En el context del camp de l’organocatàlisi, per una banda, de l’estudi de mecanismes de reaccions orgàniques, per l’altra, i de l’estudi de l’emergència de la quiralitat, s’han estudiat els següents temes: S’ha desenvolupat una metodologia per a l’addició enantioselectiva i organocatalítica de Michael d’oxazolones a maleïmides que proporciona accés a compostos amb possible interès biològic, amb dos centres estereogènics (un d’ells quaternari). La reacció empra com a catalitzador una base de Brønsted quiral comercial, derivada de la quinidina, i proporciona, en el cas d’un substituent fenil al carboni 4 de l’oxazolona, 47-80% rendiment com a un únic regioisòmer, relacions diastereomèriques des d’un 2:1 a un únic diastereòmer i 52-95% ee. En emprar un substituent alquil a l’oxazolona els resultats són similars però s’obté una mescla de regioisòmers. S’han estudiat els efectes cooperatius de la mescla arginina–àcid glutàmic com a catalitzador en la reacció aldòlica entre la ciclohexanona i el 4-nitrobenzaldehid. S’ha observat que la capacitat de cooperació és molt sensible a les condicions de reacció. En condicions de cooperació, la mescla d’aminoàcids proporciona millors selectivitats que els components per separat, tot i que també s’obté un elevat percentatge de producte d’eliminació. S’ha determinat que l’arginina és l’aminoàcid que actua com a catalitzador i s’han observat indicis d’un possible mecanisme autoinductiu. A més, s’ha estudiat la interacció entre la prolina i el guanidini de l’arginina protegida. S’ha investigat el mecanisme de la reacció entre un aldehid a,ß-insaturat i un nitroalquè en catàlisi per dienamina. S’ha caracteritzat un intermedi del cicle catalític que és propi d’un camí de reacció diferent al que havien proposat els autors que van desenvolupar la reacció. S’ha observat una clara diferència en les reaccions que empren catalitzadors basats en repulsions estèriques i aquells que tenen una posició nucleòfila lliure, i s’han estudiat els equilibris entre reactius, intermedis i el producte. D’acord amb els resultats obtinguts s’ha proposat un nou mecanisme de la reacció segons els dos tipus de catalitzador estudiats. S’ha examinat el trencament espontani de la simetria en la reacció aldòlica entre l’acetona i el 4-nitrobenzaldehid en absència d’un catalitzador extern. S’ha comprovat el fenomen i s’ha determinat que aquest té lloc en els primers instants del procés. S’ha aïllat una espècie del cru de reacció provinent d’una segona reacció aldòlica i se n’ha estudiat la possible relació amb el trencament espontani de la simetria. A més, s’ha proposat un nou model de xarxa de reaccions que condueix a un trencament espontani de la simetria sota control cinètic i posteriorment a un sistema racèmic. S’ha investigat la reacció autocatalítica asimètrica de Mannich entre cetones i imines derivades del glioxilat. En el cas d’utilitzar acetona, s’ha aconseguit preparar un mímic del producte de reacció però aquest no va presentar activitat catalítica. En utilitzar hidroxiacetona, s’ha observat que la reacció és favorable en un medi àcid però que és inhibida per bases, i s’ha descobert que el diastereòmer minoritari (anti) que s’obté en la mescla dels productes de reacció és millor catalitzador que el diastereòmer més abundant (sin), utilitzant RMN i microcalorimetria. A més, s’ha arribat a la conclusió que aquest és un procés no enantioselectiu. S’ha desenvolupat una variació d’un mètode ja existent per a la preparació més efectiva organocatalítica, diastereoselectiva i enantioselectiva dels adductes de Mannich anti. Finalment, s’ha proposat un mecanisme per a la reacció de Mannich autocatalítica en les reaccions d’hidroxiacetona. S’ha observat que la reacció de Morita–Baylis–Hillman entre la 2-ciclohexenona i el 1-metil-2-imidazolecarbaldehid té lloc sense utilitzar catalitzadors externs. A més, també s’ha observat el producte de reacció aldòlica. S’ha monitoritzat la reacció per RMN i espectrometria de masses tàndem, però no s’ha aconseguit determinar si es tracta d’un procés autocatalític, catalitzat pels reactius o bé un mecanisme competitiu on tenen lloc els dos processos. / In a context in the fields of organocatalysis, reaction mechanism studies and processes with emergence of chirality, the following studies have been made: A new method for the enantioselective organocatalytic Michael addition of oxazolones to maleimides has been developed, using chiral Brønsted bases derived from quinine as the catalyst. It allows the stereoselective synthesis of a-maleido-a-amino acids. The cooperative effects from the mixture arginine–glutamic acid as catalysts in the aldol reaction between cyclohexanone and 4-nitrobenzaldehyde have been studied, concluding that higher stereoselectivities are obtained when both amino acids are used at the same time. The origin of the cooperation has been examined, as well as the interaction between the amino acids and the reagents and product. The mechanism of the organocatalytic conjugated formal [2 + 2] cycloaddition between nitroalkenes and enals under dienamine catalysis has been investigated by screening different types of aminocatalysts and studying catalytic species by NMR. Evidences pointing to a different reaction pathway from the established one have been found. The spontaneous symmetry breaking in the aldol reaction between acetone and 4-nitrobenzaldehyde has been examined. We have seen that it occurs in the first reaction instances and a species that could be related to the process has been found. A new model for a reaction experiencing a spontaneous symmetry breaking has been proposed. The autocatalytic Mannich reaction has been investigated. Mechanistic studies have been performed by monitoring the reaction. Different situation have been examined: while in some cases the reaction can be enantioselective, in other cases the process it is totally racemic. A Morita-Baylis-Hillman reaction between 2-cyclohexenone and 1-methyl-2-imidazolecarbaldehyde in the absence of an external catalyst has been developed. The reaction can be reagent-catalyzed or autocatalytic, and evidences pointing to both pathways have been found by monitoring the reaction crude both by NMR studies and by MS2 studies.

