In the present doctoral dissertation a series of studies dealing with the psychogenetics of fearfulness are reported. In Study 1, the correlative effects of selective inbreeding on an array of fearful behaviours in the Roman rat strains were investigated. In Study 2, we determined whether a brief removal from the homecage partner (i.e. cohort removal procedure) could differentially potentiate the startle reflex of these rats. In the Main Study, we sought to establish, by means of factor analytic tools, the behavioural profile of fearfulness for a large sample (n = 800) of F2 rats in a battery of eight tests. The results were the following: First, Roman low-avoidance (RLA/Verh) rats were markedly more anxious/fearful than their high-avoidance (RHA/Verh) counterparts. Second, the magnitude of the startle was higher in fearful RLA/Verh's than in fearless RHA/Verh's, male rats displayed enhanced startle response relative to females and the startle was potentiated by cage partner removal in male RLA/Verh rats. The analysis of the behaviour of the F2 progeny in the fear test battery revealed, by using factor analytic techniques, that three main factors accounted for more than 40 per cent of the variance: a "Learned Fear" Factor containing the measures of aversive/fear conditioning, an "Emotional Reactivity" Factor with 11 out of the 14 variables analyzed and a "Fear of Heights" Factor with high loadings on open arm behaviour in the elevated plus-maze. Additional results on sex differences in, and QTL's (genetic markers) for, anxiety, derived from the analyses of the same F2 data base, are presented. We conclude by proposing a biobehavioural fit between our factor analytic map and the genetic markers explored, mainly based on the role that a locus, at chromosome 5, may have in mediating intense responses of fear to emotional stimulation. Given the conservation across species of the main rudiments of fear responses, we believe that our psychogenetic findings are potentially relevant for understanding anxiety-related conditions in humans. / En esta tesis doctoral se presentan una serie de estudios sobre psicogenética del miedo. En el Estudio 1, se investigaron los efectos correlativos de la crianza selectiva (consanguínea) en varias respuestas de miedo en las cepas de ratas Romanas. En el Estudio 2, determinamos si una separación de corta duración del compañero de caja-hogar (i.e. procedimiento de retirada de la cohorte) podría potenciar diferencialmente el reflejo de sobresalto de estas ratas. En el Estudio Principal, buscamos establecer, por medio de herramientas analítico-factoriales, el perfil conductual de temerosidad de una gran muestra de ratas F2 (n = 800) en una batería de ocho tests. Los resultados fueron los siguientes: Primero, las ratas Romanas de baja evitación (RLA/Verh) fueron marcadamente más ansiosas/miedosas que las Romanas de alta evitación (RHA/Verh). Segundo, la magnitud de la respuesta de sobresalto fue mayor en las miedosas RLA que en las no-miedosas RHA, los machos desplegaron una respuesta de sobresalto aumentada en relación a las hembras y este reflejo fue potenciado en los machos RLA por la retirada de su compañero. El análisis de la conducta de la progenie F2 en la batería de pruebas de temerosidad reveló que tres factores principales explicaban más del 40 % de la varianza: un factor de "Miedo Aprendido" que contenía las medidas de condicionamiento de miedo/aversivo, un factor de "Reactividad Emocional" con 11 de las 14 variables analizadas y un factor de "Miedo a las Alturas" con cargas altas para la conducta en los brazos abiertos del laberinto elevado en cruz. Se presentan aquí también resultados derivados del análisis de la misma base de datos F2, sobre diferencias sexuales en, y marcadores genéticos de, ansiedad. Concluimos proponiendo una correspondencia psicobiológica entre nuestro mapa analítico-factorial y los marcadores genéticos explorados, basada principalmente en el papel que puede tener un locus en el cromosoma 5 como mediador génico de las respuestas de miedo intenso ante estímulos emocionales. Dada la conservación a través de las especies de los principales rudimentos del miedo, creemos que nuestros hallazgos psicogenéticos son relevantes, potencialmente, para la comprensión de los cuadros psicopatológicos relacionados con la ansiedad en humanos.

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Con el objeto de caracterizar genéticamente a las poblaciones asnales españolas, que se encuentran en peligro de extinción, se llevo a cabo un estudio a partir del análisis de 15 loci microsatélites (AHT4, AHT5, ASB2, HMS1, HMS2, HMS3, HMS5, HMS6, HMS7, HTG4, HTG6, HTG7, HTG10, HTG15 y VHL20), en un total de 513 individuos, correspondiendo a: Andaluza (87), Catalana (140), Encartaciones (74), Mallorquina (104) y Zamorano-Leonesa (108). Adicionalmente se incluyeron 9 asnos de Marruecos, utilizados como población de referencia, y 24 caballos, utilizados como población "outgroup". Similarmente se evaluaron dos regiones parciales del mtDNA, específicamente del citocromo b y del D-loop, en 79 y 91 secuencias, respectivamente, de las razas antes mencionadas, así como, de 10 y 11 secuencias adicionales correspondientes a la raza Majorera y asno de Zimbabwe, respectivamente. Los análisis mostraron que los microsatélites amplificaron exitosamente, excepto ASB2, que no amplificó y HMS1 que resultó ser monomórfico con 165 pb. El HT promedio sobre todos los loci fue 0,683, sin diferencias significativas entre razas, mientras que el número medio de alelos osciló entre 3 (HMS5) y 15 (AHT4), con ligeras diferencias entre las razas. La PE global resultó ser del 99,99%, para todas las razas. El grado de diferenciación genética resultó ser del 4,1%, contribuyendo todos los loci a ella. El déficit promedio de heterocigotos por raza fue del 17,8%, mientras que en la población total ese déficit fue del 21,1%. A nivel jerárquico la diferencia entre razas fue del 6.4%; y las principales causas del déficit de heterocigotos intrarracial resultaron ser la consanguinidad, en las razas AND, CAT y ZAM, y la subestructuración reproductiva en ENC y MALL; no obstante no podemos obviar la posible presencia de alelos nulos en la población, pero debido a la carencia de registros genealógicos no se pudo corroborar. Las relaciones genéticas mostraron que las razas más próximas siempre fueron la Catalana y Mallorquina, estando la Andaluza siempre más alejada de las razas del norte de España. Por otro lado, el análisis de las secuencias del mtDNA, nos permitió detectar entre 6 y 7 haplotipos, para el citocromo b y el D-loop, respectivamente, con este número reducido los valores de diversidad nucleotídica correspondieron a 0,001 y 0,007, para ambas regiones, respectivamente. Los resultados del mtDNA nos permiten indicar que el estado actual de las razas asnales españolas parecen corresponder al producto de una mezcla de líneas maternas debido a un elevado flujo de genes entre ellas, o bien qué, su origen, se corresponde con la de un ancestro único y común con las razas africanas. Los análisis con marcadores moleculares del tipo microsatélite resultan muy útiles y valiosos para la caracterización genética de