The capacity of proteins to interact with each other rests at the core of biology. Given the ubiquitous nature of these interactions they have attracted the attention of scientists for the development of inhibitors or biochemical tools.The use of biologics to target protein-protein interfaces is relatively advanced; suffer although from some intrinsic drawbacks as the danger of immunogenicity, the inability to cross biological barriers efficiently and high production costs. Small molecule inhibitors do not necessarily share these drawbacks. Unfortunately the druggability of protein-protein interfaces and strategies to target them with small molecules is under open debate. In this work we explore the druggability and methods to target the protein-protein interface of VEGF, a model system with therapeutic relevance in the fields of tumor biology and macular degeneration. We focus mainly on a fragment based approach for the following reasons: i.) proved to be successful at least for some particular protein-protein interfaces, ii.) offers a good coverage of the chemical space with small libraries, iii.) may lead to compounds with improved physicochemical properties compared to HTS. NMR, which is an omnipresent method in the field of fragment based drug discovery since the pioneering work of Fesik, was our tool of choice with a strong focus on combination with novel computational approaches. In the first part of our work we express the required amounts of recombinant VEGF. Then we design and prepared a fragment library after the “SAR by catalog” principle. We developed a new methodology that allowed the preparation of fragment mixtures for NMR based screening with minimized signal overlap. This allowed the direct assessment of nearly all fragment mixtures without the need of mixture deconvolution. Further we developed a program that allowed the automatic evaluation of NMR derived fragment screening data. While being faster than tedious manual interpretation of NMR data it offered a degree of quantitative analysis that would otherwise not be possible in a reasonable amount of time. Our library consistent of over 500 fragments was screened using STD- and CPMG filtered NMR experiments. The analysis of the NMR data resulted in high hit rates but apparent very weak affinity of identified ligands. We successfully developed a competitive 19F NMR based screening assay to identify ligands that bind to the protein-protein interface of VEGF, however none clear competitors could be identified. A second library of over 350 19F containing molecules was screened which led to low hit rates and identification of ligands with apparent very weak affinity. Finally a computational analysis of VEGF surface predicted a low druggability of the protein-protein interface which was in accordance to our experimental observations. The characterization of weak binding fragments and their structural evolution was elaboration was achieved by a combined approach based on NMR and computational experiments. Ligand binding was assessed by the NMR chemical shift perturbation methodology using as probes both amide backbone N-H groups of the protein and its side chain methionine methyl groups. Binding poses were predicted by induced fit docking with the PELE algorithm under strong guidance by NMR derived restrains. Predicted binding modes were used to select fragment analogs with improved binding parameters. This was performed for three cycles and led finally to the discovery of several scaffold families that bind to or in proximity to the protein-protein interface of VEGF. Finally, we present a preliminary exploration of mRNA display for the selection of novel peptide based VEGF ligands. / En el contexto de la presente tesis hemos abordado los siguientes objetivos: 1. El uso de métodos de RMN, basados tanto en la observación del ligando como en la observación de proteína, para estudiar la unión de los compuestos de una quimioteca a la zona de VEGF involucrada en la unión a sus receptores. La interacción VEGF/VEGFR puede ser considerada como un caso de estudio para la evaluación de las interfaces proteína-proteína mediante cribado de fragmentos. 2. Desarrollar herramientas basadas en la combinación de RMN y métodos computacionales para abordar: i) un sistema automático de diseño de mezclas de fragmentos; ii) el análisis automático de datos procedentes de cribados basados en RMN; iii) la evolución de fragmentos con muy baja afinidad. 3. Explorar el uso de técnicas de “mRNA display” para el descubrimiento de nuevos ligandos peptídicos para VEGF.

L’any 2002 tres grups de recerca, entre ells el nostre grup, van demostrar teòricament que la interacció entre anions i anells aromàtics electrodeficients, anomenada interacció anió–, era favorable. Des de llavors s’ha dut a terme un intens estudi de la seva naturalesa física fins la total comprensió. Aquesta tesi es basa amb l’estudi de la interacció anió– des de tres punts de vista. Primerament, la investigació es basa en el disseny teòric de motius estructurals per donar lloc a un receptor on la interacció anió– siga molt favorable, per posteriorment avaluar la força de la interacció experimentalment en dissolució. A continuació, es va analitzar la interrelació entre un gran nombre de combinacions d’interaccions no covalents. A partir d’aquest estudi es defineixen nous conceptes i es proposen diferents formules per calcular efectes de cooperativitat. Finalment, hem anat un pas més enllà en l’estudi de la interacció analitzant: 1) l’impacte de la interacció anió– a sistemes biològics; 2) la influència de modificacions a l’anió sobre la naturalesa física de la interacció / In 2002 three research groups, among them our research group, theoretically demonstrated that the interaction between anions and electron-deficient aromatic rings, named anion– interaction, was favourable. Since then, an intense study of its physical nature has been performed to understand it completely. This thesis is based on the study of the anion– interaction from three points of view. Firstly, theoretical design of binding units to build a receptor and to obtain the most favourable binding based on anion– interactions. The binding properties of these receptors have been experimentally assessed in solution. Secondly, we have studied the interplay between a great combination of noncovalent interactions. From this study, new concepts and formula to calculate cooperativity effects have been described. Finally, we have study one step further the anion– interaction analysing: 1) the impact of anion– interaction in biological systems; 2) how the modifications in the anion influence the physical nature of the interaction.

