Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRB) / The Pauson-Khand reaction (PKR) is, formally, a [2+2+1] cycloaddition involving an alkene, an alkyne and a carbon monoxide molecule, typically mediated or catalyzed by a cobalt (0) complex. The product of this reaction is a cyclopentenone. This reaction, discovered in 1973 by P. L. Pauson and I. U. Khand constitutes, nowadays, one of the most prominent methods for the synthesis of five-membered ring compounds. Regarding whether the alkene and the alkyne belong to the same molecule or are two different entities, we refer to the intra or intermolecular PKR, respectively. The intramolecular PKR has been the most extensively used one, since it allows the formation of complex polycyclic structures in very few synthetic steps and both the regio and stereoselectivity of the reaction are substrate-controlled. The intermolecular PKR has been traditionally less studied and exploited due to the limitations it presents. First of all, when the alkyne is internal and non-symmetrical the reaction may yield mixtures of regioisomers in different proportions depending on the electronic and steric properties of the substituents. If the reaction is carried out with a terminal alkyne, only one product is formed: the one that has the substituent alpha to the carbonyl in the final cyclopentenone. On the other hand, the reaction is very tolerant to different alkynes, but only tensioned and cyclic alkenes react satisfactorily, ethylene being an exception to this rule. Cyclopentanic compounds are very abundant in nature, and they present a great variety of structures and functions. Probably, two of the most well-known families of cyclopentanic compounds in nature are prostaglandins and phytoprostanes. Prostaglandins are generated by the action of cyclooxygenase (COX) on the fatty acids that come from the phospholipid bilayer. The most common substrate for this reaction cascade in the human body is arachidonic acid. In plants, a similar process occurs with linolenic acid as substrate and the family of phytoprostanes as product. The extremely interesting properties of these compounds, such as antitumor activity, along with the difficulty to isolate them from natural sources, has led to an increasing interest on finding simple and efficient methods to access them. The fact that these products share a cyclopentenone ring (or a derivative) as a structural feature makes them aperfect synthetic target for the PKR. During the present thesis, we have developed a methodology to synthesize prostaglandins and phytoprostanes from the PK adduct of norbornadiene and N-Bocpropargylamine. The synthesis of the aforementioned starting material can be carried out enantioselectively, so that the synthetic target can also be obtained as a single enantiomer. This methodology has been applied to the synthesis of a natural phytoprostane derivative: the methyl ester of 13-epi-12-oxo Phytodienoic acid. The introduction of fluorinated substituents in organic molecules is extremely interesting, since the presence of these functional groups modifies the chemical and physical properties of the molecules to which they are incorporated. Given that, at the beginning of this thesis, there were no precedents of the intermolecular PKR of fluorinated alkynes, and considering that the particular stereoelectronic properties of these products could have an interesting impact on the regiochemical outcome of the PKR, we decided to study them in this work. Our main conclusion has been that fluorinated substituents always occupy the alpha position to the carbonyl in the final cyclopentenone. This fact indicates that the steric bulk of fluorinated groups is larger than expected and overcomes its electronic properties (it is accepted that electron-donating groups prefer the alpha position in the final PK adduct, whereas electron-withdrawing groups prefer the beta position). Furthermore, in the case of trifluoromethyl alkynes, we have developed a methodology that allows to remove this group in order to obtain the previously unknown beta-substituted regiosiomers of PK adducts of terminal alkynes. We have also developed a methodology to carry out the synthesis of trifluoromethyl PK adducts enantioselectively. As an application of our methodology, we have developed a formal synthesis of alpha-cuparenone, a naturally occurring sesquiterpene. / La reacción de Pauson-Khand (PKR) es, formalmente, una cicloadición [2+2+1] que transcurre entre un alqueno, un alquino y una molécula de monóxido de carbono. Como producto de esta reacción, típicamente mediada o catalizada por un complejo de cobalto (0), se genera una ciclopentenona. Los compuestos ciclopentánicos son muy abundantes en la naturaleza, y presentan gran variedad estructural y funcional. Probablemente, dos de las familias de compuestos ciclopentánicos más conocidas son la de las prostaglandinas y la de los fitoprostanos. En los últimos años se ha descubierto que algunos de estos productos (o derivados) poseen propiedades altamente interesantes (como, por ejemplo, actividad antitumoral). La dificultad de aislarlos de fuentes naturales ha despertado un gran interés por desarrollar métodos eficientes para obtenerlos sintéticamente. Dado que estos productos comparten un anillo de ciclopentenona como elemento estructural, constituyen unos substratos ideales para ser sintetizados mediante una PKR. Durante la presente tesis se ha desarrollado una metodología para sintetizar prostaglandinas y fitoprostanos a partir del aducto de PK del norbornadieno y la N-Bocpropargilamina. La síntesis de dicho producto de partida puede realizarse de manera enantioselectiva, de modo que el producto final puede obtenerse, asimismo, de modo ópticamente enriquecido. Esta metodología se ha ensayado con la síntesis del éster metílico de un fitoprostano natural: el ácido 13-epi-12-oxo fitodienóico. Por otro lado, al inicio de esta tesis, no se había realizado nunca una PKR intermolecular con alquinos fluorados y considerando que las particulares propiedades esteroelectrónicas de estos productos podían influir de un modo interesante en la regioquímica de la reacción, decidimos estudiarlos en profundidad durante esta tesis. La principal conclusión que se ha obtenido es que los substituyentes fluorados siempre ocupan la posición alfa al carbonilo en las ciclopentenonas finales. En el caso de que el substituyente fluorado sea un trifluorometilo, se ha desarrollado una metodología que permite quitarlo para obtener los hasta ahora desconocidos regioisómeros de aductos de PK de alquinos terminales. También se ha desarrollado una metodología para realizar dichas PKRs de forma asimétrica y obtener los aductos ópticamente puros. Como aplicación de esta estrategia, se ha realizado una síntesis formal de la alfa-cuparenona, un sesquiterpeno natural.

