Issues d'un gène ancestral commun, les molécules CD5 et CD6 sont présentes à la surface de tous les lymphocytes T (LT) matures ainsi qu'à la surface de certains lymphocytes B (LB). Ces deux protéines font partie de la famille des « Scavenger Receptor Cystein Rich » (SRCR) protéines mais la régulation, l'expression et les fonctions de ces deux molécules ne sont pas totalement résolues. Ainsi, CD5 est impliquée dans la régulation du récepteur à l’antigène des LB et des LT, dans la tolérance des LB et elle est présente à la surface des LB régulateurs. A l’opposé, CD6 possède un rôle dans la prolifération des lymphocytes, la survie, la migration et l’adhésion cellulaire. Les expressions de CD5 et CD6 diffèrent au sein des LB normaux ainsi qu'en pathologie. Dans le cadre du lupus érythémateux systémique (LES), le nombre de molécules CD5 à la surface des LB CD5+ est réduit. Dans une autre maladie auto-immune (MAI), le Syndrome de Gougerot Sjögren (SGS), l'expression de CD6 à la membrane des LB n'est pas affectée mais la distribution des LB mémoires CD6+, mais pas des LB naïfs, est modifiée par rapport aux témoins sains. En effet, les LB CD6+ sont sous représentés dans le sang périphérique et ce, en raison de leur délocalisation dans les glandes salivaires (GS) des patients. Cette délocalisation est liée à la surexpression d’ALCAM, le ligand naturel de CD6, par les cellules épithéliales au cours du SGS. L'étude de la diminution de l'expression de CD5 à la surface des LB de patients atteints de LES a permis de montrer qu'il existait un défaut dans le processus de la méthylation de l'ADN chez ces patients. Ce même défaut a été retrouvé dans les GS de patients atteints de SGS. Enfin, les LB de patients atteints de leucémie lymphoïde chronique (LLC) sont porteurs des deux molécules à leur membrane. Nous avons testé l'effet in vitro et in vivo d'un l'anticorps monoclonal (Acm) humanisé anti-CD6, T1H, dans la LLC. De façon intéressante, il s’avère que cet Acm favorise la lyse des LB de LLC et ceci, de façon équivalente au rituximab dans un modèle murin in vivo. T1H est internalisé par les LT et est donc inefficace sur ces cellules. Ces résultats nous permettent de conclure que même si les molécules CD5 et CD6 sont proches phylogénétiquement, elles possèdent des fonctions et des modes de régulation différents entre les LB et les LT mais aussi au sein des différentes populations de LB. Une meilleure compréhension des fonctions et des modes d'actions de ces deux protéines ouvre des perspectives thérapeutiques dans le traitement des MAI et de la LLC. / Derived from a common ancestral gene, CD5 and CD6 molecules are present on the surface of all mature T lymphocytes (LT) and some B lymphocytes (LB). These two proteins are members of the "Scavenger Receptor Cystein Rich" family proteins (SRCR) but the regulation, the expression and the function of these molecules is not totally resolved. CD5 is involved in the regulation of antigen receptor in LB and in LT, in the LB tolerance and is present on the surface of regulator B cells. In contrast, CD6 plays a role in lymphocyte proliferation, survival, migration, and cell adhesion. Expressions of CD5 and CD6 differ within normal LB and and LB present in different in pathologies. In the context of systemic lupus erythematosus (LES), the number of CD5 molecules on the surface of CD5+ LB is reduced. In another autoimmune disease (MAI), the Sjogren Syndrome (SS), the expression of CD6 at the membrane of B cells is not affected but the distribution of CD6 + memory LB but not naive LB is changed compared to healthy controls. Indeed, LB CD6 + are underrepresented in the peripheral blood and, it’s due to their relocation in the salivary glands (GS) of patients. This relocation is related to overexpression of ALCAM, the natural ligand of CD6, by epithelial cells in SS. The study of the decreased expression of CD5 on the surface of LB SLE patients has shown that there was a defect in the process of DNA methylation in these patients. The same defect was found in the GS of SS patients. Finally, B cells from chronic lymphocytic leukemia patients (CLL) are holders of the two molecules on their membrane. We tested the effect in vitro and in vivo of a humanized monoclonal antibody (mAb) anti-CD6, T1H, in the CLL. Interestingly, it appears that this mAb promotes lysis of CLL LB and this effect is equivalent to the one that rituximab was shown to have in an in vivo mouse model. T1H is internalized by LT and is therefore ineffective on these cells. These results allow us to conclude that even if the CD5 and CD6 molecules are phylogenetically close, they have different functions and modes of regulation between LB and LT but also within different populations of LB. A better understanding of their functions and action pathway of these two proteins opens up therapeutic perspectives for the treatment of MAI and CLL.