Glycosylation is a posttranslational modification affecting the fast majority of cellular surfaces through glycolipids and glycoproteins. It has been estimated that over 80% of all proteins are glycosylated and that the glycans decorating the periphery of these molecules are fundamental for the biological function of the entity. Many of these functions have yet to be unraveled. As the modification is a secondary-gene event, it depends on the availability and activity of a set of glycosyltransferases, the availability of both donor and acceptor substrate (both in time and place), as well as many other factors that may include temperature, pH, etc. As a consequence a single glycosylation site may express a certain number of different glycans, i.e., structural microheterogeneity. The importance of glycosylation as primary mediators of cellular communication, protein-protein cross-talk, and even cell-pathogen interaction has been attributed precisely to this phenomenon. In the past few years substantial advancements have been made in the understanding of the function of particular glycosidic epitopes, such as the most relevant blood group antigens ABO, and Sda, (sialyl)Lewisx,y,a,b, the HNK-1 antigen, etc., but many more structures have been identified without an attributed functionality, either as a stand-alone epitope or in conjunction with the underlying peptide structure. Similarly, a serious lack of knowledge still exists on the carbohydrate recognizing molecules, i.e. lectins and their function; even so they have been recognized over the last decades as decisive players in numerous biological processes, ranging from cell-cell communication, fertilization, pathogen-cell adhesion to metastasis. Both deficiencies are directly related to the absence of proper tools to elaborate well-defined carbohydrate epitopes for the study of their interaction characteristics and their employment in the discovery of new complementary molecules. Consequently, there is an increasing interest in finding powerful and nanosized tools to screen for these molecules and to study their carbohydrate interactions in detail. In this Thesis, two complementary approaches are described to characterize lectin-carbohydrate interactions with high sensitivity, low sample consumption, and without the need for sample labeling: SPR and CREDEX-MS. In SPR, we have developed an approach where the sugar is immobilized onto a sensor surface through a tailor-made peptide module that allows (1) to capture the lectin, (2) to characterize the interaction through kinetic and thermodynamic parameters, and (3) to identify the interacted protein by mass spectrometry. In CREDEX-MS, based on proteolytic excision of protein-carbohydrate complexes and mass spectrometric analysis, the peptides conforming the carbohydrate binding domain are identified. After completing a preliminary phase where the above mentioned methodologies are optimized and used for the study of carbohydrate-protein interactions using purified well-known lectins; the established platforms are employed to analyze carbohydrate-driven interactions in more complex systems. Specifically, SPR and CREDEX-MS techniques are applied in a research project on molecular aspects of reproduction with the main objective of disclosing the molecular elements that participate in the first steps of fertilization in bovine species, namely: formation of the sperm reservoir in the oviductal epithelium and gamete recognition (oocyte (ZP)-sperm interaction). / La glicosilació, el procés enzimàtic que uneix sacàrids per produir glicans que s'adhereixen a proteïnes, lípids o altres molècules biològiques, és una modificació co-traduccional i post-traduccional present a la pràctica totalitat de components cel•lulars, on trobem glicoproteïnes, glicolípids i altres glicoderivats. Pel que fa específicament a les proteïnes, s’estima que més d’un 80% estan glicosilades i que aquests glicans són fonamentals en processos biològics com la senyalització cel•lular, el cicle infecciós de certs patògens, les respostes inflamatòria i immune, la fertilització, etc. En els últims anys s’ha avançat substancialment en el coneixement bàsic de la funció de determinats epítops o cadenes glicosídiques concretes. No obstant, es desconeixen les funcions de moltes altres estructures glicosídiques. D’altra banda, també existeix un cert desconeixement sobre les molècules que reconeixen els carbohidrats, les lectines “lectores del codi glicòmic”. Aquestes proteïnes es caracteritzen per reconèixer i unir-se de forma reversible i específica a certs monosacàrids o epítops oligosacàrids donant lloc a interaccions similars a les reaccions antigen-anticòs o enzim-substrat. El paper de les lectines en processos com l'aglutinació i la definició de grups sanguinis, la inflamació (selectines), la mielinització del teixit nerviós, la progressió tumoral, etc., demostra la ubiqüitat i diversitat d'activitats en què es veuen implicades aquestes proteïnes. Per això, disposar d'una eina ràpida i fiable per al seu aïllament i identificació, previ a l'estudi de les seves interaccions amb polisacàrids, constitueix un objectiu de màxim interès en l'actual investigació biomèdica. En la present Tesi Doctoral, es descriuen dues aproximacions complementàries mitjançant les quals es poden caracteritzar les interaccions lectina-carbohidrat amb gran sensibilitat, poca mostra i sense la necessitat de cap marcatge. En la tècnica de ressonància de plasmó superficial (SPR), el sucre és immobilitzat sobre una superfície a través d'un mòdul peptídic, la qual cosa permet (1) capturar la lectina, (2) caracteritzar la seva interacció mitjançant paràmetres cinètics i termodinàmics i (3) identificar posteriorment la proteïna mitjançant espectrometria de masses. Complementàriament, la tècnica CREDEX-MS, basada en l'excisió proteolítica del complex proteïna-sucre i posterior anàlisi per espectrometria de masses, ens permet identificar els pèptids que formen part del domini d'unió al sucre.

Synthesis of Cys-containing peptides has long been posed as an attractive challenge for peptide chemist. Protecting groups for the nucleophilic beta-thiol group of Cys residues must be stable during peptide elongation, and can be removed under mild conditions when necessary. Synthesis of peptides with multiple-disulfide bonds frequently demands the implementation of additional orthogonal dimensions into the protection schemes. Therefore, combinations of orthogonal and/or compatible protecting groups for each pair of Cys residues enable the regioselective formation of disulfide bridges. The development and study of novel protecting groups for the side-chain of the Cys residue may increase the number of synthetic tools for the efficient synthesis of Cys-containing peptides. The solid-phase strategy has been applied for the preparation of small, medium-sized peptides. Nevertheless, the elongation of large peptide sequences through a stepwise solid-phase peptide synthesis is limited and convergent strategies, such as fragment condensation approach should be adopted. The preparation of fully protected peptide fragments on solid phase for convergent synthesis calls for handles with maintain intact the side-chain protecting groups upon cleavage. The present thesis has focused on the development and application of novel orthogonal strategies for the synthesis of complex peptides, including Cys-containing peptides and long and difficult peptide sequences by fragment condensation approach. Specifically, different Cys-protecting groups have been evaluated and a handle has been designed and developed. / Recientemente, el péptido linaclotide ha sido aprobado por la Food and Drug Administration (FDA) y por la European Medicines Agency (EMA) para el tratamiento de enfermedades gastrointestinales tales como el estreñimiento crónico (EC) y el síndrome del intestino irritable (SII)1. Linaclotide es administrado oralmente, y es un potente agonista selectivo del receptor de la guanilato ciclasa tipo C (GC-C) localizado en el intestino. Desde un punto de vista estructural, este péptido de cadena corta presenta un elevado número de residuos de cisteínas que le confieren una conformación bien definida debido a la presencia de tres enlaces disulfuro intramoleculares entre los residuos Cys1-Cys6, Cys2-Cys10 y Cys5-Cys13. El diseño y la optimización de una estrategia sintética eficiente para la obtención de cantidades que permitan satisfacer el mercado en un futuro, se presenta como un reto debido a la presencia de sus tres puentes disulfuro. Para la optimización de dicha síntesis es fundamental establecer y discutir sus dos principales limitaciones: el riesgo de racemización de los residuos de cisteína durante la síntesis lineal de la cadena peptídica; y el posterior plegamiento y formación de los enlaces disulfuros correctamente. Se diseñaron y estudiaron diversas estrategias regioselectiva, semi-regioselectiva y se exploró la posibilidad de preparar el péptido linaclotide siguiendo una estrategia aleatoria, utilizando un esquema de protección de los residuos de cisteína no selectivo. La elección de los grupos protectores del grupo tiol de las cisteínas, su posición en la secuencia, la influencia de los grupos protectores vecinos, además del orden de plegamiento y formación de los enlaces disulfuro fueron objeto de estudio. Finalmente, el péptido completamente plegado y oxidado se analizó detenidamente con el fin de confirmar que la conectividad establecida entre los residuos de cisteína coincidían con los enlaces disulfuro nativos presentes en Linaclotide.