Dendrimers are a class of globular highly branched macromolecules with precise architecture. They consist of a multivalent surface with functional group, a core unit where branching starts, and the interior is made of branching units and the void space in between the branched. Interesting properties of dendrimers are monodispersity, multivalency and a globular geometry. Click chemistry is a ‘set of powerful, highly reliable, and selective reactions for the rapid synthesis of useful new compounds and combinatorial libraries’. The most commonly used click reaction is the copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). Click chemistry is a powerful tool for the construction and functionalization of dendrimers. The principle objective of the present thesis is the use of click chemistry for the synthesis of higher generation dendrons and exploring the possible use of these dendrons for biomedical applications. The first generation dendrons which were synthesized in this work consist of two distinct parts: 1) a core unit derived from the acid diethylene triamine pentaacetic acid (DTPA); 2) monodisperse chains of oligoethylene glycol (OEG) of exact length which are coupled to the DTPA core unit by amide bond formation. The second and third generation dendrons were obtained in two steps: 1) conversion of the surface functional groups to azides; 2) coupling the azide building block unit to the azides of the core unit through CuAAC. Apart from the synthesis of the dendrons using click chemistry, the present thesis also described some biomedical applications of the mentioned dendrons. The core unit derived from DTPA is orthogonally protected and this allows functionalizing the dendrons with distinct moieties. Furthermore, the DTPA derivative endows the dendrons the intrinsic capability to chelate metal ions. The chelation depends on the type of complexated metal ion and also on the functional group in the focal point of the dendron. The metals which can be chelated include gadolinium, terbium and indium, all of which are interesting for medical imaging purposes. Chelating gadolinium with dendrons increase the relaxivity induced by the gadolinium ion because the size of the dendrons slows down the rotation of the metal center. Also, the relaxivity is increased due to the hydrophilic character of the dendrons. Combining the ability to chelate with the multivalency of the dendrons several multimodal platforms for medical imaging were constructed. The platforms were functionalized with targeting peptides and a fluorophore and the DTPA derived core unit carried an isotope of indium. Internalization assays demonstrated that the peptides were able to direct the platforms towards the targeted cells and other preliminary in vivo experiments indicated that the constructs accumulated in the tumors as shown in fluorescence and SPECT imaging. Other dendrons were synthesized to serve as cross-linking agents of bio functionalization platforms. The cross-linking agents were composed of four azides and one bioactive moiety and are used to form hydrogels with the biopolymer hyaluronic acid. The biofunctionalization platforms were composed of four peptides and one azide for coupling the dendron. Using these platforms, peptides sequences could be introduced into the hydrogel and this works to augment the viability of the implanted cells. Finally, an OEG-based dendron was used in combination with carbosilane dendrons to construct hybrid dendrons to bind DNA. The hybrid molecules displayed less cytotoxicity and were more effective delivering genetic material. In conclusion, it has been demonstrated that click chemistry is a powerful tool for the synthesis and versatile applications of OEG-based dendrons. / Los dendrímeros son una clase de macromoléculas que se caracterizan por tener una estructura altamente ramificada. Los dendrímeros contienen una superficie multivalente con los grupos funcionales, un núcleo donde empieza la ramificación eun interior constituido por los puntos de ramificación y los espacios vacíos entre las ramas. Las propiedades más interesantes de los dendrímeros incluyen su monodispersidad, multivalencia y geometría globular. La química click es un ¿grupo de reacciones que son poderosas, fiables y selectivas para la síntesis rápida de compuestos útiles y bibliotecas combinatorias¿. El mejor ejemplo de química click es la cicloadición catalizada por cobre entre azidas y alquinos (CuAAC). La química click es una herramienta poderosa para construir y funcionalizar dendrimeros. El objetivo principal de la presente tesis ha sido utilizar la química click para la síntesis de dendrones de generaciones elevadas y explorar la posibilidad de aplicar estos dendrones para aplicaciones biomédicas. Los dendrones de primera generación sintetizados en este trabajo consisten de dos partes distintas: 1) un núcleo derivado del ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA); 2) unas ramas monodispersas de oligoetilenglicol (OEG) que se acoplan al núcleo de DTPA a través de la formación de un enlace amida. Los dendrones de generación 2 y 3 se pueden obtener mediante dos pasos: 1) la conversión de grupos funcionales en la superficie a azidas; 2) acoplando el building block dendron con un alquino a la azida a través de la CuAAC. Aparte de la síntesis de los dendrones utilizando la química click, la presente tesis también describe unas aplicaciones biomédicas de estos dendrones. El núcleo basado en DTPA está protegido de una manera ortogonal y esto permite funcionalizar los dendrones con grupos distintos. El derivado de DTPA también otorga a los dendrones una capacidad intrínseca de complejar iones de metales. La complejación depende del tipo de metal complejado y del grupo funcional en el punto pocal del derivado de DTPA. Los metales que se complejan incluyen gadolinio, terbio e indio, los cuales son interesantes para aplicaciones de imagen médica. Complejando gadolinio los dendrones aumentan la relaxividad causado por el ion de gadolinio porque el tamaño mayor de dendron ralentiza la rotación del metal. También la relaxividad se aumenta por el carácter hidrófilo de los dendrones. Combinando la capacidad de quelar con la multivalencia del dendron se construyeron distintas plataformas multimodales para la imagen médica. Las plataformas se funcionalizaron con péptidos diriguidores y un fluoroforo y el nucleo basado en DTPA llevaba un isotopo de indio. Ensayos de internalización mostraron que los péptidos eran capaces de dirigir las plataformas a las células dianas y unos experimentos preliminares in vivo indicaron que los constructos se acumularon en tumores lo cual se podía visualizar por fluorescencia y por SPECT. Se sintetizaron dendrones como agentes de cross-linking o plataformas de biofuncionalizacion. Los agentes de cross-linking llevan cuatro azidas y un grupo bioactivo y sirve para formar un hidrogel con el biopolímero acid hyaluronico. Las plataformas de biofuncionalizacion tienen cuatro péptidos y una azida para acoplar el dendron al biopolímero. Así se pueden introducir grupos peptídicos en el hidrogel y esto sirve para aumentar la viabilidad de las células implantadas Finalmente se utilizaron los dendron de OEG en conjunto con dendrones de carbosilano para preparar dendron híbridos para complejar ADN. Estos hibridos mostraron menos citotixicad y tenían una mayor capacidad de entregar material genético. En conclusión, se ha mostrado que la química click es una herramienta potente para la síntesis y aplicación diversa de dendrones basados en OEG.

