and AMK are suggested as potential biomarkers. Melatonin can act through the MT1 receptor by regulating kinases and the expression of specific genes related to proliferation, angiogenesis, ce/1 differentiation and glucose transport. High GLUT1 (Glucose Transporter-1) expression is associated with poor prognosis in cancer. The objectives of this study were to compare the leveis of melatonin, AFMK and AMK in women newly diagnosed with breast cancer, women on adjuvant chemotherapy, health nurses which work at night compared to healthy women and normal habits and the expression of MT1 receptor and GLUT1 in breast tumors and correlated with molecular subtypes, pathological features and prognosis. Blood from 53 women with breast cancer was colletcted, 47 of them without treatment and 6 in adjuvant chemotherapy, 19 healthy women, 1 O of them night shift nurses and 9 women of normal habits. Compounds were quantified by mass spectrometry. For the expression of MT1 and GLUT1, immunohistochemistry was performed in 42 breast tumors. The results showed that women with breast cancer had lower leveis of melatonin compared to normal women (p <0.01), even Jower leveis in nurses working at night and in adjuvant chemotherapy (p <0.01). There was no significant difference in AFMK and AMK leveis between groups (p> 0.05). ln addition, patients with metastasis had high leveis of melatonin and AFMK (p = 0.02 and p = 0.01, respectively) and high leveis of AFMK were present when lymph nades were affected (p = 0.04), patients with tumors larger than 20mm and who sleep with light at night (p = 0.02 and p = 0.007, respectively). ln the immunohistochemical analysis, high MT1 expression was associated with the Luminal A subtype, with a better prognosis (p <O.OS) and in ER + tumors (p = 0.002), whereas high GLUT1 expression was associated with tripie negative, worse prognosis (p<0.05), tumors greaterthan 20mm (p= 0.004) and low in ER + tumors (p = 0.003). ln conclusion, our results show Jower leveis of melatonin in breast cancer patients and point to the benefit of melatonin supplementation as protection for women who work at night which could reduce the risk of developing breast cancer. The results of immunohistochemistry indicate that MT1 and GLUT1 can be used as prognostic markers and are potential targets for the treatment of breast cancer. According to the results it can be concluded that the breakdown of the circadian cyc/e and, therefore, changes in melatonin leveis and the expression of MT1 and GLUT1 may be related to the risk of development and prognosis of breast cancer / FAPESP 2015/02935-2