La técnica de recubrimiento "capa por capa' (layer-by-layer, LbL) de superficies cargadas mediante materiales con carga opuesta es una herramienta versátil para la fabricación de ensamblados moleculares e interfaces funcionales. Sus principales ventajas sobre otras metodologías, como las monocapas autoensambladas (SAM) o la técnica de Langmuir-Blodgett, son una enorme flexibilidad combinada con su gran simplicidad y bajo coste. Con instrumentación sencilla y protocolos de preparación simples, es posible ensamblar estructuras complejas y estables con un control nanométrico sobre su composición y estructura.La metodología LbL es especialmente adecuada para la integración de biomoléculas (proteínas, lípidos, DNA) en multicapas funcionales, ya que el proceso de ensamblaje se lleva a cabo en condiciones suaves. Las propiedades biológicas de estos materiales se mantienen o incluso mejoran tras su incorporación en los films.Otra ventaja de esta técnica es que permite recubrir sustratos de virtualmente cualquier tamaño y forma con films funcionales de manera sencilla y controlada. De particular importancia ha sido la extensión del método a la modificación de partículas coloidales. Aparte de su interés desde un punto de vista fundamental y aplicado, los coloides constituyen herramientas de gran potencial para la creación de estructuras de diseño específico en los campos de la bio y nanotecnología. La funcionalización vía LbL de partículas coloidales permite integrar múltiples funcionalidades en las partículas, y proporciona además una ruta para la creación de estructuras tridimensionales que facilitan la transición desde la nano- a la micro- y macroescala.La técnica LbL ha supuesto también un gran avance en el desarrollo de sistemas electroquímicos. Diversos materiales electroactivos pueden ser incorporados en las multicapas, junto con otras especies que proporcionan funcionalidades adicionales. Además, parámetros críticos como el grosor del film, el transporte de materia y la conductividad pueden ajustarse con precisión en estas estructuras, incrementando la capacidad de control sobre el funcionamiento final del sistema. En particular, las estructuras LbL han encontrado numerosas aplicaciones en el área de los biosensores electroquímicos. Estos dispositivos proporcionan una interfaz entre funciones biológicas específicas y procesos de transducción electrónicos, y ofrecen una alternativa con gran potencial para el desarrollo de plataformas de biodetección integradas.En el presente trabajo, la técnica LbL se emplea para ensamblar films multicapa de enzimas y polielectrolitos en la superficie de micropartículas de sílice. Dos enzimas diferentes, glucosa oxidasa (GOx) y peroxidasa (HRP) son co-inmovilizadas junto con capas precursoras e intermedias de polielectrolitos. En los films resultantes se desarrolla una reacción enzimática secuencial, con la conversión inicial de glucosa en acido glucónico y peróxido de hidrógeno, catalizada por GOx, y la posterior reducción del peróxido de hidrógeno a agua por acción de la HRP. El enfoque secuencial LbL permite explorar la influencia de diferentes combinaciones de polielectrolitos sobre la inmovilización y funcionalidad de los enzimas. Técnicas como la citometría de flujo, microscopía confocal y electrónica y medidas espectrofotométricas proporcionan información sobre la interacción entre los diferentes componentes de las capas, así como sobre la estabilidad de las suspensiones coloidales y el comportamiento de los films en presencia de los diferentes sustratos enzimáticos.Una funcionalidad electroquímica se integra adicionalmente en estos films mediante la incorporación de un polímero redox a la estructura. De este modo, los eventos específicos que tienen lugar durante la catálisis enzimática se transducen en una señal eléctrica. Las partículas nanoestructuradas asumen un doble papel en el sistema final. Por una parte, actúan como sustratos de alta área superficial para la fabricación de microreactores enzimáticos. Además, los coloides se incorporan en un film de polímero redox y se inmovilizan en la superficie de electrodos de oro, actuando como elementos de construcción para la fabricación de un biosensor electroquímico que permite la detección de glucosa y peróxido de hidrógeno. / The layer-by-layer (LbL) coating of charged surfaces with oppositely charged materials is a powerful and versatile approach for the fabrication of functional molecular assemblies and interfaces. The key advantages of this technique over other methodologies such as self-assembled monolayers (SAM) or Langmuir-Blodgett (LB) are its unparalleled flexibility in combination with its simplicity and inexpensiveness. With simple instrumentation and easy preparation steps it is possible to assemble highly complex and stable architectures with nanoscale control over their composition and structure.The LbL approach is particularly suitable for the integration of biomolecules (proteins, lipids, DNA) into functional multilayers, since layer buildup is carried out under mild conditions. Many biologically relevant species can be incorporated into the films while maintaining or even improving their biological functions. A further advantage of this technique is that substrates of virtually any size and shape can be coated with functional films in a simple and controlled fashion. Of particular interest has been the extension of the LbL method to the modification of colloidal particles. Apart from their interest from a fundamental and applied point of view, colloids have emerged as powerful tools particularly suited to meet the challenge of creating tailored building blocks for the rapidly evolving fields of bio- and nanotechnology. The LbL functionalisation of colloidal particles provides a new route for the creation of composite architectures which allow the integration of nanoscale-defined materials into two- and three-dimensional structures. This ultimately opens the way not only to functional microsystems but also to the fabrication of macroscopic devices.One of the fields in which the LbL technique has represented a major advance is the development of electrochemical systems. Electrochemically active materials can be readily incorporated into multilayer films, together with other species which provide additional functionalities. Furthermore, critical parameters such as film thickness, mass transport and conductivity can be precisely tuned, allowing an increased control over the performance of the system. In particular, LbL assemblies have found many successful applications in the area of electrochemical biosensors. These devices provide an interface between biological functions and electronic signal-transduction processes, and offer great potential for the development of new miniaturised, low-cost, integrated biodetection platforms.In the present work, the LbL technique is employed to assemble multilayer films of enzymes and polyelectrolytes on the surface of silica microparticles. Two different enzymes, glucose oxidase (GOx) and horseradish peroxidase (HRP) are co-immobilised together with precursor and intermediate polyelectrolyte layers. In the resulting multilayer films a sequential reaction takes place, with the conversion of glucose to gluconic acid and hydrogen peroxide catalysed by GOx and the subsequent reduction of hydrogen peroxide to water catalysed by HRP. The sequential LbL approach allows to explore the influence of different polyelectrolyte combinations on the immobilisation and functionality of the enzymes. Flow cytometry, confocal and electron microscopy and spectrophotometric measurements provide information about the interaction between the different layer components, as well as the stability of the colloidal substrates and the behaviour of the multilayer films in the presence of the different enzyme substrates.An electrochemical functionality is further added to these films with the incorporation of an osmium-based redox polymer to the structure. In this way the specific chemical events taking place at the redox centers of the enzymes are transduced into an electrical signal. The nanostructured particles assume a multiple role in the final system. On one hand, they act as immobilisation substrates and high surface area carriers for the creation of enzymatic microreactors. Moreover, the LbL-coated colloids are embedded in a redox polymer film and immobilised on the surface of gold electrodes, acting as building blocks fo the fabrication of an electrochemical biosensor able to detect glucose and hydrogen peroxide.