Molt sovint les seqüències de DNA repetitives adopten conformacions diferents a l'habitual estructura de B-DNA. Aquestes conformacions alternatives afecten esdeveniments genètics fonamentals, com poden ser la replicació, la transcripció, la reparació i la recombinació del DNA, induint inestabilitat en el genoma i, en darrer terme, conduint a diferents malalties. En les patologies neurològiques causades per l'expansió de repeticions de triplets, aquestes seqüències repetitives poden adoptar estructures inusuals en el DNA, mentre que els trànscrits de RNA poden, en alguns casos, estructurar-se en forma de llargues forquetes (hairpins) amb bases desaparellades, les quals es troben implicades en la patogènesi dels trastorns. L'ús d'oligonucleòtids curts com a models per analitzar les conformacions de llargues cadenes de DNA i RNA es veu obstaculitzat per la baixa estabilitat, tant estructural com tèrmica, dels primers en comparació amb els àcids nucleics nadius. En aquest sentit, la incorporació de restriccions conformacionals als models d'oligonucleòtids pot facilitar el seu estudi estructural. El nostre objectiu ha estat el desenvolupament de diferents eines químiques que redueixin la variabilitat conformacional dels oligonucleòtids sintètics amb seqüències repetitives, en particular els formats per les repeticions dels triplets CTG i CUG implicats en la distròfia miotònica. La primera aproximació que vam dur a terme per tal d’introduir restriccions conformacionals va consistir en la ciclació d’oligonucleòtids en fase sòlida, però va resultar infructuosa. A continuació, vam intentar una estratègia de ciclació assistida per motlle, on les guanosines del precursor lineal van ser parcialment protegides per així evitar la hibridació amb el motlle. Aquesta aproximació va requerir la preparació d'un nou derivat fosforamidit de la guanosina, en el qual la nucleobase es trobava protegida tant en N2 com en O6. Usant aquesta estratègia vam poder preparar amb èxit un 42mer cíclic, el qual contenia catorze repeticions del triplet CUG i on part de les guanines es trobaven parcialment protegides. No obstant això, les condicions per a la desprotecció final de les guanines no van poder ser totalment optimitzades. Una segona aproximació per tal de reduir la variabilitat conformacional dels àcids nucleics, de la qual es troben descrits nombrosos precedents, és la introducció d'entrecreuaments en els oligonucleòtids. En aquest sentit hem dissenyat i desenvolupat un mètode senzill i eficaç per introduir un entrecreuament entre les cadenes complementàries d'un dúplex. Aquest enllaç covalent no natural no pertorba de forma significativa l'estructura de B-DNA i augmenta de manera important l'estabilitat tèrmica dels dúplexs. A més a més, l'entrecreuament és reversible, podent-se eliminar si així es desitja, sent aquesta reversibilitat una de les propietats desitjades en tals unions. / Quite often, non-B DNA structures are constituted by repetitive DNA sequences. These alternative conformations affect key genetic events such as DNA replication, transcription, recombination and repair, inducing genome instability and eventually leading to human diseases. In the neurological diseases caused by triple repeat expansions, these repeats form unusual non-B DNA structures and, in some cases, long mismatched hairpins of the RNA transcripts are involved in the pathogenesis of the disorders. Use of short oligonucleotide models to get insight into the conformations of large DNAs and RNAs is hampered by the low structural and thermal stability of the former as compared to the native nucleic acids. Therefore, the incorporation of conformational constraints into the oligonucleotide models may facilitate their structural study. Our aim has been to develop chemical tools that reduce the conformational space accessible to synthetic oligonucleotides, in particular those formed by the CTG and CUG triple repeats involved in myotonic dystrophy. Our first approach to introduce conformational constraints was solid-phase cyclization, but it proved impractical. We then tried a template-assisted cyclization approach, where the guanosines of the linear precursor were partially protected to prevent hybridization with the template. This required preparation of a new guanosine phosphoramidite derivative in which the nucleobase was both N2- and O6-protected. This approach successfully furnished a partially guanine-protected cyclic 42mer containing fourteen CUG repeats. However, conditions for the final guanine deprotection could not be completely optimized. The second, well-established approach to reduce the conformational mobility of nucleic acids is to form cross-links. We have devised and developed a straightforward method to introduce a cross-link between the complementary chains of a duplex. The nonnatural covalent linkage did not significantly perturb B-DNA structure and dramatically increased the thermal stability of the duplex. Additionally, the cross-link is reversible, which is one of the desired properties of such unions.

L'interès principal d'aquesta tesi es centra en la utilització de les tècniques combinatòries per a dissenyar i sintetitzar una quimioteca de peptoides. Els peptoides són un tipus de peptidomimètics amb una estructura general basada en un esquelet de glicinies N-substituídes. Tenen una estructura molt apropiada per a ser sintetitzats en fase sòlida seguint l'estratègia combinatòria del rastreig posicional, basada en la utilització de mescles de reactius en les etapes d'introducció de diversitat. Seguint aquesta estratègia s'ha sintetitzat una quimioteca de mescles controlades de 5120 peptoides (trímers d'N-alquilglicina). Els peptoides tenen un gran interès en l'àrea biomèdica. Així doncs, el cribratge de la quimioteca de peptoides davant diverses dianes biològiques d'interès terapèutic ha permès la identificació de dos potents neutralitzadors del fenotip d'MDR en l'àrea del càncer, així com de dos potents inhibidors d'LPS en l'àrea del shock sèptic. Aquests compostos han representat un punt de partida per a l'optimització de les seves estructures per a dissenyar nous compostos conformacionalment més restringits que augmentin l'activitat i millorin la selectivitat cap a la diana d'interès.Per altra banda, s'ha portat a terme l'optimització d'un procés per a obtenir peptoides amb un extrem carboxílic terminal (peptoides àcids), seguint dues estratègies: per hidròlisi de peptoides en dissolució i per síntesi en fase sòlida. L'optimització del procés d'hidròlisi en dissolució s'ha dut a terme mitjançant un disseny d'experiments factorial, obtenint excel·lents resultats de pureses i rendiments, mentre que la síntesi de peptoides àcids en fase sòlida ha implicat treballar amb diversos tipus de resines, sent la clorur de 2-clorotritil la que va donar els millors rendiments i pureses. L'interès d'obtenir aquest tipus de derivats àcids radica en el fet de poder acoplar els peptoides a suports sòlids, com columnes d'agarosa o sefarosa, així com poder biotinilitzar-los per acoplar-los a columnes d'agarosa amb avidina. Amb aquest tipus de columnes amb el peptoide immobilitzat s'ha utilitzat la tècnica de la cromatografia d'afinitat per a identificar les dianes potencials d'un peptoide d'un extracte proteic que contenia proteïnes de diferent naturalesa.A partir de l'estudi realitzat per a obtenir peptoides àcids, s'ha dut a terme la realització d'un estudi per obtenir peptoides dímers i de peptoides dímers-cíclics, en fase sòlida i en dissolució. Aquests estudis han constituït un punt d'inici per al plantejament del disseny i síntesi de noves quimioteques combinatòries de mescles, que es realitzarà en un futur pròxim en el nostre grup d'investigació. Aquest tipus de molècules poden resultar ser molt interessants en estudis d'interacció proteïna-proteïna.Dins del context del cribratge de la quimioteca davant diferents dianes biològiques, s'ha intentat desenvolupar un assaig de fluorescència per a cribrar la quimioteca de peptoides davant la seva capacitat d'inhibir la fosforilació d'un substrat peptídic fluorescent per la proteïna cinasa A. Malauradament, s'ha comprovat que el grup fluoròfor escollit, la 7-amino-4-metilcumarina, adjacent al lloc de fosforilació del pèptid, no ha induït pràcticament cap diferència d'intensitat de fluorescència després de la reacció de fosforilació per la