Aproximadamente 170 millones de personas en el mundo se encuentran infectadas por el virus de la hepatitis C (VHC). La gran heterogeneidad del mismo, permite distinguir hasta 6 genotipos y más de 50 subtipos, los cuales presentan diferencias en cuanto a su prevalencia, distribución geográfica y rutas de transmisión. Sin ir más lejos, en la Comunidad Valenciana, el VHC está presente en casi el 3% de la población. Los genotipos mayoritarios presentes, corresponden al 1b y 1a, siendo el 1b mucho más prevalente que el segundo. Así pues se plantea el principal objetivo de esta tesis: ¿Qué hace al genotipo 1b ser más prevalente en la Comunidad Valenciana que el 1a? Dos regiones del genoma del virus han sido utilizadas para llevar a cabo este estudio: la comprendida entre la proteína E1-E2, con una extensión de 472 nucleótidos y que contiene a la región hipervariable HVR1, y otra región de 743 nucleótidos de la proteína NS5A que contiene a la región ISDR, obteniendo un número aproximado de 10.000 clones.Para contestar a la pregunta que se plantea como principal objetivo llevamos a cabo diferentes estudios tales como el cálculo de diferentes medidas de variación genética, la inferencia de la historia demográfica, el desarrollo de distintos tests de neutralidad y la búsqueda de selección positiva en ambas regiones.Con respecto al primero, no encontramos diferencias significativas al llevar a cabo la comparación de las medias de los diferentes parámetros empleados, por lo que no parece, por tanto, que la variación genética esté relacionada con la mayor prevalencia de un genotipo sobre otro.Uno de los factores que parece influir en la diferente distribución geográfica y prevalencia de los genotipos es la ruta por la cual se transmite la enfermedad. La utilización de métodos basados en la teoría de la coalescencia puede ayudarnos a reconstruir la historia epidémica de diferentes secuencias del VHC, a partir de la diversidad genética viral presente. Uno de estos métodos es el que hemos utilizado aquí para inferir la historia demográfica del VHC para los genotipos 1b y 1a. Este análisis se llevó a cabo a dos escalas: individual y genotípica. El estudio a escala genotípica parece apoyar la hipótesis de que la mayor prevalencia de un genotipo sobre otro se deba a las diferentes rutas de transmisión. Ya que por un lado, las vías de contagio muestran una clara relación entre la ruta de transmisión y un determinado genotipo, en este caso el 1b con transfusiones y el 1a con ADVP. Por otro lado la fecha en que el genotipo 1b comienza a disminuir su tasa de crecimiento parece coincidir con el aumento en 1a, y a su vez coincide con la primera introducción de métodos de screening de sangre contra no-A no-B en transfusiones. Por tanto, parece que en los últimos años el contagio vía transfusiones de sangre, debido a las fuertes medidas de control sobre los productos sanguíneos, está casi totalmente controlado, por lo que la infección del virus (genotipo 1b) por esta ruta es muy difícil, dejando vía libre al contagio por ADVP (genotipo 1a).Los dos últimos estudios apuntan hacia desviaciones al modelo neutral, las cuales, se deben a la acción de la selección positiva en el caso de la región E1-E2, favoreciendo la resistencia al ataque del sistema inmune y negativa en el caso de la región NS5A, impidiendo la acumulación de mutaciones en la ISDR y favoreciendo la replicación viral. Estos resultados son similares en ambos genotipos, por lo que no serían responsables de la mayor prevalencia de un genotipo sobre otro.Así pues tras todos los análisis realizados podemos concluir que según nuestros resultados, la diferente ruta de transmisión que parecen seguir los genotipos a y 1b, sería responsable de la mayor prevalencia del genotipo 1b sobre el 1a. / Hepatitis C virus is present in 2% of the human population. It is characterised, phylogenetically, by the presence of a number of major genotypes, with a star-like phylogenetic distribution, and composed by several minor subtypes. The most abundant genotype in Europe is called 1, with two prevailing subtypes, 1a and 1b. In order to explain the higher prevalence of subtype 1b over 1a, we have carried out several large-scale sequence analysis, such as: analysis of polimorphisms, analisys of variance inference of demographic history, neutrality test and search of amonoacidical positions under positive selection. Two regions have been used for this task: one compressing the HVR1 (hypervariable region 1) and other including ISDR (Interferon sensitive determinig region) from 100 viral clones of each one of 25 patients subtype 1a and 25 1b, from the Comunidad Valenciana (Spain).Neither analysis of polimorphisms nor analysis of variance showed differences between subtypes, only the demographic history of the populations reflected some relation with regard to the route of transmission. By other hand we have found several positions in HVR1 under positive selection that coincide in both subtypes, therefore this situation neither explain difference in prevalence. Nevertheless the presence of mutations due to positive selection, could be indicating a mechanism of virus to scape from de attack of immune system. In contrast we observe the absence of positive selection in region ISDR. This absence could be favoring the resistance to interferon and the viral replication. This last situation is similar in both subtypes too.Therefore and in general, our results showed that route of transmission could be the cause of the highest prevalence of subtype 1b over 1a.