En los últimos años, áreas como la salud y la industria han experimentado un gran desarrollo que lleva asociado la necesidad de implementar técnicas de control analítico cada vez más sensibles, rápidas, económicas y amigables con el medio ambiente. Por ello, numerosas investigaciones van encaminadas al desarrollo y puesta a punto de nuevos métodos de análisis alternativos a las costosas técnicas convencionales. El perfeccionamiento de estos métodos es uno de los principales retos de la Química analítica. Con las nuevas tecnologías se busca la automatización de sistemas para minimizar los errores derivados de la manipulación humana. En este sentido, el análisis en flujo constituye una excelente herramienta. Numerosas publicaciones avalan la aplicabilidad de estas técnicas en diferentes campos de estudio. En la última década ha sido desarrollado un nuevo método cromatográfico acoplando la técnica de análisis por inyección en flujo multijeringa a una columna monolítica. Asimismo, se han desarrollado sistemas en flujo acoplados a técnicas cromatográficas que permiten automatizar la determinación analítica con la menor intervención posible, mejorando la reproducibilidad del método. En esta tesis se presentan dos revisiones exhaustivas que abarcan las principales características y aplicaciones de la cromatografía multijeringa. Además se han desarrollado cuatro métodos analíticos para la determinación de vitaminas hidrosolubles e hidrocarburos policíclicos aromáticos. Estas metodologías han sido automatizadas mediante el uso del análisis por inyección en flujo multijeringa, obteniendo un importante ahorro de reactivos y la consecuente reducción de coste por análisis y de generación de residuos. La determinación de vitaminas se ha realizado por cromatografía multijeringa con detección UV. El método se ha aplicado a muestras reales y los resultados han sido comparados con los obtenidos por métodos de cromatografía convencional. Los policíclicos aromáticos, en muestras acuosas, han sido preconcentrados utilizando microextracción líquido- líquido dispersiva automatizada mediante un sistema de análisis por inyección en flujo multijeringa acoplado a cromatografía líquida y de gases. Los trabajos presentados en esta tesis son: 1 Contribución de análisis en flujo multiconmutado a cromatografía de alta resolución- baja presión. 2 Columnas monolíticas en el análisis en flujo: revisión de las técnicas SIC y MSC 3 Estudio de la composición de la fase móvil en cromatografía de inyección secuencial explotando el análisis en flujo multijeringa. 4 Cromatografía multijeringa (MSC): una herramienta efectiva y económica para la separación de las vitaminas solubles en agua. 5 Acoplamiento en línea de microextracción líquido- líquido dispersiva con inyección en flujo multijeringa y determinación por cromatografía de gases- espectrometría de masas en el análisis de hidrocarburos policíclicos aromáticos en agua. 6 Determinación de hidrocarburos policíclicos aromáticos usando microextracción líquido- líquido dispersiva previo a la cromatografía de alta resolución. / Due to the necessity of more sensitive and economic analytical methodologies, numerous investigations are developed in order to have automated methods that minimize errors of human manipulation. In this sense, the flow analysis is an excellent tool. In this thesis two comprehensive revisions are presented which cover key features and applications of multisyringe chromatography. Furthermore, four analytical methods for the determination of water soluble vitamins and polycyclic aromatic hydrocarbons have been developed. These methodologies have been automated by using multisyringe flow injection analysis to obtain significant savings in reagents and the consequent reduction in cost per analysis and generation of waste. The determination of vitamins has been developed by multisyringe chromatography with UV detection. The method was applied to real samples and the results were compared with those obtained by conventional chromatography methods. Polycyclic aromatic hydrocarbons have been preconcentrated using automated dispersive liquid-liquid microextraction system based on multisyringe injection analysis coupled to liquid and gas chromatography. The method was applied in aqueous samples. The works presented are listed below 1 Monolithic columns in flow analysis: a review of SIC and MSC techniques. 2 Contribution of multi-commuted flow analysis combined with monolithic columns to low-pressure, high-performance chromatography. 3 Modulation of mobile phase composition in flow-injection/ sequential injection chromatography exploiting multisyringe flow analysis. 4 Multisyringe Chromatography (MSC): An Effective and Low Cost Tool for Water-Soluble Vitamin Separation. 5 Online coupling lab on valve-dispersive liquid–liquid microextraction multisyringe flow injection with gas chromatography-mass spectrometry for the determination of sixteen priority PAHs in water. 6 Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons using dispersive liquid-liquid microextraction previous to high resolution chromatography.

