Los genes homeóticos (Hox) codifican factores de transcripción involucrados en la especificación de la identidad segmental a lo largo del eje anteroposterior en el embrión de los metazoos. Estos genes se presentan habitualmente agrupados y organizados en el mismo orden en el que se expresan a lo largo del eje anteroposterior del cuerpo. La conservación de esta organización genómica a lo largo de la filogenia ha sugerido la existencia de constricciones funcionales actuando sobre ella, pero la desestructuración del complejo en Caenorhabditis elegans y las tres roturas descritas en el género Drosophila ponen en cuestión que esta organización sea realmente necesaria para su correcto funcionamiento en algunos linajes. En este trabajo se han estudiado las consecuencias genómicas y funcionales de las dos reorganizaciones del complejo de genes Hox presentes en Drosophila buzzatii, especie perteneciente al grupo repleta. En la primera parte del trabajo se han clonado y secuenciado las regiones codificantes del gen labial (lab) en D. buzzatii y D. virilis. Se han comparado las secuencias de estas dos especies y la de D. melanogaster para comprobar si el cambio de posición del gen lab ocurrido en el linaje de D. buzzatii había producido algún cambio en la estructura del gen o en la evolución de su secuencia. Los resultados muestran una tasa de cambio heterogénea a lo largo del gen pero homogénea a lo largo de la filogenia. La tasa de cambio nucleotídico de lab se ha mantenido constante a pesar del cambio de posición. En la segunda parte del trabajo se han secuenciado dos regiones del genoma de D. buzzatii, una contiene los genes lab y abdominal A (abdA) y la otra incluye el gen proboscipedia (pb), y se ha comparado su organización génica con D. melanogaster y D. pseudoobscura para localizar con precisión los puntos de rotura. También se han comparado las secuencias no codificantes de estas regiones, se ha observado una elevada presencia de bloques conservados en los intrones y regiones adyacentes de los genes Hox. La comparación de los bloques conservados con las regiones reguladoras conocidas de los genes Hox (lab, pb y abdA) en D. melanogaster muestra que la posición y orientación de las regiones reguladoras está conservada entre las tres especies, con excepciones menores. Finalmente se analizó el patrón de expresión de los tres genes Hox en embriones y discos imaginales de D. buzzatii, D. repleta, D. virilis, y D. melanogaster, cuatro especies con diferentes organizaciones de los genes Hox. Las dos roturas estudiadas se produjeron mediante inversiones paracéntricas, con los puntos de rotura respetando las regiones reguladoras de ambos genes. De manera que las regiones reguladoras y patrones de expresión de los genes Hox adyacentes se han conservado a pesar de las reorganizaciones. En Drosophila el complejo parece tener una estructura formada por módulos (que incluyen los genes y las regiones reguladoras) independientes, cuya agrupación no es necesaria para su correcto funcionamiento. La organización de estos genes es modular y su agrupación parece ser el resultado de la inercia filogenética más que de la necesidad funcional. El descubrimiento de más reorganizaciones en otros linajes y la importancia de la colinealidad temporal en algunos organismos sugieren que la causa funcional de la conservación de la organización genómica podría ser la colinealidad temporal. Las reorganizaciones serían consecuencia de la pérdida de colinealidad temporal en organismos con desarrollo rápido por modificación de la embriogénesis. / Homeotic (Hox) genes code for transcription factors involved in the specification of segmental identity in the anteroposterior axis of the early metazoan embryo. These genes are usually clustered and arranged in the same order as they are expressed along the anteroposterior body axis. The conservation of this Hox gene organization along the phylogeny has suggested the existence of functional constraints. However, the partial disassembly of the Caenorhabditis elegans complex and the three splits observed in the Drosophila genus question whether this organization is an absolute necessity for proper function in some lineages. In this work, I analysed the genomic and functional consequences of the two splits present in Drosophila buzzatii, a member of the repleta species group. In the first part, the coding regions of the labial (lab) gene were cloned in D. buzzatii and D. virilis. The sequences of these two species were compared with that of D. melanogaster to test whether the change in position of lab in de D. buzzatii lineage produced any change in gene structure or sequence evolution. The results show that the substitution rate is heterogeneous along the gene but homogeneous along the phylogeny. The nucleotide substitution rate of lab has been constant in spite of the positional change. In the second part, two regions of the D. buzzatii genome have been sequenced, one including the lab y abdominal A (abdA) genes and the other containing the proboscipedia (pb) gene, and compared with the genic organization of D. melanogaster and D. pseudoobscura to precisely locate the breakpoints. The noncoding sequences of these regions have also been compared, and a high presence of conserved blocks has been observed in the introns and surrounding regions of Hox genes. The comparison of these conserved blocks with the known regulatory regions of the Hox genes (lab, pb and abdA) in D. melanogaster shows that the position and order of the regulatory regions is conserved between the three species, with minor exceptions. Finally the expression pattern of the three Hox genes has been analysed in embryos and imaginal discs of D. buzzatii, D. repleta, D. virilis, and D. melanogaster, four species with different Hox gene arrangements. The two splits took place through two paracentric inversions, with their breakpoints between the regulatory regions of adjacent genes. So that the regulatory regions and expression patterns of these Hox genes have been conserved in spite of the reorganizations. In Drosophila the Hox gene complex seems to be composed by independent modules (including the gene and its regulatory regions), whose association is not required for proper function. The organization of these genes is modular and their clustering seems de result of phylogenetic inertia more than of functional necessity. The discovery of more rearrangements in other lineages and the significance of temporal colinearity in some organisms suggest that the functional cause of the conservation of this genomic organization would be temporal colinearity. Rearrangements would be the consequence of the loss of temporal colinearity in organisms with a very rapid mode of embriogenesis.

El melón (Cucumis melo L.) es una hortaliza de gran importancia económica en la que existen numerosos programas de mejora genética. Uno de los objetivos de estos programas ha sido la incorporación de resistencias genéticas frente a patógenos que provocan importantes pérdidas económicas en este cultivo. El virus de las manchas necróticas del melón (MNSV) es un Carmovirus endémico de la familia de las Cucurbitáceas cultivadas bajo invernadero. La única resistencia descrita hasta el momento frente a MNSV es la conferida por el gen recesivo nsv de melón. Esta resistencia es efectiva frente a la gran mayoría de aislados conocidos del virus. Se conoce poco sobre el mecanismo de resistencia de la interacción MNSV/nsv. Así pues, el estudio de esta resistencia mediante el clonaje del gen nsv nos permitirá comprender la estrategia que utiliza el virus para infectar a la planta y esta información podrá ser utilizada para un mejor control de este virus.El objetivo principal de este trabajo ha sido el clonaje del gen nsv mediante la estrategia de clonaje posicional. En primer lugar, el gen nsv fue cartografiado en el grupo de ligamiento 11 del mapa genético de melón generado en nuestro laboratorio. A continuación, una población de 69 LDHs fue utilizada para obtener marcadores