El término retraso mental se emplea para definir las dificultades en la adquisición de procesos cognitivos y adaptativos que presenta un determinado porcentaje de la población. Este porcentaje oscila en torno al 0,3%-0,5% para los casos graves a moderados y asciende al 2%-3% si se consideran también los casos leves. El retraso mental constituye, por tanto, un problema social y sanitario que se agrava en ambos sentidos cuando se trata de una condición hereditaria. Diversos estudios señalan desde hace años que, en concreto, el retraso mental ligado al cromosoma X es una de las principales causas de déficit psíquico leve y moderado, con una incidencia acumulada estimada en 1:300 a 1:600 varones. Dentro del retraso mental se distinguen, además, formas sindrómicas, cuando éste aparece asociado a otros síntomas de tipo somático, comportamental, neurológico o metabólico, o inespecíficas, si es el único síntoma que presenta el paciente. En este trabajo se ha abordado el análisis de varias familias afectadas de retraso mental inespecífico ligado al cromosoma X, así como de una familia afectada por el síndrome de Prieto, otra afectada por el síndrome de Lenz, y un paciente esporádico con síndrome de Coffin-Lowry. El análisis se ha centrado principalmente en dos regiones: Xp22 en los casos inespecíficos, y Xq11.4 en los sindrómicos, aunque también se han analizado dos genes en Xq24-q25. En la región cromosómica Xp22 se ha estudiado una región de 2,82 Mb, candidata a albergar el gen mutado en 6 familias. Esta región contiene 19 genes, de los que 13 fueron analizados en dichas familias por ser los mejores candidatos. En uno de ellos, FLJ14503, se ha detectado el cambio c.1734G>T, que no ha podido ser identificado en secuencias de las bases de datos ni en muestras procedentes de controles no afectados de retraso mental. Su análisis ha permitido clasificar la proteína que codifica como una nueva proteína asociada a microtúbulos, pero su implicación en el retraso mental aún no ha sido probada, dado que el análisis en células CHO-K1 de la localización subcelular de la proteína, así como del efecto de su sobreexpresión, no ha permitido todavía catalogar dicho cambio como patológico. En la región Xp11.4 se analizaron mediante secuenciación otros 13 genes, sin que ninguno de ellos haya podido ser relacionado hasta el momento con el síndrome de Prieto. Tampoco el análisis cuantitativo de 6 de ellos mostró diferencias significativas entre la expresión de pacientes y controles. El análisis del caso esporádico de síndrome de Coffin-Lowry ha permitido identificar una inserción de un elemento LINE L1 defectivo en el gen RPS6KA3 como la causa molecular de la patología presentada por el paciente. La inserción se ha producido cerca del sitio dador del intrón 3, provocando el skipping del exón 4, lo que conlleva un desplazamiento de la pauta de lectura y la aparición de un codón de parada prematuro.En el caso de la familia afectada por el síndrome de Lenz, se ha identificado la mutación responsable en el gen PQBP1, situado en Xp11.23. De esta forma se amplían tanto la heterogeneidad alélica de este gen, responsable de otros síndromes y de retraso mental inespecífico, como la heterogeneidad génica del síndrome de Lenz, por tratarse del tercer locus asociado a esta enfermedad. / Due to its relative high prevalence, mental retardation constitutes a social and a health problem, and it worsens in the case of hereditary conditions. Several studies have shown that X-linked mental retardation can especially be regarded as one of the major causes of mild to moderate intellectual handicap, showing a cumulative incidence of 1:300 to 1:600 males. In this work we have analysed nine different families: seven of them were affected by non-specific X-linked mental retardation, one suffered from Prieto syndrome and another from Lenz syndrome. In addition, a sporadic patient of Coffin-Lowry syndrome was analysed for mutations in the RPS6KA3 gene. In the case of the non-specific forms, we focused mainly in the Xp22 region, where 13 genes were screened for mutations. The patients of one family displayed a nucleotide change in one of these genes (FLJ14503), that could not be found neither in database sequences nor in control samples. Analysis of the protein encoded by this gene revealed that it might be a novel microtubule associated protein, but its implication in mental retardation remains yet to be proven. Two other genes were screened in Xq24-q25, but no mutations were found. In order to identify the gene responsible for the Prieto syndrome, 13 genes in the Xp11.4 region were screened by sequencing, but none of them could be implicated in the disease. A two base pair deletion in the PQBP1 gene was found to be the cause of the disease phenotype in the Lenz syndrome affected patients. This finding does not only broaden the allelic heterogeneity already described for PQBP1 mutations, it also increases the genetic heterogeneity of the Lenz syndrome itself, as PQBP1 would be the third locus associated with the disease. Analysis of the RPS6KA3 gene showed a de novo insertion of a defective LINE L1 element as the responsible mutation in the Coffin-Lowry patient. The element has inserted close to the splice donor site of intron 3, leading to the skipping of exon 4 in the processed mRNA and the disruption of the reading frame.