las poblaciones asnales, y de esta manera ayudan y contribuyen a una mejor gestión de los planes o programas de conservación de esta especie. / In order to characterize genetically the Spanish donkey breeds, which are in danger of extinction, was carried out a study from the analysis of 15 loci microsatellites (AHT4, AHT5, ASB2, HMS1, HMS2, HMS3, HMS5, HMS6, HMS7, HTG4, HTG6, HTG7, HTG10, HTG15 and VHL20), in a total of 513 individuals, corresponding to: Andaluza (87), Catalana (140), Encartaciones (74), Mallorquina (104) and Zamorano-Leonesa populations (108). Additionally, 9 asses of Morocco were used like population of reference, and 24 horses, used like population included themselves outgroup. Similarly, two partial regions of mtDNA were evaluated, specifically of Citocromo b and the D-loop, in 79 and 91 sequences, respectively, of the breeds before mentioned, as well as, of 10 and 11 additional sequences corresponding to the Majorera breed and ass of Zimbabwe, respectively. The analysis showed that all the microsatellites amplified successfully, except ASB2, that did not amplify and HMS1 that turned out to be monomorphyc with 165 pb. The HT average on all loci was 0.683, without significant differences between breeds, whereas the average allele number oscillated between 3 (HMS5) and 15 (AHT4), with slight differences between the breeds. The cumulative exclusion probability (PE) was 99.99%, for all the breeds. The degree of genetic differentiation turned out to be from the 4.1%, contributing all loci to her. The deficit average of heterozygotes by race was of the 17.8%, whereas in the total population that deficit was of the 21.1%. At hierarchical level the difference between breeds was of the 6.4%; and main the causes of the intraracial deficit of heterozygotes turned out to be the consanguinity, in the breeds AND, CAT and ZAM, and the reproductive structure in ENC and MALL; despite we cannot avoid the possible presence of null alleles in the population, but due to the deficiency of genealogical registries it was not possible to be corroborated. The genetics relationship showed that the next breeds always were Catalana and the Mallorquina, being the Andaluza always remoter of the breeds of the north of Spain. On the other hand, the analysis of the sequences of mtDNA, allowed detecting between 6 and 7 haplotipos, for citocromo b and the D-loop, respectively, with this reduced number the values of nucleotide diversity corresponded to 0.001 and 0.007, for both regions, respectively. The results of mtDNA allow us to indicate that the present state of the Spanish donkey breeds seems to correspond to the product of a mixture of maternal lines due to a high flow of genes among them, or what, its origin, corresponds with the one of ancestral only and common with the African breeds. The analyses with molecular markers of the type microsatellites are very useful and valuable for the genetic characterization of the donkey populations, and this way they help and they contribute to one better management of the plans or programs of conservation of this species.

Determinadas razas autóctonas de asnos (Andaluza, Catalana, Mallorquina, Asno de las Encartaciones y Zamorano-Leonesa) han sufrido a lo largo del tiempo importantes y frecuentes variaciones cuantitativas, generalmente negativas y particularmente atribuibles al olvido técnico impuesto por la marginación que ha provocado la explotación de otras especies y la industrialización del campo. La disminución de sus efectivos y el cruce indiscriminado con otras razas las ha conducido al estado de razas en peligro de extinción (RD 1682, 1997), y ha conllevado a un gran confusionismo descriptivo de sus características etnológicas. El objetivo último y fundamental del proyecto CICYT AG98-0503 que se está llevando a cabo, es sentar las bases para la conservación, mantenimiento y mejora de los animales que integran cada una de estas razas, centrándose principalmente en las fases I, II y III del protocolo marcado por la FAO para poblaciones en peligro de extinción, es decir, en la conservación "in situ". Esta tesis doctoral se ha centrado en una parte de la fase II del programa de conservación, concretamente en su caracterización racial a nivel morfológico, hematológico y bioquímico clínico. Para ello, se ha llevado a cabo un trabajo de campo centrado en la búsqueda de ejemplares de las 5 razas en distintas comunidades autónomas, con la finalidad de reflejar la situación actual de la población, tomar diferentes medidas zoométricas para realizar su caracterización fenotípica (morfológica), así como extraer muestras sanguíneas, para poder establecer los valores de referencia y normalidad tanto a nivel hematológico, bioquímico y de proteínas plasmáticas. Se efectuaron extracciones sanguíneas a 491 animales de ambos sexos, tanto jóvenes como adultos; y en los animales adultos, o sea, aquéllos mayores de 3 años (317 animales), fueron tomadas un total de 26 medidas corporales (cefálicas, troncales y extremidades) para el análisis biométrico. La descripción y análisis de los parámetros estadísticos de tendencia central y de dispersión, así como el estudio y análisis de los factores: edad, sexo y raza, tanto para las variables hematológicas, bioquímicas, proteínas plasmáticas y morfológicas, nos proporcionaron valores de referencia fiables para ser utilizados tanto en la caracterización racial como en el ámbito clínico. Mediante la caracterización morfológica, aspiramos a la diagnosis racial; esto es, al encuadre del animal objeto de observación y estudio, a un grupo etnológico diferenciado. Los resultados obtenidos a partir de las 26 mediciones biométricas nos proporcionaron datos importantes para diferenciar unos animales de otros, para agruparlos en conjuntos específicos y, fundamentalmente, para deducir proporciones que a su vez indiquen aptitudes funcionales. Estas proporciones las obtuvimos con el análisis de 12 índices zoométricos corporales (etnológicos y funcionales), los cuales evidenciaron las relaciones existentes entre algunos elementos de compacidad, alzada, longitud y peso. El análisis de las correlaciones entre las 26 medidas morfométricas, para cada una de las razas y por sexos, permitieron identificar las interacciones existentes entre y dentro las distintas regiones corporales (tronco, extremidades y cabeza), y el análisis factorial de componentes principales (ACP) permitió observar el grado de relación existente entre dichas razas, así como determinar las variables de mayor importancia en la definición morfoestructural, con la finalidad de reducir el número de variables a emplear en la caracterización práctica y rutinaria de los animales en trabajos posteriores, reduciendo así la complejidad de los mismos. Para ello la matriz de datos de las 26 variables zoométricas estudiadas fue sometida a un análisis multivariante, es decir, sometimos los datos a un análisis canónico, en el que las variables fueron transformadas en variables canónicas (factor I, II y III). Estos tres factores resumieron en total un 99,71 % de la información aportada por las 26 variables de origen, el factor I contribuyó en un 95,85 %, el factor II en un 3,25 % y el factor III en un 