proteïna.Globalment, aquest treball reflecteix la validesa de la utilització i aplicació de la química combinatòria, en concret de quimioteques de mescles controlades, per a la recerca de compostos amb activitats biològiques. No obstant, en funció de les dades que es coneguin del receptor i/o dels llocs d'interacció, és convenient dissenyar la quimioteca de forma més focalitzada o de forma més diversa. En aquest disseny, tant si és inicial com si és d'optimització d'un cap de sèrie, és cada vegada més evident la importància i necessitat de l'ús d'eines computacionals i d'estudis in silico per cobrir el màxim espai de diversitat i estalviar temps i costos d'experimentació al laboratori. / Peptoids are oligomers of N-substituted glycines residues that have been developed as peptidomimetics but with improved stability and better pharmacological properties. For these reasons, peptoids have also been subjected of application of combinatorial approaches to identify bioactive molecules. In this context, we have synthesised a combinatorial library of peptoids containing 5120 compounds in 52 controlled mixtures, constructed on solid-phase by using the positional scannig format. The screening of the peptoid library against different biological targets have identified potent hits. To sum up, two molecules have been rescued from the library with a potent chemosensitiser activity against the MDR phenotype, and two other molecules have been identified with an in vivo neutralizing activity against the Gram-negative lipopolysaccharide (LPS). Optmisation of these hits is in progress to find lead compunds that may become potential drugs. On the othe hand, we have been interested in expanding the combinatorial chemistry of peptoids to those analogues bearing free carboxylic acid groups, prepared in solution and on solid phase. These compounds are attractive to link to solid-support columns in order to use the affinity cromatography to identify potential targets. As well as this, we have studied the conditions for the efficient linear condensation and cyclocondensation of these acid peptoids.Finally, we have tried to develop a fluorescent assay for the screening of the peptoid library against the phosphorylation of a fluorescent peptide by the protein Kinase A. However, there has no been detected any difference in the fluorescent intensity with the group 7-amino-4-methylcoumarin, located next to the phosphorilation site.

La recerca en el camp del desenvolupament de fàrmacs peptídics i peptidomimètics ha experimentat una evolució important durant els darrers anys. Els fàrmacs peptídics sovint presenten baixa disponibilitat oral, una vida mitjana curta, accions múltiples i àmplies fluctuacions en el seu comportament farmacocinètic. D'aquí la necessitat de desenvolupar pèptids modificats o peptidomimètics amb propietats que millorin aquests inconvenients. Una de les idees més interessants en aquest camp va ser el trasllat de la cadena lateral de l'àtom de carboni de l'aminoàcid a l'àtom de nitrogen de l'enllaç amida, tot conduint a oligòmers de glicines N substituïdes, compostos que van ser anomenats peptoides. Aquestes estructures presenten clars avantatges davant dels pèptids, com ara una estabilitat metabòlica més elevada que els fa resistents a la degradació per proteases. A més, es poden sintetitzar amb una gran variabilitat de grups funcionals, són més flexibles degut a l'absència de ponts d'hidrogen augmentant l'espai conformacional capaç d'interaccionar amb diferents dianes terapèutiques, i presenten un esquelet estructural molt apropiat per aplicar-hi estratègies combinatòries.L'absència de regeneració neuronal en el sistema nerviós central adult és un greu problema sanitari i social. Estudis recents indiquen que el bloqueig d'inhibidors endògens del recreixement axonal pot constituir una nova via per estimular la regeneració neuronal. En aquest sentit, el descobriment de la família de les semaforines (i els seus receptors: les neuropilines), els inhibidors més potents del creixement axonal, ofereix un ampli ventall de noves possibilitats experimentals i terapèutiques en regeneració neuronal. Les semaforines (SEMA) són una gran família de proteïnes secretades o associades a la membrana que actuen com a quimiorepel·lents o inhibidors dels axons, tot afectant la seva direcció de creixement, la seva fascicul·lació i ramificació així com la formació de la sinapsi.Fruit de la col·laboració amb altres grups d'investigació es va identificar, mitjançant el cribratge d'una quimioteca de peptoides, el peptoide SICHI com a inhibidor de la quimiorepulsió induïda per semaforines. La síntesi posterior d'aquest compost ens va conduir a la detecció de la formació de subproductes cíclics que impedien l'obtenció del peptoide desitjat amb rendiments de reacció acceptables. Per aquest motiu, es va plantejar la síntesi de SICHI mitjançant la combinació de monòmers d'N-alquilglicines. L'aplicació d'aquesta estratègia va obligar a desenvolupar una metodologia de síntesi dels mencionats monòmers. Es van desenvolupar un total de tres rutes sintètiques, utilitzant en cadascuna d'elles un grup protector diferent. Una vegada optimitzades, es va fer la síntesi de SICHI mitjançant l'acoblament d'aquests monòmers. El rendiment global de la síntesi va ser satisfactori, la qual cosa va permetre completar els estudis de funcionalitat d'aquest peptoide.En la segona part de la tesi, es va decidir sintetitzar una nova quimioteca optimitzada de 625 pentàmers d'N-alquilglicines i 20 mescles controlades, en fase sòlida i en format de rastreig posicional. La síntesi dels peptoides es va fer seguint l'estratègia del submonòmer, mitjançant cicles successius constituïts per una etapa d'acilació amb àcid bromoacètic i una etapa de desplaçament del bromoderivat corresponent per una amina primària. La innovació d'aquesta quimioteca radica en la utilització de la radiació de microones per accelerar les etapes de reacció. Per a les posicions de diversitat química es van escollir un total de 10 amines primàries, tenint en compte diferents criteris com hidrofobicitat, presència de grups aromàtics, possibilitat de formar ponts d'hidrogen, etc. D'acord amb el format del rastreig posicional, es va realitzar un estudi de reactivitat de les amines primàries utilitzades en les etapes d'introducció de diversitat per tal d'assegurar reactivitats similars entre elles. La quimioteca ha estat assajada fins al moment contra diverses dianes terapèutiques d'interés, amb resultats satisfactoris en l'àrea de la diabetis i el càncer. / Peptoids are oligomers of N-substituted glycines residues that have been developed as peptidomimetics but with improved stability and better pharmacological properties. For these reasons, peptoids have also been subjected of application of combinatorial approaches to identify bioactive molecules. In this context, the screening of a peptoid library identified a peptoid called SICHI as a potent inhibitor of semaphorin induced chemorepulsion activity. Subseqüent synthesis of this peptoid drove to detection of cyclic byproducts avoiding peptoid obtention in acceptable yield. For that reason, we proposed SICHI's synthesis through the combination of N-alkylglycine monomers. The application of this strategy forced us to develope a methodology of monomers synthesis. We developed three synthetic routes, using a different protecting group on each one. Once all of them were optimized, we synthesized SICHI by coupling those monomers. The yield was satisfactory, allowing us to complete functionality studies of this peptoid.In the second part of the thesis, we decided to synthesize a new optimized library of pentamers containing 625 compounds in 20 controlled mixtures, constructed on solid-phase by using the positional scanning format following the submonomer strategy. An important innovation was introduced by the application of microwave irradiation to accelerate the reaction steps. We selected 10 primary amines for diversity positions considering hydrofobic properties, presence of aromatic goups, possibility of hydrogen bridge formation, etc. As positional scanning requires, we developed a reactivity study of the primary amines used to insure similar reactivity between them. The library has been tested against different therapeutic targets, obtaining satisfactory results in the fields of diabetes and cancer.