Aquesta tesi doctoral s’ha basat en el desenvolupament de nous compostos amb capacitat per interaccionar de forma selectiva i específica amb l’estructura secundària localitzada al final de l’exó 10 del pre-mRNA codificant de la proteïna tau, ja que l’aparició de mutacions que la desestabilitzen està relacionada amb l’aparició de malalties degeneratives, com ara la FTDP-17 (Demència Frontotemporal i Parkinsonisme associat al cromosoma 17). La identificació dels lligands, s’ha dut a terme mitjançant la química combinatòria dinàmica (DCC) a travès de reaccions reversibles de bescanvi d’enllaços tiol-disulfur sobre una biblioteca dinàmica formada per un total de 10 compostos orgànics derivatitzats amb un grup tiol, tots ells amb capacitat per interaccionar amb els diversos motius estructurals presents a l’RNA. Concretament, s’han sintetitzat quatre molècules denominades Janus amb l’objectiu de reconèixer específicament els parells G-U, que es troben tant a la seqüència nativa com a les mutades, i un derivat de l’ametantrona amb capacitat per intercalar-se a la regió del bulge present a l’estructura de l’RNA diana. A més, també s’ha incorporat un compost heteroaromàtic per al reconeixement de bases desaparellades, dos derivats aminoglicosídics i l’agent intercalant acridina. Els resultats obtinguts han confirmat que els lligands derivats de l’ametantrona interaccionen preferentment amb la seqüència nativa de la diana d’RNA en comparació amb els que contenen acridina, on la combinació amb l’aminoglicòsid ha estat la més afavorida. A continuació, tant la seva síntesi a gran escala com la d’un segon grup de compostos de segona generació, basats en la guanidinilació del fragment neamina i en la doble funcionalització del residu amentatrona, s’ha dut a terme en solució. Un cop sintetitzats els diferents compostos, en una segona part del treball s’ha estudiat la seva interacció amb la diana a través de diverses tècniques biofísiques (espectroscòpia de fluorescència, d’UV-visible i d’RMN), amb l’objectiu de determinar, d’una banda, l’afinitat i l’especificitat amb la seqüència oligoribonucleotídica i, de l’altre, el seu lloc d’unió. Finalment, també s’ha determinat la capacitat estabilitzant dels lligands amb la seqüència nativa i les mutades, clau per al desenvolupament de nous fàrmacs que permetin regular el processat alternatiu de l’exó 10 del pre-mRNA de tau. / RNA plays an essential role in many cellular processes, from the regulation of gene expression to protein synthesis, as well as in the progression of viral diseases. Hence, the discovery of selective and, more importantly, specific ligands for this macromolecule represents a challenge for medicinal and bioorganic chemistry and therapy. Moreover, the potential for targeting RNA with small molecules is immense given its ability to adopt complex three-dimensional structures, similar to those observed in proteins. Most of the known RNA-binding ligands can each bind to several different RNA targets of unrelated sequence and structure, which compromises their biological applications. We hypothesize that affinity and specificity could be improved by combining two or more small molecules with different abilities to recognize some of the secondary structural motifs present in a particular RNA target. This fragment-based lead-discovery search approach offers new perspectives and opportunities for identifying RNA ligands with improved properties, as well as for increasing our understanding of RNA recognition mechanisms. In this PhD thesis, we have used dynamic combinatorial chemistry (DCC) to identify ligands for the stem-loop structure located at the exon 10-5’-intron junction of tau pre-mRNA, which is involved in the onset of several tauopathies, including frontotemporal dementia with Parkinsonism linked to chromosome 17 (FTDP-17). These compounds bind to the stem-loop RNA target with high affinity (70 – 300 nM) and are able to stabilize both the wild-type and the +3, +14 and +16 mutated sequences associated with the development of FTDP-17. In addition, some of them seem to have a preferred binding site in the target RNA, as inferred from spectroscopic studies (UV-visible, fluorescence and NMR).

Aquesta tesi doctoral està basada en el desenvolupament de nous agents antimicrobians derivats del pèptid híbrid cecropina A-melitina WKLFKKILKVL-NH2 (Pep3) que siguin sostenibles i útils per al control de malalties de plantes. Es van dissenyar i sintetitzar més de 133 anàlegs de Pep3 mitjançant química combinatòria. Es van obtenir anàlegs de Pep3 amb una elevada activitat contra fitopatògens i que presentaven baixa toxicitat. Els millors anàlegs van presentar eficàcies comparables amb pesticides de referència en la prevenció d'infeccions causades per fitopatògens. Es va estudiar el mecanisme d'acció de KKLFKKILKYL-NH2 (BP100) investigant la seva interacció amb models de membrana mitjançant tècniques espectroscòpiques. Es va observar la capacitat de BP100 a induir la permeabilització, la neutralització, i l'agregació de vesícules lipídiques aniòniques a una determinada concentració llindar. Es va deduir una equació que relaciona la CMI d'un pèptid antimicrobià amb la constant de partició i la concentració llindar en la membrana. / This PhD thesis focused on the development of new sustainable antimicrobial agents derived from the cecropin A-melittin hybrid antimicrobial peptide WKLFKKILKVL-NH2 (Pep3) for use in plant protection. A set of 133 Pep3 analogues were designed and synthetized using a combinatorial chemistry approach. Analogues of Pep 3 with high antimicrobial activity and low toxicity were obtained. The best of them were highly effective preventing infections of phytopathogens being not significantly different to conventional pesticides. Insights into the mode of action of KKLFKKILKYL-NH2 (BP100) were carried out by investigating its interaction with different model membrane systems using spectroscopic methodologies. BP100-induced vesicle permeabilization, membrane electroneutrality, and vesicle aggregation at a defined threshold concentration. Moreover, it was deduced an equation that correlates the MIC of an AMP with the partition constant and the threshold concentration in the membrane.This equation provides an easily prediction of in vivo antimicrobial activities from simple biophysical parameters.