0,61 % al total de la varianza explicada. El perímetro torácico, alzada a la cruz, diámetro longitudinal, alzada a las palomillas, alzada al nacimiento de la cola, alzada al dorso, alzada a la pelvis, y la alzada a la grupa, diámetro dorso-esternal y longitud de la cabeza, determinaron principalmente el factor I siendo éstas por tanto, las variables de mayor peso en la caracterización racialPor otro lado, el análisis del nivel de divergencia existente entre las 5 poblaciones de asnos estudiados, basándonos en caracteres cuantitativos, lo realizamos mediante el uso de la Distancia de Mahalanobis, así como con el análisis de componentes principales (ACP). Los resultados mostraron la existencia de tres grupos, sin una evidencia clara de agrupamiento por distancia geográfica. Por ello, debemos suponer que la filogenia y evolución morfológica de los asnos peninsulares ha sido un proceso complejo, englobando distintos patrones de diferenciación para los distintos grupos de caracteres, debido probablemente a la acción medioambiental y a presiones selectivas desiguales. Las mayores diferencias las encontramos entre la raza Andaluza y el Asno de las Encartaciones, mientras que las menores se localizaron entre el asno Zamorano-Leonés y el Mallorquín. Tanto en el ACP como en el cálculo de la distancia de Mahalanobis observamos como la raza Zamorano-Leonesa es la que de algún modo se encontraría en medio de todas ellas, es decir, la que presenta menores distancias morfológicas con las cuatro restantes.Los resultados de los principales estadísticos descriptivos, analizados en el estudio de 15 variables hematológicas, 11 variables bioquímicas y proteínas plasmáticas, nos proporcionaron los valores de normalidad en cada una de las razas. El análisis de varianza para el factor raza indicó la existencia de diferencias estadísticamente significativas entre las 5 poblaciones de asnos. La edad resultó ser el factor modulador con más peso sobre los parámetros sanguíneos, ya que las diferencias encontradas entre animales jóvenes (<3 años) y adultos (>3 años) fueron notables (11 de 15 variables hematológicas y 7 de 11 bioquímicas presentaron diferencias significativas). Sin embargo, las diferencias encontradas para el factor sexo reflejaron la existencia de un bajo dimorfismo sexual en lo referente a parámetros hematológicos y bioquímicos, y nulo en cuanto a las proteínas plasmáticas. / Certain autochthonous breeds of donkeys (Andaluza, Catalana, Mallorquina, Encartaciones and Zamorano-Leonesa) have suffered important and frequent quantitative variations throughout the time, that generally have been negative, probably due to the intense mechanization of the country-side and the introduction of other species of asses. The decrease of the census of their populations and the indiscriminate mixture with other breeds have lead them to the state of "endangered breeds" (RD 1682, 1997), and have done confuse their ethnic characteristics. The main objective of this thesis is first of all, reflect the present situation of the Spanish donkey breeds and in the other hand, make the biometrical, haematological and biochemical characterization of their endangered populations. This work has followed the rules marked by the FAO Expert Consultation for the identification of possible stocks for conservation and as basic tool for the study, maintenance and conservation of animal genetic biodiversity. For the biometrical study 317 adult animals (older than 3 years) have been sampled and a total of 26 corporal measures (cephalic, trunk and extremities) for each individual were taken. The results obtained from these measurements provided us important information to differ individuals from others, to group them in specific sets and, mainly, to deduce proportions that indicate functional aptitudes. We obtained these proportions analysing 12 corporal indices (ethnological and functional), which demonstrates the existing relationships between some elements of compactness, height, length and weight. For the haematological, biochemical and plasma proteins study, blood samples have taken from 491 animals of both genders and age (young and adult). The description and analysis of the average, variance, and age, sex and race factors provided us guaranteed reference values to be used for the racial characterization and for the clinical scope.The correlation's analyses between the 26 corporal measures, for each one of the breeds and genders, allowed identifying the existing interactions between and within the different corporal regions (trunk, extremities and head). The factorial analysis of principal components (ACP) allowed to observe the existing relationship degree between these breeds, and to determine the most important variables of the morphological definition, with the purpose to reduce the number of variables to be used in the practical and routine characterization of the animals in later studies, reducing then the complexity of them. To do it, all the information of the 26 corporal variables was subject to a multivariate analysis, in fact, subject in a canonical analysis, where the variables were transformed into canonical variables (factor I, II and III). These three factors summarized 99.71 % of the information by the original 26 variables, the factor I contributed in 95.85 %, factor II in 3.25 % and factor III in 0.61 % to the total of the explained variance. The thoracic perimeter, length diameter, withers height, sacrum height, root of tail height, back height, pelvis height, and rump height, the back-sternal diameter and head length, mainly determined factor I, being the heaviest weight variables for the racial characterization.On the other hand, using the Mahalanobis Distance, and also with ACP, we obtained the divergence level between the 5 donkey populations studied, according on quantitative characters. The results showed the existence of three groups, without clear evidence of clustering by geographic distance. For this reason, we must suppose that phylogenetic and morphologic evolution of the peninsular donkeys have been a complex process, including different patterns of differentiation for the different characters groups, probably coming from the environmental action and to unequal selective pressures. The greater differences were found between the Andaluza and Encartaciones breeds, while the minors were located between the Zamorano-Leonesa and Mallorquina. Using the ACP and also in the Mahalanobis Distance, we observed that the Zamorano-Leonesa breed is the one that presents minor morphologic distances with the others. The analysis of breed factor of 15 haematological parameters, 11 biochemical parameters and plasma proteins indicated the existence of statistically significant differences between the 5 populations analyzed. Age had the most influence on blood parameters because the differences found between young and adult animals were remarkable (11 of 15 haematological variables and 7 of 11 biochemical ones presented significant differences). In contrast, less significant differences between genders were found for sex factor so we demonstrate the existence of a low sexual dimorphism for haematological and biochemical parameters.

