Una de las estrategias más satisafactorias empleadas en la lucha contra el cáncer es la utilización de la terapia génica para actuar en la inmunomodulación, es decir la actuación sobre el propio sistema inmunitario del paciente para que sea éste quien reconozca al tumor como algo foráneo, que no escape a la inmunovigilancia y lograr destruirlo. En esta tesis doctoral hemos explorado bajo este concepto las vacunas por terapia génica no viral, tanto preventivas como terapéuticas, trabajando bien con antígenos aislados y genes como con células y genes. Los experimentos en modelo de melanoma murino, se han divido en tres grandes bloques. 1) En las vacunas preventivas con antígenos, se obtuvieron diferentes tasas de reducción de volumen tumoral, acompañadas de producción de inmunnoglobulinas G específicas frente al tumor tratado. Se obtuvieron los mejores resultados en modelos de vacunación con acondicionamiento tisular en los que inicialmente se acondicionaba al animal con los antígenos purificados, transfectando posteriormente con plásmidos desnudos productores del gen de mGM-CSF. 2) En las vacunas preventivas celulares, transfectando células B16 con plásmidos portadores de los genes de mGM-CSF, mIL-12, mB7.2 y combinaciones entre ellos, se obtuvo la protección total frente al tumor en los animales vacunados con 3 dosis de 2x105 células transfectdas, irradiadas, no seleccionadas. Además se demostró que la vacunación había generado memoria inmunológica, al repetir la exposición al tumor en los mismos animales un año después y volver a lograr la protección total. Adicionalmente se realizaron experimentos de vacunación exclusivamente con las células transfectadas, seleccionadas y purificadas mediante bolas magnéticas. 3) Por último, se realizaron experimentos de vacunación terapéutica, en animales portadores de tumor, siguiendo el modelo de células transfectadas. Se probaron diferentes dosis celulares y el tratamiento previo con ciclofosfamida. Los mejores resultados de inhibición tumoral y prolongación de la supervivencia se obtuvieron en las vacunas con 2 millones de células/dosis. Finalmente se realizó una primera aproximación al estudio del bloqueo del éxito de la vacunación terapéutica, analizando la población de células T reguladoras en los animales tratados. / One of the most satisfactory strategies against cancer is the use of gene therapy for immunemodulation, that is acting over the patient's immune system in order to make it recognize the tumor and fight properly against it. In this thesis, we have explored the nonviral gene therpy vaccines under this concept, working with preventive as well as therapeutic models, with purified antigens and genes and also with whole cells and genes. The experiments have been performed with a murine melanoma model and been divided in three sets. 1) In preventive antigen vaccines, different rates of tumor growth inhibition were obtained, acompained by specific antitumor immunoglobulin G production. The best results were obtained with tissue conditioning, where the animals were firstly conditioned with purified tumor antigens and later the tissues were transfected in vivo with naked plasmids producing mGM-CSF. 2) In preventive cell vaccines, transfecting B16 cells with plasmids bearing mGM-CSF, mIL-12, mB7.2 genes alone or combined, total tumor protection was obtained vaccinating with 3 doses of 2x105 transfected, irradiated, non selected cells. This vaccine also showed immunological memory since a second challenge to the tumor in the same animals one year later also reached total protection. In addition, experiments vaccinating only with the selected population of transfected cells, by means of magnetic beads, were performed. 3) Finally, therapeutic vaccines were evaluated, continuing with transfected cells. Different cell doses and pretreatment with cyclophosphamide were tested. The best results of tumor growth inhibition and survival were obtained with 2 million transfected cells/dose. A first approach to the study of the blockade in therapeutic model success was performed analysing the regulatory T cell population in the treated animals.

El género Saccharomyces incluye tanto especies naturales como especies de levaduras que se utilizan en fermentaciones industriales y tradicionales. Algunas bebidas fermentadas, como son el Pulque y la Chicha, se obtienen mediante un proceso tradicional desarrollado durante el Neolítico americano en las civilizaciones precolombinas mesoamericanas y andinas. Por ello, las levaduras que participan en estos procesos de fermentación han estado aisladas de las poblaciones vínicas del resto del mundo, hasta la llegada de los europeos en 1942, con la introducción de nuevos procesos fermentativos, como son la producción de vino y los destilados. El objetivo del presente estudio fue determinar la variación genética de las cepas del género Saccharomyces, tanto presentes en fermentaciones tradicionales como las de procesos fermentativos industriales, para deducir el origen y la historia evolutiva de Saccharomyces cerevisiae. Con técnicas moleculares se detectó a S. cerevisiae y S. paradoxus en bebidas tradicionales de Latinoamérica, y mediante estudios fisiológicos se demostró que S. cerevisiae presenta propiedades tecnológicas adecuadas para una fermentación vínica. Con el análisis filogenético de cuatro regiones nucleares y una mitocondrial se detectó que S. cerevisiae esta compuesta por dos poblaciones, una de ambientes vínicos y la otra de ambientes no vínicos, muy diferentes entre ellas. Las poblaciones vínicas se caracterizan por ser un grupo muy homogéneo, con baja tasa de recombinación, alta frecuencia de homocigosis, con menos diversidad genotípica y menos divergencia nucleotídica. Esto indica una reciente domesticación, con reproducción clonal y sucesos de autodiploidización. En cambio, las poblaciones no vínicas están formadas por un grupo muy heterogéneo, con reproducción clonal pero la reproducción sexual más frecuente por anfimixis. La detección de alelos vínicos y no vínicos entre las cepas de las poblaciones latinoamericanas indica que existe flujo genético entre ambas poblaciones. Por otro lado, se detectó que los alelos vínicos de S. cerevisiae no provienen de S. paradoxus sino de los alelos no vínicos de S. cerevisiae. En base a los resultados obtenidos se proponen dos posibles escenarios no incompatibles para el origen de S. cerevisiae. En un primer escenario, las cepas no vínicas forman una población muy