Las proteínas Muscleblind humanas, MBNL1, MBNL2 y MBNL3, son factores de splicing alternativo que se unen a sus pre-mRNAs diana mediante un nuevo dominio de dedos de zinc del tipo CCCH que esta conservado evolutivamente. Las proteínas MBNL están implicadas en la ruta de patogénesis de la Distrofia Miotónica (DM) ya que son secuestradas por la expansión del trinucleótido CUG presente en los mRNA mutantes de los genes DMPK (DM1) y ZNF9 (DM2). De acuerdo con el fenotipo de la DM, las mutaciones por pérdida de función en el gen muscleblind (mbl) de Drosophila afectan a la diferenciación terminal de la musculatura y los fotorreceptores. Sin embargo, no se conoce la función molecular de las proteínas Mbl en organismos modelo de invertebrados tales como Drosophila. En este trabajo mostramos que los tres genes MBNL humanos son parálogos, que tienen un patrón de expresión regulado a lo largo del desarrollo y que sus pre-mRNAs sufren un complejo patrón de procesado alternativo que genera distintas isoformas proteicas. Un estudio evolutivo muestra que las proteínas Mbl están presentes en todos los Bilateria y que se caracterizan por la presencia de, al menos, dos dedos de zinc del tipo CX7CX6CX3H. En humanos describimos un polimorfismo en la región 5´ no traducida del gen MBNL1 y analizamos su posible relevancia como modificador genético del fenotipo de la DM. Además, descartamos la presencia de mutaciones en la región codificante de MBNL1 en pacientes con DM sin expansión en el gen DMPK y en pacientes con Retinitis pigmentosa tipo 3. También descartamos mutaciones en la región codificante de MBNL3 en pacientes con Ptosis congénita asociada al cromosoma X. En Drosophila, hacemos un rastreo genético de modificadores dominantes del fenotipo de sobreexpresión de muscleblind en ojo. Los genes que interaccionan genéticamente se pueden agrupar en tres categorías generales: (1) Metabolismo del RNA, que incluye componentes del exon junction complex (EJC) tales como Aly y factores de splicing como nonA; (2) Regulación de la Transcripción, que incluye tanto proteínas que regulan la estructura de la cromatina (Jumeaux) como activadores de la transcripción (Dp), y (3) Control de la Apoptosis, que incluye tanto genes proapoptóticos (thread) como antiapoptóticos (Traf). Además, en este trabajo generamos moscas transgénicas que expresan la proteína de fusión MblC:GFP y las usamos para llevar a cabo experimentos de co-immunoprecipitación (coIP) con el fin de identificar proteínas que interaccionen físicamente con Mbl. Como resultado, hemos identificado seis bandas que coIP in vivo con la proteína de fusión MblC:GFP. Mediante la técnica de Western blot, descartamos la presencia en el coIP de MblC:GFP de algunas proteínas candidatas como Jumu, Aly, Amos y NonA. Este resultado nos permite concluir que estas cuatro proteínas no interaccionan físicamente con Mbl, al menos bajo las condiciones experimentales testadas. / Human Muscleblind proteins MBNL1, MBNL2 and MBNL3 are alternative splicing regulators that bind pre-mRNAs through an evolutionarily conserved tandem CCCH zinc finger domain. MBNL proteins have been implicated in the pathogenetic pathway of the Myotonic Dystrophy (DM) as they are sequestered by the CUG triplet repeat expansion-containing mRNAs of mutant DMPK (DM1) and ZNF9 (DM2) genes. In agreement with the DM phenotype, Drosophila muscleblind (mbl) loss-of-function mutations impair terminal differentiation of muscle and photoreceptor cells. However, little is known about the molecular function of Mbl proteins in invertebrate model organisms. In this work, we report that the three human MBNL genes are paralogues, their expression pattern is developmentally regulated and their pre-mRNAs undergo a complex alternative splicing regulation generating several protein isoforms. An evolutionary study shows that Mbl proteins are present in all Bilateria and are characterized by the presence of, at least, two CX7CX6CX3H zinc fingers. In humans, we describe a polymorphism in the 5´ untranslated region of the MBNL1 gene and analyze its potential relevance as a genetic modifier of the DM phenotype. Moreover, we discard mutations in the coding region of the MBNL1 gene in DM patients showing no CTG expansion in the DMPK gene and in patients with Retinitis Pigmentosa type 3. We also discard mutations in the coding region of the MBNL3 gene in patients with X-linked Congenital Isolated Ptosis. In Drosophila, we made a genetic screen for dominant modifiers of a muscleblind overexpression phenotype in the eye. Genes that genetically interact with mbl fall into three broad categories: (1) RNA metabolism, including components of the exon junction complex (EJC) such as Aly and splicing factors such as nonA; (2) Transcription regulation, which includes chromatin structure regulators (Jumeaux) and transcription activators such as Dp, and (3) Apoptosis control, including both proapoptotic (thread) and antiapoptotic (Traf) genes. In addition, we generated transgenic flies expressing a MblC:GFP fusion protein and used them to perform co-inmunoprecipitation (coIP) experiments to uncover proteins that physically interact with Mbl. We identified six bands specifically coIP with the MblC:GFP fusion protein and discarded Jumu, Aly, Amos and NonA as Mbl molecular partners.

La ataxia de Friedreich es una enfermedad humana neurodegenerativa y de herenciaautonómica recesiva. Es la ataxia hereditaria más común en la población caucásica. Laenfermedad está causada por la deficiencia de la proteína frataxina. Las claves sobre lafunción de la frataxina provienen de los diferentes estudios llevados a cabo en variosorganismos modelo. Se han aislado los genes ortólogos en un número elevado deorganismos desde bacterias al ratón y también en plantas. En nuestro laboratorio se haaislado el gen de Drosophila que codifica para la proteína frataxina, el gen fh.Drosophila ha resultado ser un excelente modelo para el estudio de enfermedadeshumanas dado que son muchos los procesos biológicos conservados entre la mosca y elhombre, como por ejemplo, la formación y degeneración del sistema nervioso, lageneración y función del corazón, el metabolismo mitocondrial, etc.En este trabajo seha abordado el estudio de la función del gen fh en D. melanogaster empleando tres delas múltiples estrategias existentes en este organismo orientadas a la obtención defenotipos mutantes: la movilización de elementos transponibles P, el sistema ARNi y lasobreexpresión. Con los experimentos de mutagénesis insercional no se obtuvieron losresultados esperados debido a que el gen fh es un gen pequeño localizado en una regiónrica en genes y flanqueado por dos e incluso tres puntos calientes de inserción. Seabordó entonces una segunda aproximación consistente en el uso del sistema UASGAL4para el desarrollo de experimentos