L'objectiu general de la present tesi és el desenvolupament d'una plataforma per la detecció electroquímica de mutacions genètiques emprant un mètode d'alta especificitat basat en l'extensió de seqüències d'ADN, anomenades cebadors, disposades organitzadament sobre una superfície (APEX). Per tant el treball inclou la preparació de molècules que constitueixen marcadors electroquímics i que van ser posteriorment enllaçades de manera covalent a les quatre bases d'ADN i, a més, el desenvolupament d'una plataforma robusta resistent a altes temperatures, que són necessàries durant la incorporació per la via enzimàtica de les bases d'ADN marcades. En la primera part del present treball, es van sintetitzar dues classes de polioxometalats (anomenats Keggin and Dawson POM) i van ser covalentment enllaçats a seqüències d'ADN. A més, al costat d'altres marcadors electroquímics, van ser enllaçats covalentment a bases d'ADN individuals per a la detecció de mutacions genètiques. A la segona part es va desenvolupar un nou mètode per a la funcionalització de superfícies de carbó vitri basat en processos electroquímics consecutius d'hidrogenació i cloració. Aquestes superfícies modificades van ser utilitzades per a la immobilització de molècules tioladas, incloent ADN tiolado. Finalment, les molècules sintetitzades i les superfícies modificades van ser usades per a la detecció electroquímica de mutacions genètiques seguint la metodologia APEX. / El objetivo general de la presente tesis es el desarrollo de una plataforma para la detección electroquímica de mutaciones genéticas empleando un método de alta especificidad basado en la extensión de secuencias de ADN, llamadas cebadores, dispuestas organizadamente sobre una superficie (APEX). Por tanto el trabajo incluye la preparación de moléculas que constituyen marcadores electroquímicos y que fueron posteriormente enlazadas de forma covalente a las cuatro bases de ADN y, además, el desarrollo de una plataforma robusta resistente a altas temperaturas, que son necesarias durante la incorporación por la via enzimática de las bases de ADN marcadas. En la primera parte del presente trabajo, se sintetizaron dos clases de polioxometalatos (llamados Keggin and Dawson POM) y fueron covalentemente enlazados a secuencias de ADN. Además, junto a otros marcadores electroquímicos, fueron enlazados covalentemente a bases de ADN individuales para la detección de mutaciones genéticas. En la segunda parte se desarrolló un nuevo método para la funcionalización de superficies de carbón vítreo basado en procesos electroquímicos consecutivos de hidrogenación y cloración. Estas superficies modificadas fueron utilizadas para la inmovilización de moléculas tioladas, incluyendo ADN tiolado. Finalmente, las moléculas sintetizadas y las superficies modificadas fueron usadas para la detección electroquímica de mutaciones genéticas siguiendo la metodología APEX. / This PhD work was started with the intention of developing platform for electrochemical detection of mutations using highly specific method called arrayed primer extension. So the work involves the preparation of labels to be linked with the four different DNA bases and the preparation of robust platform which can withstand the high temperature during enzymatic incorporation of the labelled DNA bases. The first part of this work deals of the preparation of compounds called polyoxometalates (Keggin and Dawson types) and their covalent attachment to DNA sequence and also, to DNA single bases along with other organic redox labels for mutation detection. In the second part while trying to achieve a thermally stable surface tethered DNA probes, a new method of surface functionalisation based on electrochemical hydrogenation followed by electrochemical chlorination of glassy carbon was developed. The so prepared surfaces were used for immobilisation of thiolated molecules including thiolated DNA. Finally the synthesised molecules and modified surfaces were used for electrochemical detection of genetic mutation following the APEX protocol.

Els models farmacocinètics (PBPK) són representacions matemàtiques del cos humà, que tenen com a objectiu calcular la concentració de compostos químics en els teixits humans. Els models PBPK poden millorar el càlcul del risc per a la salut humana, però de moment no han estat escassament utilitzats. Entre els compostos ambientals més perillosos per a la salut humana destaquen les dibenzo-p-dioxines policlorades i dibenzofurans policlorats (PCDD/Fs) i els compostos perfluorats (PFASs). L’objectiu de la present tesis es el desenvolupament de un model PBPK per calcular la concentració de PCDD/Fs i PFASs en teixits humans. Prèviament al desenvolupament del model PBPK, es va desenvolupar un índex de risc utilitzant mapes auto-organitzats (SOM), per calcular els compostos ambientals més perillosos per a la salut humana. Entre els compostos més perillosos es van trobar els PFASs. Després es va desenvolupar el model PBPK per predir les concentracions de PCDD/Fs en sang i en teixit adipós. Els resultats finals van ser altament coincidents amb els resultats experimentals trobats a l’àrea de Tarragona (NE d’Espanya), y per això es va considerar el model com a validat. A continuació el model es va adaptar per calcular les concentracions de PFASs. Per això, primer es va adaptar el model per PFOS i PFOA, que són els compostos perfluorats més estudiats en la literatura, i després es va estendre el model a 9 PFASs més. Finalment, es va fer un anàlisis de la incertesa del model PBPK, i la incertesa paramètrica es va estudiar visual i estadísticament. / Los modelos farmacocinéticos (PBPK) son representaciones matemáticas del cuerpo humano, que tienen como objetivo calcular la concentración de químicos en los tejidos humanos. Los modelos PBPK pueden mejorar el cálculo de riesgo para la salud humana, pero hasta el momento no han sido muy usados. Entre los compuestos ambientales más peligrosos para la salud humana destacan las dibenzo-p-dioxinas policloradas y los dibenzofuranos policlorados (PCDD/Fs) y los compuestos perfluorados (PFASs). El objetivo de la presente tesis es el desarrollo un modelo PBPK para calcular la concentración de PCDD/Fs y PFASs en tejidos humanos. Previo al desarrollo del modelo PBPK se desarrolló un índice de riesgo usando mapas auto-organizados (SOM), para calcular los compuestos ambientales más peligrosos para la salud humana. Los PFASs se encontraron entre los compuestos de más riesgo. Después se desarrolló el modelo PBPK para predecir las concentraciones de PCDD/Fs en sangre y en tejido adiposo. Los resultados finales fueron muy coincidentes con los resultados