heterogénea con alelos muy diversos, lo que dio lugar a la aparición de las cepas vínicas por domesticación, y se vio reducida la diversidad genética cuando se fijaron los alelos vínicos. En el segundo caso, las cepas vínicas y no vínicas, son poblaciones con alelos muy diferentes, pero con flujo genético se intercambiaron alelos vínicos en no vínicos, pero muy raro en el otro sentido. Finalmente se proponen que al menos tres eventos de hibridación dieron origen a las cepas híbridas aisladas de vinos, y probablemente a partir de uno solo para las cepas híbridas cerveceras. Sin embargo, los fenómenos de recombinación y de introgresión detectados entre diferentes especies de Saccharomyces permiten suponer que la hibridación puede ocurrir con mayor frecuencia. / Traditional fermented beverages and foods from Latin America are poorly studied. The yeast microbiota involved in these ancient processes has been isolated from "Old World" yeast populations until the introduction of winemaking and distillation. The aim of this work was to study the genetic variation of Saccharomyces strains from traditional and industrial fermentations and to deduce the origin and evolution of S. cerevisiae. S. cerevisiae and S. paradoxus were isolated from traditional Latin American fermentations. Some of the investigated S. cerevisiae strains showed good physiological properties that are important in the wine production. A genetic analysis was performed based on sequencing of four nuclear and one mitochondrial gene of strains isolated from Latin-American traditional and industrial (mainly European) fermentative processes. Genetic variability from S. cerevisiae strains shows two populations, one from wine and the second from non-wine fermentations. Wine population represent a very homogeneous group, with low recombination rate, high frequency of homozygous strains, low genotypic diversity and low nucleotide divergence. These finding indicate a recent domestication event by clonal reproduction and some events of haplo-selfing. Non-wine populations represent a heterogeneous group, with clonal reproduction and rare sexual reproduction by anfimixis. Wine and non-wine alleles detected in Latin-American populations indicated genetic flow. Phylogenetic analysis shows that wine alleles of S. cerevisiae are originated from non-wine alleles of S. cerevisiae, but not from S. paradoxus. Two theories are proposed for the origin of wine S. cerevisiae strains: 1) wine yeast represent a population with low genetic diversity because "wine" alleles were fixed and emerged after domestication event from an ancestral and heterogeneous population of non-wine yeast; 2) wine and non-wine strains represent populations with different alleles, but genetic flow is frequent from wine to non-wine, and rare in opposite direction. Recombination and introgresion events detected in Saccharomyces species indicated that hybridizations occur more frequently then expected. According to the phylogenetic results wine hybrids S. cerevisiae x S. kudriavzevii were originated from three hybridizations events, and brewery hybrids from one.

El riesgo de desarrollar una enfermedad cardiovascular en pacientes con hipertensión (HTA) se incrementa en más de 3 veces con respecto a otras enfermedades de elevado riesgo cardiovascular (diabetes, hipercolesterolemias, etc.), siendo además la HTA la mayor causa de mortalidad y morbilidad cardiovascular. La HTA se representa como una patología compleja que a menudo se asocia a otras alteraciones como microalbuminuria, disfunción endotelial, etc. Bajo estas condiciones fisiopatológicas se ha demostrado que se produce un aumento en la generación de especies oxidantes en el organismo, superando la capacidad de protección de los sistemas celulares de defensas antioxidantes, lo que provoca estrés oxidativo (EO).En la presente tesis doctoral se ha caracterizado el EO a nivel bioquímico y genético, mediante el análisis de los productos finales de EO, niveles de ARN mensajero y polimorfismos de genes implicados en la producción y defensa de EO y que pudieran afectar a la presión arterial y el daño orgánico.En este estudio se han analizado parámetros de EO como los glutatión reducido y oxidado, malondialdehido y 8-hidroxi 2-desoxiguanosina tanto en células mononucleares circulantes como en plasma de pacientes hipertensos (con y sin tratamientos) y en normotensos.Además, se han cuantificado los niveles de ARNm de los principales genes de estos sistemas, en linfocitos de hipertensos y controles (NADPHoxidasa, catalasa, superóxidos dismutasas y enzimas del sistema glutatión y tiorredoxina).Por otra parte, se ha realizado el estudio de variantes genéticas de genes de los sistemas implicados en EO, localizados en regiones que podrían afectar en la homeostasis oxidativa, lo que da lugar a alterarse la función de las proteínas y promotor región polimorfismos que alteran los niveles de EO como consecuencia de la regulación de genes. Esta parte del estudio se ha llevado a cabo en una población de hipertensos, controles y una población general.Los resultados obtenidos nos muestran que en la HTA esencial:1. Exite un aumento en los niveles de estrés oxidativo tanto en plasma como en células monolinfocitarias y a su vez este aumento se ve correlacionado con los niveles de presión arterial (PA) de los sujetos. Además, el EO se relaciona con el aumento los niveles de excreción urinaria de albúmina (EUA) independientemente de los valores de PA.2. Se produce un aumento de los niveles de ARNm de genes que codifican las distintas subunidades de NAD(P)H oxidasa y una disminución de los niveles de ARNm de las enzimas antioxidantes en monolinfocitos. Además, estos cambios se relacionan con el estado crónico de EO presente en la HTA, a pesar de la activación del sistema tiorredoxina y la enzima Manganeso Superóxido Dismutasa. Por tanto, los pacientes hipertensos tanto en presencia o en ausencia de microalbuminuria se encuentran peor protegidos frente a EO que los sujetos control.3. Independientemente del tratamiento antihipertensivo utilizado, los niveles de los marcadores bioquímicos de EO se reducen, y también los niveles de ARNm de todas las enzimas implicadas.4. Los análisis de asociación han mostrado que ciertas variantes, y sus haplotipos, se encuentran asociadas a niveles de EO, PA, EUA y riesgo de microalbuminuria en sujetos hipertensos. Hay que destacar que estos datos se han replicado en otra población de hipertensos y en la población general, donde