de sobreexpresión e interferencia. Lainterferencia o la sobreexpresión del gen fh en los tejidos de Drosophila equivalentes aaquellos afectados en los pacientes (sistema nervioso periférico, músculo y corazón) yen el desarrollo embrionario de Drosophila, inducen la aparición de letalidad, de algunaalteración fenotípica o de alguna modificación del comportamiento. Los defectosencontrados se concentran por una parte en el SNP, tanto en las neuronas y axones delcomportamiento sensorial, como en los axones motores embrionarios. En esta caso lasneuronas motoras no parecen afectadas, aunque la sobreexpresión y la intereferencia enestas estructuras si que han inducido defectos en el adulto. Por otra parte, se hanobservado alteraciones importantes en varios de los derivados del mesodermoembrionario, como son el músculo somático y las células cardiacas y pericardiacas.Todos estos defectos conducen a la aparición de 100% de letalidad antes de la emersióndel adulto o a una disminución de la capacidad de supervivencia y escalada en los casosen los que se obtiene descendencia. La interferencia y la sobreexpresión en el músculosólo han resultado efectivas si la alteración se produce en los primeros momentos deldesarrollo de las estructuras afectadas. Por su parte, en el SNP sólo se han producidodaños cuando se han afectado conjuntos de precursores sensoriales o de neuronassensoriales recién diferenciadas, que participan en la formación de los órganossensoriales en el embrión y en el adulto. Pero al parecer, la función de fh no es igual deimportante en todos los órganos sensoriales, ya que la modificación de su expresión enlos órganos cordotonales no parece producir ningún efecto significativo, aunque esposible que sea debido a que las funciones que desarrollan también son realizadas porlas neuronas multidendríticas.Todos los resultados descritos permiten establecer un modelo, en D. melanogaster, parael estudio de la ataxia de Friedreich. / Friedreich ataxia is a severe autosomal recessive disease characterized byneurodegeneration, cardiomyopathy, and diabetes, resulting from reduced synthesis ofthe mitochondrial protein frataxin. It is the most common ataxia among the caucasianpopulation. The research developed in in patient cells and model organisms such asyeast, worm, fruitfly and mouse have suggested several hypotheses on the frataxinfunction, but the full physiology of frataxin in mitochondria has not been wellestablished yet. In our laboratory, the Drosophila frataxin gene (fh) was isolated. Veryrecently Drosophila has become an excellen model to study human diseases given thathumans and flies have in common the most important biological processes, for exampledevelopment and degeneration of nervous system, heart development, mitochondrialmetabolic pathways, etc... In this work, we have carried out the study of the Drosophilafrataxin function using three strategies: insertional P element mutagenesis, RNAisystem and overexpression. The insertional mutagenesis was unsuccessful because fh isa small gene that lies in a crowed genomic region and is surrounded by two and eventhree insertional hotspots. Then we began to use a second approach based on thegeneration of transgenic flies overexpressing and reducing the Drosophila frataxinhomolog gene by means of the UAS-GAL4 system. Full lethality, phenotypic alterationsor misbehaviours (climbing deficits and shortened life span) were achieved when thisgene was overexpressed or knocked down in a general or mesodermal patterns and inthe PNS (the most affected tissues in the patients) due to the appearance ofdevelopmental defects in muscle, heart and nervous system. Our results showed thatboth an excess or a reduction of frataxin expression disturb development of muscularand nervous systems in Drosophila. As in humans, the damages are mainly focused onthe Drosophila peripheral nervous elements (sensory and motor axons and neurons).Moreover, important defects have also been observed in mesodermic derivates such assomatic muscles, cardial and pericardial cells. However, the defects have only beenprovoked when the misexpression was carried out in the earlier stages of muscle andnervous system development.All these data together suggest that D. melanogaster could be an appropiate modelorganism to study Friedreich ataxia.

La distrofia miotónica tipo 1 (DM1) es una enfermedad neuromuscular que se debe auna expansión de repeticiones CTG inestables en la región 3' no traducida del genproteína kinasa de la DM (DMPK). La DM1 se caracteriza por la miotonía y distrofiamuscular que muestran los pacientes, los cuales también presentan cataratas,arritmias cardiacas y alteraciones neuropatológicas. A nivel bioquímico muestrandefectos en el procesado alternativo de pre-mRNAs específicos lo cual explica algunossíntomas definitorios de la DM1. El mecanismo de patogénesis se debe a la toxicidadde los RNAs con expansiones CUG para la célula. Varias proteínas de unión a RNA,como las proteínas humanas Muscleblind-like MBNL1-3 son secuestradas por lostranscritos mutantes DMPK. Las proteínas MBNL colocalizan con los foci ribonuclearesCUG dentro de los núcleos de músculo y neuronas de pacientes DM1. Existendefectos asociados a DM1 en ratones knockout para Mbnl1 y en moscas mutantesmuscleblind. Nos propusimos generar un modelo en Drosophila de la DM1 paraentender su mecanismo molecular y celular. En primer lugar comprobamos que lasproteínas Muscleblind de Drosophila y la humana MBNL1 eran homólogos funcionales.Un modelo basado en secuestrar la proteína Muscleblind endógena con RNAsportadores de repeticiones CUG sólo sería relevante desde el punto de vistabiomédico si la proteína de Drosophila y la humana realizan funciones equivalentes.Una vez demostrada la conservación funcional entre ambas proteínas mediante elrescate del fenotipo mutante muscleblind expresando la proteína humana, generamosmoscas transgénicas capaces de expresar 60 y 480 repeticiones CUG en un transcritono codificante bajo el control del sistema GAL4/UAS. Detectamos que los RNAs de480 repeticiones CUG formaban inclusiones nucleares y que Muscleblind erasecuestrada por estos transcritos tal y como ocurre en pacientes DM1. La expresiónde RNAs (CUG)480 en músculo mostró una reducción dependiente de la edad en eltamaño de la fibra de los músculos indirectos del vuelo y un aumento en el número devacuolas. Analizamos el patrón de procesado de la α-actinina, un gen muscular, enmoscas que expresan RNAs (CUG)480 y se observó una alteración en los niveles deisoformas. En pacientes también se ha descrito una degeneración en las células de laretina y una pérdida en las neuronas fotorreceptoras. Analizamos la retina de lasmoscas modelo que expresaban RNAs (CUG)480 en el disco de ojo-antena y mostraronalteraciones en la adhesión de las células subretinales y la