AFLPs y RADPs ligados al gen nsv mediante la estrategia del "Bulked Segregant Analysis". Dos mapas genéticos de alta resolución fueron construidos en dos poblaciones diferentes, una F2 de 408 individuos y un BC1 de 2727 individuos. Los marcadores flanqueantes y los que cosegregaban con el gen en la primera población de LDHs fueron convertidos en marcadores de PCR para ser usados fácilmente en estas poblaciones de gran tamaño. Además, dos genotecas de BACs de melón, una generada a partir de un genotipo resistente a MNSV y otra a partir de uno susceptible, fueron examinadas con estos marcadores y se obtuvo un mapa físico de la región del gen nsv mediante paseo cromosómico. En la población F2, los marcadores flanqueantes al gen 1L3 y 5B3sp6 se encontraban separados entre sí por 4 recombinantes, mientras que en la población BC1 los marcadores flanqueantes eran 1L3 y 10O16sp6 y 20 el número de recombinantes entre ellos. La relación distancia física/distancia genética en esta región del genoma de melón se estimó en 228 kb/cM, relación óptima para llevar a cabo el clonaje posicional del gen. Finalmente, se ha llegado a identificar el BAC 1-21-10 que contiene físicamente al gen nsv. La existencia de microsintenia en la región del gen nsv con una región del genoma de Arabidopsis permitió la identificación de un gen candidato para nsv de una manera rápida. Se identificó el factor de iniciación de la traducción 4E (eIF4E) como el candidato para nsv, que había sido previamente identificado como el responsable de la resistencia frente a potyvirus en pimiento, guisante y lechuga. El desarrollo de un marcador de PCR a partir del eIF4E de melón confirmó que éste cosegregaba con el gen nsv en las poblaciones F2 y BC1. A continuación, la secuenciación completa del ADNc de eIF4E reveló que la única diferencia entre las secuencias del alelo resistente y de dos alelos susceptibles residía en un nucleótido, que correspondía con un cambio de aminoácido en la posición 228 de la proteína: una leucina en el genotipo resistente a MNSV y una histidina en los dos genotipos susceptibles. Probablemente, esta mutación en eIF4E es la responsable de la resistencia presente en PI161375. / The melon (Cucumis melo L.) it is a vegetable of great economic importance in which numerous breeding programs exist. One of the objectives of these programs has been the incorporation of genetic resistance forehead to pathogens that cause important economic losses in this culture.Melon necrotic spot virus (MNSV) is an endemic Carmovirus of the Cucurbit family grown under greenhouse conditions. The melon gene nsv is the only known natural source of resistance against MNSV. This resistance confers protection against all widespread MNSV. Little is known on the resistance mechanism of the MNSV/nsv interaction. Therefore, the study of this resistance by positional cloning of the gene nsv will allow us to understand the strategy that the virus uses to infect to the plant and this information could be used for a better control of this virus.The main aim of this work has been the cloning of the gene nsv by positional cloning. First, the nsv gene was mapped in the linkage group 11 of the genetic melon map generated in our laboratory. Next, a population of 69 LDHs was used to obtain AFLP and RADP markers around the nsv gene by means of the strategy of the "Bulked Segregant Analysis". Two high-resolution genetic maps were constructed in two different populations, a F2 of 408 individuals and a BC1 of 2727 individuals. The flanking markers and those that they co-segregated with the gene in the first population of LDHs were converted into PCR markers to be used easily in these populations of great size.In addition, two melon BACs libraries, one generated from a resistant genotype to MNSV and another one from one susceptible one, were examined with these markers and a physical map of the nsv region was obtaining by chromosomal walking. In the population F2, nsv-flanking markers 1L3 and 5B3sp6 were separated to each other by 4 recombinant, whereas in population BC1 the flanking markers were 1L3 and 10O16sp6 and 20 the number of recombinant among them. In this melon genome region the physical/genetic relationship was considered in 228 kb/cM, optimal relation to carry out the positional cloning of the nsv gene. Finally, we also identified a single BAC 1-21-10 that physically contains the gene nsv.The existence of microsintenia between the nsv region and a region of the Arabidopsis genome allowed to the identification of a gene candidate for nsv in a fast way. The eukariotic Initiation Factor 4E (eIF4E) was identified like a candidate for nsv. eIF4E had been previously identified as the gene that confers resistance against potyvirus in pepper, pea and lettuce. The development of a PCR marker from eIF4E of melon confirmed that this one co-secreted with the nsv in the F2 and BC1 populations. Next, sequencing full-length cDNA of eIF4E revealed only one difference between a resistant genotype and two susceptible genotypes. This mutation corresponds with a change of amino acid in the protein position 228: a leucine in the resistant genotype to MNSV and a histidine in both susceptible genotypes. Probably, this mutation in eIF4E is the responsible for the resistance in PI161375.

El sistema SOS és una xarxa multigènica sota el control negatiu del repressor LexA, amb importància vital per a la supervivència cel·lular ja que la seva desrepressió es dóna quan la cèl·lula presenta danys en el material genètic que poden ser transmesos a la descendència. Aquest fet, junt amb la seva amplia distribució en el domini Bacteria ens presenten el coneixement del seu funcionament en els diferents grups com una eina filogenètica idònia.Per a tal fi, i com a fil conductor d'aquest treball, és va procedir a l'estudi del reguló LexA a Dehalococcoides ethenogenes, un bacteri verd no sulfurós; Magnetococcus sp. soca MC-1,un bacteri magnetotàctic; i Leptospira interrogans serovar Lai, la primera espiroqueta amb un lexA identificat. Per a tal es va procedir a la clonació i purificació del gen lexA de cada un d'ells i a la purificació del seu producte.En el primer d'ells es va definir la caixa d'unió de LexA (AGAACN4GTTCT), comprovant a partir d'ella els seus vincles amb els bacteris grampositius, així com la no regulació del gen recA, considerat com a canònic, pel mateix.A Magnetococcus sp. soca MC-1, la caixa SOS descrita fou GTTCN7GTTC. Fins el moment, aquest microorganisme es trobava ubicat dins la subclasse Alfa del Proteobacteris, però tant el coneixement del motiu d'unió del seu LexA com els gens que integraven el reguló, ens el mostren com una branca estretament relacionada amb aquesta classe, però clarament independent.A Leptospira interrogans serovar Lai, el resultat fou sorprenent, ja que la caixa SOS d'aquest microorganisme, la varem haver d'identificar a partir de la regió promotora de recA, ja que no era present en la de lexA, esdevenint així el primer exemple en el que LexA no autoregula la seva expressió. Aquesta dada així com el fet de no poder detectar cap altre gen sota el seu control, ens mostren Leptospira, com un pas entremig en la tendència evolutiva seguida en les espiroquetes de perdre el seu gen lexA.Els següents articles es presenten a la secció d'annexes, i en ells es descriuen i discuteixen els resultats sobre els quals està basada aquesta tesis.:I. Fernandez de Henestrosa, A.R., J. Cuñé, I. Erill, J.K. Magnuson, i J. Barbé. 2002. A green nonsulfur bacterium, Dehalococcoides ethenogenes, with the LexA binding sequence found in gram-positive organisms. J. Bacteriol. 184(21): 6073 - 6080.II. Fernandez de Henestrosa, A.R., J. Cuñé, G. Mazón, B.L. Dubbels, D.A. Bazylinski, i J. Barbé. 2003. Characterization of a new LexA binding motif in the marine magnetotactic bacterium strain MC-1. J. Bacteriol. 185: 4471 - 4482.III. Cuñé, J., P. Cullen, G. Mazon, S. Campoy, B. Adler, i J. Barbé. 2005. The Leptospira interrogans lexA gene is not autoregulated. J. Bacteriol. 187: 5841 - 5845.