Els anàlegs nucleosídics poden ser utilitzats com a fàrmacs anticancerígens i en teràpies antivirals. Les proteïnes encarregades del reconeixement i translocació dels derivats cap a l'interior cel•lular són els transportadors nucleosídics (NTs), els quals es classifiquen en transportadors de nucleósids concentratius (CNTs) i equilibratius (ENTs), i els transportadors de cations orgànics (OCTs). La utilització de compostos marcats radioactivament és habitual en l'estudi de l'activitat d'aquestes proteïnes, tot i que aquest tipus d'assaig no permet l'anàlisi del transport intracel•lular o la distribució dels nucleòsids a l'interior cel•lular. Per aquest motiu, l'objectiu del present treball és l'obtenció d'anàlegs nucleosídics fluorescents que permetin l'estudi de l'activitat dels transportadors CNT i OCT in vivo mitjançant microscòpia confocal de fluorescència. Els compostos fluorescents triats per a l'estudi s'escullen en funció de la seva estructura (amb modificacions mínimes respecte als nucleòsids naturals) i característiques espectroscòpiques (longitud d'ona mínima d'absorció de 350 nm). Segons aquests criteris es trien cinc anàlegs: pirrolo-Citidina (pirrolo-C), Uridina-furà (U-furà), derivat tricíclic de citidina (tC), derivat de pteridina i anàleg amb un grup benzotiofé. A excepció del primer anàleg (compost comercial), els derivats són sintetitzats i purificats per HPLC. La interacció de les molècules amb les proteïnes CNT i OCT es determina mitjançant la inhibició del transport de [(3)H]Uridina o [(3)H]MPP+ en cèl•lules HeLa transfectades transitòriament. Per altra banda, experiments d'electrofisiologia utilitzant oòcits de Xenapus laevis que expressaven una determinada proteïna CNT permeten avaluar la internalització dels derivats. l'estudi in vivo del transport dels anàlegs fluorescents realitza mitjançant microscòpia confocal de fluorescència amb una longitud d'ona d'excitació de 350 nm. Els derivats nucleosídícs fluorescents pirrolo-C i U-furà, presenten una forta interacció amb els transportadors hCNT1 i hCNT3, amb unes ICsD de l'ordre baix i inhibeixen significativament l'activitat de hOCT1 i hOCT2. Segons els resultats dels assajos d'electrofisiologia, tant pirrolo-C com U-furà poden ser internalitzats pels dos transportadors concentratíus. El compost tC inhibeix l'activitat tant de hCNT2 com de hCNT3 amb una baixa afinitat, però no indueix corrents de sodi en oòcits en els estudis d'electrofisiologia. Finalment, els derivats de pteridina i benzotiofé no mostren cap tipus d'interacció amb els transportadors. Els experiments in vivo utilitzant microscòpia confocal de fluorescència mostren una clara acumulació intra cel•lular de U-furà i pirrolo-C. / Nucleoside analogues constitute an important class of drugs used in the treatment of hematological malignancies, solid tumors and antiviral therapies. Proteins responsible for the recognition and translocation of nucleoside derivatives into cells are nucleoside transporters (NTs) and organic cation transporters (OCTs). The use of radiolabeled nucleosides is common in the functional analysis these proteins, however, it does not allow real-time in vivo studies of intracellular trafficking and distribution of nucleosides and their metabolites within cells. The development of novel fluorescent nucleoside analogues may allow the measurement of cellular uptake by fluorescence microscopy and can provide a new approach to quantitatively study nucleoside transporter-related functions. To obtain fluorescent tools to allow the study of concentrative nucleoside transporters (CNTs) and OCTs in vivo, we synthesized fluorescent pyrimidine and purine analogs. We examined its inhibitory effects on transpcrter-mediated uptake of [(3)H]Uridine or [(3)H]MPP+ using transitory transfected HeLa cells. The uptake of analogues for which no radiolabeled forms was evaluated using the two-electrode voltage clamp technique in Xenopus laevis oocytes expressing particular hCNT type proteins. To evaluate the in vivo intracellular uptake of selected derivatives we used confocal microscopy and an excitation wavelength of 350 nm. Two analogues (uridine and cytidine derivatives) were high-affinity inhibitors of hCNT1 and hCNT3 and partially inhibit the activity of hOCT1 and hOCT2. Additionally, electrophysiology experiments showed that these compounds were hCNT1 and hCNT3 subst rates. A tricyclic oxophenothiazine derivative was a low-affinity inhibitor of hCNT2 and did not induce sodium currents in oocytes in electrophysiology studies. Finally, a guanosine analogue that incorporates one carbonil group in the nucleobase did not show any interaction with hCNTs. In vivo experiments using fluo rescent confocal microscopy showed a clear intracellular accumulation of fluorescent nucleosides in cells expressing hCNT or hOCT proteins. In addition, the uridine analogue showed different accumulation than the cytidine derivative. While the first accumulated along all the experiment, the cytidine analogue showed a progressive decrease in its intracellular accumulation. On the other hand, the oxophenothiazine derivative did not show a different interaction with membrane cells that present CNTs. In conclusion, in vivo experiments using confocal microscopy demonstrated that both pyrimidine analogues can be used to distinguish cells with or without expression of hCNT1/3 or hOCT1/2. These fluorescent derivatives can provide an excellent tool to quantify concentrative nucleoside transporters in intact cells.