falta de los rabdómeros delos fotorreceptores. Externamente mostraban un fenotipo de ojo rugoso y ligeramentemás pequeño que utilizamos para comprobar mediante una combinación alélica depérdida de función de muscleblind que las repeticiones CUG estaban interfiriendogenéticamente con la función de este gen. Realizamos una búsqueda demodificadores dominantes con este fenotipo ojo rugoso para identificar genespotencialmente relacionados con el mecanismo de patogénesis de la enfermedad.Identificamos los genes viking y thread entre otros como modificadores y losagrupamos en cinco categorías en función del proceso celular en el que estuvieranactuando; factores de transcripción reguladores, reguladores de la estructura de lacromatina, adhesión celular, apoptosis y metabolismo del RNA. Finalmentecomprobamos in vivo si los RNAs CUG podían ser una fuente de siRNA o miRNAs. Laexpresión de estos RNAs de doble cadena incrementaron los niveles de transcritos demuscleblind por un mecanismo desconocido. En resumen, hemos demostrado queestas moscas reproducen aspectos de la enfermedad humana DM1 y puedenutilizarse para el estudio de la misma. / Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is a neuromuscular disease involving the expansionof unstable CTG repeats in the 3´ untranslated region of the DM protein kinase (DMPK)gene. DM1 is multisystemic and characteristic features include myotonia, musculardystrophy, cardiac arrhythmias, and neuropathology. A biochemical hallmark of DM1 ismisregulated alternative splicing of specific skeletal muscle, heart and brain premRNAs.In mice, expression of 250 CUG repeats within a heterologous RNA gives riseto DM1-like phenotypes demonstrating that expanded CUG repeat transcripts are toxicto cells. RNA binding proteins, most notably human Muscleblind-like proteins MBNL1-3are sequestered by mutant DMPK transcripts. MBNL proteins co-localize with CUGribonuclear foci within muscle and neuron nuclei in DM1 patients. DM1-associateddefects are remarkably similar to those observed in Mbnl1 knockout mice andmuscleblind mutations in Drosophila provide additional examples of DM1-likealterations. To understand this toxic RNA gain-of-function mechanism we developed aDrosophila model expressing 60 and 480 CUG repeats in the context of a nontranslatableRNA. Previously, we showed that MBNL1 rescues a muscleblind loss-offunctionphenotype, thus demonstrating functional conservation. CUG-expressing fliesreproduced aspects of the DM1 pathology, including nuclear accumulation of CUGtranscripts, dystrophic muscles that degenerate with age, splicing misregulation, andreduced Muscleblind activity (evident from the enhancement of CUG-inducedphenotypes by a decrease in muscleblind dose). Targeted expression of CUG repeatsto the developing eye was toxic originating eyes externally rough and smaller thannormal. This phenotype was utilized to identify 15 genetic modifiers. These includedviking and thread, which suggest cellular processes previously unknown to be alteredby CUG repeat RNA such as cell adhesion, programmed cell death, nuclear-cytoplasmexport complex ECJ, and chromatin remodelling. We also explored the possibility thatCUG repeat RNA could be a source of small interfering RNAs, thus silencingtranscripts containing complementary sequences such as muscleblind transcriptthemselves. Surprisingly, we detected an increase of muscleblind mRNA in CUGexpressingflies. To sum up, here we describe Drosophila flies that reproduce aspectsof the human disease DM1 and that can find application in the study of DM1.

El gen muscleblind (mbl) es necesario para el adecuado desarrollo del sistema nervioso periférico embrionario y la diferenciación terminal de los fotorreceptores y los músculos en Drosophila. A partir del único gen muscleblind de Drosophila se generan cuatro transcritos por procesado alternativo que codifican para cuatro proteínas caracterizadas por la presencia de dedos de zinc del tipo Cys3H. Los homólogos de muscleblind en vertebrados son los genes Muscleblind-like1, 2 y 3 (MBNL1-3). Las proteínas humanas MBNL1, 2 y 3 tienen la capacidad de modificar el procesado alternativo de diversos transcritos y tienen un papel importante en la patogénesis de la distrofia miotónica (DM). La DM es una enfermedad autonómica dominante generada por la expansión del trinucleótido CTG en una región no codificante del gen DMPK. La presente tesis recoge experimentos realizados en diferentes sistemas para desvelar la función molecular de las proteínas Muscleblind de Drosophila. Este trabajo demuestra la conservación de la actividad como factores de splicing alternativo y la ruta patogénica de la DM en moscas. Se describen dos nuevas dianas moleculares de las proteínas Muscleblind, los transcritos de la alpha-actinina y la troponinaT, cuyo patrón de splicing está alterado en mutantes mbl y en moscas que expresan repeticiones CUG. Además, mediante experimentos en cultivo celular se muestra la capacidad de estas proteínas de inducir muerte celular al ser sobre-expresadas en células S2 de Drosophila. Las isoformas de Muscleblind mostraron diferente capacidad en los distintos ensayos funcionales realizados. Mediante experimentos de sobre-expresión en células de vertebrado y mutagénesis dirigida mostramos la implicación de los extremos carboxilo en la diversificación funcional de las isoformas de Muscleblind. Las isoformas se localizan en distintos compartimentos sub-celulares y la eliminación de un sitio putativo de sumolización (FKRP) conservado altera la capacidad de inducir muerte celular de MuscleblindC. / The human Muscleblind-like proteins MBNL1-3 bind RNAs through pairs of zinc fingers of the Cys3His type. They have the ability to modify alternative splicing and sub-cellular localisation of defined transcripts and their function is impaired in myotonic dystrophies type 1 and 2 (DM1 and DM2). DMs are autosomal dominant neuromuscular diseases characterized by myotonia, muscle weakness, and iridescent cataracts, among other symptoms. At a molecular level, DM patients show disruption of alternative splicing regulation of specific transcripts. The genetic cause of these diseases is the expansion of either a CTG or a CCTG repeat in non-coding regions of the DMPK (DM1) and ZNF9 (DM2) genes. Upon transcription, expanded RNAs form stable hairpins, which sequester nuclear factors depleting them from their normal function. Among those factors are the MBNL proteins. The relevance of MBNL sequestration in DM pathogenesis is supported by muscleblind like 1 knock-out mice (Mbnl1DE3/DE3), which reproduce the main features of DM patients including myotonia, cataracts, and RNA splicing defects in transcripts such as troponinT 2 and 3. Furthermore, expression of Mbnl1 protein reverts the DM-like alterations of mice expressing expanded CUG containing RNA.