experimentales encontrados en el área de Tarragona (NE de España), y por esta razón el modelo se consideró como validado. A continuación el modelo se adaptó para calcular las concentraciones de PFASs. Para ello, primero se adaptó el modelo para PFOS y PFOA, que son los compuestos perfluorados más estudiados en la literatura, y después se extendió el modelo a otros 9 PFASs. Finalmente, se hizo un análisis de la incertidumbre del modelo PBPK, y la incertidumbre paramétrica se estudio visual y estadísticamente. / Physiologically based pharmacokinetic (PBPK) models are mathematic representations of the human body that aims to assess the time course distribution of chemicals in human tissues. PBPK models may improve the assessment of human health risk but until now were not well studied. Among the most harmful environmental pollutants for human health there are polychlorinated dibenzo-p-dioxins and polychlorinated dibenzofurans (PCDD/Fs) and perfluoroalkyl substances (PFASs). The objective of the present work is to develop a PBPK model to assess the time course concentration of PCDD/Fs and PFASs in human tissues. Previously to the PBPK model development, a ranking index was developed using self-organizing maps (SOM) to assess the most harmful environmental contaminants, being PFASs among the most harmful compounds. After that, the PBPK model was developed to assess and predict the concentration of PCDD/Fs in human blood and adipose tissue. The final outcomes were very coincident with the experimental data found in Tarragona County (NE of Spain), and the model was considered as a validated. After that, the model was adapted to assess the concentrations of PFASs. Firstly the model was developed for PFOS and PFOA, that are the most studied compounds in the research literature, and then the model was expended to 9 PFASs more. Finally the uncertainty analysis of the PBPK model was conducted, and the parametric uncertainty was visually and statistically studied.

Se presentan los resultados obtenidos al estudiar diferentes combinaciones instrumentales entre LC como método de separación y DAD y MS empleando fuentes de ionización API (ESI y APCI), así como analizadores TOF e IT para la detección. Estas técnicas se han acoplado además con distintos procedimientos de tratamiento de la muestra basados en los principios de “química sostenible”, como DLLME y SBSE. Se proponen distintos métodos de análisis para la determinación de un buen número de compuestos orgánicos de carácter tóxico, tales como melamina y sus derivados, fungicidas, insecticidas y citoquininas, así como otros compuestos de interés como lactonas macrocíclicas en distintos tipos de alimentos. También se proponen nuevos procedimientos para la determinación de otros compuestos beneficiosos para la salud como nucleótidos y compuestos polifenólicos, en diferentes alimentos. Utilizando de modo general la cromatografía de líquidos, LC, se han ensayado diferentes fases estacionarias y distintos disolventes como fases móviles, incluyendo agua, metanol, acetonitrilo y mezclas de los anteriores, así como disoluciones de ácidos y reguladoras. Se ha trabajado en elución isocrática o mediante elución por gradiente. La cromatografía de pares iónicos permitió la separación de cinco nucleótidos monofosfato autorizados, CMP, UMP, AMP, GMP e IMP. Se ha aplicado con éxito al análisis de una gran variedad de alimentos infantiles y/o funcionales y cereales infantiles, incluyendo un estudio de la estabilidad de los nucleótidos en alimentos lácteos acidificados. LC de intercambio catiónico ha permitido el control de la presencia de MEL y sus derivados (AMN, AMD y CA) en alimentos. Aunque DAD permite la determinación de MEL y AMN, esta forma de detección no resulta útil para CA y AMD. La detección por MS permite una cuantificación adecuada de los cuatro analitos, mejorando también la sensibilidad. Se propone un modo de detección dual para la separación por LC de siete polifenoles, tres ácidos fenólicos y cuatro HTs, en zumos de granada y diferentes partes de la fruta y el granado, proporcionando una sensibilidad elevada. En definitiva, se proponen nuevos progresos en la integración de múltiples acoplamientos en línea y combinaciones de técnicas de preparación de muestra y analíticas, como SPE-DLLME y LC-DAD-APCI-IT-MS/MS para la determinación de cinco insecticidas neonicotinoides en miel. / The results obtained by studying different instrumental combinations, namely liquid chromatography (LC) as the separation technique and diode array detection (DAD) and mass spectrometry (MS) using API ion source (ESI and APCI) and TOF analyzers and IT for quantification are presented. These techniques have been further coupled with different treatment procedures of the sample based on the principles of "green chemistry" as dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) and stir bar sorptive extraction (SBSE). Thus different methods of analysis for the determination of a large number of toxic organic compounds such as melamine and its derivatives, fungicides, insecticides and cytokinins, as well as other compounds of interest including macrocyclic lactones in foods are proposed. New procedures for the determination of other chemicals such as nucleotides and polyphenolic compounds are also proposed. LC was always used, and different stationary and mobile phases as solvents including water, methanol, acetonitrile and mixtures thereof, as well as solutions of acids and buffers were tested. Both isocratic or gradient elution modes were considered. The ion pair chromatography allowed the separation of five authorized monophosphate nucleotides, namely CMP, UMP, AMP, GMP and IMP. The new procedure has been successfully applied to the analysis of a variety of baby foods and/or functional and cereals, including a study of the stability of the nucleotides in acidified dairy foods. Cation exchange LC has allowed the monitoring of the presence of MEL and derivatives thereof (AMN, AMD and CA) in foods. Although DAD allows the determination of MEL and AMN, this form of detection is not suitable for CA and AMD. MS detection allows accurate quantification of the four analytes, also improving sensitivity. Dual detection mode for LC separation of seven polyphenols, phenolic acids three and four HTS pomegranate juices and in different parts of the fruit and pomegranate, providing high sensitivity is proposed. Finally, further progress in integrating multiple links online and combinations of techniques and analytical sample preparation, such as SPE- DLLME for the determination by LC-DAD-APCI-IT-MS/MS of five neonicotinoid insecticides in honey are also studied.