Les malalties de transmissió alimentària, especialment les que posen en perill la vida, incideixen en un dels requisits bàsics per a la salut i el benestar de les persones: la necessitat d'aliments innocus i exempts de contaminació. Aquestes tipus de malalties han estat presents durant tota la història i en la societat actual han en alguns casos esdevingut un important problema de salut pública. El principal factor que ha contribuït a aquesta problemàtica és la globalització, la qual permet que de forma ràpida i extensa les intoxicacions alimentàries puguin afectar la població. La síndrome de l'oli tòxic (SOT) que va aparèixer repentinament a Espanya l'any 1981 va afectar a més de 20.000 persones i va provocar més de 400 morts. Estudis epidemiològics i d'anàlisi química d'olis relacionats amb la SOT van relacionar la malaltia amb el consum d'oli de colza desnaturalitzat amb anilina, refinat il·legalment, barrejat amb altres olis i venut com a comestible. Tot i que 25 anys més tard es continua sense identificar els veritables agents causants de la intoxicació, es coneix que les anilides dels àcids grassos són bons biomarcadors de l'oli adulterat i que els derivats acilats del 3-(fenilamino)propan-1,2-diol (PAP) ho són de l'oli tòxic. Per aquest motiu, aquests darrers composts han estat senyalats com els principals sospitosos d'haver causat la intoxicació i així es justifica l'interès que ha desvetllat el seu estudi en el últims anys. Els estudis realitzats en la present tesi han estat centrats en realitzar noves aportacions relacionades amb la SOT, les quals es poden resumir en tres punts. Per una banda s'ha dut a terme l'obtenció d'un model d'oli tòxic el qual reproduís de la forma més fidel els olis causants de la intoxicació. Aquests olis s'han obtingut amb concentracions d'anilides i de derivats del PAP de l'ordre dels associats amb la SOT. Per tal d'obtenir els nivells desitjats d'anilides i de derivats del PAP, s'ha desenvolupat un procés model de desodorització mitjançant el qual es controlaria l'efecte de les diverses variables que influeixen en la formació d'aquests derivats anilínics. Una altra aportació que s'ha realitzat és la síntesi d'estàndards de compostos de la família dels derivats del PAP els quals han estat identificats en els olis models realitzats en el nostre laboratori. Finalment s'ha dut a terme un estudi exhaustiu de la formació dels derivats anilínics en olis models, així com la seva interrelació i reactivitat en les condicions de desodorització i d'emmagatzematge, amb la finalitat de trobar una explicació a les diferències observades entre els olis tractats a Catalunya i els de Sevilla pel que fa a la seva composició química. / Toxic Oil Syndrome (TOS) was a food-born intoxication that occurred in Spain in 1981. It caused over 400 deaths and affected more than 20,000 people. TOS was attributed to the ingestion of rapeseed oil that had been adulterated with aniline, illegally refined and delivered for human consumption. Two chemical species derived from aniline have been identified in oil batches: fatty acid anilides, qualified as biomarkers of the adulterated oil, and fatty acid esters of 3-(N-phenylamino)propane-1,2-diol (PAP), considered toxic oil biomarkers. These compounds were generated by chemical processes during oil refining, specifically in the deodorization step, which involves treatment of the oil at high temperatures under vacuum to remove volatile contaminants. Taking precedent into account, the initial objective of the present thesis was to reproduce on a laboratory scale the deodorization process that would have taken place at the refinery involved with TOS. Specifically, the production of refined, aniline-denatured rapeseed oils with a composition of aniline derivatives similar to that found in the toxic oil batches was attempted. Such model oils would then be used for conducting further studies in animals. On the other hand, we have synthetised a family of PAP derivatives that have been identified in laboratory-processed oils. Finally, we focused on the formation, the interactions and the reactivity between OOPAP, OPAP, and OA. Of particular interest was the interaction observed between OOPAP and OA. This relationship was investigated in more depth to evaluate its potential relevance to the final composition of the toxic oil model as well as to the toxicity of TOS.