se han mantenido dos de estas asociaciones.5. En el análisis de asociación entre los polimorfismos de distintos genes observamos la interacción entre el gen de la XDH y GPX1 en la población hipertensa. Estas interacciones nos confirman la naturaleza compleja de esta patología y de la necesidad de enfocar las nuevas investigaciones hacia el estudio de las interacciones entre distintos genes y estos con los factores ambientales. / Hypertension is a complex disease that is often associated with other disorders such as microalbuminuria, endothelial dysfunction, etc. Under this pathophysiological condition has been shown that there is an increase in the generation of oxidizing species in the body, without being able to avoid the protection capacity of cellular antioxidant defense systems, leading to oxidative stress (OS).In this thesis OS status has been characterized by biochemical and genetic level of OS byproducts, messenger RNA levels and polymorphisms of oxidant and antioxidant system genes.The results have shown increased levels of oxidative stress in blood and peripheral mononuclear cells and this increase is correlated with levels of blood pressure (BP) in essential hypertension.Furthermore OS seems to be a determinant of urinary albumin excretion (UAE) independent of BP levels even in hypertensive subjects.The increase in mRNA levels of genes encoding different subunits of NAD(P)H oxidase complex and decreased mRNA levels of antioxidant enzymes in peripheral mononuclear cells, has been related to the chronic state of OS in the hypertension, despite the action of thioredoxin system and manganese superoxide dismutase enzyme. Thus, hypertensive patients in presence or absence of microalbuminuria are less protected from OS compared to control subjects. Furthermore, any type of antihypertensive treatment reduced the levels of OS, and therefore also the mRNA levels of all enzymes involved.The association analysis have confirmed that certain genetic variants, their haplotypes and their interactions, are associated with levels of OS, BP, UAE and microalbuminuria risk in hypertensive subjects. It should be noted that these results have been replicated in another hypertensive population and in spanish general population some associations have remained.

La ataxia de Friedreich (FA) es una enfermedad neurodegenerativa autosómica recesiva con una prevalencia en la población de 1- 4 casos cada 100.000 habitantes. La mutación más común que provoca la ataxia de Friedreich es la expansión de la repetición del microsatélite GAA situado en medio de una secuencia Alu-Sx en el primer intrón del gen FXN. Las repeticiones asociadas a la enfermedad se encuentran en el intervalo desde 70 a más de 1000 repeticiones del triplete. El gen produce una proteína llamada frataxina cuya síntesis se ve comprometida en los pacientes ya que las expansiones del triplete GAA interfieren en la transcripción del gen. La función de la proteína no está del todo clara aunque se conoce que desempeña dicha función en la mitocondria. Así, se barajan varias hipótesis, (1) la frataxina sería una proteína que participaría en el sistema de almacenaje del hierro en la mitocondria; (2) otra posible función que podría desempeñar la frataxina es que actuase como transportador de hierro; (3) como tercera posible función, la frataxina estimularía la actividad de la cadena de transporte de electrones activando la formación de ATP; (4) además se ha descrito que la frataxina actuaría como antioxidante mitocondrial, cuya función sería eliminar los productos oxidativos como son las especies reactivas del oxigeno (ROS); o por último (5) la frataxina actuaría como una proteína chaperona para la formación de los centros Fe-S de proteínas mitocondriales. En este trabajo se ha abordado el estudio de la función del gen fh en Drosophila melanogaster empleando la técnica del ARN de interferencia, así como la confirmación de la localización mitocondrial de la frataxina. El sistema de la ARN de interferencia fue complementado con el uso del sistema UAS-GAL4 que permite la interferencia del gen fh en un patrón concreto. En este caso se han realizado estudios a nivel bioquímico de individuos que interfieren el gen fh de forma ubicua. Además estos estudios se realizaron modificando las condiciones de estrés oxidativo. Los resultados obtenidos apoyan el hecho de que, al menos en nuestro modelo, este factor sería importante en el desarrollo de la enfermedad así como que, en estas condiciones de alto estrés oxidativo y con reducción de la proteína frataxina, la aconitasa sería la enzima más sensible. Por otra parte, se ha comparado el patrón de desarrollo embrionario de individuos que sobreexpresaban el gen fh y que expresan el gen humano FXN. Los tejidos que se han comparado son los más afectados en los pacientes con ataxia de Friedreich, y son el sistema nervioso periférico (SNP), el sistema muscular en el cual se incluye el corazón, así como también el sistema nervioso central (SNC). En este estudio hemos observado que se produce una falta de fusión entre algunos músculos del embrión de Drosophila melanogaster,. Además, se ha observado una gran desestructuración de las fibras nerviosas que forman SNP. Por otra parte, no se ha observado ningún defecto ni en el SNC, que concuerda con los resultados obtenidos con la sobreexpresión del propio gen fh, ni en el corazón, el cual sí se veía afectado en el desarrollo de los individuos que sobreexpresaban el gen fh. A nivel bioquímico, tanto la sobreexpresión del gen fh como la sobreexpresión del gen FXN tienen como resultado la reducción de la actividad de la enzima aconitasa. Estos resultados nos permiten afirmar que las funciones de la frataxina humana y la de Drosophila melanogaster están conservadas, apoyando el uso de este organismo como modelo tanto para el estudio de la función de la frataxina. / Friedreich ataxia (FA), the most common form of hereditary ataxia, is caused by a deficit in the mitochondrial protein frataxin. While several hypotheses have been suggested, frataxin function is not well understood. Oxidative stress has been suggested to play a role in the pathophysiology of FA, but this view has been recently questioned, and its link to frataxin is unclear. We report the use of RNA interference (RNAi) to suppress the Drosophila frataxin gene (fh) expression. This model system parallels the situation in FA patients, namely a moderate systemic reduction of frataxin levels compatible with normal