El presente trabajo de tesis estudia diferentes mutantes zeste1 y el efecto que esta mutación tiene sobre la regulación de la transcripción en diversos genes. En primer lugar se estudiaron los machos de las cepas M115 y RM115 cuya característica principal, además de ser portadores de la mutación z1, es la inserción de un elemento FB-NOF en el tercer intrón del gen CG32795, que forma con white un par de genes head-to-tail. Para estudiar el efecto de la inserción de FB-NOF en un entorno z1, fue necesario en primer lugar caracterizar el gen CG32795, a nivel de secuencia del mRNA y de predicción de la posible función de la proteína codificada. Se encontraron diversas variantes de splicing, tanto para su extremo 5' como para el 3', parecidas pero diferentes de las variantes predichas anteriormente. Conociendo más en profundidad este gen, nos propusimos estudiar los posibles efectos de la inserción de FB-NOF respecto a la expresión de los genes w y CG32795. Los resultados nos llevaron a un estudio más detallado de la expresión de w en diferentes partes del cuerpo, teniendo en cuenta la especificidad de tejido que la interacción zeste-white presenta. Así, demostramos que el gen w no se ve afectado por la inserción de FB-NOF en su extremo 3' y que las diferencias de expresión observadas son debidas a la duplicación del Zeste Binding Site de w en un entorno z1. Sin embargo, la inserción de FB-NOF en el tercer intrón de CG32795 si modifica la expresión de este gen. La inserción no es sólo responsable de la alteración de la expresión de CG32795 sino también la reordenación que se produce en la cepa RM115 eliminando la copia de w original y dejando la que se duplicó en M115.La segunda parte de esta tesis estudia las hembras mutantes z1. Analizamos la expresión de dos genes con un ZBS (w y dpp) y observamos como se reduce la expresión de dichos genes en las hembras z1. Además, estudiando la expresión del gen CG32795 constatamos que el efecto de la interacción zeste-white es local, sin afectar a CG32795 aunque su extremo 5' se encuentra a tan solo 700bp del extremo 3' del gen w. La reducción de la expresión podría ser debida a alteraciones en la estructura de la cromatina, puesto que los agregados de Zeste en los ZBS son los responsables de reclutar el complejo remodelador de la cromatina BRM, facilitando así la transcripción. Mediante un ensayo de nucleasa micrococal detectamos algunas modificaciones en el posicionamiento de nucleosomas en los ZBS de w y dpp, siendo el posicionamiento en las hembras z1 más estricto. Si el complejo BRM es el responsable de estas diferencias, los patrones de metilación también podrían verse alterados, pues muchos factores asociados a los complejos SWI/SNF se han relacionado con actividades de regulación de la expresión mediante modificación de los mismos. Mediante el ensayo de modificación del DNA por bisulfito sódico estudiamos los patrones de metilación de cinco regiones. Sorprendentemente, el ZBS de w y de dpp, así como las regiones próximas a ellos, se encontraban hipometilados en las hembras z1. El desconocimiento general sobre la metilación en D. melanogaster nos hizo plantear cuales pueden ser las secuencias diana de la metilación en esta especie. Así realizamos un estudio estadístico sobre cuales son las dos bases anteriores y posteriores a las Cs metiladas en nuestras secuencias. Se obtuvieron diferencias en las frecuencias de cada posición y se estableció como secuencia más frecuente para ser metilada ApDp5mCpDpD. Aún así, es una secuencia muy degenerada, y se hacen necesarios estudios más profundos y amplios para confirmarla. / The present PhD thesis studies several zeste1 mutants and this mutation effect over the transcriptional regulation of some genes. The first part is based on the study of the males of M115 and RM115 strains, mainly characterized by the z1 mutation and the insertion of a FB-NOF element in the third intron of the CG32795 gene, known to form a head-to-tail gene pair with white. To study the FB-NOF insertion effect on a z1 background firstly we need to characterize the CG32795, its mRNA sequence and the codified protein predicted structure and function. Several splicing variants were found, not only for its 5' end but also for its 3'end, similar but different from the ones been predicted previously. Once obtained this information we proceeded to study the effects of the FB-NOF insertion over the w and the CG32795 gene expression. The results lead us to a deeper study of the w expression in different body segments, taking into account the zeste-white interaction tissue specificity. Thus, we proved that the w gene expression is not affected by the FB-NOF insertion downstream of its 3' end. The differences observed in the w expression levels were due to the duplication of the w Zeste Binding Site in a z1 background. On the contrary, the FB-NOF insertion not only does modify CG32795 expression, but also mediates the reordenation produced in the RM115 strain being responsible of the w original copy lost and leaving alone the w copy duplicated in the M115 strain.The second part studies the z1 female mutants. We analyzed the expression of two genes possessing a ZBS (w and dpp). The results obtained showed an expression reduction for both genes in the z1 females. Moreover, through the study of the CG32795 gene expression we showed that the zeste-white interaction effect is local, not having any effect on CG32795 expression even though its 5' end is located at only 700bp from the w gene 3' end. Knowing that the Zeste aggregates in the ZBS recruit the chromatin remodelling complex BRM, facilitating thus transcription, we thought that the expression reduction might occur due to chromatin structure alterations. A micrococal nuclease assay was performed and some modifications in nucleosome positioning were found in w and dpp ZBS, being the positioning in the z1 females stricter. Were the BRM complex responsible of those differences, the DNA methylation patterns might also be changed, since many SWI/SNF associated factors have been related to expression regulation duties through DNA methylation patterns modification. A bisulphite modification assay was performed, studying the DNA methylation pattern of five different regions. Surprisingly, w and dpp ZBS and the regions surrounding them were hypomethylated in the z1 females. The little information available about DNA methylation in D. melanogaster encouraged us to study the DNA methylation sites in this specie. Our sequences were statistically analyzed including the two bases before and after the methylated cytosine. The results showed differences in the each nucleotide frequency in each position. The preferently methylated "consensus sequence": ApDp5mCpDpD. However, it is a much degenerated sequence and deeper and broader studies are required to confirm it.

No description available.

La variació genètica és la pedra angular de l'evolució biològica. La descripció i explicació de les forces que controlen la variació genètica dins i entre poblacions és el principal objectiu de la genètica de poblacions. L'obtenció d'un número explosiu de seqüències nucleotídiques a diferents gens i espècies ha canviat radicalment les perspectives de la genètica de poblacions, transformant-la des d'una ciència empírica insuficient fins a un esforç interdisciplinari de gran abast, on els aparells de generació de noves seqüències a gran escala s'integren amb eines bioinformàtiques per a l'extracció i gestió de dades, juntament amb avançats models teòrics i estadístics per a la seva interpretació. Aquesta tesi és un projecte de bioinformàtica i genètica de poblacions complet, l'objectiu principal del qual és l'estudi de la diversitat genètica a les poblacions. S'ha dut a terme en tres passos seqüencials: (i) el desenvolupament d'eines per a l'extracció, processat, filtrat i control de qualitat de seqüències nucleotídiques, (ii) la generació de bases de dades de coneixement a partir de les dades obtingudes a la primera part i (iii) la prova d'hipòtesis que requereixen de dades de varies espècies i loci. A la primera part de la tesi hem desenvolupat PDA (Pipeline Diversity Analysis), una aplicació Web de codi obert que permet l'exploració del polimorfisme a grans conjunts de seqüències de DNA heterogènies. Aquesta eina es nodreix dels milions de seqüències haplotípiques d'estudis individuals que hi ha emmagatzemades a les principals bases de dades moleculars i genera dades de genètica de poblacions que poden ser utilitzades per a descriure patrons de variació nucleotídica a qualsevol espècie o gen. Totes les dades extretes i analitzades a la primera part de la tesi són utilitzades a la segona part per a crear un recurs via Web complet que proporciona col·leccions de seqüències polimòrfiques amb les seves mesures de diversitat associades en el gènere Drosophila (DPDB, Drosophila Polymorphism Database). Aquest recurs ha significat un repte ambiciós que ha permès posar a prova l'eficiència del sistema creat a la primera part.Finalment, s'inclouen dos estudis que utilitzen els mòduls d'extracció i anàlisi de dades desenvolupats a la primera part. En el primer, hem estudiat patrons de variació genètica per a inferir selecció negativa i positiva a seqüències conservades no codificadores a Drosophila. Per a aquest estudi hem utilitzat dades de re-seqüenciació a D. melanogaster junt amb dades genòmiques comparatives a d'altres espècies de Drosophila per a demostrar que les regions fredes de mutació no poden explicar aquests blocs conservats. Els resultats mostren que les seqüències conservades no codificadores són mantingudes per l'acció de la selecció purificadora. El segon estudi es centra en l'evolució codificant dels gens Hox, una classe de factors de