La leishmaniosi canina és una zoonosi causada pel paràsit Leishmania infantum, sent el gos el principal reservori. És endèmica de la conca Mediterrània, de l'orient Mitjà i d'Amèrica del Sud arribant la prevalença de la infecció en aquestes zones al 67%. A més, és una malaltia en expansió ja que recentment s'han descrit casos als Estats Units i Regne Unit.L'objectiu d'aquesta tesi és l'estudi de la base molecular de la resistència i la susceptibilitat a la leishmaniosi visceral canina (CVL) des de dues vessants diferents, l'estudi del polimorfisme de 12 gens candidats i el MHC de classe II i el perfil immunològic en l'establiment de la infecció i en la posterior evolució de la malaltia.S'han caracteritzat 22 nous SNPs pel gen Slc11a1, que està involucrat en la primera barrera de defensa de l'organisme contra els paràsits, a part de tenir múltiples efectes pleotròpics que influencien la resposta immunitària posterior. Un estudi cas-control format per 164 gossos de 19 races, on s'han analitzat 24 polimorfismes per aquest gen, ens ha permès identificar 3 SNPs significatius: A4549G localitzat a l'intró 6, C4859T localitzat a l'exó 8 i C8542T localitzat a l'intró 13, corroborant la implicació d'aquest gen en la CVL.Com a conseqüència d'un treball en col·laboració amb el Centre for Integrated Genomic Medical Research (CIGMR) (Universitat de Manchester) s'ha caracteritzat la regió MHC de classe II i s'han genotipat 97 SNPs en 11 gens candidats relacionats amb la resposta immunitària: IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, MIF (Migration-Inhibitory Factor), NOS (Nitrix Oxide Synthase), TNF (Tumor Necrosis Factor), Slc11a1 i VDR (Vitamin D Receptor). El polimorfisme d'aquests gens candidats s'han analitzat en una població de 36 gossos de races que tenen una elevada prevalença de la malaltia. S'han identificat dos al·lels associats a susceptibilitat a la CVL, l'al·lel DQB1*02301 i l'al·lel DRB1*01502, tot corroborant per aquest darrer l'associació prèviament descrita. Aquests dos al·lels es troben en el mateix haplotip en la raça boxer, raça on també s'ha identificat un al·lel que només es troba en els animals control, DRB1*01301. A partir de l'anàlisi dels 11 gens candidats hem identificat 3 SNPs significativament associats a CVL: 1 SNP localitzat en la regió 3' flanquejant de la IL-6 (20R191) i 2 SNPs localitzats en l'intró 7 del gen VDR (13M453 i 15S439) suggerint un paper rellevant d'aquests gens en la CVL.Tots aquests gens candidats han estat genotipats en una població de podencs eivissencs, raça considerada com a resistent. Els resultats obtinguts, confirmen que aquesta raça té una base genètica pròpia que probablement configura la seva particular resistència a la malaltia. S'han identificat nous al·lels pel MHC-II (DRB1*06901 i DQB1*04801) i haplotips específics pel gen Slc11a1. Per l'anàlisi del perfil immunològic en la infecció per Leishmania infantum s'ha dut a terme un estudi d'expressió de citocines (IL-4, IL-10, IL-12, IL-13, IFN-&#947;, TNF-&#945; i TGF-&#946;) mesurades mensualment durant un any en 6 beagles d'infecció experimental que van presentar una diferent progressió de la malaltia. Els resultats obtinguts en aquest estudi proporcionen nous indicis dels mecanismes immunològics que controlen la progressió de la leishmaniosi canina, que es caracteritza per la producció de citocines Th1 i Th2. En la fase inicial de la infecció una predominant resposta Th2 amb una elevada expressió de IL-4 i IL-13 pot afavorir la replicació del paràsit i la disseminació de la infecció. L'elevada expressió d'IFN-&#947; durant la fase patent de la infecció està associada a l'augment de la càrrega parasitària i als símptomes clínics. A més, és important remarcar l'elevada variabilitat de l'expressió gènica durant la preinfecció que dificulta l'establiment d'uns nivells de referència d'expressió basal per aquestes citocines.Els resultats d'aquesta tesi corroboren el paper dels gens Slc11a1 i DRB1 amb la leishmaniosi visceral canina i evidencien nous gens candidats relacionats amb la malaltia, reafirmant la base genètica de la resistència/susceptibilitat de l'hoste; a més, aporten informació del perfil de diferents citocines en la infecció per Leishmania infantum. / La leishmaniosis canina es una zoonosis causada por el protozoo Leishmania infantum y el perro es considerado el principal reservorio del parasito. Es una enfermedad endémica de la cuenca Mediterránea, Oriente medio y Sudamérica y la prevalencia en estas zonas llega al 67%. Además es una enfermedad en expansión ya que recientemente se han descrito casos en Estados Unidos y en Reino Unido.El objetivo de esta tesis es el estudio de la base molecular de la resistencia y la susceptibilidad a la leishmaniasis visceral canina (CVL) a partir de dos aproximaciones distintas, el estudio del polimorfismo en 12 genes candidatos y el MHC de clase II y el perfil inmunológico en el establecimiento de la infección y en la posterior evolución de la enfermedad.Se han caracterizado 22 nuevos SNPs para el gen Slc11a1, que está involucrado en la primera barrera de defensa contra los parásitos. Un estudio caso-control formado por 164 perros de 19 razas, donde se han analizado 24 polimorfismos para este gen, nos ha permitido identificar 3 SNPs significativos: A4549G localizado en el intrón 6, C4859T localizado en el exón 8 y C8542T localizado en el intrón 13, corroborando la implicación de este gen en la CVL.Gracias a un trabajo en colaboración con el Centre for Integrated Genomic Medical Research (Universidad de Manchester) se ha caracterizado la región del MHC de clase II y se han genotipado 97 SNPs en 11 genes candidatos relacionados con la respuesta inmune: IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, MIF (Migration-Inhibitory Factor), NOS (Nitrix Oxide Synthase), TNF (Tumor Necrosis Factor), Slc11a1 y VDR (Vitamin D Receptor). El polimorfismo de estos genes se ha analizado en una población de 36 perros pertenecientes a razas que presentan una elevada prevalencia para la enfermedad.Se han identificado dos alelos asociados a susceptibilidad a la CVL, el alelo DQB1*02301 y el alelo DRB1*01502, corroborándose para este último la asociación descrita previamente. Estos dos alelos forman parte del mismo