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) constitue l'hémopathie maligne la plus fréquente dans les pays occidentaux et résulte d’une accumulation de lymphocytes B (LB) monoclonaux matures porteurs de la glycoprotéine CD5. Les LB de LLC sont également caractérisées par une altération de l'homéostasie du calcium avec, d'une part, la mise en évidence de facteurs de survie contrôlés par le calcium tels que phospho-ERK, NFAT-2 et IL-10, et d'autre part par une progression de la maladie qui est associée à la réponse au calcium. Tout d'abord, afin de mieux comprendre l'impact de la molécule CD5 sur les dérégulations du calcium, il a été montré que l'introduction d'un plasmide d'expression pour CD5 dans les lignées de cellules B humaines s'accompagnait d'une entrée calcique à l’état basale. Ensuite, cette entrée, appelée entrée constitutive, a été recherchée dans les LB de LLC pour montrer qu'elle caractérisait les patients non traités en phase d'évolution. Comme pour les lignées de cellules B CD5, cette nouvelle voie d'entrée du calcium est autonome et indépendante de la voie classique de signalisation du LB de LLC : BCR-IP3R. L'étude des protéines responsables de cet influx a permis de mettre en évidence, premièrement trois partenaires STIM1, Orai1 et TRPC1, et deuxièmement l'importance de la fraction membranaire de STIM1 (STIMPM) puisque l'utilisation d'un anticorps monoclonal anti-STIM1 (Acm) est capable d’inhiber l'entrée constitutive du calcium qui à son tour agit sur la survie des LB, pour les patients STIMPM positifs, lorsque l'Acm anti-STIM1 est utilisé en association avec le rituximab, un Acm thérapeutique anti-CD20. Enfin, la modélisation de la partie Cterminale de STIM1 permet d'envisager plusieurs cibles potentielles pour le développement de nouveaux Acm anti-STIM1. En conclusion, la mise en place, par le clone malin de LLC, d'une entrée constitutive du calcium favorise son agressivité et constitue donc une nouvelle voie thérapeutique contrôlable par l'utilisation d’Acm anti-STIM1 ce qui ouvre de nouvelles perspectives comme outils diagnostiques et thérapeutiques. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common hematological malignancy in Western countries and is a result of the accumulation of mature monoclonal B lymphocytes (B-CLL) carrying the CD5 glycoprotein. The B-CLL are also characterized by an alteration of calcium homeostasis with, on the one hand, the demonstration of calcium-controlled survival factors such as phospho-ERK, NFAT- 2 and IL-10, and on the other hand by a progression of the disease which is associated with the response to calcium. Initially, in order to better understand the impact of the CD5 molecule on calcium deregulations, it has been shown that the introduction of an expression plasmid for CD5 into human B cell lines was accompanied by a calcium entry in the basal state. Then, this entry, called constitutive entry, was sought in the B-CLL to show that it characterized untreated patients in the evolution phase.As with CD5 B cell lines, this new calcium entry pathway is autonomous and independent of the classical B-CLL signaling pathway: BCR-IP3R. The study of the proteins responsible for this influx made it possible to highlight, firstly three partners (STIM1, Orai1 and TRPC1), and secondly the importance of the membrane fraction of STIM1 (STIMPM) since the use of a human monoclonal antibody (mAb) anti-STIM1 is able to inhibit the constitutive entry of calcium which in turn acts on the survival of B-CLL, for STIMPM positive patients, when the anti-STIM1 mAb was used in combination with rituximab, a therapeutic anti-CD20 mAb. Finally, the modeling of the C-terminal part of STIM1 makes it possible to envisage several potential targets for the development of new anti-STIM1 mAbs. In conclusion, the introduction by the CLL malignant clone of a constitutive entry of calcium favors its aggressiveness and thus constitutes a new therapeutic pathway controllable by the use of anti-STIM1 mAb, which opens new perspectives like diagnostic and therapeutic tools.