S'han dissenyat i sintetitzat conjugats acridina-oligonucleòtid que puguin actuar com a inhibidors de la telomerasa a través de l'estabilització d'estructures quàdruplex de guanines (G) formades en els extrems telomèrics de les cèl·lules humanes. Els intermedis clau en la ruta sintètica que ha permès obtenir els conjugats desitjats han estat derivats acridínics assimètricament disubstituïts que contenen un grup carboxílic en un dels extrems, els quals s'han fet reaccionar amb 5'-amino-oligonucleòtids. El mètode sintètic desenvolupat ha permès l'obtenció d'una petita biblioteca de conjugats acridina-oligonucleòtid amb introducció de diversitat a diferents nivells (derivat acridínic, seqüència oligonucleotídica i espaiador d'unió entre ambdós components).Els conjugats obtinguts s'han avaluat, en primer lloc, com a estabilitzadors d'estructures quàdruplex de G formades per la seqüència telomèrica humana, mitjançant la tècnica FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Posteriorment, s'ha avaluat també la seva capacitat d'inhibició de la telomerasa mitjançant assaigs TRAP (Telomeric Repat Amplification Protocol). Així, s'ha posat de manifest que els conjugats obtinguts estabilitzen els quàdruplex de G formats per la seqüència telomèrica humana i que inhibeixen la telomerasa, encara que en ambdós casos, en menor intensitat que les acridines que contenen. Finalment, s'ha observat una correlació força acceptable entre els resultats obtinguts en ambdós experiments (d'estabilització i d'inhibició).Per altra banda, s'han sintetitzat diversos oligonucleòtids cíclics rics en guanines potencialment formadors de quàdruplex de G, i s'ha dut a terme un estudi estructural d'aquests utilitzant les tècniques d'espectroscopia ultravioleta (UV), Dicroïsmse Circular (DC) i Ressonància Magnètica Nuclear (RMN). En particular, s'ha observat que el dodecàmer cíclic d<pTTAGGGTTAGGG> forma una estructura ben definida de quàdruplex bimolecular tipus cistella en presència de sodi. Finalment, s'ha estudiat la interacció d'aquests oligonucleòtids cíclics amb algunes de les acridines obtingudes anteriorment. En aquest sentit, s'ha observat que aquestes últimes estabilitzen les estructures de quàdruplex de G formades pels oligonucleòtids cíclics, i que, en el cas de l'octàmer d<pTTGGTTGG> fins i tot indueixen la seva estructuració. / Several acridine-oligonucleotide conjugates have been designed as potential telomerase inhibitors via G quadruplex stabilization in the human telomeres. A general synthetic methodology has been set up in order to obtain such conjugates. The key intermediates for the obtaining of the desired molecules appeared to be asymmetrically disubstituted acridine derivatives containing a carboxylic group in one end. Such intermediates were reacted with 5' amino-oligonucleotides to afford the conjugates. A small conjugate library has been synthesized with structural diversity being introduced at different levels (acridine derivative, oligonucleotide sequence and linker).The obtained conjugates have been evaluated in a first step as G quadruplex stabilizers through FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) studies. Also telomerase inhibition has been tested for the compounds. Typical TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol) assays have been performed. It has been shown that most of the conjugates not only stabilize G quadruplex formed by the human telomeric sequence but also inhibit telomerase activity, although with less potency than the sole acridines. Furthermore some correlation between both properties (G quadruplex stabilization and telomerase inhibition) can be observed. On the other hand, some G-rich cyclic oligonucleotides, which can be considered as potentially G-quadruplex forming oligonucleotides, have been obtained. A structural study has been carried out using different techniques such as UV spectroscopy, Circular Dicroism (CD) and Nuclear Magnetic Resonance (NMR). It has been observed that the cyclic dodecamer d<pTTAGGGTTAGGG> forms a well defined bimolecular basket-like G-quadruplex structure in the presence of sodium. Finally, some studies directed to study the interaction between such oligonucleotides and some of the acridines previously obtained have shown that the later ones generally stabilize G-quadruplex structures formed by the cyclic oligonucleotides. In particular, most of the acridines tested induce the cyclic octamer d<pTTGGTTGG>, to form a bimolecular G-quadruplex.