A lo largo de esta Tesis Doctoral se investiga el potencial analítico y la aplicabilidad del acoplamiento instrumental GC-MS mediante diferentes analizadores de masa. La Tesis Doctoral consta de tres partes diferenciadas. En la primera se desarrolla, valida y aplica metodología analítica basada en el acoplamiento GC-MS para la determinación de contaminantes orgánicos persistentes en muestras procedentes de la acuicultura marina. Entre las muestras se incluyen materias primas de origen vegetal y animal, piensos con diferente composición y filetes de dorada cultivada. Concretamente se desarrollan metodologías para la determinación de PAHs y PBDEs. Para ello se utilizaran analizadores de triple cuadrupolo y tiempo de vuelo. La utilización de un analizador de triple cuadrupolo como herramienta de análisis ofreció una elevada sensibilidad y selectividad para el análisis de compuestos target a niveles traza. La utilización del analizador de tiempo de vuelo permitió una confirmación adicional de los positivos de PAHs determinados mediante el triple cuadrupolo. En la segunda parte de la Tesis se han explorado las posibilidades que ofrece el analizador de tiempo de vuelo desde el punto de vista cualitativo y confirmativo de contaminantes orgánicos mediante técnicas de screening. Concretamente se realizaron estudios sobre muestras de sales marinas, salmueras y aguas medioambientales. La utilización del analizador de tiempo de vuelo ha permitido la realización de diferentes enfoques de análisis screening, bien con analitos preseleccionados (análisis target), analitos no seleccionados previamente (análisis non-target) y analitos seleccionados post adquisición con equipos de MS (análisis post-target). Por último, las metodologías analíticas disponibles se aplican al estudio de la posible bioacumulación de PAHs, OCs y PBDEs en los productos de la acuicultura marina, mediante un estudio experimental que incluye un ciclo completo de engorde de doradas (Sparus aurata L.) en el marco del Proyecto AQUAMAX (Sustainable Aquafeeds to Maximise the Health Benefits of Farmed Fish for Consumers. www.aquamaxip.eu). Las muestras consideradas en este estudio fueron materias primas de origen vegetal y animal, piensos con diferente composición y filetes de dorada cultivada. El trabajo desarrollado en esta Tesis Doctoral ha permitido concluir que la estrategia a seguir depende principalmente del objetivo que se desea alcanzar, considerando el uso de una instrumentación u otra en función de las necesidades requeridas. En esta Tesis Doctoral se ha desarrollado y aplicado metodología analítica altamente especializada con instrumentación avanzada basada en el acoplamiento GC-MS. La metodología desarrollada presenta excelentes características analíticas y resulta de interés tanto en análisis de rutina de estos contaminantes como para la investigación y búsqueda de contaminantes de creciente interés, tanto en el mundo alimentario como en el campo medioambiental.

Objetivos Determinar los contenidos de elementos traza (Cr, Co, Ni, Cu, Zn, As, Se, Cd, Sb, Hg, Tl y Pb), elementos mayoritarios y características mineralógicas de suelos no contaminados, seleccionados de diferentes grupos litológicos, en la Región de Murcia. Estudiar las posibles relaciones entre los elementos traza y diferentes propiedades físico químicas y mineralógicas de los materiales seleccionados en la Región de Murcia. Determinar la variabilidad geoquímica de elementos traza (Cr, Co, Ni, Cu, Zn, As, Se, Cd, Sb, Hg, Tl y Pb) en los suelos seleccionados. Identificar la existencia de zonas con anomalías/ contaminación de elementos traza (Cr, Co, Ni, Cu, Zn, As, Se, Cd, Sb, Hg, Tl y Pb) en la Región de Murcia mediante la aplicación de índices de contaminación/enriquecimiento. Metodología Para alcanzar los objetivos propuestos y de acuerdo con el plan de trabajo, se han utilizado muestras del Banco de suelos del Grupo de Investigación “Contaminación de Suelos” de la Universidad de Murcia (GCSMU). Podemos distinguir entre dos tipos de muestras: muestras seleccionadas para el estudio geoquímico y muestras seleccionadas para detectar anomalías/contaminación en la Región de Murcia. A partir del Banco de suelos, donde partíamos de 451 muestras, se seleccionaron 108 muestras para llevar a cabo el estudio geoquímico más detallado, de manera que se pudiera hacer un estudio estadístico representativo con un número de muestras adecuado en función de la litología se las muestras. Conclusiones Los elementos traza Cr, Zn, Ni, Co, Cu y As se encuentran, en general, asociados a silicoaluminatos y óxidos de hierro, particularmente a filosilicatos a 10 Ǻ y 14 Ǻ, minerales del material litológico, y además son más abundantes en suelos en los que predomina la fracción arcilla y limo, su origen puede ser geogénico. El Pb presenta un comportamiento distinto y niveles elevados en suelos con minerales calcita y/o dolomita, con alto contenido en carbonatos. Su origen puede ser geogénico o antropogénico, y en cada zona en que se presenten anomalía, será preciso estudiarla con detalle. El contenido en elementos traza más elevado de los diferentes grupos litológicos está en los