En la present Tesi Doctoral en primer lloc s’ha completat un estudi previ de reaccions aldòliques d’α-hidroxi metil cetones, tant per a grups protectors benzílics com silílics. Així, al Capítol 1 s’ha demostrat que la tria adequada del grup protector de l’α-hidroxi cetona i l’àcid de Lewis permet accedir a aldols 1,4-anti o 1,4-sin amb bons rendiments (5697%) i diastereoselectivitats en ocasions excel•lents (fins a rd 96:4), dins el context de l’aldòlica d’acetat. Les metodologies desenvolupades també s’han avaluat amb aldehids quirals en processos doblement asimètrics. La notable capacitat d’inducció asimètrica dels enolats de titani d’α-benziloxi metil cetones ha quedat demostrada per l’obtenció dels seus aldols amb unes diastereoselectivitats excel•lents, independentment de la configuració de l’aldehid. Fins i tot, un d’aquests aldols obtingut enantiomèricament pur s’ha utilitzat en la síntesi del fragment C12C16 de l’epotilona B. A més, una seqüència de reacció aldòlica-reducció desenvolupada anteriorment al grup s’ha aplicat a l’(S)-3-tert-butildimetilsililoxi-4-metil-2-pentanona per obtenir els corresponents triols 1,2-sin-2,4-sin amb rendiments excel•lents (9192%) i un control estereoquímic que depèn, majoritàriament, de la reacció aldòlica inicial (rd 80:2094:6). Al Capítol 2 s’ha demostrat la utilitat sintètica de les reaccions aldòliques d’enolats de titani d’α-hidroxi etil cetones desenvolupades anteriorment en el grup de recerca. Aquestes metodologies s’han aplicat amb èxit en la síntesi total de l’herboxidiè, contribuint a la construcció de gran part del seu esquelet carbonat i dels estereocentres requerits. La reacció aldòlica de l’(S)-2-benziloxi-3-pentanona i la seqüència d’aldòlica-reducció de l’(R)-2-tert-butildimetilsililoxi-3-pentanona han estat etapes clau en la síntesi dels fragments C1C9 (17%, deu etapes) i C10C19 (43%, set etapes), respectivament. La unió d’aquests fragments ha permès obtenir l’herboxidiè amb un 8% de rendiment global amb la seqüència lineal més llarga de catorze etapes. Després d’haver estudiat a fons les reaccions aldòliques d’enolats de titani d’α-hidroxi cetones, s’ha explorat la reactivitat d’aquests nucleòfils en altres processos de construcció d’enllaços CC. Al Capítol 3 s’ha desenvolupat l’addició de Michael de l’enolat de titani de l’(S)-2-benziloxi-3-pentanona a cetones α,β-insaturades, amb què s’han obtingut els corresponents adductes 1,3-anti-3,4-anti amb excel•lents diastereoselectivitats (rd ≥ 89:11). Partint del mateix nucleòfil, en aquest Capítol també s’ha iniciat un estudi d’addicions de Michael a nitro alquens. L’addició de l’enolat de titani de l’(S)-2-benziloxi-3-pentanona a l’(E)-4-metoxi-β-nitroestirè ha produït el corresponent adducte de Michael amb excel•lent diastereoselectivitat (rd ≥ 97:3). Aquests primers resultats són prou esperançadors i demostren l’interès sintètic que poden arribar a tenir aquestes reaccions, que actualment constitueixen una línia activa d’investigació al grup de recerca. Finalment, prenent com a punt de partida el caràcter biradicalari de determinats enolats de titani, en aquesta Tesi s’ha iniciat un estudi de la reactivitat d’aquests substrats en reaccions de formació d’enllaços CC i CO. Així, al Capítol 4 s’ha estudiat l’al•lilació d’N-acil oxazolidinones quirals amb al•lil estannans, amb què s’han obtingut els corresponents adductes amb un control estereoquímic excel•lent (rd ≥ 97:3). D’altra banda, en la constitució d’una nova línia d’investigació al grup, en el darrer Capítol també s’ha desenvolupat l’oxidació estereoselectiva d’N-acil oxazolidinones quirals amb TEMPO. S’ha demostrat que la utilització d’aquest radical estable permet l’oxidació dels corresponents enolats de titani i condueix als α-aminoxi derivats amb rendiments i diastereoselectivitats excel•lents (9095%, rd ≥ 93:7) i, a més, s’ha descrit l’aminoxilació estereoselectiva en la posició d’enolats conjugats. L’eliminació de l’auxiliar quiral i/o el trencament reductiu de l’enllaç NO han permès arribar a derivats sintèticament útils. Per últim, s’ha descobert que es pot assolir la hidroxilació directa d’aquests substrats a través de la reacció dels seus enolats de titani amb O2. / The first Chapter of the present text deals with substrate-controlled titanium-mediated aldol reactions of chiral α-hydroxy methyl ketones. The appropriate choice of the Lewis acid and the protecting group in the α-hydroxy ketone gives access to either 1,4-anti or 1,4-syn aldol adducts in good yields (5697%) and diastereoselectivities up to ≥ 97:3 with a broad range of aldehydes. Furthermore, a sequential aldol reaction-reduction transformation from (S)-3-tert-butyldimethylsilyloxy-4-methyl-2-pentanone provides 1,2-syn-2,4-syn triols in excellent yields (9192%) and a stereochemical control which mostly relies on the aldol step of the sequence (dr 80:2094:6). The usefulness of these methodologies is proven in Chapter 2 with its application in the total synthesis of herboxidiene. Most of the carbon backbone and the required stereocentres are constructed through an aldol reaction of (S)-2-benzyloxy-3-pentanone and an aldol reaction-reduction sequence from (R)-2-tert-butyldimethylsilyloxy-3-pentanone, which are key steps in the synthesis of C1C9 fragment (17%, 10 steps) and C10C19 fragment (43%, 7 steps), respectively. Assembling of both fragments affords herboxidiene in 8% overall yield (14 steps, longest linear sequence). After a thorough study of aldol reactions of titanium enolates from α-hydroxy ketones, the reactivity of these nucleofiles is explored in other CC bond-forming reactions. In Chapter 3, the Michael addition of the titanium enolate of (S)-2-benzyloxy-3-pentanone to α,β-unsaturated ketones is developed, which provides 1,3-anti-3,4-anti adducts in excellent diastereoselectivities (dr ≥ 89:11). Finally, considering the biradical character of certain titanium enolates, in Chapter 4 the reactivity of such substrates in some CC and CO bond-forming reactions is investigated. Allylation of chiral N-acyl oxazolidinones with allyl stannanes is achieved and the corresponding adducts are obtained with excellent levels of stereocontrol (dr ≥ 97:3). Moreover, the stereoselective oxidation of chiral N-acyl oxazolidinones with TEMPO is described. The use of this stable radical leads to α-aminoxy derivatives in excellent yields and diastereomeric ratios (9095%, dr ≥ 93:7), and the stereoselective oxidation in the position of conjugate enolates is also accomplished. Elimination of the chiral auxiliary and/or reductive cleavage of the NO bond provides synthetically useful derivatives.