Los IRES o Sitios Internos de Entrada Ribosomal son secuencias altamente estructuradas que se encuentran en la región no traducida del extremo 5' (5'-UTR) de diversos virus y mRNAs eucariotas que habilitan un mecanismo de traducción alternativo independiente de cap. La elevada conservación entre los genotipos virales hacen de los elementos IRES dianas potenciales hacia las que orientar el diseño de nuevos compuestos antivirales. Hace unos años, un cribado masivo por espectrometría de masas para seleccionar ligandos del IRES de hepatitis C (HCV IRES) permitió identificar un derivado de 2-aminobenzimidazol. Estudios adicionales de relación estructura-actividad originaron Isis-11, un derivado de 2¬aminobenzimidazol que inhibía la replicación de HCV a concentraciones submicromolares. Además, Isis-11 exhibió una afinidad micromolar por el subdominio Ila del IRES de HCV, un segmento esencial para la unión correcta del IRES al ribosoma. Los estudios estructurales sobre el subdominio Ila demostraron que los ligandos basados en 2-aminobenzimidazol se unen a una protuberancia de cinco nucleótidos altamente conservada produciendo un cambio conformacional que conlleva la inhibición de la función IRES. La fiebre aftosa (FMDV o Foot-and-Mouth Disease Virus) es un picornavirus cuya traducción es también mediada por IRES. A pesar de diferir en secuencia y estructura, los IRES de HCV y FMDV comparten ciertas similitudes. Éstas han llevado a conjeturar sobre la posibilidad que los derivados de 2-aminobenzimidazol pudieran comportarse también como ligandos del IRES de FMDV e inhibir su actividad. En la presente Tesis, se ha descrito la preparación de nuevos derivados de Isis-11, a los que hemos nombrado IRAB (IRES Aminobenzimidazol Binder). Para ello, se ha desarrollado una nueva ruta sintética, reduciendo el número de etapas y la complejidad del procedimiento original. Tras la síntesis se ha evaluado la interacción de los compuestos con la estructura del IRES de FMDV mediante ensayos biofísicos y de footprinting. Los experimentos biofísicos se han llevado a cabo mediante diferentes técnicas. En un primer bloque, se intentó evaluar la interacción de los ligandos con el IRES de FMDV mediante curvas de fusión y dicroísmo circular. Tras esta evaluación preliminar, se han realizado valoraciones por fluorescencia que han permitido determinar la afinidad de los ligandos por diferentes segmentos del IRES de FMDV. A modo de comparación, se han realizado los mismos experimentos con el subdominio Ila de HCV IRES. Los resultados han mostrado afinidades en los rangos submicromolar y micromolar bajo. Por último, se llevó a cabo una caracterización termodinámica completa de la interacción mediante valoraciones por calorimetría isotérmica (ITC) Los experimentos de footprinting mediante el radical hidroxilo y por SHAPE (Selective 2'- Hydroxyl Acylation analyzed by Primer Extension) han permitido determinar el impacto de la interacción de los ligandos sobre las estructuras secundaria y terciaria del IRES de FMDV. En conjunto, los resultados no han mostrado un lugar único de interacción con el IRES de FMDV. No obstante, todo parece sugerir que la interacción de los ligandos con el IRES tiene lugar preferentemente con uno de los dominios del IRES esenciales para su correcta actividad, produciendo con ello un cambio conformacional sutil pero suficiente para inhibir el mecanismo de traducción mediado por IRES. El estudio se ha completado llevando a cabo estudios de actividad de los derivados aminobenzimidazol, midiendo en primer lugar la inhibición de la traducción mediada por IRES, en FMDV y HCV, mediante experimentos in vitro, y también determinando in vivo la inhibición de replicación viral en células infectadas. En vista de los resultados, se puede concluir que la actividad antiviral de los dos compuestos ensayados, Isis-11 e IRAB-1, tiene relación con su capacidad en interferir en la traducción de FMDV mediada por IRES por interacción directa con el RNA. Una ruta sintética más directa y la actividad sensiblemente mejor de IRAB-1 en relación a Isis-11 permiten pensar que podrán desarrollarse otros derivados IRAB con mayor actividad antiviral, producto de una mejor selectividad por el RNA IRES. / IRES or Internal Ribosomal Entry Sites are highly structured sequences harbored on the 5' untranslated region (5'-UTR) of several virus and eukaryotic mRNAs that enable an alternative cap-independent translation. Highly conserved in virus genotypes, IRESs are attractive targets to design novel antiviral drugs. A few years ago, massive MS-screening for the selection of Hepatitis C virus IRES (HCV IRES) ligands identified a 2-aminobenzimidazole-containing compound. Further SAR studies conducted on 2-aminobenzimidazoles originated Isis-11, which inhibited HCV replication with a submicromolar EC50. Isis-11 exhibited a micromolar affinity against subdomain Ila of hepatitis C virus IRES (HCV IRES), an essential motif for the proper binding of the IRES to the ribosome. Structural studies showed that subdomain Ila contains a highly conserved 5-nucleotide bulge to which Isis-11 and related compounds can bind to promote a conformational switch that ultimately leads to IRES function inhibition. Foot-and-mouth disease virus (FMDV) is a picornavirus whose translation is also driven by the IRES element present at the 5'-UTR of RNA. Although HCV and FMDV IRES differ significantly in nucleotide sequences and structure, the similarities between both IRESs led us to hypothesize that 2-aminobenzimidazole derivatives could also act as FMDV IRES binders, and lead to the inhibition of FMDV IRES-mediated translation. We describe the preparation of new Isis-11 analogues, collectively referred to as IRAB (IRES aminobenzimidazole binders), that have been shown to inhibit FMDV IRES-dependent protein synthesis and viral replication at micromolar concentracions. A series of biophysical assays, such as circular dichroism, fluorescence and microcalorimetry, have been performed to determine the binding affinity of these ligands for segments of FMDV IRES. For comparison purposes, the same compounds have been also evaluated as HCV IRES ligands. In both cases, affinities in the micromolar and submicromolar range have been determined. SHAPE (Selective 2'-Hydroxyl Acylation analyzed by Primer Extension) analysis and hydroxyl radical footprinting have been also carried out to characterize the binding of IRAB analogues to FMDV IRES.