Los viroides, los agentes infecciosos más pequeños descritos hasta la fecha (246-401 nt), están constituidos únicamente por una molécula circular de RNA de simple cadena. A pesar de su tamaño y de no codificar proteínas son capaces de replicarse autónomamente, moverse sistémicamente, y causar enfermedades en plantas susceptibles gracias a su capacidad para interaccionar con factores del huésped. Dichas propiedades biológicas y moleculares hacen de estos patógenos un excelente modelo para abordar el estudio de cuestiones básicas sobre la relación entre la estructura del RNA y su función.La replicación de los viroides transcurre según un mecanismo de círculo rodante en el que sólo intervienen intermediarios de RNA. Este proceso conlleva tres etapas: i) la transcripción reiterada del RNA circular monomérico infeccioso más abundante, al cual se la asigna arbitrariamente la polaridad positiva, ii) el corte de los RNAs oligoméricos de una o de ambas polaridades, y iii) la ligación de los RNAs monoméricos lineales resultantes. Mientras que para los viroides cloroplásticos (familia Avsunviroidae) se conoce el sitio de corte de los RNAs oligoméricos y la actividad catalítica implicada (ribozimas de cabeza de martillo que sus RNAs de ambas polaridades pueden adoptar), para los viroides nucleares (familia Pospiviroidae) ambos aspectos son controvertidos.En el presente trabajo hemos abordado el estudio del procesamiento (corte de los RNAs oligoméricos de polaridad positiva y ligación de los RNAs monoméricos lineales) de los viroides nucleares utilizando una metodología in vivo basada en plantas de Arabidopsis thaliana que expresan transcritos diméricos de tres miembros de la familia Pospiviroidae. Mediante el análisis del extremo 5' de los RNAs monoméricos lineales procesados in vivo (en plantas transgénicas o en plantas huésped infectadas), hemos identificado el sitio de corte en un motivo conservado en la familia: la rama superior de la región central conservada (CCR, central conserved region). Las secuencias que la componen y las repeticiones invertidas que la flanquean pueden adoptar un plegamiento en horquilla o, alternativamente, una estructura de RNA bicatenario palindrómico en RNAs oligoméricos. El sitio de corte determinado se localiza en posiciones estructuralmente equivalentes en los tres viroides estudiados, lo que sugiere la implicación de una o de ambas estructuras en la etapa de corte. Los datos obtenidos con varias líneas transgénicas de A. thaliana que expresan cDNAs diméricos de uno de los tres viroides mutados en posiciones definidas de la CCR han permitido concluir que el sustrato de la reacción de corte debe ser la estructura de RNA bicatenario palindrómico y que el bucle E, presente en la conformación en varilla de algunos miembros de la familia, participa en la reacción de ligación aunque no es el único motivo estructural relevante. Es de destacar que el modelo propuesto en este trabajo es aplicable a todos los miembros de la familia Pospiviroidae, y difiere de los modelos previos basados en estudios in vitro que tienen una aplicación más restringida.Los sitios de corte en la conformación que contiene el RNA bicatenario palindrómico generan RNAs monoméricos lineales con extremos 3' con dos nucleótidos protuberantes, la huella característica de las RNasas III. La caracterización de los grupos químicos terminales de los RNAs monoméricos lineales procesados in vivo indica la presencia de extremos 5'-P, 3'-OH compatibles con la actividad de una enzima de esta familia y con una RNA ligasa distinta a la única caracterizada en plantas. / Viroids are small, circular, noncoding RNAs that currently are known to infect only plants. They also are the smallest self-replicating genetic units known. Without encoding proteinsand requirement for helper viruses, these small RNAs contain all the information necessary to mediate intracellular trafficking and localization, replication, systemic trafficking, and pathogenicity. All or most of these functions likely result from direct interactions between distinct viroid RNA structural motifs and cellular factors. Viroids present a simple model system to address some basic questions about the RNA structure-function relationships.Replication of viroids entails reiterative transcription of their incoming single-stranded circular genomes, to which the (+) polarity is arbitrarily assigned, cleavage of the oligomeric strands of one or both polarities to unit-length, and ligation to circular RNAs. While cleavage in chloroplastic viroids (family Avsunviroidae) is mediated by hammerhead ribozymes, where and how cleavage of oligomeric (+) RNAs of nuclear viroids (family Pospiviroidae) occurs in vivo remains controversial.In the present work we have re-examined this question in vivo, using transgenic Arabidopsis lines expressing three dimeric nuclear viroid RNAs and host plants infected. Using this methodology, we have mapped the processing site of these three members at equivalent positions of a conserved region (the hairpin I/double-stranded structure that the upper strand and flanking nucleotides of the central conserved region can form). Together with mapping the in vivo processing site, our results with sixteen mutants of one of these viroids support that cleavage is directed by an RNA motif conserved in all members of the family, and ligation by an extended conformation containing a motif termed loop E. These results have deep implications on the underlying mechanism of both processing reactions, which are most likely catalyzed by enzymes different from those generally assumed: cleavage by a member of the RNase III family, and ligation by an RNA ligase distinct from the only one characterized so far in plants, thus predicting the existence of a least a second plant RNA ligase.