L'estructura cristal•logràfica del receptor opioide ha estat una gran incògnita fins al seu recent descobriment. En aquesta tesi s'han realitzat aportacions al disseny racional de fàrmacs opioides, mitjançant la posada a punt de tècniques d'anàlisi proteòmica del receptor opioide i amb estudis de la seva interacció amb lligands peptídics endògens (encefalines i endorfines) i els seus anàlegs, per interpretar millor les conformacions dels lligands i el seu mode d'unió al centre actiu. D'altra banda, s'han realitzat estudis de nous inhibidors dels enzims que degraden les encefalines (Endopeptidasa neutra i Aminopeptidasa-N). L’opiorfina (H-Gln-Arg-Phe-Ser-Arg-OH) mostra una potent activitat analgèsica en models animals de dolor després estimulació química i mecànica equipotent a la morfina per activació dels mecanismes endògens de regulació del sistema opioide. Aquesta se segrega en la saliva humana i actua com a inhibidor dual de NEP i AP-N, prolongant l’efecte de les encefalines. En aquesta part, s'han realitzat estudis de relació estructura-activitat (SAR) i conformacionals per millorar el disseny d'inhibidors d'aquests enzims. / The crystallographic structure of opioid receptors has been a great unknown until its recent discovery. This thesis has made contributions to the rational design of opioid drugs, by tuning proteomic analysis techniques on opioid receptors and studying their interactions with endogenous peptide ligands (enkephalins and endorphins) and its analogues to a better understanding of conformations of the ligands and their binding mode to the active center. Furthermore, studies have been made about new inhibitors of enzymes which degrade enkephalins (NEP and aminopeptidase-N). Opiorphin (H-Gln-Arg-Phe-Ser-Arg-OH) exhibits potent analgesic activity in animal models of pain after chemical and mechanical stimulation equipotent to morphine, by activation of the endogenous opioid system. It is secreted in human saliva and acts as a dual inhibitor of NEP and AP-N. In this part, structure-activity relationship (SAR) and conformational studies have been made to improve the design of inhibitors of these enzymes.

En el trabajo desarrollado en esta tesis se han sintetizado y caracterizado diversas nanopartículas de óxidos de hierro funcionalizadas con escuaramidas o antifolatos a través del uso de linkers apropiados como la dopamina o el APTES. Varias nanopartículas funcionalizadas con escuaramidas han sido utilizadas para evaluar su comportamiento supramolecular frente a carboxilatos e iones de metales pesados. Se ha demostrado la capacidad de la conjunción nanopartícula-escuaramida para actuar como receptores de estos analitos estableciendo cierta selectividad en el proceso. Algunas de estas nanopartículas también han sido estudiadas como posibles agentes transportadores de fármacos antineoplásicos, específicamente, antifolatos. Se han evaluado dos estrategias de transporte: una a través de interacciones no covalentes y otra mediante enlaces covalentes. A través de ensayos de viabilidad celular frente a células de adenocarcinoma de pulmón humano (A549) se determinó la mayor eficacia de la estrategia covalente frente a la no covalente.

En la present tesi doctoral s’ha plantejat com un dels principals objectius desenvolupar un sistema de diagnòstic in vitro per a detectar al∙lèrgies a fàrmacs β‐lactàmics, i més concretament contra amoxicil∙lina, una de les penicil∙lines més utilitzades com a antibiòtic avui dia. Per tal d’aconseguir els determinants antigènics necessaris per desenvolupar l’assaig desitjat s’han utilitzat dos estratègies. Una d’elles consisteix en la producció d’antígens a partir de la conjugació de proteïnes a penicil∙lines. Mitjançant aquesta estratègia s’han aconseguit obtenir un total de 17 antígens que es poden classificar en 4 grups diferents, en funció del tipus d’haptè i mètode de conjugació utilitzat. L’altra estratègia utilitzada és molt més innovadora. Consisteix en la preparació d’una sèrie de sondes peptídiques mitjançant síntesi en fase sòlida. Aquestes sondes, totalment caracteritzades per RMN i MS, han resultat ser reactives a amoxicil∙lina i generar diferents epítops, simulant la unió que pot haver entre una proteïna endògena i el fàrmac abans de desenvolupar una reacció d’hipersensibilitat. Però amb la gran avantatge que aquests adductes han pogut ser aïllats (gràcies a la incorporació d’un grup cromòfor en la sonda peptídica) i caracteritzats per RMN i MS. Concretament, durant aquest treball s’han aconseguit aïllar 3 adductes, dos en medis aquosos isotònics a pH 4,7 i un a pH 11. L’adducte aïllat a pH 11 es correspon amb el que es coneix com el determinant antigènic majoritari de l’amoxicil∙lina, que consisteix en la obertura de l’anell β‐lactàmic per l’atac nucleòfil, d’una amina de les proteïnes. Els dos adductes aïllats a pH 4,7 no s’havien descrit fins el moment i, conseqüentment s’han hagut d’elucidar estructuralment. Per dur a terme aquesta tasca s’han utilitzat tres pèptids simplificats anàlegs a una de les sondes peptídiques emprades. Mitjançant l’elucidació estructural dels compostos formats entre aquests peptíds i l’amoxicil∙lina s’ha aconseguit fer una proposta de les estructures més probables dels adductes creats a pH 4,6. Tant els antígens com els adductes penicil∙línics s’han utilitzat com a determinants antigènics per desenvolupar immunoasssaigs per la detecció de IgEs específiques