En el transcurso de esta tesis se ha trabajado en la síntesis total de la Anfidinolida B2. Ésta es una macrolactona citotóxica aislada de un dinoflagelado marino (Amphidinium sp.) por el grupo de Shimizu y colaboradores en Brewer’s Bay, St. Thomas, Virgin Island. Como los espectros de la Anfidinolida B2 son muy parecidos al de la Anfidinolida B1 (cristalizada y cuya configuración absoluta pudo determinarse por Rayos X y experimentos de degradación), B2 se consideró un epímero en C18 de la B1. Sin embargo, su estructura sigue siendo incierta ya que Carter et al. sintetizaron la estructura propuesta por Shimizu y observaron que los datos espectroscópicos no coincidían con la natural. La retrosíntesis planteada en nuestro grupo se basa en cuatro desconexiones principales que dan lugar a cuatro fragmentos de complejidad estructural. El Fragmento I se ha sintetizado a través de una alilación asimétrica de la cetona metílica, transformación apenas usada en síntesis totales. Después de probar varias metodologías optamos por utilizar la alilación asimétrica de Schaus, que nos proporcionó nuestro alcohol alílico en un 95% de rendimiento y una relación enantiomérica de 95:5. De esta manera pudimos optimizar la síntesis de primera generación de este fragmento llevada a cabo por la Dra. Mireia Sidera, obteniendo el alcohol en 3 etapas y un rendimiento total del 32%. El Fragmento II, se ha conseguido sintetizar a través de un exhaustivo estudio de la apertura del 3,5-dimetiltetrahidrofuran-2-ol donde el 2,2,2-trifluoroetanol es un aditivo clave en la olefinación de Wittig para evitar la posible adición conjugada que da lugar al producto cíclico. La síntesis del fragmento se ha llevado a cabo a través de una dihidroxilación asimétrica de Sharpless, formación de la amida de morfolina y posterior intercambio a cetona vinílica. La síntesis del Fragmento III ha supuesto un estudio de la reacción de Negishi, donde se ha intentado realizar un coupling Csp3–Csp2, habiendo sido imposible obtener altos rendimientos. No obstante, la unión de un intermedio del Fragmento III con el Fragmento I, también mediante reacción de Negishi, nos ha permitido formar el enlace C13–C14 de la Anfidinolida B2. Una vez realizada esta unión, sí que se ha podido llevar a cabo la unión Csp3–Csp2 para alargar la cadena del Fragmento III y acabar epoxidando mediante una reacción organocatalítica de Jørgensen la posición α,β del aldehído que sirve para la unión con el Fragmento IV. Los resultados de los experimentos de la reacción de Negishi han servido para extrapolarlos a otros acoplamientos que habían resultado problemáticos con anterioridad en el grupo. Así, se ha realizado la síntesis de la Palmerolida A, macrólido inhibidor del melanoma aislado en 2006 por Baker y colaboradores, aplicando las condiciones optimizadas con anterioridad. Finalmente, la síntesis del Fragmento IV mediante reacciones triviales nos ha llevado a la unión de éste con el Fragmento Oeste a través de la reacción de Julia-Kocienski. Actualmente nos encontramos estudiando la saponificación y posterior esterificación para la obtención del macrociclo que dará lugar a la Anfidinolida B2. / The present Doctoral Thesis describes our efforts towards the Total Synthesis of Amphidinolide B2, a novel macrolide with potent cytotoxicity against lymphoma murine cells and humane carcinoma cells. It is a 26-membered ring macrolactone, with an allylic epoxide, four doble bonds and 9 stereogenic centres. However, the absolute configuration is still unknown as Carter and co-worker sinthetised the proposed structure and observed that the spectroscopic data were not in agreement with those reported by Shimizu. They propose a new structure for Amphidinolide B2, where the two alcohols in C16 and C18 have a syn relative configuration. Our retrosynthesic analysis was based in four main disconnections that lead to four principal fragments. The synthesis of Fragment I has been optimized using a methyl ketone asymmetric allylation of ketones developed by Schaus. In this manner, the synthesis of the fragment could be achieved in 3 steps and 32% overall yield. Fragment II was envisage via an olefination reaction of lactol 1.9. However, this reaction was not trivial and an exhaustive study was carried out. Finally, using Wittig olefination reaction with 0.9 equivalents of ylide or 2.0 equivalents of trifluoroethanol, the product could be obtained. Negishi reaction has also been studied for the Csp3–Csp2 coupling. After several optimizations, we have been able to synthesize Western Fragment with this protocol. Finally, Jørgensen’s catalytic asymmetric epoxidation allowed us to the formation of the α,β-epoxy aldehyde. Taking advantage of the Negishi reaction study performed bellow, we decided to focus our attention in the challenging C15–C16 bond formation of Palmerolide A, a melanoma-inhibiting macrolide. After some studies changing the protecting group, we obtained the coupling product in 78% yield. Fragment IV is the simplest of all. The synthesis starts from γ-butirolactone and sulfone 6.1 is obtained in 4 steps and 53%. This compound was used for the Julia–Kocienski olefination obtaining 6.3 in moderate yield. Unfortunately, we haven’t had enough time to continue with the synthesis, which implies a saponification, sterification of Fragment II, ring-closing metathesis to form the macrolactone and the final directed oxi-Michael adition to obtain the C18 stereogenic center.