transcripció essencials en el desenvolupament primerenc que estan involucrats en l'especificació de les regions al llarg de l'eix anteroposterior del cos. Hem mesurat les taxes de divergència nucleotídica i de fixació d'insercions i delecions a tres gens Hox, i les hem comparat amb les de tres gens derivats de Hox i un conjunt de gens no Hox per a provar la hipòtesi que els gens Hox evolucionen lentament. Els resultats mostren que tant el número de substitucions no sinònimes com el grau de constrenyiment funcional no són significativament diferents entre els gens Hox i els no Hox, i que els gens Hox i els derivats de Hox contenen significativament més insercions i delecions que els gens no Hox a les seves seqüències codificants. Per tant, els gens Hox evolucionen més ràpidament que altres gens essencials expressats al desenvolupament primerenc, amb patrons d'expressió complexos o amb introns llargs rics en elements cis-reguladors.Resumint, els treballs presentats a aquesta tesi tanquen un cicle complet de projecte bioinformàtic, incloent tots els passos necessaris des de l'extracció de dades fins a la generació de nou coneixement científic. És més, el resultat de cada pas és la llavor per a múltiples possibles estudis en el següent pas, i per tant aquesta tesi té moltes aplicacions per a la comunitat científica. / La variación genética es la piedra angular de la evolución biológica. La descripción y explicación de las fuerzas que controlan la variación genética dentro y entre poblaciones es el principal objetivo de la genética de poblaciones. La obtención de un número explosivo de secuencias nucleotídicas en distintos genes y especies ha cambiado radicalmente las perspectivas de la genética de poblaciones, transformándola desde una ciencia empírica insuficiente a un esfuerzo interdisciplinario de un gran alcance, donde los aparatos de generación de nuevas secuencias a gran escala se integran con herramientas bioinformáticas para la extracción y gestión de datos, junto a avanzados modelos teóricos y estadísticos para su interpretación.Esta tesis es un proyecto de bioinformática y genética de poblaciones completo, cuyo objetivo es el estudio de la diversidad genética en las poblaciones, que se ha llevado a cabo en tres pasos secuenciales: (i) el desarrollo de herramientas para la extracción, procesado, filtrado y control de calidad de secuencias nucleotídicas, (ii) la generación de bases de datos de conocimiento a partir de los datos obtenidos en la primera parte y (iii) la puesta a prueba de hipótesis que requieren de datos de varias especies y loci. En la primera parte de la tesis hemos desarrollado PDA (Pipeline Diversity Analysis), una aplicación Web de código abierto que permite la exploración del polimorfismo en grandes conjuntos de secuencias de DNA heterogéneas. Esta herramienta se alimenta de los millones de secuencias haplotípicas de estudios individuales que hay almacenados en las principales bases de datos moleculares y genera datos de genética de poblaciones que pueden ser utilizados para describir patrones de variación nucleotídica en cualquier especie o gen. Todos los datos extraídos y analizados en la primera parte de la tesis son utilizados en la segunda parte para crear un recurso vía Web completo que proporciona colecciones de secuencias polimórficas con sus medidas de diversidad asociadas en el género Drosophila (DPDB, Drosophila Polymorphism Database). Este recurso ha significado un reto ambicioso que ha permitido poner a prueba la eficiencia del sistema creado en la primera parte.Finalmente, se incluyen dos estudios que utilizan los módulos de extracción y análisis de datos desarrollados en la primera parte. En el primero, hemos estudiado los patrones de variación genética en secuencias conservadas no codificadoras para inferir selección negativa y positiva en Drosophila. En este estudio hemos utilizado datos de re-secuenciación en D. melanogaster junto con datos genómicos comparativos en otras especies de Drosophila para demostrar que las regiones frías de mutación no pueden explicar estos bloques conservados. Los resultados muestran que las secuencias conservadas no codificadoras se mantienen por la acción de la selección purificadora. El segundo estudio se centra en la evolución codificadora de los genes Hox, una clase de factores de transcripción esenciales en el desarrollo temprano que están involucrados en la especificación de las regiones a lo largo del eje anteroposterior del cuerpo. Hemos medido las tasas de divergencia nucleotídica y de fijación de inserciones y deleciones en tres genes Hox, y las hemos comparado con las de tres genes derivados de Hox y un conjunto de genes no Hox para probar la hipótesis que los genes Hox evolucionan lentamente. Los resultados muestran que tanto el número de sustituciones no sinónimas como el grado de constreñimiento funcional no son significativamente distintos entre los genes Hox y los no Hox, y que los genes Hox y los derivados de Hox contienen significativamente más inserciones y deleciones que los genes no Hox en sus secuencias codificadoras. Así, los genes Hox evolucionan más rápidamente que otros genes esenciales expresados en el desarrollo temprano, con patrones de expresión complejos o con intrones largos ricos en elementos cis-reguladores.En síntesis, los trabajos presentados en esta tesis cierran un ciclo completo de proyecto bioinformático, incluyendo todos los pasos necesarios desde la extracción de datos hasta la generación de nuevo conocimiento científico. Es más, el resultado de cada paso es la semilla para múltiples posibles estudios en el siguiente paso, y por lo tanto esta tesis tiene muchas aplicaciones para la comunidad científica. / Genetic variation is the cornerstone of biological evolution. The description and explanation of the forces controlling genetic variation within and between populations is the main goal of population genetics. The deciphering of an explosive number of nucleotide sequences in different genes and species has changed radically the scope of population genetics, transforming it from an empirically insufficient science into a powerfully explanatory interdisciplinary endeavor, where high-throughput instruments generating new sequence data are integrated with bioinformatic tools for data mining and management, and advanced theoretical and statistical models for data interpretation. This thesis is an integrative and comprehensive bioinformatics and population genetics project whose central topic is the genetic diversity of populations. It is accomplished in three sequential steps: (i) the development of tools for data mining, processing, filtering and quality checking of raw data, (ii) the generation of databases of knowledge from refined data obtained in the first step, and (iii) the testing of hypotheses that require multi-species and/or multi-locus data. In the first part of the thesis, we have developed PDA Pipeline Diversity Analysis , an open-source, web-based tool that allows the exploration of polymorphism in large datasets of heterogeneous DNA sequences. This tool feeds from the millions of haplotypic sequences from individual studies that are stored in the main molecular biology databases, and generates high-quality, population genetics data that can be used to describe patterns of nucleotide variation in any species or gene. All the extracted and analyzed data resulting from the first part of this thesis is used in the second step to create a comprehensive on-line resource that provides searchable collections of polymorphic sequences with their associated diversity measures in the genus Drosophila (DPDB Drosophila Polymorphism Database ). This resource means an ambitious pledge to test the efficiency of the system created in the first part.Finally, two different studies that make use of the modules of data mining and analysis developed are shown. First, we study patterns of sequence variation to infer constraint and adaptation in Drosophila conserved noncoding sequences (CNSs). For this study we have used population genetics re-sequencing data from D. melanogaster together with comparative genomic data from other Drosophila species. We show that patterns of nucleotide sequence evolution in Drosophila CNSs are incompatible with the notion that mutational cold-spots explain these conserved blocks. Rather, the results support the hypothesis that CNSs are maintained by the action of purifying selection. The second study focuses on the coding evolution of Hox genes, a class of essential transcription factors expressed early in development that are involved in the specification of regional identities along the anteroposterior body axis. We have measured the rates of nucleotide divergence and fixation of insertions and deletions of three Hox genes, and compared them with those of three Hox-derived genes and a set non-Hox genes to test the hypothesis that Hox genes evolve slowly. Our results show that both the number of nonsynonymous substitutions and the degree of functional constraint are not significantly different between Hox and non-Hox genes, and that Hox and Hox-derived genes contain significantly more insertions and deletions than non-Hox genes in their coding sequences. Thus, Hox genes evolve faster than other essential genes expressed early in development, with complex expression patterns or with long introns rich in cis-regulatory elements.As a whole, the works presented in this thesis round a complete bioinformatics project off, including all the necessary steps from mining the data to generating new scientific knowledge. More interestingly, the outcome of each step is the seed of multiple possible studies in the next step, and thus this thesis has many applications for the scientific community.