Οι αντι-TNFα βιολογικοί παράγοντες χρησιμοποιούνται ευρέως στην καθ’ ημέρα κλινική πράξη για την αντιμετώπιση συστηματικών φλεγμονωδών νοσημάτων όπως είναι η ρευματοειδής αρθρίτιδα, η αγκυλοποιητική σπονδυλίτιδα, η ψωριασική αρθρίτιδα και η νόσος του Crohn. Σύντομα, όμως, έγινε αντιληπτό ότι οι ασθενείς υπό θεραπεία με ανταγωνιστές του TNFα συχνά αναπτύσσουν στον ορό τους αντιπυρηνικά αντισώματα (ΑΝΑ) κυρίως τύπου IgM, ενώ ένα μικρό ποσοστό των ασθενών αυτών αναπτύσσει κλινικό σύνδρομο που θυμίζει ιδιοπαθή ΣΕΛ. Tα Β λεμφοκύτταρα θεωρείται ότι κατέχουν κεντρικό ρόλο στην παθογένεια του ΣΕΛ. Xαρακτηρίζονται από επίταση των φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών σε υπολείμματα τυροσίνης μετά από διέγερση του Β αντιγονικού υποδοχέα (BCR) και από μειωμένη έκφραση της κινάσης Lyn, ενός ενζύμου που ανήκει στην οικογένεια των Src κινασών και διαδραματίζει διπλό ρόλο, ευοδωτικό και ανασταλτικό, στην οδό σηματοδότησης του BCR. Επιπλέον, τα Β λεμφοκύτταρα στον ΣΕΛ χαρακτηρίζονται από μειωμένη έκφραση του δείκτη CD21 (υποδοχέας του συμπληρώματος τύπου 2), ενώ υπάρχουν αναφορές για αυξημένη έκφραση του δείκτη επιφανείας CD20. Για να μελετήσουμε τους μηχανισμούς της αυτοανοσίας που επάγεται από τη χρήση των αντι-TNFα παραγόντων εξετάσαμε εάν τα Β λεμφοκύτταρα των ασθενών υπό αντι-TNFα αγωγή αποκτούν φαινοτυπικά ή/και λειτουργικά χαρακτηριστικά που να προσομοιάζουν με αυτά που έχουν περιγραφεί για τα Β λεμφοκύτταρα στον ΣΕΛ. Συγκεκριμένα μελετήσαμε τα επίπεδα της Lyn, Syk, SHP-1, της φωσφορυλιωμένης Syk στη θέση τυροσίνης 348 (ΡΥ348-Syk), τα επίπεδα των τυροσινικά φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών καθώς και τους δείκτες επιφανείας CD20, CD21 και CD5 σε 29 ασθενείς με συστηματικά ρευματικά νοσήματα πριν και μετά την έναρξη θεραπείας με αντι-TNFα βιολογικούς παράγοντες. Διαπιστώσαμε ότι τα επίπεδα της Lyn, αλλά όχι της Syk ή της SHP-1, αυξάνονται μετά τη θεραπεία με αντι-TNFα παράγοντες, ιδίως σε ασθενείς με σπονδυλοαρθροπάθειες. H ενζυματική δραστηριότητα της Lyn διατηρείται μετά την έναρξη αγωγής με αντι-TNFα, όπως διαπιστώθηκε από την κατά 2.9 φορές αύξηση των επιπέδων της PY348-Syk, η οποία χαρακτηρίζει την ενεργοποιημένη μορφή της Syk και αποτελεί ειδικό στόχο της Lyn. Επιπλέον, βρήκαμε ότι τα μη-διεγερμένα Β λεμφοκύτταρα ασθενών που λαμβάνουν ανταγωνιστές του TNFα εμφανίζουν επίταση των φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών σε θέσεις τυροσίνης. Το CD20, ένας δείκτης επιφανείας που εκφράζεται αποκλειστικά στα Β λεμφοκύτταρα και συμμετέχει στη διατήρηση των ενδοκυτταρίων επιπέδων Ca++ μετά από διέγερση του BCR αυξάνεται μετά από θεραπεία με αντι-TNFα βιολογικό παράγοντα κυρίως στους ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα, ενώ τα επίπεδα του CD21 παρέμειναν αμετάβλητα. Επίσης, διαπιστώσαμε επέκταση του πληθυσμού των CD5+ B λεμφοκυττάρων, ενός υποπληθυσμού των Β κυττάρων που αποτελεί γνωστή πηγή φυσικών αυτοαντισωμάτων, κατά τη διάρκεια θεραπείας με αντι-TNFα. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι τα Β λεμφοκύτταρα των ασθενών που λαμβάνουν θεραπεία με ανταγωνιστές του TNFα εμφανίζουν λειτουργικές και φαινοτυπικές διαταραχές οι οποίες μπορεί να σχετίζονται με την επαγωγή αυτοανοσίας, αλλά διαφέρουν από τις διαταραχές που έχουν περιγραφεί για το Β λεμφοκύτταρο στον ΣΕΛ και μπορεί να αναπαριστούν ένα διαφορετικό μοντέλο αυτοανοσίας. Περαιτέρω μελέτες για την αποσαφήνιση των μηχανισμών αυτοανοσίας από την χρήση των αντι-TNFα παραγόντων θα μπορούσαν να συμβάλλουν στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών και της παθογένειας άλλων αυτοάνοσων φλεγμονωδών νοσημάτων. / Biologic agents against ΤΝFα have been widely used for the management of systemic inflammatory disorders, such as rheumatoid arthritis, ankylosing spondylitis, psoriatic arthritis and Crohn’s disease. However, it soon became apparent that patients under ΤΝFα blockade commonly develop serologic autoimmune manifestations. Emergence of ANA, usually of the IgM isotype, is common in anti-TNFα treated patients and a few of these patients may develop a SLE-like syndrome. B cells are implicated in the pathogenesis of SLE and are characterized by enhanced tyrosine phosphorylation of proteins following BCR ligation and reduced expression of Lyn, a Src-family kinase abundantly expressed in B cells with both stimulatory and inhibitory properties on the BCR-signaling pathway. Reduced levels of B-cell surface CD21 (complement receptor type 2) and increased expression of CD20 have also been described for lupus B cells. To dissect the mechanisms of anti-ΤΝFα induced autoimmunity we examined the phenotype and function of B cells prior to and following treatment with ΤΝFα antagonists. Levels of Lyn, Syk, SHP-1, tyrosine 348 phospho-Syk (PY348-Syk) and tyrosine phosphorylated proteins were evaluated in 29 patients before and following treatment with TNFα blockers. B-cell surface expression of CD20, CD21 and CD5 were also assessed. Following treatment, B cell cytoplasmic levels of Lyn, but not Syk or SHP-1, significantly increased following treatment with anti-ΤΝFα agents, particularly in patients with spondyloarthropathies. Increased Lyn levels following treatment correlated with increased Lyn enzymatic activity as evidenced by a 2.9-fold increase of PY348-Syk levels, which comprises a Lyn-specific target. Moreover, unstimulated peripheral B cells from anti-ΤΝFα treated patients displayed a tendency towards increased tyrosine phosphorylated proteins following treatment. CD20, a B-cell restricted signaling-associated molecule implicated in the regulation of intracellular calcium levels following BCR ligation, significantly increased in patients with rheumatoid arthritis following treatment with anti-ΤΝFα agents whereas levels of CD21 remained unchanged. Circulating CD5+ B cells, a B-cell subpopulation and a known source of natural autoantibodies, were also significantly expanded during treatment. Our findings suggest that B cells in anti-ΤΝFα treated patients display functional and phenotypical aberrations that may be associated with the induction of autoimmunity, but do not acquire a typical idiopathic SLE profile. These aberrations are distinct from those previously described for lupus B cells and may thus represent a different model of autoimmunity. Further studies regarding the mechanisms underlying the induction of autoimmunity by TNFα antagonists may enhance our understanding on the molecular backgrounds and the pathogenesis of other autoimmune inflammatory disorders.