Existeix un interès creixent, tant en el món acadèmic com en la recerca industrial en el desenvolupament de sistemes d’alliberament de fàrmacs macromoleculars (proteïnes, pèptids, oligonucleotids) capaços de travessar la mucosa. En aquest sentit, la utilització de vectors sintètics per a l’alliberament de les esmentades macromolècules, permet disposar d’una plataforma versàtil i altament eficient. Tanmateix, la capa de mucosa amb propietats adhesives i altament viscoelàstica, té una elevada capacitat d’atrapar i eliminar qualsevol substància estranya que quedi adherida sobre la seva superfície, limitant, de forma evident, la eficàcia de qualsevol tractament Aquesta Tesi es centra en el desenvolupament de sistemes d’alliberament de DNA, dissenyats a mida, que presenten una elevada estabilitat i eficàcia de transfecció amb un nivell molt baix de toxicitat i molt important en el context de la tesi, una capacitat de permeació a través de la mucosa. A més la tesi també es centra en el disseny i el desenvolupament de mètodes i tècniques in vitro que ajudin a una millor selecció de sistemes eficients d’alliberament a través de la mucosa. Així s’ha desenvolupat un mètode simple i eficient, basat en la utilització de una microbalança de quartz amb dissipació (QCM-D). Aquest mètode ha permès avaluar la interacció de polímers i nanopartícules amb una capa de mucina. Els resultats obtinguts amb el mètode desenvolupat han permés dissenyar sistemes de nanopartícules amb un potencial més gran de permeació a través de la mucosa. Aquesta tècnica d’alta sensibilitat també ha ofert la possibilitat d’avaluar las dos propietats oposades, el coneixement de les quals és necessari per un correcte disseny de sistemes cpaços de creuar la mucosa: mucoadhesió vs mucopenetració. Los Poly(β-amino ester)s (PBAEs) s’han proposat com a sistemes biodegradables capaços de formar nanopartícules, per complexació amb DNA, que presenten una elevada capacitat de transfecció. Tanmateix, mostren problemes d’estabilitat en condicions fisiològiques i són incapaços de travessar la capa de mucosa. En aquesta tesi es descriu una nova solució en la preparació de les formulacions dels nanocomplejos basada en la utilització de recobriments que estabilitzen les nanopartícules i augmenten la seva permeabilitat. Els recubrimeintos proposats inclutyen: i) sucres (sucroses, trhalosa i manitol), ii) quitosà sense modificar de 22 KDa i amb 60-120 kDa, iii) quitosan modificat amb àcid tioglicolidoi i iv) acid poliacrílic-bromelaina. Totes les noves formulacions s’han avaluat amb diferents quantitat de recobriment. S’han determinat les seves propietats fisicoquímiques i la seva eficàcia de transfecció i citotoxicitat en front de cèl.lules COS-7. S’ha estudiat La difusió de las partícules a través de la mucosa gàstrica de porc utilitzant diferents tècniques com el tub rotatori de silicona o el multiple particle tracking (MPT). Els resultats obtinguts han mostrat la superior estabilitat, eficàcia de transfecció i permeabilitat sobre la mucosa de las noves formulacions dissenyades. / Existe un interés creciente, tanto en el mundo académico como en la investigación industrial en el desarrollo de sistemas de liberación de fármacos macromoleculares (proteínas, péptidos, oligonucleótidos) capaces de atravesar la mucosa. En este sentido, la utilización de vectores sintéticos para la liberación de dichas macromoléculas, permite disponer de una plataforma versátil y altamente eficiente. Sin embargo, la capa de mucosa con propiedades adhesivas y altamente viscoelástica, tiene una elevada capacidad de atrapar y eliminar cualquier sustancia extraña que quede adherida sobre su superficie, limitando, de forma evidente, la eficacia de cualquier tratamiento Esta Tesis se centra en el desarrollo de sistemas de liberación de ADN, diseñados a medida, que presentan una elevada estabilidad y eficacia de transfección con un nivel muy bajo de toxicidad y muy importante en el contexto de la tesis, una capacidad de permeación a través de la mucosa. Además la tesis también se centra en el diseño y el desarrollo de métodos y técnicas in vitro que ayuden a una mejor selección de sistemas eficientes de liberación a través de la mucosa. Así se ha desarrollado un método simple y eficiente, basado en la utilización de una microbalanza de cuarzo con disipación (QCM-D). Este método ha permitido evaluar la interacción de polímeros y nanopartículas con una capa de mucina. Los resultados obtenidos con el método desarrollado han permitido diseñar sistemas de nanopartículas con un mayor potencial de permeación a través de la mucosa. Esta técnica de alta sensibilidad también ha ofrecido la posibilidad de evaluar las dos propiedades opuestas, el conocimiento de las cuales es necesario para un correcto diseño de sistemas cpaços de cruzar la mucosa: mucoadhesió vs mucopenetració. Los Poly (β-amino ester)s (PBAEs) se han propuesto como sistemas biodegradables capaces de formar nanopartículas, por complejación con ADN, que presentan una elevada capacidad de transfección. Sin embargo, muestran problemas de estabilidad en condiciones fisiológicas y son incapaces de atravesar la capa de mucosa. En esta tesis se describe una nueva solución en la preparación de las formulaciones de los nanocomplejos basada en la utilización de recubrimientos que estabilizan las nanopartículas y aumentan su permeabilidad. Los recubrimeintos propuestos inclutyen: i) azúcares (sucrosa, trhalosa y manitol), ii) quitosano sin modificar de 22 KDa y con 60-120 kDa, iii) quitosano modificado con ácido tioglicólico y iv) ácido poliacrílico-bromelaina. Todas las nuevas formulaciones se han evaluado con diferentes cantidades de recubrimiento. Se han determinado sus propiedades fisicoquímicas y su eficacia de transfección y citotoxicidad frente a células COS-7. Se ha estudiado La difusión de las partículas a través de la mucosa gástrica de cerdo utilizando diferentes técnicas como el tubo rotatorio de silicona o el múltiple particle tracking (MPT). Los resultados obtenidos han mostrado superior estabilidad, eficacia de transfección y permeabilidad sobre la mucosa de las nuevas formulaciones diseñadas. / Mucus penetrating nanoparticle-based delivery systems of macromolecular drugs are currently receiving increasing attention in both academic and industrial research. Synthetic delivery systems provide highly suitable and tunable platform for the delivery of the macromolecules. However, a highly viscoelastic and adhesive mucus layer generally traps and rapidly removes most foreign substance from the mucosal surfaces, thereby limiting effectiveness of these nanocarriers. This Thesis is addressed to the development of engineering DNA delivery systems capable of high stability and transfection efficiency with low toxicity, and quickly crossing the mucus layer. Moreover, this Thesis is focused on design and development of methods and techniques in vitro in order to select more efficient delivery systems. A simple and efficient method, based on the use of the quartz crystal microbalance with dissipation (QCM-D) technique, is developed and evaluated the interaction of the polymers and nanoparticles with the mucin layer, resulting in the development of nanoparticle-based delivery systems to mucosal tissue. This highly sensitive technique also offers to evaluate the two opposing properties, needed for the design of efficient mucous permeation systems: mucoadhesion vs mucus penetration. Poly(β-amino ester)s (PBAEs) are currently considered of great interest as biodegradable polymeric carriers of DNA delivery, but they present limited stability in physiological conditions and the inability to penetrate the mucus layer. In this Thesis, we describe a novel surface-modified formulation of DNA delivery systems consisting of PBAE/DNA complexes and the coating agents, including: i) sugars (sucrose, trehalose or mannitol), ii) unmodified chitosan with a 22 kDa (CS) and a with a 60-120 kDa (CSM), iii) chitosan-thioglycolic acid (CS-TGA), and iv) poly(acrylic acid)-bromelain (PAA-BRO) conjugates. All novel formulations formed with different amounts of the coating agents are evaluated the physicochemical properties. The influence of coating agents on transfection efficiency and cytotoxicity is evaluated in COS-7 cells. Particle diffusion through porcine intestinal mucus (PImucus) is assessed by either rotating silicone tube technique or multiple particle tracking (MPT). The results highlight the superior stability, transfection efficiency and mucus permeability of the novel nanoparticle-based drug delivery systems. The effect of the amount of coating agents is also discussed.