IntroduccióEl treball "Detecció i estudi de gens implicats en el desenvolupament prenatal de la rata" parteix de la hipòtesi de treball de què la carcinogènesi i el desenvolupament són processos que comparteixen mecanismes de funcionament com són l'elevat índex de proliferació, la capacitat de migració cel·lular o l'angiogènesi sostinguda i que, per tant, deuen compartir els gens que els regulen. Amb aquest plantejament a l'horitzó, aquest treball té com objectiu detectar gens implicats en el desenvolupament per, en un futur proper, estudiar si estan o no implicats en la carcinogènesi. Per detectar gens durant el desenvolupament es va utilitzar una tècnica de fingerprinting, RNA arbitrarily primed PCR ( RAP-PCR). La RAP-PCR és una tècnica destinada a l'estudi d'expressió gènica diferencial que utilitza, com a material, RNA de les diferents mostres que es volen comparar. En primer lloc el RNA s'ha de convertir a cDNA mitjançant la retrotranscripció (RT) amb la utilització d'un primer de disseny arbitrari. El cDNA obtingut s'amplifica per una reacció de PCR que, en la RAP-PCR, presenta tres particularitats: temperatures baixes d'hibridació en els primers cicles, augment de concentració de sals a la mescla i la utilització d'un primer arbitrari, el mateix o no de la RT. El resultat és l'amplificació d'un determinat nombre de seqüències de DNA que, mitjançant una electroforesi, es visualitzen com un patró de bandes en un gel desnaturalitzant d'acrilamida, poden així comparar-se l'expressió de cada transcrit entre les diferents mostres.Material i mètodesEl material, per a la realització de la tècnica de RAP-PCR, es va obtenir mitjançant microdissecció de fetus (E17-E20) procedents de 7 rates (Rattus norvergicus) gestants de la de la soca OFA (línia Sprague-Dawley). Els segments microdissecats corresponien a subdivisions amb criteris anatòmics i embriològics, del tub digestiu des de l'estómac fins al recte. Dels diferents segments microdissecats es va realitzar l'extracció de RNA amb el mètode d'extracció amb tiocianat de guanidini i fenol-cloroform (Chomczynski i Sacchi, 1987). A partir del RNA es va realitzar la retrotranscripció, mitjançant l'acció de l'enzim M-MLV i amb la participació d'un primer arbitrari (D4S 2912-GT), obtenint-se, d'aquesta manera, una primera selecció de cDNAs. El cDNA obtingut es va amplificar per PCR, amb les característiques descrites prèviament, i utilitzant el mateix primer que en la retrotranscripció (D4S 2912-GT). Els productes de PCR varen ser sotmesos a electroforesi en gels de seqüenciació obtenint-se com a resultat un patró de bandes característic i reproduïble. Les diferents bandes es varen retallar dels gels, varen ser eluïdes en aigua i conservades a 4ºC. Després de l'estudi dels patrons d'expressió dels diferents seqüències en els gels d'acrilamida es varen seleccionar 10 bandes per a la seva clonació i posterior seqüenciació.Per a dur a terme la clonació, les bandes es varen lligar al plasmidi pCR2.1, per l'acció d'una lligassa durant 16 hores a 14ºC de temperatura. El producte del lligatge es va utilitzar per transformar, per xoc tèrmic, bacteris competents de l'espècie Escherichia coli (soca To F-10) que, després d'un temps curt de creixement, es sembraven a plaques de Petri que contenien LB-Agar. Després de 14-16 hores de creixement es seleccionaven les colònies de bacteris que havien incorporat el plasmidi amb l'insert i mitjançant PCR es confirmava la incorporació de l'insert de la mida (núm. de parells de bases) desitjada. Amb la informació proporcionada per la PCR s'efectuava la selecció de clons per realitzar la seqüenciació automàtica. Les seqüències obtingudes per la tècnica de la seqüenciació automàtica eren analitzades mitjançant el programa BLAST a les bases de dades de la NCBI i de la UCSC, obtenint-se un llistat d'homologies amb gens seqüenciats en diferents espècies i en el genoma humà, respectivament. A fi de confirmar els resultats i obtenir una informació precisa de la localització de l'expressió es va realitzar la tècnica de la hibridació "in situ" de la banda que, segons la seqüenciació, corresponia a un fragment d'hsp86. Per a tal fi es varen construir ribosondes sense i antisense a partir d'un dels clons bacterians que havien incorporat l'insert. Per a la construcció de les ribosondes, la banda va ésser transferida al plasmidi pBluescript SK, que posseeix promotors de T3 i T7 RNA polimerases (per a la síntesi de les sondes sense o antisense, respectivament), a diferència del pCR2.1 que només en posseeix un d'ells. La síntesi de les ribosondes es va realitzar mitjançant l'acció de les RNA polimerases T3 o T7, utilitzant nucleòtids marcats amb digoxigenina pel marcatge de la sonda i com a motlle el plasmidi linealitzat. La tècnica de la hibridació "in situ" es va efectuar sobre talls sagitals, realitzats en criòstat i adherits a portaobjectes, de fetus sencers de rata, fixats per perfusió amb Paraformaldehid al 4% en PB, procedents de 4 rates gestants de la de la soca OFA (línia Sprague-Dawley) de 17 a 20 dies de gestació.Resultats i discussióEls resultats d'aquest treball varen ésser obtinguts a tres nivells: 1. Patró de bandes en els gels d'acrilamida2. Anàlisi de les seqüències 3. Hibridació "in situ"1. Patró de bandes en els gels d'acrilamida: Els patrons de bandes en els gels d'acrilamida varen mostrar patrons d'expressió de les diferents bandes, que varen ser identificades per un codi de lletres i números. Aquests resultats varen proporcionar la informació per a decidir les bandes a seqüenciar però en cap cas varen ser considerats com a resultats definitius.2. Anàlisi de les seqüències: Donat que la metodologia de la RAP-PCR amplifica tot tipus de RNAs, en el nostre cas, hem obtingut tres seqüències de RNA ribosòmic (H3, N0 i N1.2), dues procedents del genoma mitocondrial (E3 i G1), tres RNAs missatgers (F8/hsp86, G0/CCT-5 i M2/GTP binding protein) i, finalment, dues seqüències (J2 i N1.1) han mostrat una seqüència desconeguda de nucleòtids. Respecte a les seqüències que varen mostrar màxima homologia amb RNAs missatgers l'anàlisi bioinformàtica ens va proporcionar la següent informació: La banda G0, que a la RAP-PCR s'expressa més intensament a la part més anterior del duodè, va mostrar homologia d'un 93% amb Mus Musculus Chaperonin subunit 5 (epsilon) (Cct5) i d'un 87% amb Homo Sapiens mRNA for KIAA0098 protein. KIAA0098 és homologa a nivell del seu exó 1 amb Homo Sapiens mRNA activated in tumor supression, clone TSAP9 que s'ha clonat en un estudi en el que es va considerar com un probable gen supressor de tumors, donada la seva expressió diferencial en dues línies cel·lulars, l'una tumoral i l'altre no. (Roperch JP et al. (1999). SIAH-1 promotes apoptosis and tumor supression through a network involving the regulation of protein folding, unfolding, and trafficking: Identification of common effectors with p53 and p21Waf1 . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8070-8073).La banda M2, que a la RAP-PCR s'expressa a les diferents localitzacions sense diferencies remarcables, ha mostrat homologia d'un 92% amb Mus musculus largeG mRNA for large GTP binding protein i d'un 84% amb Homo sapiens optic atrophy 1 (autosomal dominant) (OPA1) , per la qual cosa considerem que és homòloga al gen de l'atròfia òptica tipus 1, a nivell del seu domini GTP.La banda F8, que a la RAP-PCR s'expressa a les mostres corresponents a les parts més distals del tub digestiu, va mostrar homologia d'un 98-100% amb Rattus norvegicus hsp86 gene for heat shock protein 86, homòloga a la hsp 90a humana.3. Hibridació "in situ" : La Hibridació "in situ" amb les sondes construïdes a partir de la banda F8, corresponent a un fragment del gen de la hsp86 de la rata, va mostrar els següents resultats: la sonda sense no va mostrar hibridació a cap dels talls estudiats i la sonda antisense va mostrar un patró d'expressió molt conservat a les diferents edats del període fetal de la rata. Les localitzacions en les que va hibridar la sonda antisense, amb diferents intensitats de marcatge, són, amb una ordenació craniocaudal, les següents: escorça cerebral, capa ependimaria dels plexes coroïdals, epiteli de les cavitats nasal i nasofaringea, glàndules salivals, glàndules glossopalatines, epiteli de revestiment dels bronquis de gran mida, timus, greix bru, ganglis raquidians, cèl·lules hematopoètiques o hepatòcits a nivell hepàtic, epiteli i serosa del intestí prim i gros, escorça renal i suprarenal i cèl·lules germinals del testicle.Dels resultats obtinguts en la HIS amb la sonda F8 destaquem que existeix expressió del gen de la hsp86 en els epitelis nasal i bronquial, revestiment ependimari dels plexes coroïdals i en cèl·lules germinals del testicle, localitzacions en les què les cèl·lules presenten cilis o flagels. Els cilis i flagels estan formats per una estructura interna, l'axonema, constituïda, en vertebrats, per nou doblets de microtúbuls que n'envolten a dos centrals. Cada microtúbul esta format per protofilaments constituïts per heterodímers d'a i b tubulina. Es coneix bé que la hsp90a es la xaperona que col·labora en el plegament de les tubulines, pel que considerem que l'expressió de la sonda F8 en les localitzacions en les que hi ha elements mòbils, es deu a aquest fet. S'ha relacionat hsp90a amb càncer degut a què aquestes proteïnes col·laboren en el plegament de proteïnes necessàries pel creixement i la divisió cel·lular. Per altre banda, Mizuno et al (2001) recentment han descrit la interacció de hsp90a i hsp90b amb Pim-1, un protooncogén relacionat amb proliferació cel·lular en limfomes i leucèmies. Així mateix, s'ha observat sobrexpressió d'hsp90a en diferents tipus de càncer (d'endometri, de pàncrees, de mama, de nasofaringe, de glàndules salivals i en leucèmies), alguns dels quals es desenvolupen en teixits a on s'expressa la sonda F8 durant el període fetal de la rata. Tots aquests fets recolzen