embryonic development. Under these conditions, fh-RNAi flies showed a shortened life span, reduced climbing abilities, and enhanced sensitivity to oxidative stress. Under hyperoxia, fh-RNAi flies also showed a dramatic reduction of aconitase activity that seriously impairs the mitochondrial respiration while the activities of SDH, respiratory complex I and II, and indirectly complex III and IV are normal. Remarkably, frataxin overexpression also induced the oxidative-mediated inactivation of mitochondrial aconitase. This work demonstrates, the essential function of frataxin in protecting aconitase from oxidative stress-dependent inactivation in a multicellular organism. Moreover our data support an important role of oxidative stress in the progression of FA and suggest a tissue-dependent sensitivity to frataxin imbalance. We propose that in FA, the oxidative mediated inactivation of aconitase, which occurs normally during the aging process, is enhanced due to the lack of frataxin. Moreover we carried out studies comparing the development between flies overexpressing fh and flies overexpressing the frataxin human gene FXN. We have seen structural abnormalities in the muscular and nervous systems in flies interfering and overexpressing fh in an ubiquitous way or in a tissue-specific patterns (PNS and heart). Flies expressing human frataxin showed the same abnormalities in the PNS although these defects were stronger than those observed for fly frataxin overxpression. However the heart developed normally in the transgenic flies carrying the FXN gene. Concerning the biochemical studies, we have seen significant reduction of the aconitase activity being similar in all scenarios. Moreover, in all cases flies showed reduction of lifespan and defects in behaviour as climbing.

La esquizofrenia es un desorden mental severo, con una incidencia del 1% y una elevada heredabilidad (alrededor del 80%). Por ello, hay un enorme interés en conocer los factores genéticos implicados en la vulnerabilidad a padecer esquizofrenia. Sin embargo, esta enfermedad presenta una herencia poligénica y además un importante número de factores ambientales parecen influir en su aparición. Asimismo, la heterogeneidad clínica también es elevada y esto dificulta el tener un fenotipo bien definido para el estudio genético. Por ello, el estudio de fenotipos más recortados y mejor definidos puede ser de gran utilidad. En el presente trabajo, se han seleccionado nueve genes de interés. Nuestra hipótesis principal es que variaciones en estos genes modulan la vulnerabilidad a padecer esquizofrenia o alguno de sus rasgos característicos, particularmente las alucinaciones auditivas, el deterioro cognitivo y la disfunción emocional. Como objetivo, nos planteamos el estudio de polimorfismos genéticos en varias muestras caso-control y familiares de España, Alemania y Estados Unidos. Se realizaron análisis de asociación caso-control, basados en familias y estudios de asociación con diferentes escalas clínicas. Asimismo, se estudió el impacto de ciertos polimorfismos sobre fenotipos de neuroimagen estructural y funcional. Los resultados más interesantes fueron los siguientes: por una parte, diferentes genes del sistema serotoninérgico (principalmente los genes SLC6A4 y HTR2A) parecían influir en el estado emocional del paciente, así como en la respuesta emocional del paciente a las alucinaciones auditivas. Además, el gen ASPM se asoció con el riesgo de psicosis y con diferentes parámetros cognitivos y de neuroimagen. Otros genes como NOS1, STMN1, PDE4D y PLEKHB1 parecían influir sobre el riesgo de psicosis, así como sobre las puntuaciones obtenidas en diferentes escalas psicopatológicas, si bien en estos casos la significación fue menor. Todos estos resultados permiten proponer un modelo de vulnerabilidad, según el cual ciertos genes tendrían un mayor efecto sobre la vulnerabilidad a sufrir esquizofrenia, mientras que otros genes influirían sobre la severidad de ciertos síntomas. Además, nuestros resultados apoyan la existencia de una vulnerabilidad genética a respuestas emocionales aberrantes, que podría estar modulada por la variación en ciertos genes, tales como el transportador de serotonina. / Schizophrenia is a severe psychotic mental disorder, with a prevalence of around 1% in general population. It is well known that this disease presents a high heritability (around 80%). For this reason, there is a great interest in discovering the genetic factors affecting the risk for schizophrenia. However, due to the polygenic inheritance of this disorder, it is particularly hard to discover schizophrenia-related genes. Moreover, it has been hypothesized that an important number of environmental factors of different nature may affect the vulnerability to schizophrenia. Furthermore, schizophrenia is a clinically heterogeneous disorder and it can be particularly difficult to have a well-defined phenotype for genetic studies. For all these reasons, we consider that it is important to study the neurobiology of schizophrenia as a global entity, but also to complement these studies with other approaches, for example through the use of other alternative phenotypes, such as cognitive impairment, electrophysiological responses or auditory hallucinations, for example. In the present study, different candidate genes were selected. Our main hypothesis is that variations in these nine genes modulate the vulnerability to schizophrenia and some of their most characteristic and important features, particularly auditory hallucinations, cognitive impairment and, finally, the emotional dysfunction associated to schizophrenia. To test this hypothesis, we focused the study on the analysis of genetic polymorphisms (mainly single nucleotide polymorphisms) in three case-control samples from Spain, Germany and United States and a family sample from the United States. All samples were of Caucasian origin. Different analysis were performed, namely case-control association analysis, family-based association analysis (in some cases) and association analysis with clinical measures that corresponded to different psychopathological scales (BPRS, KGV, PANSS and PSYRATS for auditory hallucinations and delusions). Moreover, we also assessed the impact of certain genetic polymorphisms on functional and structural neuroimaging phenotypes, which evaluated both cognitive and emotional aspects. The most interesting results were the following: first, several polymorphisms from