haplotipo en la raza boxer, raza en la que también se ha identificado un alelo que solo se encuentra en los animales controles, DRB1*01301. A partir del análisis de los 11 genes candidatos hemos identificado 3 SNPs significativamente asociados a CVL: 1 SNP localizado en la región 3' flanqueante de la IL-6 (20R191) y 2 SNPs localizados en el intrón 7 del gen VDR (13M453 y 15S439) sugiriendo un papel relevante de estos genes en la CVL.Todos estos genes candidatos han sido genotipados en una población de podencos ibicencos, raza considerada resistente a la leishmaniosis. Los resultados obtenidos confirman que esta raza tiene una base genética propia que probablemente configura su particular resistencia a la enfermedad. Se han identificado nuevos alelos para el MHC-II (DRB1*06901 y DQB1*04801) y haplotipos específicos para el gen Slc11a1. Para el análisis del perfil inmunológico en la infección por Leishmania infantum se ha llevado a cabo un estudio de expresión de citoquinas (IL-4, IL-10, IL-12, IL-13, IFN-&#947;, TNF-&#945; y TGF-&#946;), analizadas mensualmente durante un año, en beagles de infección experimental que presentaron diferencias en la progresión de la enfermedad. Hemos observado que en la fase inicial de la infección una predominante respuesta Th2 con una elevada expresión de IL-4 y IL-13 puede favorecer la replicación del parásito y la diseminación de la infección. La elevada expresión de IFN-&#947; durante la fase patente de la infección está asociada con el aumento de la carga parasitaria y a los síntomas clínicos. Además, es importante remarcar la elevada variabilidad de la expresión génica durante la pre-infección, dificultando el establecimiento de niveles de referencia de la expresión basal de estas citoquinas.Los resultados de esta tesis corroboran el papel de los genes Slc11a1 y DRB1 en la leishmaniosis visceral canina y ponen en evidencia nuevos genes candidatos relacionados con la enfermedad, reafirmando la base genética de la resistencia/susceptibilidad en el huésped; además, aportan información del perfil de diferentes citoquinas en la infección por Leishmania infantum. / Canine visceral leishmaniasis (CVL) is a zoonosis caused by Leishmania infantum. The dog is considered the main peridomestic reservoir of the parasite. CVL is endemic in the Mediterranean basin, Middle East, and South America and the prevalence of Leishmania infection can reach 67% in these areas. Moreover, leishmaniasis is emerging within non endemic areas such as North America and the United Kingdom. Leishmaniasis is thus increasingly becoming an important concern both from human public health and animal welfare perspectives.The aim of the present study is to insight into the molecular mechanisms of the resistance and susceptibility to CVL. Analyzing the polymorphism in 12 candidate genes and for the MHC class II region and by evaluating the immunological profile during the establishment of the infection and the progress of the disease. We have characterized 22 new SNPs in the Slc11a1 gene, which is involved in the first step of defense against the parasites and it is known for its multiple pleiotropic effects influencing the immune response. A total of 24 polymorphisms of the Slc11a1 gene have been typed in 164 dogs from 19 different breeds and we have discovered significant associations with CVL for 3 SNPs: A4549G in intron 6, C4859T in exon 8 and C8542T in intron 13, corroborating the role of this gene in CVL.In collaboration with the Centre for Integrated Genomic Medical Research (CIGMR) (University of Manchester) we have genotyped the MHC class II region and a panel of 97 SNPs from 11 candidate genes related with the immune response: IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, MIF (Migration-Inhibitory Factor), NOS (Nitrix Oxide Synthase), TNF (Tumor Necrosis Factor), Slc11a1 and VDR (Vitamin D Receptor). Polymorphism at these genes has been analyzed in a breed-matched case-control study of 36 dogs of 4 different breeds known to be predisposed to CVL.We have identified two susceptibility alleles for CVL, the allele DQB1*02301 and allele DRB1*01502, corroborating for this allele the association previously described. These two alleles were found in the same haplotype in the boxer breed. Moreover, we have identified an allele (DRB1*01301) only in the control animals of this breed. Data analyses for the 11 candidate genes have revealed that 3 SNPs were significantly associated to CVL: 1 SNP identified in the 3' flanking region of IL-6 (20R191) and 2 SNPs identified in intron 7 of VDR gene (13M453 and 15S439), suggesting the role of these candidate genes on CVL.All these candidate genes have been genotyped in a cohort of Ibizan Hounds as a resistant breed. Data analysis confirms a specific genetic background for this breed that probably contributes to the resistance to CVL. New alleles for the MHC class II (DRB1*06901 and DQB1*04801) and specific haplotypes for the Slc11a1 gen have been identified.To evaluate the immunological profile associated to Leishmania infantum infection we have performed a cytokine gene expression study (IL-4, IL-10, IL-12, IL-13, IFN-&#947;, TNF-&#945; and TGF-&#946;) monthly during one year follow-up in six experimentally infected beagle dogs that presented different progression of the illness. Our results contribute to the knowledge of the pathogenesis of canine visceral leishmaniasis, which is marked by a balance production of Th1 and Th2 cytokines. In the first stage of infection a predominant Th2 response with an early IL-4 and IL-13 expression could favours parasite survival and the spread of the infection. A higher late IFN-&#947; expression is associated with the increase of parasite load and clinical status. Moreover, the high variability of expression during the pre-infection stage difficult the establishment of reference basal levels for these cytokines.The results of this study corroborate the role of the genes Slc11a1 and DRB1 in canine visceral leishmaniasis and provide new candidate genes related with the disease, further confirming the importance of host genetics in resistance/susceptibility to infectious disease. Moreover, they provide information of the cytokine profile in Leishmania infantum infection.