la relació de hsp90a amb hiperproliferació i càncer.Recapitulant, veiem que en aquest treball hem trobat dues seqüències G0 (Chaperonin subunit 5 (epsilon)) i F8 (hsp 86) que podem relacionar amb càncer, el primer com a probable gen supressor de tumors i el segon com a gen relacionat amb proliferació cel·lular. Creiem que després d'aquest treball, en el que només es pretenia identificar gens del desenvolupament, la porta que pretenem travessar en la següent fase, per relacionar genèticament càncer i desenvolupament, està una mica més oberta. / Introduction"Detection and study of gens implicated in the prenatal development of the rat" is a doctoral thesis based on the working hypothesis that carcinogenesis and development are processes that share functional mechanisms, such as high proliferation index, celular migration ability and sustained angiogenesis, and consequently it must share the gens that regulate them, too. With this idea in mind the objective of this work is the detection of development implicated gens in order to, in a future, determine its implication in carcinogenesis. In order to detect genes during development the fingerprinting technique RNA arbitrarily primed PCR (RAP-PCR) was used. RAP-PCR is a technique for the study of differential genic expression that use RNA from different samples to be compared. First, RNA is transformed in cDNA through retrotranscription (RT) using of an arbitrary primer. cDNA is then amplified by a PCR that, in RAP-PCR, displays three peculiarities: low hibridization temperatures in the first cicles, an increase in the concentration of salts in the mix and the use of an arbitrary primer, the same of the RT or not. The result is the amplification of a determined number of sequences of DNA that can be observed as a fingerprinting pattern in a denaturalising acrilamide gel, thus permitting to compare transcrit expression between two samples.Material and MethodsFor the RAP-PCR technique, the material was obtained by microdissection of fetusses (E17-E20) from 7 pregnant rats (Rattus norvergicus) of the OFA strain (Sprange-Dawley line). The microdissected segments corespond to subdivisions with anatomic and embryologic criteria, from stomach to rectum. The RNA extraction from the microdissected segments was done by the Guanidium tiocianate extraction method (Chomczynski & Sacchi, 1987). Once the RNA was obtained, the retrotranscription was done, through the action of the M-MLV enzime and the participation of an arbitrary primer (D4S 2912-GT), obtaining, in this way, a first cDNA selection. The cDNA was amplified by PCRs, with the previously described characteristics, and using the same primer than in the retrotranscription (D4S 2912-GT). PCR's products were submited to electrophoresis in sequentiation gels, obtaining a characteristic and reproducible pattern. The different bands were cuted out from the gels, eluted in water and keeped at 4ºC. After analyzing the expression patterns of the different transcrits in acrilamide gels, ten bands were selected for its clonation and posterior sequentiation.To carry out the clonation the bands were ligated to pCR®2.1 plasmidium, by the action of a ligase enzime during 16 hours at 14ºC. The ligation product was used to transform by thermic shock competent E Coli bacteriums (To F-10 strain) that, after a short growing period, were sow in Petri plaques containing LB-Agar growing media. After 14-16 hours of growing, the bacterial clones that had incorporated the plasmidium with the insert were choosed and was confirmed by PCR which of them had the insert with the expected size, in order to select them for the automatic sequentiation. The obtained sequences were analized through BLAST programe in the NCBI and UCSC data bases, obtaining, in this way, homologies with gens in different species and in human genome, respectively.In order to confirm the results and to obtain accurate information on the localization of the expression, "in situ" hibridization technique of the band that, according to sequentiation, corresponded to a hsp86 fragment, was performed. For that purpose riboprobes sense and antisense were constructed from one of the bacterial clones that had incorporated the insert. For the construction of the riboprobes, the band must be transferred to the pBluescript SK plasmidium, that possesses promotors of the T3 and T7 RNA polimerases (for the sintesis of the sense and antisense probes, respectively), diferently of pCR2.1 that only has one of them. Riboprobes Synthesis of the was done by the action of RNA polimerases T3 and T7, using digoxigenin marked nucleotides, in order to mark the probe, and the linealizated plasmidium as mould. The "in situ" hibridization was done over sagital sections, carried out in criostate and adhered to glass slides , of whole rat fetuses, fixed by perfusion with 4% Paraphomaldehid in PB, obtained from 4 pregnant rats of the OFA strain (Sprague-Dawley line) at the 17-20 days of pregnancy.Results and discussionResults of this work were obtained in three levels: 1. Band pattern in the acrilamide gels2. Sequences analysis 3, "In situ" hybridization1. Fingerprinting pattern in the acrilamide gels: Fingerprinting patterns showed expression patterns of the diferent bands, that were identified by a number and a letter code. These results gave us the information for deciding wich which bands to be sequenciate, but in no case this was considered to be definitive.2. Sequence analysis:Due to the fact that RAP-PCR amplifies all kinds of RNA, we have obtained in our study three sequences of rRNA (H3, N0, N1.2), two from the mitochondrial genome (E3 and G1), three mRNA (F8/hsp86, G0/CCT-5 i M2/GTP binding protein). Finally, two sequences (J2 i N1.1) have shown a unknown nucleotid sequence. In respect to the sequences that showed the highest homology with mRNA, the bioinformatic analysis gave us the following information: The G0 band, that in the RAP-PCR is more intensivily expressed in the more anterior part of the duodenum, showed 93% of homology with Mus Musculus Chaperonin subunit 5 (epsilon) (Cct5) and 87% with Homo Sapiens mRNA for KIAA0098 protein. KIAA0098 is homologue in exon 1 with Homo Sapiens mRNA activated in tumor supression, clone TSAP9 that was cloned in a study where it was considered a probable tumor supressor gen, due to its differential expression in two celular lines, one tumoral and not the other (Roperch JP et al. (1999). SIAH-1 promotes apoptosis and tumor supression through a network involving the regulation of protein folding, unfolding, and trafficking: Identification of common effectors with p53 and p21Waf1 . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8070-8073).The M2 band, that in RAP-PCR is expressed with no remarkable differences between different localizations, has shown 92% of homology with Mus musculus largeG mRNA for large GTP binding protein and 84% with Homo sapiens optic atrophy 1 (autosomal dominant) (OPA1) , two reasons to consider it homologue with optic atrophy 1 gene, in its GTP dominium.The F8 band, that in RAP-PCR, is expressed in the more distal parts of the digestive tube, showed 98-100% homology with Rattus norvegicus hsp86 gene for heat shock protein 86, homologue to hsp 90a. 3. "In situ" Hibridization: The "in situ" hibridization with probes constructed from F8 band, that corresponded to a fragment of the hsp86 gene of the rat, showed the following results: Sense riboprobe showed no hibridization in the studied sections and the anti-sense showed an expression well conserved pattern in the different ages of the fetal period of the rat. Localizations where antisense probe hibridizated, with different mark intensities, were the following, in a craniocaudal order,: Cerebral cortex, ependimary layer of the choroidal plexus, epithelia of the nasal and nasopharinx cavities, salival glands, glosopalatine glands, surface epithelium of the larges bronchii, thimus, brown fat, raquidial ganglia, hematopoyetic cells or hepatocites in the liver, epithelia and serose layer in the small and large bowel, renal and suprarenal cortex and germinal cells in the testes.From our results obtained by "in situ" hibridization with the F8 probe we emphasize that expression of the hsp86 gene exists in the nasal and brochial epithelia, ependimary layer of the choroidal plexus and germ cells of the testes, all of them locations where cells display cilia or flagelae. Ciliae and flagelae are formed by and internal structure, axonem, consisting in vertebrates, by nine protophylaments constituted by a and b tubulin heterodimers. Is well known that hsp90a is the chaperon that collaborates in the folding of tubulines, reason for which we consider that the expression of the F8 probe in the locations with mobile elements is due to this fact. Hsp90a has been related to cancer because these proteins collaborate in the folding of the proteins neededfor celular growth and division. In the other way Mizuno et al. (2001) have recently described the interaction of hsp 90a and hsp90b with pim-1, a protooncogen related to celular proliferation in leukemias and limphomas. It has similarly been observed overexpression of hsp90a in different cancers ( endometrium, pancreas, breast, nasopharinx, salival glands and leukemias ), some of them developed in tissues where F8 probe is expressed during the rat fetal period. All these facts support the relation between hsp90a with hyperproliferation and cancer.Summarizating, we have found in this work two sequences G0 ( Chaperonin subunit 5 (epsilon)) and F8 (hsp86) that can be related to cancer, the first as a probable tumor supressor gene and the second as a gen related to celular proliferation.. We belive that, after this study, that only pretended to identify development gens, the door that we pretend to cross is now a little more open, for genetically relate cancer and development in the next phase.