materiales metamórficos, GL 14, (excepto para el Pb, que está el máximo en los limos rojos), y el menor en GL 16, limos rojos y costras. El orden de abundancia de elementos traza, en general, es Cr>Zn>Ni>Cu>As>Co>Pb, el resto están a niveles muy escasos. Según el análisis cluster realizado, todos los grupos litológicos se parecen entre si (los materiales con más carbonatos), menos el GL 14 (metamórficos), y el GL 16, limos rojos y costras. Las técnicas estadísticas que combinan con análisis geoquímicos pueden ser una herramienta útil para proveer identificación de fuentes. Sin embargo, no siempre se utilizan los mismos parámetros (media, mediana, media geométrica, etc.) siendo necesaria una armonización de métodos. Los resultados obtenidos para los índices de contaminación/ geoconcentración (Igeo) para la Región de Murcia, nos indican que As, Cd, Co, Cr, Cu, Ni, Se y Tl se encuentran en el nivel de fondo correspondiente a su grupo litológico o menor en más del 80%. El Pb, Zn, Sb y Hg lo estarán en más del 50 %. Las anomalías se presentan en Hg (aunque su concentración es muy escasa y son puntuales, 12%), en el Pb en un 7 % y en Sb y Tl en menos del 2 %. Existe una gran variabilidad espacial en la litología de los materiales sedimentarios carbonatados de la Región de Murcia, lo que conlleva una gran dificultad para realizar el diseño de muestro y toma de muestras para la detección de anomalías o contaminación de metales pesados. En este tipo de materiales sería preciso muestrear a escala de detalle en las zonas de anomalías detectadas. / Aims Determining the content of trace elements (Cr, Co, Ni, Cu, Zn, As, Se, Cd, Sb, Hg, Tl and Pb), majority elements percentage and mineralogical composition of non-contaminated soils selected from different lithologic groups in Murcia Region. To study the possible relationships among the trace elements and the different physical, chemical and mineralogical properties of the selected materials from the Murcia Region. Determining the geochemical variability of the trace elements (Cr, Co, Ni, Cu, Zn, As, Se, Cd, Sb, Hg, Tl y Pb) in the selected soils samples. To Identify the existence of zones with anomalies/contamination of the trace elements (Cr, Co, Ni, Cu, Zn, As, Se, Cd, Sb, Hg, Tl y Pb) in Murcia Region by the way of contamination/enrichment indexes. Methodology To achieve the proposed aims, and according to the working plan, samples from the Soil bank of the Research Group “Soil Contamination”’ of the University of Murcia (GCSMU) have been used. We can distinguish between two types of samples: those selected for the geochemical study and those selected to detect anomalies/contamination in the Region of Murcia. 108 samples from the Soil Bank were selected, from 451 original samples, for a more detailed geochemical study with the objective of doing a statistically representative evaluation with an adequate number of samples, based on their lithology. Conclusions The trace elements (Cr, Co, Ni, Cu, Zn, As, Se, Cd, Sb, Hg, Tl y Pb) are founded, in general terms, associated to aluminosilicates and iron oxides, specifically to the phyllosilicates 10 Ǻ y 14 Ǻ, minerals of the lithologic material, and what is more, they are more abundant in soils where the clay and silt predominate: it´s origin can be geogenic. Lead presents a distinctive behavior and showed high content in soils with calcite and/or dolomite, with high carbonate content. Its origin could be geogenic or anthropogenic, and in each zone where anomalous values are found, a detailed study would be necessary.. The highest content of trace elements from the different lithologic groups was found in the metamorphic material GL14 (with exception of the Pb, at its maximum in the red limes), and the lowest in the GL16, red limes. The trace elements abundance order is, in general (Cr>Zn>Ni>Cu>As>Co>Pb). The rest appear in very low levels. According to the Cluster analysis carried out, all the lithologic groups are similar between them (the materials with higher carbonates content), except the GL 14 (metamorphic) and the GL16 (red limes). The statistical techniques that combine with geochemical analysis can be a useful tool to provide source identification. Nevertheless, the same parameters are not always used (mean, median, geometric mean, etc.) and a methodological harmonization is required. The results obtained for the contamination/geoconcentration (lgeo) indexes in the Region of Murcia show that As, Cd, Co, Cr, Cu, Ni, Se y Tl are found in the bottom level corresponding to their lithologic group, or less, in more than the 80% of the cases. Pb, Zn, Sb y Hg will be in more of the 50%. The anomalies appear in the Hg (despite its concentration is scarce and punctual) in a 12%, the Pb in a 7% and the Sb and TI in less than a 2%. High spatial variability was found in the lithology of the carbonated sedimentary materials of the Murcia Region, and that implies big difficulties in the sampling design an collection in order or detect the anomalies or contamination of heavy metals. When anomalies or contamination sources are present in this kind of materials, a detailed sample collection is required.