en sèrums de pacients al∙lèrgics a penicil∙lines. Aquests assaigs s’han desenvolupat en format ELISA i magneto‐ELISA. Gràcies a la preconcentració dels sèrums i la eliminació del senyal inespecífic que ofereix el magneto‐ELISA, s’ha aconseguit desenvolupar un assaig on totes les mostres dels pacients al∙lèrgics han presentat una resposta positiva en front d’algun dels tres adductes. Alguns dels antígens també han sigut reconeguts utilitzant l’assaig ELISA convencional. Per tal d’avaluar a la vegada antígens i adductes es va traslladar l’assaig al format microarray. Però després de fer grans esforços per incrementar el senyal, optimitzant tots els paràmetres possibles de l’assaig no va ser possible detectar IgEs específiques. El segon bloc d’aquesta tesi consisteix en prevenir les reaccions adverses a penicil∙lines detectant aquests fàrmacs en mostres d’aliments. Per portar a terme aquest segon objectiu es va plantejar desenvolupar un immunoassaig per a la detecció d’amoxicil∙lina en mostres de llet. Per això calia prèviament produir anticossos específics contra amoxicil∙lina. En un primer moment es van desenvolupar anticossos policlonals de conill utilitzant dos tipus d’immunògens que havien estat dissenyats d’una forma racional. L’immunogen Amx1‐PLL estava dissenyat per generar anticossos específics per a reconèixer la part variable de l’amoxicil∙lina mentre que l’immunogen Amx2‐Br‐HCH estava pensat per produir anticossos de família, és a dir, anticossos capaços de reconèixer l’anell β‐lactàmic de totes les penicil∙lines. La polilisina (PLL) va resultar no ser suficientment immunogènica. Pel contrari l’immunogen Amx2‐Br‐HCH sí va produir anticossos contra amoxicil∙lina. Els antisèrums As218 i As219 van presentar una gran afinitat per tots els conjugats amoxicil∙línics produits, però en canvi molt poca competició per la molècula d’amoxicil∙lina. Això va suggerir que una bona part de la població dels anticossos policlonals estaven reconeixent una estructura modificada de la penicil∙lina, concretament la seva forma oberta, l’àcid amoxiciloic. Es va aconseguir obtenir una gran detectabilitat per aquest analit, amb valors de IC50 al voltant de 0.35 μg/L, molt per sota dels límits establerts per aquest fàrmac. Per tant, tot i no haver pogut desenvolupar un assaig contra amoxicil∙lina en forma tancada, sí s’ha aconseguit un assaig amb molt bons resultats per a detectar amoxicil∙lina en forma oberta. Finalment es va fer un últim intent d’obtenció d’anticossos contra amoxicil∙lina produint anticossos monoclonals. Aquests es produeixen aïllant les cèl∙lules productores d’anticossos o limfòcits B, i clonant aquests amb cèl∙lules tumorals immortals. Els hibridomes resultants s’aïllen individualment, i cadascun d’aquests és capaç de crear una immunoglobulina diferent. Tot i l’esforç emprat en aquesta via, no va ser possible aïllar cap clon productor i per tant no es van poder produir anticossos monoclonals específics contra amoxicil∙lina. / One of the principal aims of this work has been to develope an in vitro diagnostic assay to detect allergies to b‐lactam antibiotics, especially amoxicillin. Two strategies have been applied to obtain all the antigenic determinants. The first strategy has allowed to obtain 17 different antigenic determinants coming from penicillin G, penicillin V, amoxicillin and ampicillin. This strategy is based on the rational design and synthesis of bioconjugates. The other strategy uses peptides probes to obtain new antigenic determinants form amoxicillin. The principal advantage of using peptide probes is that adducts can be isolated and characterized in a very easy way. In this case, we have been able to isolate 3 different adducts coming form amoxicillin. Two of them have been obtained at pH 4.6 and one at pH 11. Adduct obtained at pH 11 corresponds with the major determinant. The amine of the lysine reacts with the b‐lactam ring and opens the structure. The two adducts obtained at pH 4.6 have never been described before. The elucidation of its structures has been done synthesizing three new simplify peptide probes. Adducts formed have been successfully analyzed by Mass spectroscopy and NMR. All these antigens and adducts have been used as antigenic determinants to develop and immunoassay to detect specific IgEs against penicillins. The assay has been tested with serums coming from allergic patients. And the best results have been obtained using the magneto‐ ELISA. All the serums have showed a positive response against almost one of three adducts. The second block of this work has been focus on the adverse reactions prevention detecting penicillin in food samples. The way to achieve this second objective was to develop an immunoassay to detect amoxicillin in milk samples. The antibodies used in this immunoassay were design and produce during this work. Two different immunogen were synthesized but only one was able to produce antibodies against penicillins. Although all the antigens were recognize by the antiserums only showed competition against open‐ring penicillins. Excellent results were achieved detecting amoxicilloic acid. We were able to obtain an assay with a very good detectability (IC50 around 35 μg/L) against amoxicilloic acid. Monoclonal antibodies were produced during this work too. The aim was to produce specific antibodies against amoxicillin. It wasn’t able produce monoclonal antibodies against this analyte.