The global emergence and spread of multidrug-resistant bacteria is an important public health issue. However, the antimicrobial pipeline remains unacceptably lean, in fact over the last 25 years, the number of antimicrobial agents that reach the market has sharply decreased. In this context, there is now a renewed interest in the search for drugs that have more than one target on the bacterial cell, rather than a specific chiral receptor or enzyme. Antimicrobial peptides (AMPs) are a class of antibiotics that have attracted great interest in the last few years because they rarely spur the development of resistant organisms as their mechanism of action involves disruption of the bacterial membrane. In this thesis we report the design, preparation and activity of new compounds based on the sequence of the polymyxins, a class of antibiotics highly active against Gramnegative bacteria, and used clinically as last resort treatment for multidrug-resistant pathogens. The compounds synthesized proved to be highly active against both Grampositive and Gram-negative bacteria, including several strains of resistant bacteria. Furthermore, biophysical experiments using liposomes and monolayers as model membranes and flow cytometry and transmission electron microscopy using bacteria were carried out to study the mechanism of action of these compounds. The results of the most active candidate indicate that an alternative, non-membrane dependent mechanism of action might be involved. In the second part of the thesis, a series of 9 peptides were designed and synthesized from repeated KIAGKIA motifs, based in the sequence of the antimicrobial peptide PGLa from the magainin family, with lengths between 14 and 28 amino acids. Circular dichroism spectroscopy showed that they all formed alpha-helices when found in a lipid environment. Biological assays for haemolysis and antimicrobial activity, as well as fluorescence vesicle leakage and solid-state NMR spectroscopy, were used to correlate peptide length with membrane activity. These data are fully consistent with the formation of transmembrane pores. Only peptides that are long enough to span the hydrophobic bilayer core can induce vesicle leakage, haemolysis, and inhibit bacterial growth. The shorter peptides do not show these effects. Solid-state NMR analysis in oriented bilayers with different thickness also demonstrated the need for a minimum peptide length to flip from a surface-bound alignment into a more inserted, possibly even transmembrane state. With increasing length the peptides start to tilt and perturb the bilayer. Since the threshold behaviour seen for biological activity closely matches the biophysical results, the peptides could be used as molecular rulers to determine the thickness of bacterial membranes, showing that E. coli (≈ 27 Å) < S. aureus and P. aeruginosa (≈ 30 Å) < E. faecalis (≈ 34 Å). / L'aparició i propagació mundial de bacteris resistents a múltiples fàrmacs s’ha convertit en un problema clínic molt important. No obstant això, el nombre de nous antimicrobians que es troben en les últimes etapes de desenvolupament és molt baix. Els pèptids antimicrobians són una classe d’antibiòtics que han despertat gran interès en els últims anys pel fet que poques vegades estimulen el desenvolupament d’organismes genèticament resistents ja que la seva diana terapèutica és principalment la membrana bacteriana. En aquesta tesi es descriu el disseny, preparació i activitat de nous compostos basats en la seqüència de les polimixines, un tipus de pèptids antimicrobians altament potents contra bacteris Gram-negatius i usats clínicament. Els compostos sintetitzats van presentar elevada activitat tant en bacteris Gram positius com Gram-negatius, incloent diverses soques resistents. Addicionalment, experiments biofísics usant liposomes i monocapes com a models de membrana i citometria de flux i microscòpia electrònica de transmissió usant bacteris es van usar per estudiar el mecanisme d’acció d’aquests compostos. Els resultats del candidat més actiu semblen indicar que presenta un mecanisme d’acció alternatiu on la membrana bacteriana no és l’única diana terapèutica. En la segona part de la tesi, es descriu el disseny i síntesi d’una sèrie de 9 pèptids, basats en la seqüència del pèptid antimicrobià PGLa de la família de les magainines. Els pèptids alfa-helicoïdals (vist mitjançant l’ús de dicroïsme circular), presenten repeticions del heptàmer KIAGKIA, amb llargades de 14 a 28 aminoàcids. Assaigs biològics, de fluorescència i de RMN de fases condensades es van usar per relacionar la llargada peptídica amb la activitat en la membrana. Les dades obtingudes són consistents amb la formació de porus transmembrana, només aquells pèptids prou llargs per travessar la bicapa lipídica indueixen permeabilització, hemòlisi i inhibeixen el creixement bacterià mentre que els pèptids curts no mostren aquests efectes. L’anàlisi usant RMN de fases condensades amb lípids de diferent llargada també va mostrar la necessitat d’una llargada mínima dels pèptids per passar d’un estat superficial a un estat més inserit, probablement transmembrana. Atès que els llindars observats per a l'activitat biològica coincideixen estretament amb els resultats biofísics, els pèptids van ser utilitzats com a regles moleculars per determinar el gruix de les membranes bacterianes, és a dir E. coli (≈ 27 Å) < S. aureus i P. aeruginosa (≈ 30 Å) < E. faecalis (≈ 34 Å).

This work is divided in 2 different parts: Part A: Cyclization and conjugation can confer on biomolecules better activity, resistance toward enzymatic degradation and better internalization properties. In order to develop a versatile methodology for polyamide conjugation and cyclization, several protected maleimide-containing monomers were synthesized and incorporated into polyamide sequences. Maleimide protection was accomplished by Diels-Alder reaction with 2,5-dimethylfuran. The resulting cycloadduct underwent a retro-Diels-Alder reaction upon heating. These monomers were included in peptide and peptoid sequences, and it was assessed in all cases that the maleimides obtained after deprotection were fully reactive. Double conjugates were obtained by incorporating both a free and a protected maleimide in the same sequence. These were peptides were selectively linked to two different biomolecules, namely a peptide-thiol or an oligonucleotide-diene. By assembling sequences containing both maleimide and cysteine, several cyclic polyamides were obtained. These could include almost all proteinogenic amino acids. By combining orthogonally-protected cysteines and free and protected maleimides, bicyclic peptides could also be synthesized. Cyclic peptide conjugates were synthesized, by taking advantage of the different protecting group schemes developed. These compounds could contain the conjugation spot within or outside the cycle, either at the C- or the N- terminus. All cyclizations were performed by Michael addition, and conjugations were performed by reactions such as Diels-Alder cycloaddition, Michael addition or Huisgen cycloaddition. Finally, a series of cyclic peptide – PNA conjugates were synthesized and tested as alternative splicing inducers. Unfortunately their activity did not surpass the one from previously tested conjugates. Part B: Foot-and-mouth disease virus (FMDV) promotes translation of its genetic material through a cellular mechanism, in which part of its RNA sequence, the IRES, plays a crucial role. FMDV IRES contains a GNRA loop, and AD2, a small molecule, is known to interact with these kind of loops. The initial goal of this part was to study the interaction between AD2 and the GUAA loop of the FMDV IRES. AD2 was synthesized, and in vitro assays were performed in order to assess its activity and binding site. By using a bicistronic RNA, a differential response was observed in the inhibition of the cap- and the IRES-dependent translation, assessing that AD2 was active. The binding site determination was attempted with the SHAPE assay, but no defined binding site could be established. At the same time a series of biophysical assays with synthetic RNA were performed. Thermal denaturation experiments and CD measurements, as well as isothermal titration calorimetry assays were carried out, but none of them afforded relevant data. However, EC50 values could be obtained by employing fluorescently-labeled RNA. These experiments showed that AD2 interacted with the desired loop, but also with a bulge nearby. The binding stoichiometry was determined by mass spectrometry. The masses of the different RNA-ligand complexes indicated high stoichiometries, that is, several AD2 molecules were interacting with relatively short RNA sequences. Considering the in vitro results, the EC50 values obtained in the fluorescence titrations and the observed stoichiometries, we could conclude that AD2 interacts with the desired loop with high affinity, but it also interacts, and even more strongly, with other RNA structures found in FMDV IRES. / Aquest treball està dividit en dues parts diferenciades. A la primera part s’ha desenvolupat una metodologia per obtenir conjugats i cicles de poliamides (pèptids i peptoides) fent ús de reaccions tipus “click” sobre maleimides, com ara addicions de Michael o cicloaddicions de Diels-Alder o Huisgen. Les maleimides s’incorporen a les cadenes de poliamida protegides amb dimetilfurà, i es desprotegeixen escalfant. Combinant en una mateixa seqüència maleimides protegides i desprotegides, cisteïnes amb grups protectors ortogonals entre ells, o alquins, s’han sintetitzat conjugats, dobles conjugats, cicles, bicicles i conjugats de pèptids cíclics. En tots els casos la poliamida s’ha ciclat amb una addició de Michael, i les conjugacions s’han dut a terme amb addicions de Michael o cicloaddicions de Diels-Alder o Huisgen. Tanmateix s’han sintetitzat conjugats tipus pèptid cíclic – PNA amb potencial activitat biològica, però malauradament els resultats no han millorat els obtinguts amb altres compostos similars. A la segona part s’ha estudiat la interacció de l’AD2, una molècula petita, amb el loop GUAA de l’IRES del virus de la febre aftosa. Els estudis biològics in vitro han indicat que inhibeix més la traducció mediada per IRES que la cap-dependent, però malauradament no s’ha pogut determinar de forma inequívoca el lloc d'unió. Paral•lelament s’han realitzat estudis biofísics amb RNAs sintètics. La determinació de la variació de la temperatura de fusió dicroisme circular i la calorimetria no han proporcionat informació útil. Amb estudis per fluorescència amb RNAs marcats, en canvi, s’ha determinat la EC50, i s’ha observat que l’AD2 és afí pel loop desitjat, però ho és encara més per un bulge proper. La determinació per ESI de l’estequiometria dels complexos mostra que l’AD2 és promiscu, ja que diverses molècules d’AD2 s’uneixen a cada seqüència curta d’RNA assajada. En resum, doncs, l’AD2 interacciona amb el loop desitjat amb alta afinitat, però també interacciona, i de forma més afí, amb altres estructures d’RNA presents a l’IRES.