L’objectiu d’aquesta tesi és millorar l’aplicació de mètodes de cromatografia de líquids acoblada a espectrometria de masses (LC-MS) per a l’estudi de toxines lipofíliques i emergents produïdes per microalgues en un ecosistema litoral mediterrani (Delta de l’Ebre, Catalunya, NO Mar Mediterrani). La primera contribució fou l’avaluació de diferents condicions per implementar el mètode de control de referència de toxines lipofíliques en bivalves, obtenint majors rendiments i complint amb els requeriments legals. Aquest mètode s’aplicà en l’estudi d’una floració de Dinophysis sacculus a la badia dels Alfacs, considerant diferents aproximacions per caracteritzar el risc: anàlisi de toxines en microalgues, dissoltes en aigua, i en bivalves. Els perfils toxínics de D. sacculus només presentaren àcid okadaic i pectenotoxina-2 (la toxina principal). El contingut de toxina total per cèl·lula s’incrementà cap al final de la floració, coincidint amb la màxima concentració d’àcid okadaic en musclos (fins a 3,7 vegades el màxim permès a Europa), la concentració de pectenotoxines fou menor. Els ostrons no acumularen toxines per sobre del nivell màxim permès. El mètode LC-MS permeté la detecció de les toxines emergents pinatoxina-g (primera detecció a Espanya) i espiròlid-1, les quals foren confirmades inequívocament mitjançant MS d’alta resolució, en concentracions baixes en marisc i mostrejadors passius. No es detectaren metabòlits acilats de pinatoxines i els falsos positius es descartaren amb informació ortogonal. Les toxines emergents denominades palitoxines també s’investigaren, i es descobriren dues noves palitoxines en cultius de noves soques d’Ostreopsis cf. ovata de Catalunya: l’ovatoxina-g (46-dehidroxi ovatoxina-a) i un isòmer de la palitoxina (anteriorment “palitoxina putativa”), igual que la palitoxina però hidroxilada en C-42 i entre l’extrem A y C-8, i deshidroxilada en C-17 i probablement en C-64. Els perfils toxínics contenien ovatoxines-a,-b,-c,-d i –e, amb concentracions per cèl·lula majors que les d’altres soques mediterrànies. / El objetivo de esta tesis es mejorar la aplicación de métodos de cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas (LC-MS) para el estudio de toxinas lipofílicas y emergentes producidas por microalgas en un ecosistema litoral mediterráneo (Delta del Ebro, Cataluña, NO Mar Mediterráneo). La primera contribución fue la evaluación de diferentes condiciones para implementar el método de control de referencia de toxinas lipofílicas en bivalvos, obteniendo mayores rendimientos y cumpliendo con los requerimientos legales. Este método se aplicó al estudio de una floración de Dinophysis sacculus en la bahía de Alfacs, considerando diferentes aproximaciones para caracterizar el riesgo: análisis de toxinas en microalgas, disueltas en agua, y en bivalvos. Los perfiles toxínicos de D. sacculus sólo presentaron ácido okadaico y pectenotoxina-2 (la más abundante). El contenido de toxina total por célula se incrementó hacia el final de la floración, coincidiendo con la máxima concentración de ácido okadaico en mejillones (hasta 3.7 veces el máximo permitido en Europa), la concentración de pectenotoxinas fue menor. Las ostras no acumularon toxinas por encima del nivel permitido. El método LC-MS permitió la detección de pinatoxina-g (primera detección en España) y espirólido-1 (toxinas emergentes), confirmadas inequívocamente mediante MS de alta resolución, en concentraciones bajas en bivalvos y muestreadores pasivos. No se detectaron metabolitos acilados de pinatoxinas, y los falsos positivos se descartaron con información ortogonal. Las toxinas emergentes denominadas palitoxinas también se investigaron, y se descubrieron dos nuevas palitoxinas en cultivos de nuevas cepas de Ostreopsis cf. ovata de Cataluña: ovatoxina-g (46-dehidroxi ovatoxina-a) y un isómero de la paltoxina (anteriormente “palitoxina putativa”), igual que la palytoxina pero hidroxilada en C-42 y entre el extremo A y C-8, y dehidroxilada en C-17 y probablemente en C-64. Los perfiles toxínicos contenían ovatoxinas-a,-b,-c,-d y –e, con concentraciones por célula mayores que las de otras cepas mediterráneas. / This thesis aims to improve the application of liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS) methods for the study of lipophilic and emerging toxins produced by microalgae in a coastal Mediterranean environment (Ebro Delta, Catalonia, Spain, NW Mediterranean Sea). The first contribution was the evaluation of different conditions for the implementation of the official reference control method for lipophilic toxins in shellfish, in order to obtain higher sample throughput and meet legal requirements. This method was applied to study a bloom of Dinophysis sacculus in Alfacs Bay, considering different approaches to characterize risks: analysis of toxins in microalagae, dissolved in water and in shellfish. Toxin profiles of D. sacculus only included okadaic acid and pectenotoxin-2 (the most abundant). Toxin content per cell increased towards the end of the bloom, concomitant with the maximum okadaic acid concentration in mussels (up 3.7 times the maximum permitted level in Europe), pectenotoxins were accumulated at lower concentrations. Oysters did not accumulate toxins over the maximum permitted level. The optimized method allowed the detection of the emerging toxins pinnatoxin-g (first report in Spain) and spirolide-1, which were unequivocally confirmed by High Resolution MS at low concentrations in shellfish and passive samplers. Acyl ester metabolites of pinnatoxins were not detected, and false positives were discarded by orthogonal information. The emerging toxins named palytoxins were also investigated in the study area, and two new palytoxins were discovered in cultures of new strains of Ostreopsis cf. ovata from Catalonia: ovatoxin-g (46-dehydroxy ovatoxin-a) and isomeric palytoxin (formerly “putative palytoxin”), like palytoxin but hydroxylated at C-42 and in the segment from the A-side terminal to C-8, and dehydroxilated at C-17 and most likely at C-64. Toxin profiles also contained ovatoxin-a, -b, -c, -d and –e, at concentrations per cell higher than toxin quotas reported for other Mediterranean strains.