La present tesi doctoral està adreçada al desenvolupament de catalitzadors que permetin dur a terme processos sintètics de manera més eficient i sostenible. Es presenten dues noves famílies de catalitzadors suportats, ambdues pertanyents al grup de complexos organometàl·lics moleculars immobilitzats sobre un suport sòlid. La primera família inclou complexos de Pd amb lligands carbè N-heterocíclic monodentats de gran impediment estèric, immobilitzats sobre òxids inorgànics, com ara sílicas, alúmina o òxid de titani. Aquesta família de catalitzadors es va aplicar en dos tipus de reaccions: i) reaccions d'acoblament C-C i ii) semireducción d'alquins. Entre les reaccions d'acoblament esmentades, els complexos de [Pd (NHC)] immobilitzats es van aplicar a les reaccions de Suzuki, Heck i Sonogashira, i es van avaluar en base a la seva activitat, selectivitat i reciclabilitat. A més, en el cas de les reaccions de Suzuki i Sonogashira, aquests catalitzadors també es van aplicar en condicions de flux continu. L'aplicació d'aquesta família de catalitzadors en la semireducció selectiva d'alquins es va dur a terme utilitzant dues metodologies diferents: utilitzant hidrogen molecular, o bé utilitzant el sistema trietilamina / àcid fòrmic com donador de H (condicions de transferència d'hidrogen). La segona família de catalitzadors suportats contempla complexos de Rh (I) estabilitzats amb lligands bidentats de tipus carbé N-heterocíclic, amb quiralitat axial, i funcionalitzats amb un grup piré. La immobilització d'aquests complexos de Rh sobre la superfície de nanotubs de carboni "multi-walled" va tenir lloc mitjançant interaccions de tipus "pi-pi stacking" entre la superfície dels nanotubs i el grup piré present en el lligand. Finalment, es presenten els resultats obtinguts en l'aplicació d'aquests complexos de Rh en diversos processos catalítics. / La presente tesis doctoral se centra en el desarrollo de catalizadores que permitan llevar a cabo procesos sintéticos de manera más eficiente y sostenible. Se presentan dos nuevas familias de catalizadores soportados, ambas pertenecientes al grupo de complejos organometálicos moleculares inmovilizados sobre un soporte sólido. La primera familia incluye complejos de Pd con ligandos carbeno N-heterocíclico monodentados de gran impedimento estérico, inmovilizados sobre óxidos inorgánicos, como sílicas, alúmina u òxido de titanio. Esta familia de catalizadores se aplicó en dos tipos de reacciones: i) reacciones de acoplamiento C-C y ii) semireducción de alquinos. Entre las reacciones de acoplamiento mencionadas, los complejos de [Pd(NHC)] inmovilizados se aplicaron en las reacciones de Suzuki, Heck y Sonogashira, y se evaluaron en base a su actividad, selectividad y reciclabilidad. Además, en el caso de las reacciones de Suzuki y Sonogashira, estos catalizadores también se aplicaron en condiciones de flujo continuo. La aplicación de esta familia de catalizadores en la semireducción selectiva de alquinos se llevó a cabo utilizando dos metodologías diferentes: utilizando hidrógeno molecular, o bien utilizando el sistema trietilamina/ácido fórmico como dador de H (condiciones de transferencia de hidrógeno). La segunda familia de catalizadores soportados contempla complejos de Rh(I) estabilizados con ligandos bidentados de tipo carbeno N-heterocíclico, con quiralidad axial, y funcionalizados con un grupo pireno. La inmovilización de estos complejos de Rh sobre la superficie de nanotubos de carbono "multi-walled" tuvo lugar mediante interacciones de tipo "pi-pi stacking" entre la superficie de los nanotubos y el grupo pireno presente en el ligando. Finalmente, se presentan los resultados obtenidos en la aplicación de estos complejos de Rh en varios procesos catalíticos. / The present PhD thesis aims at contributing to the development of more efficient and sustainable synthetic processes through catalysis. In this regard, two families of new solid-supported catalysts are presented. Both families belong to the group of molecularly defined organometallic complexes immobilized onto a solid support. The first family includes Pd complexes of sterically hindered monodentate N-Heterocylic Carbene ligands supported onto inorganic oxide materials, namely silicas, alumina and titania. This family of catalysts was applied in two types of reactions: i) C-C cross-couplings and ii) semireduction of alkynes. Among cross-coupling reactions, the supported [Pd(NHC)] complexes could be applied in Suzuki, Heck and Sonogashira couplings and their performance was assessed in terms of activity, selectivity and reusability. For the Suzuki and Sonogashira couplings, the catalysts were also appied under continuous flow conditions. The application of this family of catalysts in the selective reduction of alkynes was carried out following two different methodologies: using hydrogen gas, or using triethylamine/formic acid as the H-donor system (transfer hydrogenation conditions). The second family of solid-supported catalysts features Rh(I) complexes bearing axially chiral bidentate N-Heterocyclic carbene ligands functionalized with a pyrene moiety. Immobilization of these Rh complexes onto the surface of multi-walled carbon nanotubes was achieved by means of "pi-pi stacking interactions" between the surface of the nanotubes and the pyrene moiety present in the ligand. Results obtained from the application of these complexes as catalysts in various reactions are presented.