És sabut de fa molt temps que les inversions cromosòmiques son mantenides per selecció natural a les poblacions de Drosophila. No obstant, els mecanismes moleculars que generen aquest valor adaptatiu encara no es coneixen. A les poblacions naturals de D. buzzatii, la inversió 2j forma un polimorfisme equilibrat amb l’ordenació 2st, en què els individus 2j tenen una mida més gran y un temps de desenvolupament més llarg en comparació amb els 2st. En aquest treball hem posat a provat la hipòtesi de que un efecte de posició d’un dels punts de trencament podria ser la causa d’aquests canvis fenotípics. Per a fer-ho hem analitzat l’expressió d’un gen adjacent al punt de trencament proximal, CG13617, en línies de D. buzzatii amb i sense la inversió 2j. Hem trobat que els embrions 2j presenten un nivell d’expressió de CG13617 cinc vegades menor causat per un RNA antisense originat en una còpia d’un transposó de la família Galileo inserit al punt de trencament. Les conseqüències funcionals de la reducció de l’expressió de CG13617 s’han investigat utilitzant la tècnica de RNA interferència per reproduir aquest silenciament a D. melanogaster. Els experiments de microarrays i RT-PCR en temps real comparant larves de primer estadi amb i sense expressió de CG13617 han revelat que 41 gens mostren nivells d’expressió reduïts quan CG13617 és silenciat, mentre que cap gen presenta un increment. A més, hi ha un excés significatiu de gens implicats en la replicació del DNA i el cicle celular entre els afectats pel silenciament de CG13617. Nou de deu d’aquests gens van ser analitzats a D. buzzatii i també tenen un nivell d’expressió reduït en embrions 2j, però no en larves de primer estadi, una fase en què la diferència d’expressió de CG13617 entre ordenacions cromosòmiques és menor i el RNA antisense ja no es transcriu. Per a esbrinar la possible funció d’aquest gen hem dut a terme un exhaustiu anàlisi de seqüències nucleotídiques i proteiques en els 12 genomes de Drosophila disponibles i també en altres organismes. La proteïna CG13617 conté un dit de zinc tipus C2H2 molt conservat, tres regions que poden formar coiled coils, dues seqüències PEST i senyals de localització i exportació nuclear. També presenta similitud amb la proteïna humana DZIP1 i amb Iguana, un component de la via de senyalització Hedgehog al peix zebra, fet que indica que el seu paper dins la cèl·lula podria estar relacionat amb el transport de factors de transcripció cap a dins i cap a fora del nucli. Aquests resultats suggereixen que el gen CG13617 podria estar implicat en la regulació de la replicació del DNA i que l’efecte de posició en els portadors de la inversió 2j podria contribuir a explicar les diferències fenotípiques observades entre els individus 2st i 2j, així com el valor adaptatiu d’aquesta inversió. / Chromosomal inversions have been known for a long time to be maintained by natural selection in Drosophila populations. However, the molecular mechanisms underlying their adaptive value remain uncertain. In D. buzzatii natural populations, inversion 2j forms a balanced polymorphism with the 2st arrangement, in which 2j individuals have a larger size and a longer developmental time compared to 2st carriers. In this work we tested the hypothesis that a position effect of one of the inversion breakpoints could be the cause of these phenotypic changes by analyzing the expression of a gene adjacent to the proximal breakpoint, CG13617, in D. buzzatii lines with and without inversion 2j. We have found that in 2j embryos an antisense RNA originated in a copy of a Galileo family transposon inserted at the breakpoint causes a 5-fold decrease of the expression level of CG13617. In order to investigate the functional consequences of the reduction in CG13617 expression, we have used RNA interference to reproduce this silencing in D. melanogaster. Microarray and real-time RT-PCR experiments comparing first instar larvae with and without CG13617 expression revealed that 41 genes show reduced expression levels when CG13617 is silenced, while none is up-regulated. Interestingly, genes involved in DNA replication and cell cycle are significantly enriched among those affected by CG13617 silencing. Nine out of ten of these genes analyzed in D. buzzatii also show a reduced expression level in 2j embryos, but not in first instar larvae, a stage where the CG13617 expression difference between chromosomal arrangements is lower and the antisense RNA is no longer transcribed. To gain insight into the potential function of this gene we have carried out a comprehensive nucleotide and protein sequence analysis in the 12 available Drosophila genomes and also in other organisms. CG13617 protein contains a conserved C2H2 zinc finger, three coiled coil regions, two PEST sequences, and putative nuclear localization and export signals, and shows similarity to human DZIP1 and zebrafish Iguana (a component of the Hedgehog signaling pathway) proteins, which indicates that its cellular role could be related to the transport of transcription factors in and out of the nucleus. These results suggest that gene CG13617 could be involved in the regulation of DNA replication and that the position effect in 2j carriers might contribute to explain the phenotypic differences observed between 2st and 2j individuals as well as the adaptive value of the inversion.