Le potentiel régulateur des lymphocytes B (LB), largement associé avec la production d’interleukine-10 (IL-10), a été mis en évidence dans des modèles murins de pathologies spécifiques d’Ag. Les cellules B transitionnelles (Tr.) CD24fortes CD38fortes ont été décrites comme régulatrices, au travers de la production d’IL-10, de l’inhibition de la prolifération T, ainsi que de la suppression de la réponse inflammatoire des cellules T. Les LB transitionnels représentent un stade de développement central dans la maturation des cellules B, en faisant le lien entre les cellules immatures de la moelle osseuse et celles matures situées dans les organes lymphoïdes secondaires. Dans une première étude, nous montrons que cette population est hétérogène, et composée de LB Tr. de type 1 (T1), T2, T3 et Tr. CD27+. Les LB T3 anergiques semblent jouer un rôle dans la tolérance périphérique en limitant la prolifération des lymphocytes T (LT) CD4+, tandis que les LB Tr. CD27+ IL-10+ nouvellement décrits inhibent la différenciation des LT CD4+ en cellules productrices d’IFN-γ et de TNF-α. Notons que les LB T1 et Tr. CD27+ se différencient rapidement en cellules productrices d’Ac suite à la reconnaissance de signaux de l’immunité innée. La production d’IL-10 est en partie dépendante des signaux perçus, provenant du microenvironnement. Nous avons décrit dans un second travail que les LB s’adaptent aux cellules avec lesquelles ils sont cultivés. En effet, les cellules B régulent spécifiquement les LT CD4+ mémoires (et non naïfs), en limitant leur prolifération avant d’induire une mort cellulaire. Ces caractéristiques fonctionnelles pourraient être associées avec une modification du programme transcriptionnel, permise par la plasticité des cellules B, qui se polarisent en LB régulateurs (Breg) de façon ciblée. L’expression des gènes PRDM1 et IL10 serait associée avec une signature Breg spécifique en culture mixte autologue, en opposition avec celle des gènes NFκB1 et BCL6. La transplantation rénale est un excellent modèle physiopathologique, pour étudier l’importance de certaines populations de LB dans la tolérance immunologique. L’étude BHL (B lymphocytes in humoral rejection and alloimmunisation) nous a permis de confirmer que les LB Tr. ont probablement un rôle important dans cette tolérance du greffon. La présence d’anticorps spécifiques du donneur (DSA) semble limiter l’émergence des LB Tr., même si le pourcentage de cellules B CD24fortes CD38fortes n’est a priori pas associé avec la capacité du compartiment lymphocytaire B à réguler la prolifération des cellules T des patients alloimmunisés. / Regulatory B cells (Breg) were first reported to be interleukine-10 (IL-10) producing B cells in mice. The almost concurrent discovery of Breg cells drew interest toward potential links with transitional B cells because of phenotypic and functional similarities. In addition with IL-10 production, CD24high CD38high transitional B cells limit the proliferation of T cells and the polarization of CD4+ T cells into Th1 cells. Transitional B cells represent a central developmental stage in B-cell maturation, linking generation in the bone marrow with differentiation in periphery. In a first study, we reveal for the first time that human transitional B cells encompass not only transitional type 1 and type 2 B cells, but also distinct anergic type 3 B cells, as well as IL-10-producing CD27+ transitional B cells. Interestingly, the latter two subsets differentially regulate CD4+ T-cell proliferation and polarization toward Th1 effector cells. Additional experiments showed that type 1 and CD27+ transitional B cells are capable to differentiate into antibody secreting cells after toll-like receptor 9 engagement. In a second work, we wanted to explore the ability of B cells to target T-cell populations. We demonstrate that B cells can be suppressive cells. B cells are capable to target CD4+ memory T-cell, limiting the proliferation and inducing the death of this T-cell population. At the opposite, B cells seem to be effector of CD4+ naïve T-cell functions. These properties are probably associated with a specific transcriptional program. Thus, we observed that suppressive B cells overexpress PRDM1 and IL10, whereas effector B cells preferentially express BCL6 and NFκB1 in in vitro mixed culture. In the last part, we worked on B-cell phenotype and functions in transplanted patients. BHL (B lymphocytes in humoral rejection and alloimmunisation) is a clinical study that aims to better understand the role of B cells in the alloimmunisation and the chronic rejection occurring after renal transplantation. Donor specific antibodies (DSA) seem to limit the expansion of transitional B cells, which are probably not associated with the ability of B cells to regulate T-cell proliferation in DSA+ patients.