serotonergic system genes (mainly SLC6A4 and HTR2A genes, but also TPH2 gene to a lesser extent) appeared to modulate the patient's emotional state, including the emotional response to auditory hallucinations, assessed with clinical scales and neuroimaging techniques. Moreover, the positive selection gene ASPM, involved in neurodevelopmental processes, was associated with the risk for psychosis and with different cognitive and neuroimaging measures in both the Spanish and the American sample. Other genes such as NOS1, STMN1, PDE4D and PLEKHB1 also appeared to influence the risk for psychosis and the scores in some psychopathological scales, although in these cases significance was weaker.All these findings allow us to propose a vulnerability model. According to this model, some genes would have a major effect on the vulnerability to schizophrenia, while other genes would have an effect on the severity to certain symptoms. Regarding the vulnerability to auditory hallucinations, our results also support the existence of a genetic vulnerability to aberrant emotional responses, which could be modulated by the variation in different genes, such as the serotonin transporter gene, among others.

Los aislados de CTV están formados generalmente por una mezcla de variantes de secuencia, que se generan mediante procesos de mutación y recombinación. Su frecuencia en la población es el resultado de distintas presiones selectivas y de fenómenos de migración y deriva genética, generalmente asociados a los procesos de transmisión. El objetivo de esta tesis era analizar por separado el efecto de diversos factores de los procesos de transmisión sobre la estructura poblacional y la diversidad genética de distintos aislados del virus. Se analizó el efecto de la transmisión por pulgón. Ésta ocurrió con baja eficiencia y en general, las secuencias de los genes analizados en las plantas receptoras fueron idénticas a las de las plantas donantes y el aislado de colección. La transmisión por injerto y/o pulgón supone un cuello de botella que puede dar lugar a un efecto fundador. Se analizó el efecto de la transmisión por injerto entre plantas de una misma especie huésped y no se observaron cambios llamativos en la estructura y diversidad poblacional. También se estudió si la transmisión por injerto de dos aislados de CTV a diferentes especies y variedades comerciales propagadas sobre citrange Carrizo podía inducir cambios en la población. Aunque no observamos cambios significativos en la diversidad genética, la estructura poblacional se vio alterada en algunas plantas. Esta alteración fue debida a la aparición de nuevas variantes de secuencia cercanas filogenéticamente que llegaban a predominar en dichas poblaciones. Finalmente, se utilizó un aislado clonal de CTV para el estudio de la variación genética de novo en distintos huéspedes a lo largo del tiempo. Se efectuaron pases sucesivos por injerto de dicho aislado desde su huésped original a distintos huéspedes susceptibles, y a un huésped parcialmente resistente (naranjo amargo). Las poblaciones en los huéspedes susceptibles presentaron una elevada estabilidad, pero los pases sucesivos en el huésped naranjo amargo dieron lugar a cambios importantes en la población, debido a la aparición de variantes de secuencias muy divergentes anteriormente halladas en dos aislados naturales del virus. La detección de secuencias minoritarias cuya posición filogenética se sitúa entre los tres genotipos avala la idea de una evolución entre el genotipo original y los otros dos detectados para intentar adaptarse al huésped. El hallazgo de secuencias recombinantes entre los tres genotipos apoya la presencia de éstos en el huésped naranjo amargo. La inoculación de huéspedes susceptibles a partir de plantas de naranjo amargo puso de manifiesto la progresiva pérdida de infectividad de la población mantenida en esta especie, debido en parte a la baja acumulación de CTV en la misma. Además fue imposible detectar el virus en brotes de lima propagados sobre estas plantas, lo que sugiere que además del bajo título viral algún factor del huésped pudiese dificultar el paso de CTV desde naranjo amargo a lima. / CTV isolates are composed of a population of sequence variants, resulting from mutation and recombination events. The frequency of these variants in the population is the outcome of different selective pressures, and migration and genetic drift phenomena generally associated to transmission processes. Here we analyzed separately the effect of different factors of the transmission process on the diversity and population structure of CTV isolates. We studied the effect of aphid transmission by nucleotide sequence comparisons between the donor and receptor plants and the collection CTV isolate. Transmission efficiency was low, and no sequence variation was observed. Aphid and graft transmission are a bottleneck resulting in a founder effect. We analysed the effect of graft transmission to a host of the same species. No obvious changes were observed in the CTV population structure and diversity We also studied if graft-transmission to different varieties propagated on Carrizo citrange could alter the CTV population. Although significant diversity changes were not observed, the population structure was occasionally altered due to the appearance of new sequence variants genetically close that became predominant in these populations. Finally, we used a clonal CTV isolate to study genetic variation generated de novo in different hosts. This isolate was serially passed by graft-transmission in different susceptible hosts and in a partially resistant host (sour orange). While CTV population was stable in the susceptible hosts, passages through sour orange caused major changes due to the appearance of new diverged sequence variants previously found in two natural isolates). Detection of minor variants phylogenetically located between these three genotypes supports the idea of an evolutionary process between the original and two new genotypes to get adapted to sour orange. Recombination events involving the three genotypes supports the presence of more than one genotype in infected sour orange. Inoculation from sour orange to susceptible hosts showed progressive loss of infectivity, due in part to the low virus titer in this host. CTV could neither be detected in Mexican lime propagated on these sour orange plants, suggesting that some host factor might also block CTV movement from sour orange to lime.