El interés por los mecanismos que generan las reordenaciones cromosómicas se ha reavivado recientemente gracias al enorme avance que supone la comparación de genomas secuenciados. En Drosophila, las inversiones cromosómicas son abundantes como polimorfismos intraespecíficos y como cambios fijados entre especies. Sin embargo, aun sabemos poco acerca de la generación de estas inversiones naturales y sus consecuencias moleculares. Se conocen diversos mecanismos moleculares capaces de generar inversiones cromosómicas. En el mecanismo clásico, un fragmento cromosómico generado por dos roturas puede repararse erróneamente y resultar invertido (NHEJ). Por otro lado, los elementos transponibles (TE) pueden actuar como sustrato de la recombinación ectópica entre copias insertadas en orientación inversa en sitios cromosómicos alejados e inducir inversiones. Los TE también pueden generar inversiones por otros procesos como la transposición aberrante o como simples endonucleasas. De cualquier modo, ambos mecanismos son capaces de producir duplicaciones asociadas a la inversión. En diversos análisis moleculares de puntos de rotura de inversiones en Drosophila se han descrito duplicaciones invertidas que la flanquean. Sin embargo, un problema aun no resuelto es si el mecanismo per se puede producir las coincidencias y no aleatoriedad observada de los puntos de rotura o, si la selección modula su distribución independientemente de cómo se produzcan. Este trabajo completa el estudio de nuestro grupo de investigación que ha demostrado anteriormente que tres inversiones polimórficas del cromosoma 2 de Drosophila buzzatii (2j, 2q7, 2z3) se generaron por recombinación ectópica entre copias del elemento transponible Galileo. En la única inversión fijada estudiada previamente en D. buzzatii (inversión 5g) no se ha demostrado la implicación de TE. Hemos llevado a cabo el estudio de los puntos de 2 rotura de las otras tres inversiones fijadas en el cromosoma 2 de D. buzzatii desde su divergencia del ancestro del grupo repleta: 2m, 2n y 2z7. Por otro lado, las inversiones 2m y 2n están dispuestas en tándem, compartiendo un punto de rotura a nivel citológico. En ambos puntos de rotura de la inversión 2z7 se han encontrado fragmentos degenerados de un elemento de la familia Galileo que sugieren que esta inversión podría haberse originado por recombinación ectópica. Por otro lado, el análisis molecular de las inversiones 2m y 2n, ha confirmado la coincidencia citológica de uno de los puntos de rotura. La inversión 2m está asociada a una duplicación génica que incluye el gen CG4673 y dos genes anidados en éste (CG5071 y CG5079). En la posición original (punto de rotura AC), los genes CG4673 y CG5079 se han pseudogeneizado. En la duplicación (punto de rotura BE), el gen CG4673 es funcional pero no hay rastro de los genes anidados debido a la pérdida del intrón 6 (que incluye ambos genes anidados). Esta duplicación parece además, haber sufrido una posterior micro-inversión. Existen tres posibles mecanismos para explicar el origen de esta compleja reorganización y la reutilización observada. (i) primero se originaría la inversión 2m mediante NHEJ y posteriormente la inversión 2n por recombinación ectópica entre copias del elemento BuT5. (ii) primero se originaría la inversión 2n mediante NHEJ y posteriormente la inversión 2m por inserción híbrida. (iii) que ambas inversiones hubieran sido simultáneas. (1 rotura escalonada + 2 roturas DSB más reparación NHEJ de los dos fragmentos generados). Finalmente, se habrían localizado hasta tres transcritos relacionados con el gen CG4673 en D. buzzatii por uno sólo en el genoma no invertido de D. mojavensis. Uno procedería de la copia degenerada del gen (punto de rotura AC) y otros dos de la copia del gen funcional (punto de rotura BE). Estos transcritos se relacionan formando moléculas de dsRNA que podrían estar regulando la expresión del gen funcional. / The interest in the origin of chromosomal rearrangements has been recently revived due to the increase in the number of sequenced genomes and the results obtained from their comparison. In Drosophila, chromosomal inversions are abundant as intraspecific polymorphisms and as fixed changes between species. However, still little is known about the molecular causes that generate natural inversions and their consequences. Moreover, the distribution of inversion breakpoints is nonrandom and breakpoints are commonly reused. This nonrandom distribution could be due to the mechanism that generate the inversions or to selection. Different molecular mechanisms are capable of generating chromosomal inversions. In the classical view, the insertion in the opposite direction of a chromosome fragment generated by two breaks generates an inversion (Non Homologous End Joining). Ectopic recombination between homologous sequences inserted in reverse orientation can also produce a chromosomal inversion. Transposable elements (TE) have been described as agents of ectopic recombination. Moreover, TE can also be involved in the generation of inversions by other processes such as aberrant transposition or acting as simple endonucleases. In any case, duplications flanking the inversion have been reported in several molecular analyses of breakpoints in Drosophila. The origin of these duplications has been commonly described as result of the reparation of a staggered break. Breakpoint reuse, inversion success and preferential mechanisms between species, time or chromosomes of inversion still remains unclear. Our work aims at shedding light on the non resolved problems about inversions. Our research group has been working with Drosophila buzzatii species that belongs to the repleta group as a model to understand the generation of chromosomal inversions. Our research group has previously shown that three polymorphic inversions of the chromosome 2 of D. buzzatii (2j, 2q7, 2z3) were generated by ectopic recombination between copies of the transposable element Galileo. On the other hand, in the only previously studied fixed inversion in D. buzzatii (5g) transposable elements has not been related with its origin. To analyze a possible profile between mechanism and success of fixation, we have carried out the study of the breakpoints of the other three inversions fixed on chromosome 2 of D. buzzatii since its divergence from the ancestor of the repleta group: 2m, 2n and 2z7. On the other hand, inversions 2m and 2n are arranged in tandem, sharing a breakpoint under cytological view. Degenerated fragments of a transposable element of the Galileo family were found in both breakpoints of inversion 2z7 suggesting that this inversion could have been originated by ectopic recombination as previously studied polymorphic inversions. 2z7 is the first fixed inversion described as a result of ectopic recombination. Degenerated fragments of BuT5 were founded in all breakpoints of inversions 2m and 2n. Furthermore, inversion 2m has been associated with a gene duplication that includes the gene CG4673 and its two nested genes (CG5071 and CG5079). In the original position (2m inversion distal breakpoint), CG4673 and CG5079 genes have became pseudogenes. In the duplication (2m and 2n shared breakpoint), the gene CG4673 is functional however there are no traces of the nested genes due the loss of the intron that includes them. Furthermore, molecular analysis of the inversions 2m and 2n has confirmed the coincidence of the breakpoints. Finally, the whole duplication was later inverted due the one micro-inversion. There are three possible mechanisms to explain the origin of this complex arrangement and the observed reuse. (i) The inversion 2m occurred first with NHEJ and later ectopic recombination between copies of the BuT5 element generated inversion 2n. (ii) The inversion 2n occurred by NHEJ and later the inversion 2m by hybrid insertion. (iii) Both inversions were simultaneous (two wrong repaired fragments generated with one staggered breakage and two double strand breakages). Finally, three transcripts related to the gene CG4673 have been found in D. buzzatii while only one was found in the non-inverted genome of D. mojavensis, also from repleta group. One of these three transcripts corresponds to the pseudogene in the 2m inversion distal breakpoint and the other two transcripts correspond to the functional copy of the gene in the 2m-2n shared breakpoint (one sense and one antisense transcript). These transcripts form dsRNA molecules that could be involved in the regulation of the expression of the CG4673 gene.