Le lymphocyte B (LB) des patients lupiques est réfractaire à tous les procédés décrits à ce jour pour activer une fonction régulatrice B (Breg). Il constitue de ce fait un modèle intéressant d’étude de la déficience Breg chez l’Homme et soulève de nombreuses interrogations. Est-il possible de restaurer un défaut d’activation de la régulation LB? Si oui est-il possible d'agir à temps et le plus efficacement possible, et comment s'y prendre? Ou au contraire, est-ce un état irréversible de la cellule B? Ce travail de thèse a pour objectif principal de répondre à cette problématique essentielle à notre compréhension du Breg. Grace à un polypeptide de synthèse le Glatiramer acetate (GA), nous montrons que la restauration de la fonction régulatrice d’un Breg chez les patients lupiques est possible. Le compartiment LB mémoire fixe fortement le GA et la pré-sensibilisation par le GA permet d’augmenter le potentiel régulateur des LB mémoires mais n’affecte aucunement celui des LB matures. Le GA exerce deux actions majeures sur le LB mémoire. D’une part, il génère une meilleure capacité d’inhibition de la prolifération T, dont le mécanisme est associé à un contact cellulaire impliquant les molécules HLA-DR. D’autre part, il favorise un contrôle plus efficace de la polarisation Th1 qui est très probablement associé à sa capacité à induire la production d’IL-10 dans ces LB. Enfin, le GA modifie le phénotype des LB mémoires puisque l’expression de CD5, IL-21R, ou encore PD-1 est significativement augmentée, autant de molécules impliquées dans la fonction suppressive et dans la production d’IL-10. En conclusion, nous montrons qu’amplifier une fonction régulatrice et surtout la restaurer lorsqu’elle est défaillante chez les malades, est parfaitement possible in vitro. Face à l’engouement suscité par le développement de procédés favorisant l’expansion des Bregs chez la souris à des fins thérapeutiques, l’enjeu est aujourd’hui d’être en mesure d’extrapoler de telles démarches chez l’Homme. Ce travail, avec toute la modestie requise, contribuera à faire naître un nouvel élan vers de telles perspectives. / B cell in systemic lupus erythematous (SLE) is unresponsive to all methods described to date, to activate B cells regulatory (Breg) function. Therfore, it is an interesting model to study the Breg deficiency in Human, and highlights many questions: is there a way to restore a defect of the Breg activation ? If yes, how can we act more efficiently ? Or in contrast, is it an irreversible state of the B cell? Glatiramer Acetate (GA) is a synthetic polypeptide used in the treatment of multiple sclerosis. We show that Breg activity of SLE B cells can be restored after stimulation with GA. Interestingly, memory B cells bound high level of FITC-conjuated GA in contrast to mature B cells. We desmonstrate that GA can increased specifically the regulatory activities of memory B cells. GA exerts two major actions on the memory B cells. It generates an improved capacity of inhibition of the T cell proliferative response, whose mechanism is associated with a cellular contact involving HLA-DR molecules. In addition, GA supports a more effective control of the Th1 polarization which is most likely associated with its capacity to induce the production of IL-10 in these B cells. Finaly, GA modifies the memory B cell phenotype since the expression CD5, IL-21R, or PD-1 is significantly increased, all molecules involved in the suppressive function and the IL-10 production. In conclusion, our results show for the first time that amplification of Breg function and additionally its restoration when it is defective in patients, can be perfectly achieved in vitro. Currently, while the development of new process supporting the expansion of Bregs in the mouse model exist, the challenge is to extrapolate such methods in human. Through the control of their regulatory potential, regulatory B cells could be the targets of novel therapeutic approach in autoimmune diseases. This study might open up new horizons in this field.