PAPEL DEL ESTUDIO GENÉTICO EN EL DESPISTAJE Y EL DIAGNÓSTICO DE LA HEMOCROMATOSIS HEREDITARIA.La Hemocromatosis Hereditaria (HH) es una enfermedad genética afltosómica recesiva vinculada al gen HFE que ocasiona un defecto en el metabolismo del hierro, con una hiperabsorción del mismo, produciendo unos depósitos elevados y patológicos en higado, corazón, páncreas, y ocasionando daño en cada uno de estos organos.El diagnóstico de HH se realiza mediante la cuantificación de hierro en la biopsia hepática o por el estudio de las mutaciones del gen HFE. Se ha observado que un alto % de pacientes con HH presentan la mutación C282Y y en menor cflantia la H63D. Pero hay variabilidad entre diferentes poblaciones e incluso dentro de un mismo pais.La HH es el desorden genético más común en individuos de raza caucásica y de origen céltico, con una prevalencia media de 2-5/1000, y es más frecuente en individuos del norte de Europa y sus descendientes.Protocolo l: Objetivo: Determinar la incidencia de las mutaciones genéticas del gen HFE en una población de pacientes estudiados en el hospital de Sant Pau que presentaban sobrecarga de hierro.Paciente: Para esto se estudiaron los pacientes que acudieron al Hospital de Sant Pau de manera consecutiva en un periodo de tres meses, que presentaban sobrecarga férrica con IST>50% y ferritina>450ng/l y a los que se determinaron las mutaciones del gen HFE. Métodos: el gen HFE se amplificó mediante PCR, y el ADN se digirió con enzimas de restricción Rsal (C282Y) y Mbol (H63D).Los fragmentos se valoraron por electroforesis en geles de agarosa.Resultados: De los 55 pacientes estudiados, 3 pacientes(5,45%) fueron homocigotos para la mutación C282Y y 2 pacientes (3,6%) eran heterocigotos para las 2 mutaciones. Por lo tanto, 5 de 55 pacientes (9%) presentaban las mutaciones genéticas diagnósticas de HH.Protocolo ll: Objetivo:Determinar la incidencia de las mutaciones genéticas responsables de la HH y su relación con la concentración de hierro en higado en pacientes biopsiados en el Hospital de Sant Pau por sospecha de HH.Pacientes: Se incluyeron 78 pacientes con indica de saturacion de transferrina (IST) >50% y ferritina >450,ug/l a los que se les habla practicado una biopsia hepática para cuantificación del hierro, entre 1980 y 1999. Y se clasificaron según el indica de hierro hepático (IHH) en tres grupos: Grupo I con IHH>1,9; Grupo II con IHH entre 1 y 1,9; y GrupoIII con IHH <1.Métodos: El estudio de las mutaciones del gen HFE se realizó como en el protocolo I y la cuantificación de hierro en biopsia hepática se valoró mediante desecación y colorimetria.Resultados: En el grupo 1, 26 de los 31 pacientes (83,85%) tenian una mutación relacionada con HH; 24 pacientes (77,4%) eran homocigotos para la mutación C282Y y 2 (6,45%) eran heterocigotos para las 2 mutaciones. De los 5 pacientes restantes, 4 (12,9%) eran homocigotos para la mutación H63D y un paciente (3,22%) era heterocigoto para la mutación H63D.En el segundo grupo de los 7 pacientes, 2 (28,57%) eran homocigotos para la mutación C282Y, y otros 2 pacientes eran heterocigotos para las dos mutaciones. Los restantes 3 pacientes tenían genotipo normal.En el grupo III con IHH<1, ninguno de los 40 pacientes era homocigoto para la mutación C282Y, 4 (10%) eran dobles heterocigotos, 3 pacientes (7,5%) eran homocigotos para la mutación H63D, 15 (37,5%) eran heterocigotos para la mutación H63D y 17 (42,5%) tenian un genotipo normal. Pero si tenemos en cuenta los criterios histológicos y genéticos, 39 pacientes fueron diagnósticados de HH, ocho de estos pacientes (20,5%) no cflmplian los criterios histológicos de HH, por lo que el estudio genético nos permitió establecer el diagnóstico de HH en estos pacientes. En definitiva en el presente estudio se puede observar que el 87,17% de los pacientes con HH tienen las mutaciones descritas, siendo el 66,6% de los pacientes homocigotos para la mutación C282Y y el 20,5% dobles heterocigotos. Solo 5 pacientes del total de 39 con diagnóstico de HH (12,8%), no presentaban las mutaciones diagnósticas de HH.Protocolo III: Objetivo: Evaluar el papel de la mutación S65C del gen HFE en pacientes con HH que son negativos para las otras dos mutaciones, con el fin de conocer la frecuencia de esta mutación en nuestra área.Pacientes: Se realizó la mutación S65C en 141 pacientes, en los que se descartó la homocigocia C282Y y los dobles heterocigotos. Y se dividieron en 2 grupos: Grupo l: 41 pacientes con sobrecarga de hierro y Grupo ll: 100 pacientes sin sobrecarga de hierro.Métodos:el ADN se digirió con la enzima de restricción Hinf-l y los fragmentos se valoraron por electroforesis en geles de agarosa.Resultados:Solo un paciente de los 41 casos del primer grupo con sobrecarga de hierro fue heterocigoto para la mutación S65C y normal para las otras dos mutaciones. Ninguno de los pacientes del segundo grupo presentó esta mutaciónProtocolo IV: Se realizó un protocolo institucional de trabajo para la HH en el Hospital de Sant Pan.Conclusiones:-EI 9% de los pacientes con sobrecarga férrica (ISTy ferritina sérica elevados) que acudieron al hospital presentan mutaciones genéticas diagnósticas de HH.-En los pacientes con indica de hierro hepático IHH >1,9, el 83,85% presentaron una mutación compatible con HH (77,4% homocigotos para la mutación C282Y y 6,45% heterocigotos para las dos mutaciones).-El 12,9% de los pacientes con IHH >1,9 eran homocigotos para la mutación H63D.-Hay un porcentaje de pacientes (16,12%) que tienen criterios histológicos de sobrecarga férrica con IHH>1,9, pero no tienen las mutaciones diagnósticas de HH.-Existe un 20,5% de pacientes con mutaciones genéticas diagnósticas de HH que no cumplen los criterios histológicos cuantitativos de la enfermedad.-En nuestro estudio, el 87,17% de los pacientes diagnosticados de HH, (teniendo en cuenta criterios genéticos e histológicos) tenian mutaciones genéticas compatibles con HH (66,6% homocigotos para la mutación C282Y y 20,51% dobles heterocigotos).-La mutación S65C del gen HFE es muy poco frecuente en los pacientes con sobrecarga férrica en nuestra área geográfica. / ROL OF THE STUDY GENETIC IN THE SCRENING AND DIAGNOSTIC OF THE HEMOCHROMATOSIS HEREDITARY.Hereditary hemochromatosis (HH) is an autosomal recessive disorder of iron metabolism, continued absorption of iron despite increasing body iron overload and the excessive cellular iron levels, leads to tissue damage in liver, pancreas, heart,The diagnosis of HH is based on the demonstration of increased iron stores in the hepatic biopsy or mutations in the genetic test. Extensive studies of patients of European ancestry have disclosed a high prevalence for the C282Y mutation among patients with HH. Depending on the areas, affected individuals ranged from one in 300 to 2-5/1000 in Caucasian populations (4,5)Protocol Il: Objective: Determine the relation between the C282Y y H63D genetic mutations and iron stores in the hepatic biopsy.Patients: Seventy eight unrelated of spanish origin patients with hepatic biopsy and hepatic iron index (IHH), serum transferrin saturation above 50%, elevated ferritina concentration were tested for the HFE C282Y y H63D mutations The patients were divide in the three group using the IHH (group I >1,9; group 11 11,9; group 111<1).Methods: the HFE mutationts were determined using the primers and conditions developed by Feder et al. The iron in the liver biopsy was evaluated using the method described by Barry M. and Sherlock S.Results: In the group 1, 26 out of 31 (83.85%) patients had anHFE mutation related to HH, including 24 patients (77.4%) withC282Y homocygosity (W/HH) and two patients were compound heterozygotes (6.7%) (CY/HD), four cases (12,9%) werehomozygotes for the H63D mutation (CC/DD).and one patient (3,22%) was heterozygotes for the H63D mutation,In the group 11, two out of 7 patients (28,57%) were homozygous for the C282Y mutation and two (28,57%) were compound heterozygotes (CY/HD), and three patients did show the wild type genotype (37.5%). including 2 with Porphyria Cutanea Tarda and 1 with juvenile Hemochromatosis.In the group III, none of 40 patients were homozygous for the C282Y mutation, only 4 of 40 patients (10%) were compound heterozygotes (CY/HD). Fifteen (37,5%) was heterozygotes for the H63D mutation and 17 out of 40 patients (42,5%) had a normal genotype.Statisitcal significant differences in iron overload were found in the different groups of HFE mutations.Homozygous patients for the C282Y mutation had the highest levels of Hll with significant differences with the other groups. Compound heterozygotes and patients with homozygosity for the H63D mutation had increased levels of Hll with respect to the control group (wild type and CC/HD). However, this increase was milder than in the case of the C282Y mutation.Conclusion: In our population the C282Y mutation was asociated with (83.3%) of HH (76.6% were homozygous and 6.7% compound heterozygotes). In conclusion, our study confirm the high proportion of the C282Y mutation detected in HH in our patients, and supports the potencial use of molecular genetic analysis as a confirmation test where there is clinical and bioquimical suspictinfthed isease.