En el periodo 1991-2002 la prevalencia de infección por virus de la hepatitis C (VHC) en la población de donantes de sangre de la Comunitat Valenciana ha disminuido un 66%, estando en el último año (2002) alrededor del 0.27%. En general, la prevalencia en nuestra Comunidad fue superior a la media de España y a la de otros países europeos y similar a la de Estados Unidos y Japón. En cuanto a la tasa de incidencia de la infección por VHC en donantes de sangre, la Comunitat Valenciana ha disminuido en el periodo de estudio casi 30 veces, llegando a un valor de 3.4 x 105 donante-años en 2002, presentando una tasa superior a la del resto de España y de los demás países considerados. Por tanto, el riesgo residual ha disminuido también en este periodo, llegando a ser de 1.12 x 106 donaciones en 2002. Este valor también ha sido superior respecto a los demás países comparados. Entre las distintas provincias de la Comunitat Valenciana hay diferencias significativas entre los valores de prevalencia anual, siendo en el periodo 1991-1999 mayores en las provincias de Valencia y Castellón que en la provincia de Alicante (p<0.05). En cambio, en el periodo 2000-2002 los valores de prevalencia de VHC en Alicante han sido similares a los de las provincias de Valencia y Castellón.A lo largo del periodo 1990-2002, han ido disminuyendo los valores de prevalencia, incidencia y riesgo residual de transmisión de VHC. La disminución del riesgo residual se ha producido en parte por el aumento de sensibilidad en las pruebas de cribado. La exclusión de los donantes con riesgo de transmitir el VHC y la información recibida por la población general sobre las vías de contagio de la infección han contribuido, probablemente, al descenso de la prevalencia e incidencia. En cuanto a las técnicas clásicas de detección de anticuerpos empleadas en el estudio, la especificidad de las pruebas serológicas de cribado de 3ª generación para la detección de anticuerpos anti-VHC (99.84%) ha sido mayor que la de las pruebas de 2ª generación (p<0.05). Respecto a las pruebas serológicas de confirmación, la proporción de resultados indeterminados obtenidos con las pruebas de 2ª y 3ª generación ha sido similar (25-30%).La introducción de la pruebas amplificación genómica (NAT) en 1999 para el cribado de todas las donaciones de sangre en la Comunitat Valenciana no ha supuesto grandes dificultades y ha reducido el periodo ventana de la infección por VHC y, por tanto, el riesgo residual. El rendimiento observado con la introducción de las pruebas de detección genómica del VHC en la Comunitat Valenciana, entre 1999 y 2006 ha sido de una donación en periodo de ventana serológico por cada 320000 unidades de sangre. Este rendimiento es superior al obtenido en otros centros de transfusión españoles, europeos y de Estados Unidos, lo cual podría deberse a la prevalencia de infección por VHC más elevada en nuestra comunidad. El rendimiento esperado por la introducción de dichas pruebas NAT en el periodo 2000-2002 ha resultado ser similar al rendimiento NAT observado. La puesta en marcha de la prueba NAT en el cribado de donaciones de sangre, ha hecho que sea innecesaria la prueba de cuantificación de la enzima alanina aminotransferasa (ALT) para la detección de infección por VHC en las fases iniciales de la enfermedad. / In the period 1991-2002 the prevalence for HCV infection in the population of blood donors of the Valencian Region has dropped 66%, being in the last year (2002) around 0.27%. As the incidence rate of the infection for HCV in the Valencian blood donors has been reduced in the period of study 30 times, reaching 3.4x105 donor-years in 2002, the residual risk has also dropped in this period, being of 1.12x106 donations in 2002. Among the different provinces of the Valencian Region there are significant differences on annual prevalence, being the provinces of Valencia and Castellón higher than the province of Alicante (p<0.05) in the period 1991-1999. On the other hand, in the period 2000-2002 the prevalence of HCV in the three provinces have been similar. Along the period 1990-2002, the prevalence, incidence and residual risk of transmission of HCV have continued dropping. The decrease of the residual risk has taken place partly due to the increase of sensibility in the screening tests. The exclusion of the donors with risk of transmitting the HCV infection and the public awareness of infection has probably contributed to the descent of the prevalence and incidence rates. As regards the antibodies detection test used in the study, the specificity of screening serologic test of third generation (99.84%) for detection of the Hepatitis C Virus (HCV) has been higher than that of second generation test (p<0.05). About the confirmation serologic test, the proportion of indeterminate results obtained with the second and third generation test has been similar (25-30%). The introduction screening genomic test (NAT) in our center has not been difficult, the window period of the infection for HCV has been reduced and thus, the residual risk. Between 1999 and 2006, the observed yield with the introduction of the genomic test for detection of the HCV in the Valencian Region, has been 1:320000. This observed yield has been similar to the expected yield by NAT test between 2000 and 2002. Due to the implementation of the NAT screening test in blood donations, the alanine aminotransferase (ALT) quantification test for the detection of HCV in the initial phases of the illness is unneccessary.