Gene loss is the most important event in the process of genome reduction that appears associated with bacterial endosymbionts of insects. These small genomes were derived features evolved from ancestral prokaryotes with larger genome sizes, consequence of a massive process of genome reduction due to drastic changes in the ecological conditions and evolutionary pressures acting on these prokaryotic lineages during their ecological transition to host-dependent lifestyle. In the present thesis, the process of genome reduction is studied from different perspectives. In the first chapter, genome rearrangements have been studied in a set of 31 complete γ-proteobacterial genomes that includes five genomes of bacterial endosymbionts of insects. This is carried out by comparing the order of a subset of 244 single-copy orthologous genes presents in all the genomes and calculating the number of inversions and breakpoints between each genome pair. This reveals that inversions were the main rearrangement event in γ-proteobacteria evolution, with a progressive increase in the number of rearrangements with increased evolutionary distance. However, significant heterogeneity in different γ-proteobacterial lineages was also detected, with a significant acceleration in the rates of genome rearrangements in bacterial endosymbionts of insects at initial stages of the association. In the second chapter, the structure and functional capabilities of Sodalis glossinidius has been studied. S. glossinidius is the secondary endosymbiont of tsetse flies, and it´s at very initial stages of genome reduction process. It´s genome is experiencing a massive process of gene inactivation, with 972 pseudogenes (inactivated genes) that were described but not annotated in the original annotation of the genome. In this chapter, a complete functional re-annotation of this genome was carried out, that includes the characterization of 1501 pseudogenes though analysis of S. glossinidius intergenic regions. A massive presence of CDSs related with mobile genetic elements and surface proteins were detected, being also the functional classes most affected by pseudogenization. The reconstruction of the metabolic map of S. glossinidius revealed a functional profile very similar to that of free-living enterics, with inactivation of L-arginine biosynthesis pathway, whereas the comparison with Wigglesworthia glossinidia (tsetse primary endosymbiont) reveals possible cases of metabolic complementation between both tsetse endosymbionts at thiamine, coenzyme A and tetrahydrofolate biosynthesis level. Finally, in the third chapter of the thesis, the complete reductive evolution process associated with S. glossinidius was studied from a systems biology perspective through the reconstruction of their genome-scale metabolic networks at different stages of this process and the prediction of their internal reaction fluxes under different external conditions through Flux Balance Analysis. This revealed the decisive role of the pseudogenization of genes involved in L-arginine and glycogen biosynthesis and specially the pseudogenization of the key anaplerotic enzyme phosphoenolpyruvate carboxylase in the ecological transition to a host-dependent lifestyle experienced by S. glossinidius. A progressive decrease in network robustness to gene deletion events and to changes in particular reaction fluxes were detected. Finally, reductive evolution simulations over the functional network of S. glossinidius under different external conditions revealed a higher plasticity in minimal networks evolved in a nutrient-rich environment, and allow defining different sets of essential and disposable genes based on their presence or absence in minimal metabolic networks. These essential genes had more optimized patterns of codon usage and more restricted patterns of sequence evolution than disposable genes that could be lost without affecting the functionality of the network. However, lineage-specific estimates of dN and dS in S. glossinidius and Escherichia coli revealed that common features of ancient bacterial endosymbionts like acceleration in the rates of sequence evolution and the loss of adaptative codon usage were starting to affect S. glossinidius evolution. / En esta tesis doctoral, el proceso de reducción genómica característico de bacterias endosimbiontes de insectos ha sido estudiado utilizando diferentes aproximaciones computacionales basadas en la genómica comparada y la biología de sistemas. Por un lado, las dinámicas de reordenaciones genómicas han sido estudiadas en un subconjunto de 31 genomas completos de γ-proteobacterias que incluyen 5 genomas completos de endosimbiontes bacterianos de insectos, revelando una aceleración significativa de las tasas de reordenaciones en estos genomas en etapas iniciales del proceso de reducción. Posteriormente, el genoma de Sodalis glossinidius, el endosimbionte secundario de la mosca tsétsé, fue re-anotado con el objetivo de evaluar el impacto de los procesos de inactivación génica y proliferación de elementos genéticos móviles en etapas tempranas del proceso de reducción, asi como su impacto sobre las capacidades funcionales de la bacteria en el contexto ecológico de su coexistencia con el endosimbionte primario ancestral Wigglesworthia glossinidia. Finalmente, el proceso completo de reducción genómica en S. glossinidius ha sido estudiado a través de la reconstrucción de su red metabólica