L'oli d'oliva, el vi o els fruits secs són productes típics de la regió Mediterrània que ofereixen un valor afegit gràcies als seus beneficis per a la salut i excel·lents característiques sensorials. Per aquest motiu és necessari un control de la qualitat i autenticitat d'aquests productes, que són altament susceptibles a fraus i adulteracions. Un aspecte important és l'avaluació de la qualitat sensorial, que descriu paràmetres percebuts pels sentits (gust, visió, olor i tacte) mitjançant panells validats i entrenats d'experts. Aquests panells tendeixen a ser subjectius i requereixen llargs temps d'anàlisi i alts costos. Com a conseqüència hi ha hagut un increment en el desenvolupament de tècniques d'anàlisi capaces de simular les respostes obtingudes amb el panell de tast humà. L'anomenat 'panell electrònic' ofereix respostes objectives mitjançant l'ús de tècniques multivariants que permeten establir correlacions entre els descriptors definits pels humans i els senyals obtingudes instrumentalment. Aquesta tesi pretén oferir tècniques instrumentals alternatives, ràpides i senzilles per determinar la qualitat sensorial d'aliments com l'oli d'oliva, el vi o les ametlles. Els estudis duts a terme inclouen el tractament de les respostes sensorials obtingudes mitjançant metodologies de referència (principalment panells de tast humans), l'optimització dels procediments analítics per treballar amb tècniques instrumentals i el desenvolupament d'eines quimiomètriques adequades per construir els models multivariants. També s'han desenvolupat estratègies de fusió de dades per combinar les diferents dades instrumentals que simulen els sentits humans (olor, gust i visió). / El aceite de oliva, el vino o los frutos secos son productos típicos de la región Mediterránea que ofrecen un valor añadido gracias a sus beneficios para la salud y excelentes características sensoriales. Por este motivo es necesario un control de la calidad y autenticidad de estos productos, que son altamente susceptibles a fraudes y adulteraciones. Un aspecto importante es la evaluación de la calidad sensorial, que describe parámetros percibidos por los sentidos (gusto, visión, olor y tacto) mediante paneles validados y entrenados de expertos. Estos paneles tienden a ser subjetivos, requieren largos tiempos de análisis y altos costes. Como consecuencia ha habido un incremento en el desarrollo de técnicas de análisis capaces de simular las respuestas obtenidas con el panel de cata humano. El llamado 'panel electrónico' ofrece respuestas objetivas mediante el uso de técnicas multivariantes que permiten establecer correlaciones entre los descriptores definidos por los humanos y las señales obtenidas instrumentalmente. Esta tesis pretende ofrecer técnicas instrumentales alternativas, rápidas y sencillas para determinar la calidad sensorial de alimentos como el aceite de oliva, el vino o las almendras. Los estudios llevados a cabo incluyen el tratamiento de las respuestas sensoriales obtenidas mediante metodologías de referencia (principalmente paneles de cata humanos), la optimización de los procedimientos analíticos para trabajar con técnicas instrumentales y el desarrollo de herramientas quimiométricas adecuadas para construir los modelos multivariantes. También se han desarrollado estrategias de fusión de datos para combinar los diferentes datos instrumentales que simulan los sentidos humanos (olor, gusto y visión). / Olive oil, wine or nuts are typical products of the Mediterranean region that offer added value thanks to its health benefits and excellent sensory characteristics. Therefore, the control the quality and authenticity of these products is necessary, mainly because they are highly susceptible to fraud and adulterations. An important aspect is the evaluation of sensory quality that describe parameters perceived by the senses (taste, sight, smell and touch) using validated and trained panels of experts. These panels tend to be subjective, requiring long-time analysis and high costs. As a result there has been an increase in the development of analytical techniques capable to simulate the responses obtained with the human taste panel. The so-called 'electronic panel' provides objective responses using multivariate techniques, which establish correlations between descriptors defined by humans and signals obtained instrumentally. This thesis aims to offer fast and simple alternative instrumental techniques to determine the sensory quality of foods such as olive oil, wine and almonds. Studies carried out include the treatment of sensory responses obtained by reference methodologies (mainly human taste panels), optimization of analytical procedures to work with instrumental techniques and the development of appropriate chemometric tools to build multivariate models. Data fusion strategies have also been studied by combining different instrumental data that simulate the human senses (smell, taste and sight).

L'objectiu general de la Tesi és al desenvolupament de noves plataformes basades en les interaccions supramoleculars i covalents per la detecció de malalties genètiques i patògens biològics, utilitzant l'amperometria i l'electro-quimioluminescència. A la Primera Etapa de la Tesi, es van desenvolupar les plataformes supramoleculars en les que el polímer lineal de carboximetilcel•lulosa va ser doblement modificat amb unitats d’adamantano/ferrocè i ADN, i dipositat sobre una superfície de ciclodextrina ensamblada a un elèctrode d'or. En la segona part, es va desenvolupar una nova estratègia per la immobilització sal de diazoni sobre electrodes d'or i carboni. Aquesta estratègia combina l'avantatge de l’immobilització espontània amb la rapidesa de l'electrodeposició. En aquest mètode, el zinc actua com a reductor per a la formació de radicals aril, aconseguint-se en pocs minuts una capa fina de molècules orgàniques. Finalment, aquesta superfície va ser provada amb èxit per a la detecció de ADN utilitzant amperometria i electro-quimioluminescència. / El objetivo general de la Tesis es el desarrollo de nuevas plataformas basadas en interacciones supramoleculares y covalentes para la detección de enfermedades genéticas y patógenos biológicos, utilizando amperometría y electro-quimioluminiscencia. En la primera etapa de la Thesis, se desarrollaron plataformas supramoleculares en las que el polímero lineal de carboximetilcelulosa fue doblemente modificado con unidades de adamantano/ferroceno y ADN, y depositado sobre una superficie de ciclodextrina ensamblada a un electrodo de oro. En la segunda parte, se desarrolló una nueva estrategia para la inmovilización de una sal de diazonio sobre electrodos de oro y carbono. Esta estrategia combina la principal ventaja de la inmovilización espontánea con la rapidez de la electrodeposición. En este método, el zinc actúa como reductor para la formación de radicales arilo, lográndose en pocos minutos una capa fina de moléculas orgánicas. Finalmente, esta superficie fue probada exitosamente para la detección de DNA utilizando amperometría y electro-quimioluminiscencia. / The overall objective of the Thesis is to develop novel genosensor platforms based on supramolecular and covalent interactions for point-of-care detection of genetic diseases and biological pathogens, using amperometric and electrochemiluminescence techniques. In first part of the Thesis it was developed a supramolecular genosensor platforms based on bifunctionalised carboxymethylcellulose polymer backbone bearing adamantane/ferrocene units and a DNA probe on a cyclodextrin surface linked to the gold surface. In the second part, a new approach based on Zn-mediated grafting of a bipodal diazonium salt was developed. This strategy successfully combines the principal advantage of potentiostat-free spontaneous grafting with the rapidness of electrografting. In this method, by exploiting zinc as a reducing agent for the formation of aryl radicals, the grafting in few minutes of a very thin organic layer with no instrumentation required was accomplished. Finally, it was successfully tested for DNA detection using amperometry and electrochemiluminiscence.