En los vertebrados, las gonadotrofinas (FSH y LH) son hormonas esenciales en el control de la gametogénesis y esteroidogénesis gonadal. Sus acciones están mediadas por la activación de sus respectivos receptores. A pesar de su importancia en la función reproductora, en teleósteos se dispone de muy poca información relativa a estos receptores. En este trabajo se investigaron las características moleculares, estructurales y funcionales de los receptores de gonadotrofinas (FSHR y LHR) de un teleósteo marino, la lubina (Dicentrarchus labrax). Además, se evaluó la especificidad de unión al ligando de estos receptores. Usando un método de RT-PCR cuantitativo, se midieron los perfiles de expresión de los receptores de gonadotrofinas durante la primera maduración gonadal de machos y hembras de lubina. Asimismo, se investigaron posibles relaciones entre estos perfiles, los de la proteína responsable de la respuesta aguda de la esteroidogénesis (StAR) y los perfiles plasmáticos de esteroides sexuales. Estudios recientes realizados en diversas especies de peces sugieren que el receptor de TSH (TSHR), que comparte características estructurales con los receptores de gonadotrofinas, podría estar directamente implicado en la fisiología gonadal. Por ese motivo, en este trabajo se investigó una posible participación del TSHR en la función reproductora de la lubina. Los resultados obtenidos contribuyen a entender en que momento del ciclo reproductor las células germinales en crecimiento son sensibles a las señales procedentes de la hipófisis (gonadotrofinas). Además, se ha demostrado que, a diferencia de otros peces, las interacciones entre los receptores de gonadotrofinas de lubina y sus respectivos ligandos son específicas. Asimismo, podemos decir que en la lubina, los receptores de gonadotrofinas se expresan en momentos diferentes del ciclo reproductor. Esto apoya la idea de que la FSH y la LH poseen diferentes acciones en el control de la función gonadal. Desde de un punto de vista aplicado, estos conocimientos podrían ser de gran importancia en la manipulación del ciclo reproductor de esta especie de gran valor económico. Por lo tanto, estos estudios son relevantes tanto por su componente de investigación básica como por las posibles aplicaciones que pueden derivarse. / In vertebrates, the pituitary gonadotropins, follicle-stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH), are the main regulators of gametogenesis and gonadal hormone production. To exert their biological actions, gonadotropins must bind to, and activate specific cell-surface receptors. The primary aim of the studies underlying this thesis was to investigate the role of gonadotropins in the sea bass (Dicentrarchus labrax) reproductive function by studying their cognate receptors. Two cDNAs encoding a FSH receptor (sbsFSHR) and a LH receptor (sbsLHR) were cloned and characterized. Their gene structure, expression, and functional activity were evaluated. Sea bass FSHR and LHR mature proteins display typical features of the glycoprotein hormone receptor family members, but the sbsFSHR also contains some remarkable differences when compared with other fish or mammalian FSHRs. Among them, a distinct extracellular N-terminal cysteine domain as regards to its length and cysteine number, and the presence of an extra leucine-rich repeat. sbsLHR is more conserved than sbsFSHR when comparing their genomic primary structures with other vertebrate gonadotropin receptors, particularly in the extracellular domain. Furthermore, two alternately spliced variants of the sbsFSHR were amplified. Both correspond to transcripts originated by removal of exons from the extracellular domain. Expression analysis revealed that the sbsFSHR is exclusively expressed in gonads, specifically in the wall of previtelogenic and early-vitelogenic follicles. On the contrary, sbsLHR mRNA was found to be widely distributed in somatic tissues. Recombinant sbsFSHR was specifically stimulated by bovine FSH, while sbsLHR was activated by both bovine LH and FSH. Nevertheless, specific stimulation of both sea bass FSHR and LHR was observed when recombinant sea bass gonadotropins were used advancing specific interactions. This behaviour differs from studies in other teleost where promiscuous activation was reported. The expression profiles of sea bass gonadotropin receptors were investigated in the gonads of both sexes during a complete reproductive cycle, in parallel with the expression of steroidogenic acute regulatory protein (StAR) gene and reproductive hormones. While in male sea bass, both gonadotropin receptors show different expression patterns, in females their expression patterns were somehow similar. Expression of the sbsFSHR was connected with early stages of gonadal development, but also with the spermiation period in males and the maturation-ovulation period in female. The expression profile of the sbsLHR, in both sexes, supports the already suggested involvement of LH in the regulation of the final stages of fish gamete maturation and ovulation/spermiation. sbsStAR expression was strongly correlated with sbsLHR expression. In addition, the expression profile obtained for sbsStAR suggests that this protein mediates the rapid delivery of sterol substrate for the synthesis of gonadal maturation inducing steroids. No strong relationship between gonadotropin receptor expression and plasma levels of the analysed sex steroids was seen. Further studies will be needed to understand how gonadotropins and sex steroids interact to regulate sea bass reproduction.Recent studies reported abundant expression of TSHR transcripts in both the ovary and testis of some fish species. To help elucidate the physiological role that TSHR may have in the gonadal function of sea bass, a cDNA encoding a TSHR was isolated from the gonads of this fish species. The mature protein displays typical features of the members of the glycoprotein hormone receptor family. By RT-PCR analysis we demonstrate the extra-thyroidal expression of sbsTSHR in numerous tissues of the sea bass. Seasonal changes in sbsTSHR mRNA levels in female and male sea bass during puberty suggest that in females the TSHR could participate in active vitellogenesis and in the regulation of gamete maturation and ovulation, whereas in males, the TSHR would be involved in the regulation of early stages of the gonadal development and also of gamete maturation and spermiation.

No description available.