a diferentes etapas de este proceso y su análisis funcional mediante Análisis de Balance de Flujos, evaluando la robustez de las redes frente a sucesos de deleción asi como las dinámicas evolutivas de genes esenciales y no esenciales en base a su presencia en redes mínimas evolucionadas a partir de la red funcional. Este análisis permitió identificar sucesos de inactivación génica con efectos drásticos sobre las capacidades funcionales del sistema como los genes implicados en la biosíntesis de arginina y glicógeno, y especialmente la inactivación de la enzima fosfoenolpiruvato carboxilasa, asi como una disminución progresiva de la robustez de las redes frente a diferentes sucesos mutacionales asociada al proceso de pérdida génica. Finalmente, simulaciones de evolución reductiva sobre la red funcional bajo diferentes condiciones de entorno ha permitido definir conjuntos de genes esenciales y delecionables en base a su presencia o ausencia en las redes mínimas producto de las simulaciones, revelando una mayor conservación a nivel de secuencia y un uso de codones más optimizado en genes esenciales frente a genes cuya pérdida no afecta a la funcionalidad del sistema.

El cierre dorsal (CD) es uno de los últimos procesos morfogenéticos de la embriogénesis de Drosophila y que consiste en el cierre del agujero más dorsal que presenta el embrión durante el estadio 13 de su desarrollo. Para ello, las capas epiteliales laterales migran mientras que la amnioserosa se contrae e invagina. Este proceso necesita de la coordinación de la epidermis, la amnioserosa y el vitelo, así como de reestructuraciones en el citoesqueleto celular, la polarización de las células epidérmicas más dorsales, la formación de filopodios y lamelipodios y la activación de rutas de transducción de señal como la de las JNKs. El CD es el proceso más estudiado de la extensión y fusión de epitelios y comparte muchas similitudes con el proceso de curación de heridas en vertebrados. cabut (cbt), es un gen que codifica un factor de transcripción necesario para que se produzca el CD. cbt se expresa en la epidermis y el vitelo actuando bajo el control de las JNKs y regulando la expresión del gen decapentaplegic en el leading edge. Las proteínas ortólogas a Cbt en vertebrados pertenecen a la familia de factores de transcripción TIEG, que han sido descritos como inhibidores de la proliferación celular y asociados a diferentes tipos de procesos cancerosos. Cbt está relacionado con otros procesos como el ciclo circadiano, la regeneración de discos imaginales, el control del ciclo celular, el crecimiento celular, la remodelación neuroendocrina y la respuesta a la ecdisona la guía de axones y sinaptogénesis. En esta tesis doctoral se han generado diferentes herramientas genéticas, bioquímicas e inmunológicas para poder realizar diferentes aproximaciones que nos lleven a dilucidar cuales son las funciones de Cbt durante el desarrollo embrionario así como sus dianas transcripcionales y cuales son los dominios funcionales responsables de su actividad. Para ello se generó un anticuerpo que reconoce de forma específica a Cbt y se realizaron ensayos de Inmunodetección así como de Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP‐on‐chip). Esto ha permitió realizar un estudio amplio del patrón de expresión embrionario de la proteína, tanto durante el CD como en otros estadios del desarrollo, demostrando que Cbt no solo se expresa en los núcleos de la epidermis, el vitelo y el intestino posterior durante el CD, sino también en los núcleos de la amnioserosa a través de la ruta de las JNKs. Además se han descrito nuevos patrones de expresión de Cbt en embriones tempranos, en el sistema nervioso central y periférico embrionario‐larvario sugiriendo nuevas funciones de esta proteína. A nivel estructural y mediante ensayos en cultivo celular, se ha determinado que la señal de transporte al núcleo de Cbt se encuentra en el N‐terminal y corresponde al motivo 71PNKKPRL77, siendo imprescindibles para este transporte las lisinas K73K74. Además, se ha podido determinar que, al igual que las proteínas TIEG, Cbt puede actuar como activador y/o represora de la transcricpión. Por último, mediante microarrays en embriones mutantes cbt durante el CD, hemos demostrado que la expresión de Cbt en la epidermis está regulada por la ruta de señalización de la ecdisona y que, a su vez, Cbt regula la expresión de más de 1000 genes entre los que se encuentran Tm2, InR, fas y los genes inducibles por ecdisona ImpE1 e ImpL1. Asímismo, los ensayos de ChIP‐on‐chip han mostrado que Cbt es capaz de unirse a varias regiones genómicas entre las que se encuentran su propio promotor y el promotor del gen NPC1a, implicado en el tráfico de lípidos. Estos resultados sugieren que la ecdisona está implicada en el CD, a través de Cbt, y que el transporte de lípidos podría tener un papel importante en el mismo / cabut (cbt) encodes a transcription factor involved in Drosophila dorsal closure (DC), and it is expressed in embryonic epithelial sheets and yolk cells during this process upon activation of the Jun N-terminal kinase (JNK) signaling pathway. Additional studies suggest that cbt may have a role in multiple developmental processes, such as neuroendocrine cell remodeling, ecdysone response, circadian rhythm, axon guidance, synaptogenesis, cell growth and cell cycle. The vertebrate orthologes of Cbt, the family of TIEG transcription factors, are