L’objectiu general de la present Tesi Doctoral és el desenvolupament i estudi de noves reaccions d’addició i substitució mitjançant l’organocatàlisi asimètrica. Més concretament, s’han abordat els següents temes. S’ha desenvolupat una metodologia per a la desimetrització de ciclohexanones 4-substituïdes mitjançant reacció aldòlica directa amb aldehids aromàtics, promoguda per un nou sistema catalític basat en prolina no modificada i una tiourea aquiral com a cocatalitzador, en dissolvents apolars. Estudis de mecanisme del sistema catalític han demostrat que el paper del cocatalitzador no és el de promoure la solubilització directa de la prolina, com es va pensar en un principi, sinó el d’ajudar en la formació de dues espècies catalítiques solubles derivades de la reacció entre la prolina i la cetona (l’oxazolidinona bicíclica i el seu isòmer zwitteriònic). S’han desenvolupat dues metodologies per a la construcció asimètrica de compostos organofluorats mitjançant reaccions de Michael entre aldehids alfa, beta-insaturats i diferents carbonucleòfils fluorats, com ara el fluorobis(fenilsulfonil)metà i el 2-fluoromalonat de dietil, sota activació per ió imini. S’ha estudiat la derivatització d’alguns dels adductes de Michael obtinguts, demostrant que els protocols desenvolupats són útils per a l’obtenció de diferents compostos fluorats rellevants, com ara aminoalcohols fluorats. S’han desenvolupat dues metodologies organocatalítiques en cascada per a la construcció asimètrica de sistemes carbocíclics. En primer lloc, la seqüència Michael/Michael/aldòlica entre oxindoles no substituïts en el carboni 3 i enals, permet la síntesi d’oxindoles espirànics i altres compostos espirànics relacionats amb resultats excel•lents. En segon lloc, la seqüència de reacció Michael/alfa-alquilació entre 2-bromomalonats i enals, permet la síntesi de formilciclopropans amb tres centres estereogènics, un d’ells quaternari. Les dues reaccions estan catalitzades pel alfa, alfa-difenilprolinol protegit com a éter de trimetilsilil. S’ha estudiat la reacció nitrosoaldòlica asimètrica entre oxindoles 3-substituïts no protegits i nitrosobenzè, promoguda per un catalitzador bifuncional tiourea/amina terciària, per a l’obtenció de 3-aminooxindoles, una estructura present en diferents productes naturals amb activitat biològica rellevant. Malgrat que la reacció transcórre amb enantioselectivitat moderada, en alguns dels exemples el producte de reacció precipita en el medi de reacció. Mitjançant simple filtració és possible aïllar els 3-aminooxindoles enantioenriquits, sense necessitat d’ulterior purificació. S’han desenvolupat diverses metodologies per a l’alquilació al•lílica asimètrica de carbonats de Morita-Baylis-Hillman (MBH) racèmics, amb nucleòfils carbonats. En primer lloc s’han emprat bissulfones i fluorobissulfones com a nucleòfils, que condueixen a la síntesi dels productes formals de metilació i fluorometilació al•lílica dels adductes de MBH. Seguidament, la utilització de fluoromalonat de dietil com a nucleòfil, permet l’obtenció de compostos al•lílics fluorats quirals. Per últim, la reacció one-pot entre carbonats de MBH racèmics amb 2-hidroximalonat de dietil O-protegit i 2-aminomalonat de dietil N-protegit, permet la construcció catalítica de alfa-metilen-gamma-lactones i alfa-metilen-gamma-lactames amb un centre estereogènic. La reacció es basa en l’alquilació al•lílica asimètrica dels carbonats de MBH amb els malonats, seguida de desprotecció de l’oxigen o del nitrogen en el cru de reacció, i lactonització/lactamització espontània, per a l’obtenció de les alfa-metilen-gamma-lactones i les alfa-metilen-gamma-lactames. / The general objective of this PhD Thesis is the development of addition and substitution reactions by means of asymmetric organocatalysis. First, a desymmetrization methodology of 4-substituted cyclohexanones has been developed through aldol reaction with different aromatic aldehydes, promoted with a new catalytic system based on non-modified proline and an achiral thiourea cocatalyst in apolar solvents. Mechanistic studies on this new catalytic system have revealed that the actual role of the cocatalyst is the generation of two catalytic and soluble species derived from proline and the ketone: the bicyclic oxazolidinone and its zwitterionic isomer. Second, two Michael reactions have been developed for the asymmetric synthesis of organofluorine compounds. The reaction of different fluorinated carbon-based nucleophiles, such as fluorobis(phenylsulfonyl)metane and diethyl fluoromalonate, with alpha, beta-unsaturated aldehydes, allows the construction of different enantioenriched fluorinated compounds. Third, two new cascade reaction have been developed for the asymmetric synthesis of complex scaffolds in one synthetic operation. The reaction between non-subtituted oxindoles and enals, through a Michael/Michael/aldol sequence, allow the synthesis of spyrooxindoles and related spiranic compounds with excellent results. The reaction between 2-bromomalonates and enals, though a Michael/alpha alquilation sequence, allow the asymmetric construction of a broad set of formylcyclopropanes. Fourth, the nitrosoaldol reaction between 3-substituted oxindoles and nitrosobenzene have been studied, for the asymmetric synthesis of tetrasubstituted 3-aminooxindoles. Although the reaction proceeds with moderate enantioselectivity, in some cases the final product precipitates in the reaction medium. Therefore, by means of a simple filtration of the crude reaction mixture, the 3-aminooxindoles can be isolated without need of further purification and with an important enhancement in the enantiomeric excess. Finally, different protocols for the asymmetric allylic alkylation of Morita-Baylis-Hillman (MBH) carbonates have been developed. The reaction of racemic MBH carbonates with different carbon-based nucleophiles, such as bis(phenylsulfonyl)metane, 2 fluoromalonate, 2-hydroxy- and 2-aminomalonate, under Lewis base catalysis, allows for the asymmetric synthesis of allylic compounds.