La leucemia aguda es una alterción clonal de los progenitores hematopoyéticos, con una gran heterogeneidad tando desde el punto de vista clínico como biológico. Actualmente el tratamiento de los pacientes con leucemia aguda se estratifica según factores pronósticos. Disponemos de diversas técnicas útiles en el diagnóstico, clasificación y seguimiento de los enfermos con leucemia aguda y es necesario integrar todas ellas para conseguir una correcta caracterización de la leucemia aguda. De esta manera se definen, dentro de la heterogeneidad de la leucemia aguda, entidades clínico-biológicas con determinado valor pronóstico y tributarias a un tratamiento más individualizado. En este sentido, el análisis inmunofenotípico en la leucemia aguda es imprescindible para la correcta clasificación, aporta información pronóstica y más recientemente se utiliza en el estudio de la enfermedad residual mínima en la remisión.El objetivo de esta tesis es analizar el valor en la caracterización de la leucemia aguda de nuevos marcadores como CD66 y CD123 y estabecer correlaciones entre el patrón inmunofenotípico y la presencia de lesiones moleculares con valor pronóstico como los reordenamientos: bcr/abl en la LLA y aml-1/eto, cbfb/myh-11, mll y duplicación de flt3 en la LMA. / Acute lekemias are considered to be clonal disorders involving early hematopoietic progenitor cells, with a wide clinical and biological heterogeneity. Clinical outcome and treatment depends on prognostic factors. Actually, correlation of several techniques is mandatory for the correct knowledge of this disease. In this way, phenotype analysis by flow cytometry is usful for acute leukemia classification, and more recently, for the study of minimal residual disease. The aim of this thesis is 1) To analyze the value new markers such us: CD66 and CD123 in order to distinguish better the phenotypic properties of normal and tumoral cells and their utility in the study of minimal residual disease and 2) To analyze the utility of immunophenotype for the screening of specific genetic lesions common in acute leukemia such us: BCR/ABLl in ALL and AML-1/ETO, CBFB/MYH-11, MLL rearrangements and FLT3 mutations in AML.

Introducció: l'envelliment és un procés gradual i espontani de canvi, que resulta en la maduració fins a la vellesa. El segment de població de més de 65 anys està creixent a tot el món. S'estima que a l'any 2025, el número de persones de més de 65 anys s'haurà gairebé duplicat. La malaltia cardiovascular és la primera causa de mort al món occidental. La prevalença dels diversos factors de risc cardiovascular varia amb l'edat, la població i els grups ètnics però en general augmenta a mida que envellim. Dos dels processos diferencials de la població geriàtrica són la fragilitat i el deteriorament cognoscitiu. La fragilitat és una combinació del procés natural d'envelliment i diversos problemes mèdics i s'associa a un deteriorament general de la salut, risc de caigudes, pèrdua de força, deteriorament de la mobilitat, incapacitat, hospitalització i augment de la mortalitat general i cardiovascular, així com amb a nivells baixos d'educació i pobresa. El deteriorament cognoscitiu és prevalent a la població geriàtrica i com a conseqüències hi ha dificultat per a aprendre tasques complexes que complica el seguiment d'instruccions terapèutiques, particularment són noves pel pacient. Hi ha evidència que el tractament dels factors de risc cardiovascular a la població geriàtrica pot reduir la morbiditat i la mortalitat cardiovascular. També hi ha evidència que un programa d'activitat física regular prevé i ajuda en el tractament de factors de risc cardiovascular. Malgrat els obvis beneficis el compliment terapèutic and recomenacions d'exercici físic és limitat. Els objectius d'aquesta tesi són: determinar els efectes d'un programa d'exercici de baixa intensitat en els factors de risc cardiovascular en una població geriàtrica, i els factors que afecten el compliment terapèutic amb un programa d'exercici de baixa intensitat. Metodologia: el diseny d'aquest estudi és longitudinal amb anàlisi de les variables abans i després de la intervenció. Participants: membres d'una congregació n apostólica a Baltimore; es va excloure a aquells amb malalties que contraindiquen exercici. Intervenció: el programa de 6 mesos de durada va consistir en exercici de d'intensitat baixa-moderada, 3 vegades per setmana i una classe setmanal de promoció de salut i nutrició. Vem determinar el perfil lipídic , glucosa, hemoglobina glucosilada, tensió arterial, índex de massa corporal, pic de capacitat aeróbica, caminada de 6 minuts, força, funcionalitat i multiples questionaris (depresió, qualitat de vida, motivació per a l'exercici). També varem determinar l'assitencia al programa. Resultats: 16 dels 56 que varen començar el programa el varen acabar; edad 66 + 9 ays [51 - 82]; dotze (75%) eren dones. L'assistencia va ser de 27% de les sessions oferides. Els funionament social (OR = 1.15, IC 1.02 - 1.30) i el sentit d'afiliació (OR = 1.36, IC 1.04 - 1.78) van ser els predicators d'assistència. Al final del programa hubo un aumento significativo de la fuerza de los brazos (p=0.04) y del rendimiento en la caminada de seis minutos (p=0.02). Conclusió: l'exercici és una opció útil en el tractament dels factors de risc cardiovascular en la població geriàtrica sempre i quan es recomeni a les dosis adequades (tant en quant a la intensitat com a la freqüència) i es tingui en consideració els aspectes que s'associen amb un increment de l'adherencia a un programa d'exercici. / Introduction: aging is a process of gradual and spontaneous change that results in maturation all the way to old age. The segment of population older than 65 years is growing world wide. In 2025 it is estimated the number of people older than 65 years will have doubled. Cardiovascular disease is the first cause of death in the western world. Prevalence of cardiovascular risk factors changes with age, type of population and ethnic group; however, in general, it increases with age.Two of the characteristics that differentiate the elderly form the general population are frailty and cognitive decline. Frailty is a combination of the natural aging process and multiple medical problems. It is associated with a general health decline, increased risk of falls, loss of strength, worsening of mobility, disability, hospitalization, increase of all cause mortality and cardiovascular mortality as well as low education level and poverty. There is evidence that the treatment of cardiovascular risk factors in the geriatric population can reduce cardiovascular morbidity and mortality. There is also evidence that a program of regular physical activity prevents and helps treat cardiovascular risk factors. Despite the obvious benefits adherence to recommendations of exercise is limited. The aims of this thesis are two fold: to determine the effects a low intensity exercise program on the cardiovascular risk of a geriatric population and to determine the factors that affect compliance with a low intensity exercise program. Methods: this is a longitudinal study with pre-post analysis. Subjects: members of an apostolic congregation in Baltimore; those with diseases that contraindicate exercise were excluded. Intervention: six month program consisting of low to moderate intensity exercise, three times per week and a once a week health promotion and nutrition class. Lipid profile, glucose, glicosilated hemoglobin, blood pressure, body mass index, pick of aerobic capacity, six-minute walk, strength, functional status and multiple questionnaires (depression, quality of life, motivation inventory) were collected. The assistance to the program was also determined. Results: sixteen of the 56 who started the program finished it; age 66 ± 9 years [51-82]; twelve were female (75%). Assistance to the program was 27% of the offered sessions. Social functioning (OR = 1.15, CI 95% 1.02-1.3) and sense of affiliation (OR = 1.36, CI 95% 1.04-1.78) predicted assistance. At the end of the program there was a significant increase in the strength of the arms (p=0.04) and the six minute walk (p=0.02).Conclusion: exercise is a useful therapeutic option for the treatment of cardiovascular risk factors in the geriatric population so long as it is used at adequate doses (intensity and frequency) and factors associated with compliance to an exercise program are taken into consideration.