La tecnologia glicosintasa ha esdevingut una eina important per a la síntesi d’oligosacàrids, polisacàrids i glicoconjugats. Les glicosintases són glicosidases mutades desproveïdes d’activitat hidrolítica però capaces de catalitzar eficientment la formació d’enllaços glicosídics amb rendiments elevats en fer ús d’un donador glicosídic activat. A més a més, el donador activat i el seu producte de transglicosidació poden actuar com acceptors donant lloc a l’autocondensació del donador o a l’elongació del producte de transglicosidació, produint polisacàrids. En el present treball es pretén sintetitzar nous polisacàrids artificials funcionalitzats amb estructures definides mitjançant l’ús de la tecnologia glicosintasa. D’una banda, s’ha intentat augmentar la massa molecular dels polisacàrids fent ús d’un mòdul d’unió de carbohidrats (CBM). Aquest mòdul podria millorar la solubilitat dels nous polímers a mesura que es van sintetitzant durant la reacció de polimerització. L’efecte en el grau de polimerització ha estat estudiat tant pel mutant glicosintasa en presència de CBM com per la proteïna de fusió glicosintasa-CBM. D’altra banda, s’han sintetitzat polisacàrids artificials funcionalitzats a partir de donadors disacarídics activats on la funcionalització desitjada ha sigut prèviament introduïda a la posició C-6’. Aquests donadors funcionalitzats actuen com a substrat pel mutant glicosintasa que catalitzarà la reacció d’autocondensació. El grup azido va ser escollit com a un grup funcional adequat donada la seva versatilitat i mida, suficientment petit com per a ser acceptat per l’enzim. Els donadors fluorur de 6-azidolaminaribiosa i fluorur de 6-azidocel·lobiosa han estat sintetitzats i avaluats com a substrats per les reaccions glicosintasa amb el mutant E134S de la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis i el mutant E197A de la cel·lulasa d’Humicola insolens, respectivament. S’han sintetitzat 6-azido i 6-amino-6-deoxicel·luloses artificials amb una seqüència de funcionalització alternada. De forma oposada a la modificació química de cel·luloses on la seqüència de substitució és intrínsecament aleatòria, la polimerització catalitzada per glicosintases de donadors glicosídics modificats apropiadament, permet accedir a noves cel·luloses funcionalitzades amb seqüències de substitució definides i regulars. / La tecnología glicosintasa se ha convertido en una herramienta importante para la síntesis de oligosacáridos, polisacáridos y glicoconjugados. Las glicosintasas son glicosidasas mutadas desprovistas de actividad hidroítica pero capaces de catalizar eficientemente la formación de enlaces glicosídicos con rendimientos elevados utilizando un dador glicosídico activado. Además, el dador activo y su producto de transglicosidación pueden actuar como aceptores dando lugar a la autocondensación del dador o a la elongación del producto de transglicosidación, produciendo polisacáridos. En el presente trabajo se pretenden sintetizar nuevos polisacáridos artificiales funcionalizados con estructuras definidas mediante el uso de la tecnología glicosintasa. Por un lado, se ha intentado aumentar la masa molecular de los polisacáridos utilizando un módulo de unión de carbohidratos (CBM). Este módulo podría mejorar la solubilidad de los nuevos polímeros a medida que se van sintetizando durante la reacción de polimerización. El efecto en el grado de polimerización ha sido estudiado tanto para el mutante glicosintasa en presencia de CBM como para la proteína de fusión glicosintasa-CBM. Por otro lado, se han sintetizado polisacáridos artificiales funcionalizados a partir de dadores disacarídicos activados donde la funcionalización deseada ha sido introducida previamente en la posición C-6’. Estos dadores funcionalizados actúan como sustrato para el mutante glicosintasa que catalizará la reacción de autocondensación. El grupo azido fue escogido por ser un grupo funcional adecuado dada su versatilidad y tamaño, suficientemente pequeño como para ser aceptado por el enzima. Los dadores fluoruro de 6-azidolaminaribiosa y fluoruro de 6-azidocelobiosa han sido sintetizados y evaluados como sustratos para las reacciones glicosintasa con el mutante E134S de la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis y el mutante E197A de la celulasa de Humicola insolens, respectivamente. Se han sintetizado 6-azido y 6-amino-6-deoxicelulosas artificiales con una secuencia de funcionalización alternada. De forma opuesta a la modificación química de celulosas donde la secuencia de sustitución es intrínsicamente aleatoria, la polimerización catalizada por glicosintasas de dadores glicosídicos modificados apropiadamente, permite acceder a nuevas celulosas funcionalizadas con secuencias de sustitución definidas y regulares. / The glycosynthase technology has become a powerful enzymatic tool for the synthesis of oligosaccharides, polysaccharides and glycoconjugates. Glycosynthases are mutated glycosidases devoid of hydrolase activity but able to efficiently catalyze the formation of glycosidic bonds in high yields when using an activated glycosyl donor. In addition, the activated donor and its transglycosylation product, can both act as acceptors leading to the autocondensation of the donor or to the elongation of the transglycosylation product leading to polysaccharides. The present work aims to synthesize novel artificial functionalized polysaccharides with defined structures by the use of the glycosynthase technology. On the one hand, an increase in the molecular weight of the polysaccharides is attempted by the use of a carbohydrate binding module (CBM). This module might improve the solubility of the new polymers that are synthesized during the polymerization reaction. The effect on the polymerization degree has been studied for both the glycosynthase mutant in the presence of CBM and for the fusion protein glycosynthase-CBM. On the other hand, functionalized artificial polysaccharides have been synthesized from activated disaccharidyl donors where the desired functionalization has been introduced at position C-6’. These functionalized donors act as a substrate for the glycosynthase mutant that will catalyze the autocondensation reaction. The azido group was chosen as a suitable functional group given its versatility and its size, small enough to be accepted by the enzyme. Donors 6-azidolaminaribiosyl fluoride and 6-azidocellobiosyl fluoride have been synthesized and evaluated as substrates for the glycosynthase reactions by the E134S 1,3-1,4-β-glucanase from Bacillus licheniformis mutant and the E197A cellulase mutant from Humicola insolens, respectively. Artificial 6-azido- and 6-amino-6-deoxicelluloses with an alternating functionalization pattern have been produced. As opposed to chemically modified celluloses where the substitution pattern is intrinsically random, the glycosynthase-catalyzed polymerization of properly modified glycosyl donors gives access to novel functionalized celluloses with defined and regular substitution patterns.