Natural products from terrestrial plants and microorganisms have long been a traditional source of drugs. For centuries humans have been looking on their environment for medicines to treat illnesses. But unlike terrestrial sources, marine habitat has not been so extensively studied; this field awaited refinements in technologies to collect the source organisms, and development of more advanced analytic techniques to better understand the more complex isolated compounds. Since 1950s this field has suffered an exponential push; considering that water covers around a 70% of the earth’s surface, and 32 of the 33 animal phyla are represented in aquatic media, marine habitat represents an extensive source of new bioactive molecules. Synthesis represents a powerful tool to use on our behalf for structure determination and supply of material for clinical tests on the development of new bioactive drugs. This thesis is focused on the synthesis and structure determination of bioactive compounds isolated from marine habitat: barmumycin and phormidolides B-D. Our strategy lied on the identification of the target by comparison of the available data from the natural product with data of our synthetic compounds. Barmumycin was isolated from an extract of a marine actinomycete and found to be cytotoxic against various human tumor cell lines. Macrolactone 1 was assigned on the basis of 1H and 13C NMR spectroscopy. Compound 1 was synthesized by two different routes. The main goal of both our synthesis is the alkylation of a weak nucleophilic aniline by this two different methods, which are based on a reductive amination and on a nucleophilic substitution. However, major spectroscopic differences between isolated barmumycin and 1 led to revision of the proposed structure. New structure 2, based on a pyrrolidine with an exocyclic double bond linked to an aromatic ring by an amide bond, was proposed. On the basis of the enantioselective synthesis of this new compound, and subsequent spectroscopic comparison of it to an authentic sample of barmumycin, the structure of the natural compound was indeed confirmed as that of 2. Polyketide macrolides are a class of secondary metabolites with interesting biological activities and complex structure and stereochemistry. A general overview of THF-containing macrolactones has been compiled, a class of compounds with high potential as drug candidates. Described are isolation, structure determination and the described synthesis up to 2012. Phormidolides B-D are polyketide macrolides related to oscillariolide and phormidolide A. These compounds were isolated from an active organic extract of a sponge of the Petrosiidae family and presented antitumor activity. The planar structure of Phormidolides B-D was determined on the basis of comparison of the spectra of the natural product with oscillariolide and phormidolide A and with the study of NMR spectra of isolated compounds. The relative stereochemistry of the macrocyclic core was only determined for 4 out of the 6 stereocenters of the macrocycle. The next target of this thesis is the enantioselective synthesis of the macrocyclic core of phormidolides B-D. The best synthetic pathway to the synthesis of the macrolide core of phormidolides B-D was selected with a not-stereoselective synthetic study. A strategy based on an olefin metathesis was discarded. On the other hand a strategy based on a Julia-Kocienski olefination completed the preparation of the macrocycle as a mixture of diasteromers. A robust and efficient methodology for the enantioselective synthesis of the macrolide core of phormidolides B-D was developed from the Julia-Kocienski olefination route. The strategy is versatile and can be used for the synthesis of the different diastereomers of the macrocycle making the appropriate changes in the starting materials and chiral inductors. The selective synthesis of the Z-trisubstituted double bond present on the macrocyclic core of phormidolides B-D was the objective of an optimization process that culminated with the use of a 1-(tert-butyl)tetrazolyl sulfone to succesfully afford the formation of the endocyclic alkene with excellent stereoselectivity. It is a fact that the discovery of New Molecular Entities (NME) requires innovation, new ideas and processes. Scientists have learned over the years how to overcome the problems often associated with marine derived natural products development and this work is one more example of this scenario. / Els productes naturals extrets de plantes i organismes terrestres han estat durant molts anys font d’inspiració per a la preparació de fàrmacs. Per contra el medi marí no ha rebut tanta atenció, la química dels productes naturals marins ha hagut d’esperar que les tecnologies es modernitzessin per facilitar la recol•lecció de mostres i la determinació estructural dels productes extrets, que presenten molta més complexitat estructural que els productes d’origen terrestre. En els últims 50 anys, aquest camp ha estat objecte de gran interès ja que representa una font de noves molècules bioactives, amb estructures i mecanismes d’acció diferents dels coneguts. En aquesta tesi s’ha treballat en dos projectes focalitzats en l’estudi de molècules d’origen marí com a fàrmacs, utilitzant la síntesi com a eina en els primers estadis de desenvolupament ja que la quantitat aïllada de les fonts naturals només serveix per fer una primera aproximació a estructura i activitat. La barmumicina és un producte natural amb activitat biològica del que s’ha confirmat l’estructura gràcies a la síntesi. El compost que es va determinar en la primera assignació s’ha obtingut per síntesi i s’ha comparat amb el producte natural duent a la conclusió que l’estructura no era la correcta. La reassignació i síntesi d’una nova molècula proposada ha confirmat la identitat d’aquest producte natural. Les formidolides B-D són productes naturals d’alta complexitat estructural. S’ha desenvolupat la síntesi del fragment macrocíclic de les formidolides B-D, abordant dues aproximacions per a la formació de l’alquè trisubstituit; una basada en una metàtesi d’olefines i l’altra en una olefinació de Julia-Kocienski. La segona ruta s’ha seleccionat com a ruta per adaptar a procediments estereoselectius. Adaptant aquesta estratègia, s’ha desenvolupat una metodologia que permet sintetitzar eficaçment i de forma enantioselectiva el macrocicle de les formidolides B-D; l’estratègia és versàtil, ja que canviant els materials de partida o els auxiliars quirals es pot dirigir la síntesi cap al diastereòmer desitjat. El punt clau de la síntesi ha estat la formació del doble enllaç trisubstituitZ amb bon rendiment i selectivitat, pel qual s’ha dut a terme una optimització del procés. S’han sintetitzat tres estereoisòmers i la comparació dels espectres de RMN del producte natural i els sintètics ha permès establir la configuració relativa dels esterocentres que presenta la macrolactona del producte natural. Els resultats presentats demostren la utilitat de la síntesi en el desenvolupament de productes naturals, ja sigui en la determinació d’estructura, estereoquímica o en la producció en sí.