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRBB) / Objectives: Objective 1 – Effect of mutations perturbing the ULBR of the Unique domain of c-Src. The first objective of this thesis was the in vitro characterization of the effect of mutations in the ULBR on the previously determined main interactions of the Unique domain: binding to lipids and to the SH3 domain. Objective 2 - Phosphorylation of c-Src Unique domain in Xenopus laevis oocytes and mammalian cell extracts. Phosphorylation of the Unique domain of c-Src is one of the modulation parameters affecting lipid binding and had previously been reported to affect c-Src activity. The second objective was to study the phosphorylation of the isolated Unique domain in Xenopus laevis oocytes, that enabled the study of phosphorylation in a living cell and in cell extracts, that allowed further manipulation of the phosphatase/kinase network. Objective 3 - Functional studies of the Unique domain in the context of the full-length protein. The last objective was the evaluation of the functional significance of the modifications investigated in the isolated Unique domain as objectives 1 and 2 in a human colorectal cell line and in the context of the full length protein. The present thesis addressed fundamental aspects of the biological role of the intrinsically disordered Unique domain of c-Src that until now was poorly understood. We have first characterized through a structural biology approach the effects of sitedirected ULBR mutations on the previously described interactions with lipids and with the folded SH3 domain. Then, we have investigated the phosphorylation events taking place on the Unique domain by state-of-the-art in-cell NMR techniques. Finally, we have shown the functional role of USrc in the context of normal and cancer cell lines. All together, our results have demonstrated that the Unique domain of human c-Src actively participates in the regulation mechanism in which the tyrosine kinase c-Src is involved. This study represents a new essential milestone in the understanding of how c-Src can control a wide variety of signaling events inside cells. Furthermore, it potentially opens the way to the possibility of new applications for cancer therapy through the development of novel selective drugs targeting functional active residues locating in the Unique domain. This thesis represents a “proof-of-concept” of how from the atomistic comprehension of a subject of interest (structural approach) it can be possible to understand and successively demonstrate the biological significance of the observed phenomena (functional approach). Conclusions: - Mutations in the Unique Lipid Binding Region affect the lipid binding capability of USrc but not the inter-domain interaction with the folded SH3. - Disruption of the conserved FGGF motif causes important local effects that affect the structure of the ULBR. - The SH3 domain of human c-Src loses its ability to interact with lipids in presence of a polyproline peptide. - Real-time NMR spectroscopy allowed the study of complex phosphorylation/dephosphorylation processes in USrc mediated by kinases and phosphatases in Xenopus laevis derived cells or cell extracts. - Three different phosphorylation sites present in the Unique domain that were unequivocally assigned to Ser 17, Ser 69 and Ser 75 have been identified in Xenopus laevis, COS-7, MEFs and HeLa cell systems. - It was the first time that phosphorylation of Ser 69 of c-Src was observed in those model systems. - The biological relevance of the ULBR has been firstly demonstrated in Xenopus laevis oocytes in the context of the full-length c-Src. - The functional roles of the described phosphorylation events together with ULBR mutations have been shown in HEK293T cells and in the human colorectal SW620 cancer cell lines in the context of the full-length protein. - A “positional regulation model” has been proposed as a new c-Src selectivity regulation mechanism. / Aquesta tesi, titulada “Caracterització estructural i funcional del domini únic intrínsecament desplegat de c-Src humana”, aborda els aspectes fonamentals de la funció biològica del domini Únic intrínsecament desordenat de c-Src (USrc) que fins ara ha sigut poc estudiat. Hem caracteritzat primer mitjançant tècniques de biologia estructural als efectes de les mutacions de la ULBR (Unique Lipid Binding Region) dirigides al lloc de les interaccions descrites anteriorment amb els lípids i amb el domini SH3. Llavors, hem investigat els esdeveniments de fosforilació que tenen lloc en el domini únic per tècniques de RMN en cèl•lules. Finalment, hem demostrat el paper funcional de USRC en el context de línies de cèl•lules normals i canceroses. En conjunt, els nostres resultats han demostrat que el domini únic de c-Src participa activament en el mecanisme de regulació en què la tirosina quinasa c-Src està implicada. Aquest estudi representa una nova fita essencial en la comprensió de com c-Src pot controlar una àmplia varietat d'esdeveniments de senyalització dins de les cèl•lules. A més, té el potencial d'obrir el camí a la possibilitat de noves aplicacions per al tractament del càncer mitjançant el desenvolupament de nous fàrmacs selectius dirigits residus actius funcionals localització en el domini únic. Aquesta tesi constitueix una "prova de concepte" de com des de la comprensió atomista d'un tema d'interès (enfocament estructural) pot ser possible entendre i successivament demostrar la importància biològica dels fenòmens observats (enfocament funcional).