involved in proliferation and cancer. In this thesis, we have generated different genetic, biochemical and immunological tools for the study of the function of Cbt during fly development, its transcriptinal targets and the structural domains responsible for its function. To analyze Cbt subcellular localization throughout embryogenesis, as well as Cbt´s transcriptional targets, we generated a Cbt-specific antibody that allowed us to (1) detect new Cbt expression patterns and (2) perform Chromatin Immunoprecipitation assays followed by microarray analyses (ChIP-on-chip). Immunohistochemical analyses during DC revealed that Cbt is expressed in the yolk, epidermal and amnioserosal cells, which contribute to the DC process. Also, Cbt is expressed in the central and peripheral nervous system. Moreover, cell culture assays have determinated that the 71PNKKPRL77 motif of Cbt functions as a nuclear localization signal (NLS), and that the conserved TIEG´s NLS, is not functional in insects. Direct mutagensis demonstrated that K73 and K74 residues are necessary for Cbt transport to the nucleus. Whole embryo microarray analyses of cbt mutants during DC were performed, and they revealed that Cbt regulates more than 1000 genes during the DC process, such as the 20-hydroxyecdysone hormone (20E)-inducible genes ImpE1 and ImpL1. Indeed, 20E regulates Cbt in the epidermis. Finally, ChIP-on-chip studies showed direct binding of Cbt to genomic regions close to Cbt and NPC1a (Niemann-Pick Type C-1) genes, which regulate trafficking of sterols through endocytic/secretory pathway. Taken together, these results suggest that 20E and lipid trafficking are involved in the DC through Cbt.

Cer and So are involved in regulation of apoptosis and cell cycle arrest while on the other hand S1P promotes cell growth and inhibits apoptosis. The antagonistic effects of these metabolites are regulated by enzymes that interconvert Cer, So, and S1P. In this work two of these enzymes were studied: sphingosine phosphate lyase and acid ceramidase. First several methods to determine the activity of these enzymes were developed and optimized, resulting in the publication of sensitive fluorogenic and chromatographic methods for enzyme activity. Particularly the assay optimized for acid ceramidase activity was used in the finding and identification of new inhibitors in several compound libraries. As a result compounds RBM2-1B, RBM2-1D and RBM2-1E were identified as acid ceramidase and dihydroceramide desaturase inhibitors. Furthermore compounds RBM1-12, RBM1-13 and SABRAC were also described as acid ceramidase inhibitors. Since several publications described the upregulation of acid ceramidase in advanced prostate cancer, we decided to investigate the particular effect of the acid ceramidase inhibition in a cellular model of advanced prostate cancer. Using cells PC-3/Mc we inhibited acid ceramidase through two different approaches: first silencing the gen ASAH1 and comparing the effects with chemical inhibition of the enzyme using compounds RBM1-12, RBM1-13 and SABRAC. We evaluate the effect of acid ceramidase inhibition in cell growth, invasivity and 3D growth in vitro, finding a diminished growth and 3D growth in both cells those knockdown for ASAH1 and treated with inhibitors. Finally, the effect of ASAH1 silencing in in vivo tumor growth and lung colonization was also determined. To this end male NOD-SCID mice were used for xenotransplants with cells PC-3/Mc_ASAH1_KD or control and the tumor growth or lung colonization was followed by luminometry. We found that the silencing of ASAH1 in PC-3/Mc cells delayed the growth and also the lung colonization, highlighting the potential of acid ceramidase inhibition as adjuvant in the treatment of prostate cancer and also in the prevention of metastases formation.

Thiamine pyrophosphate (TPP) serves as a cofactor in universal metabolic pathways, including glycolysis, the pentose phosphate pathway (PPP) and the tricarboxylic acid cycle; moreover, it is essential for the proper functioning of all organisms. Recently, several steps of the plant thiamine biosynthetic pathway have been characterised, and a mechanism of feedback regulation for thiamine biosynthesis via riboswitching has been unravelled. In plants, thiamine is made in the chloroplasts and then transferred to the cytosol to generate the active form of thiamine, TPP. The mitochondria and chloroplasts must import TPP from the cytosol because both organelles contain TPP-dependent enzymes. In Arabidopsis, two members of the mitochondrial carrier family (MCF), AtTpc1 and AtTpc2, export TPP to the mitochondria, but the chloroplast TPP carrier is still unknown. This project aims to identify thiamine chloroplast transporter(s) and investigate mitochondrial thiamine transporters in Arabidopsis. The approaches used to achieve the aims of this project include phylogenetic analysis, mutant analysis, polymerase chain reaction techniques and gene construct techniques. AtTpc1 and AtTpc2 have a limited effect on plant growth under normal conditions, at least in terms of stem length and secondary stem length. Moreover, phylogenetic analysis showed that AtFolt1 (Arabidopsis folate transporter) and CTT (AT3G51870) are putative chloroplast TPP transporters. The inhibition of AtFolt1 by about 50% and CTT by about 80% was associated with reduced TPP levels in leaves. Thus, AtFolt1 and CTT may be chloroplast TPP transporters.