En esta tesis doctoral el concepto de multivalencia en el reconocimiento de proteínas (lectinas) con azúcares se combinó con la idea de la química dinámica combinatoria. Esto se aplicó, no sólo para sacar ventaja del efecto de la mejor afinidad de tales sistemas multivalentes, sino también para dotar al sistema con una mayor variedad de constituciones y geometrías. La determinación de las afinidades relativas de los miembros de la biblioteca dinámica dio una visión de los requisitos necesarios para la unión entre azúcares – lectina. El primer enfoque para acceder a los sistemas multivalentes para el reconocimiento de lectinas (presentado en el capítulo 2 de la tesis), está basado en estrategias bien conocidas. Enlaces covalentes reversibles son usados para acceder a bibliotecas dinámicas combinatorias (DCLs). En esta parte del trabajo se confirmó la viabilidad del procedimiento analítico elegido. Especies diméricas, similares a las que se había conocido desde experimentos de otros grupos, mostraban buena analisabilidad de los DCLs formados. El método analítico elegido (HPLC MS) permitió la detección de las afinidades y selectividades relativas de tales constituyentes de la respectiva biblioteca. Para la elaboración de las bibliotecas dinámicas, varios intentos fueron realizados basados en el mismo concepto: Una subunidad central con múltiples puntos de conexión para favorecer interacciones reversibles. Formación de una librería dinámica basada en un conector central. Específicamente, se evaluaron los puentes di sulfuro y la formación de imina. Algunos de estos estudios resultaron ser complicados por problemas secundarios, tales como solubilidad en agua y las interacciones secundarias no deseadas de unidades centrales, debido principalmente a reacciones intramoleculares. Sin embargo, finalmente se obtuvo una biblioteca combinatoria dinámica multivalente y se analizó con éxito mediante técnicas de HPLC-MS. El DCL, está basado en el intercambio de sulfuro para formar puentes di-sulfuro entre las diferentes unidades de azúcar. Esto fue posible gracias a la solubilidad en agua de las subunidades carboxilato y al uso de enlaces cortos entre los puntos de conexión del tiol y de la estructura central, evitándose la formación de enlaces intramoleculares. Formación de una librería dinámica. Las partes se conectan a través de enlaces disulfuros. Sin embargo, incluso cuando se controlaron los problemas mencionados anteriormente, la formación fiable y estable de los miembros de la librería era difícil debido a la desintegración sustancial durante la etapa de análisis. Por lo tanto, la posterior comparación de las afinidades de los miembros de la DCL no era posible. No obstante, los enfoques presentados ofrecen oportunidades para nuevos experimentos, que con una cuidadosa elección de las condiciones pueden conducir al éxito. Desafortunadamente, el marco temporal de esta tesis no lo permitió estudiar en detalle; había que seguir otras pistas más prometedoras. La coordinación de ligando metal, especialmente con ligandos de tipo bipiridina coordinados a centros de FeII, evitó la mayoría de problemas encontrados anteriormente (parte desarrollada en el Capítulo 3). Observándose que en las condiciones necesarias para trabajar con la proteína elegida (ConA lectina) la formación de complejos era muy fiable. Como primera prueba de concepto para un comportamiento de dinámica combinatoria, se evaluaron DCLs simples que no contenían azúcares sobre la base coordinativa bipyridina. Una librería dinámica basada en el intercambio de ligandos de un centro metálico. Después, DCLs que contenían azúcares fueron sintetizadas y fueron comprobadas con la proteína. Ligandos con sustituyentes azúcar fueron usados como bloques prefabricados, obteniéndose, mediante síntesis sencillas y con buenos rendimientos. Ligandos con sustituyentes azúcares y basados en bipyridina que pueden formar complejos hexavalentes. Métodos de HPLC bien elegidos permitieron el análisis de los DCLs, así como la determinación de las afinidades relativas con la lectina ConA. La cuantificación de las entidades con más afinidad apoyó el concepto de multivalencia para sistemas que intercambian dinámicamente múltiples unidades de reconocimiento. A partir de este estudio básico, se desarrollaron otras DCLs que incorporaron componentes de diferentes geometrías. Las afinidades relativas de estos complejos compararon y revelaron que algunos miembros de la biblioteca contienen disposiciones tridimensionales más afines para la interacción con la lectina. La proteína tiene más afinidad a un único miembro de la biblioteca dinámica Por otra parte, los miembros de la librería de forma esférica parecen mostrar mayor afinidad a la proteína, en acuerdo con la teoría de “statistical rebinding”. Una biblioteca dinámica de geometrías diferentes. En resumen, DCLs basadas en la coordinación con metal (en contraste con enlaces covalentes dinámicos) han demostrado que constituyen una manera fácil de acceder a los procesos de intercambio multivalentes, proporcionando nuevas perspectivas para desentrañar las reglas de interacciones multivalentes de azúcares - lectina.