Els avenços que a les darreres dècades han protagonitzat les tècniques de genotipatge i de seqüenciació, unit al desenvolupament de tècniques estadístiques especialitzades i sofisticades, han permès elaborar noves vies de recerca per comprendre l’etiologia de malalties complexes l’origen de les quals, en molts casos, és multifactorial. Així com s’han establert factors ambientals que poden modular el risc de patir certes malalties, també s’han detectat variants genètiques que hi poden estar involucrades. Patologies com la diabetis, el càncer, l’esquizofrènia o l’asma es veuen influenciades per factors genètics en interacció amb factors ambientals. Al capdavant d’aquestes investigacions es troben els mapes de polimorfismes. El polimorfisme més comú al genoma humà és la variació en una sola base de la seqüència genòmica, l’anomenat ”Single Nucleotide Polimorphismï conegut per les seves inicials ”SNP”. Degut a la seva abundància, els SNPs són molt adients per generar mapes genètics i han esdevingut els marcadors més utilitzats en estudis d’associació genètica. Si bé des de fa dècades l’estudi del genoma humà s’ha centrat principalment en analitzar les variacions en la seqüència genòmica, des d’inicis de l’any 2000 sabem per diversos estudis que aquestes variacions tendeixen a donar-se en bloc. D’altra banda, també s’ha demostrat que les recombinacions genètiques que es donen al llarg del genoma no es produeixen de manera uniforme. Per aquest motiu, el genoma presenta zones que es transmeten en bloc, de progenitors a descendents, i que poden incloure blocs de variacions. Aquestes zones de baixa recombinació que es segreguen en bloc són els anomenats haplotips. Els haplotips poden facilitar el descobriment de gens relacionats amb malalties que pateixen els éssers humans. L’inter`Les en l’assignació d’haplotips i l’anàlisi de l’associació entre haplotips i malaltia en mostres d’individus no relacionats ha crescut incommensurablement als darrers anys degut a l’èmfasi que projectes com HapMap han situat sobre l’anàlisi d’haplotips. Ara bé, la deter-minació dels haplotips donada una mostra de genotips per un conjunt d’individus no sempre és immediata, havent de recórrer a tècniques específiques per tal de separar els cromosomes. Les tècniques de tipus molecular són les que aporten menys error però desafortunadament són cares i això dificulta el seu ús, sobretot en estudis poblacionals que tracten amb mostres grans. Per superar aquesta limitació, les investigacions han tendit a utilitzar la inferència estadística com a via més usual a l’hora de determinar els haplotips. La inferència sobre les freqüències haplotípiques és una bona solució per reconstruir la mostra haplotípica, però cal tenir present els efectes que el fet de treballar amb estimacions comportarà sobre tots els càlculs que es realitzin amb la mostra. En aquest sentit, resulta interessant dedicar esfor¸cos per tal d’intentar minimitzar la propagació d’aquests errors en les anàlisis d’associació genètica amb haplotips. Tot i que existeix diversitat de programes per fer anàlisis haplotípiques aplicables a mostres d’individus no relacionats, molts d’ells presenten limitacions que esdevenen una bona mo-tivació per intentar cercar d’altres alternatives teòriques i computacionals per tractar més eficientment la problemàtica dels haplotips. En aquesta tesi doctoral es presenta el desenvolupament i la implementació informàtica d’un mètode per estimar haplotips i els efectes associats a diversos tipus de fenotips. El marc teòric amb que s’ha treballat és la inferència Bayesiana combinada amb tècniques de Markov Chain Monte Carlo que optimitzin les qües-tions computacionals. L’eina resultat és el paquet BayHap, publicada com a paquet a l’entorn estadístic R. El programa s’ha validat sobre escenaris de dades simulats i sobre dades reals. L’aplicació mostra millores en l’estimació d’efectes associats a haplotips amb baixa freqüència i alhora ofereix la possibilitat de dur a terme l’anàlisi d’haplotips sota un punt de vista bayesià amb les avantatges que aquest fet ofereix. / Nowadays, haplotypic information has become vitally important to clarify the genetic basis of the etiology of some common diseases. Comparing DNA of healthy and diseased individuals let us to describe changes in the genomic sequence that could modify the risk of su ering from the disease. Association studies are the framework where this class of analysis are carried out. The DNA variations more often analyzed due to its high frequency along the genome are the Single Nucleotide Polimorphisms. One \SNP" is the change in only one nucleotide between individuals at the same position of their genomes. Is well known that there are zones in the genomic sequence with a low rate of recombinations, that are inherited as a block by the o spring. These zones are called haplotypes, and everyone carries two of them. On the other hand, in the last decade researchers have stated that mutations as SNPs are also transmitted in blocks, situated in haplotypic zones. For all of this, the knowledge of haplo- types corresponding to a sample of genotypes observed for some SNPs of a set of unrelated individuals could be very helpful to better understand the genetic association with a phe- notype of interest. Initiatives as the international HapMap project have strongly motivated the scienti c community to use haplotypes in association analysis. Unfortunately, in the absence of family data, obtaining haplotypic information is not straightforward. Since every cell of the human organism contains 22 pairs of homologous chromosomes, plus the sexual chromosome, for each chromosomical location at the autosomal chromosomes there are two bases, one for each homologous chromosome at the same position of the DNA sequence. Given that current lab techniques usually only report genotypic data and do not provide the chromosome for each base, individuals with two or more heterozygous sites have uncertain haplotypes because there is more than one possible haplotype pair compatible with their genotype. To overcome this limitation, research has tend to use statistical inference as the most common way to determine haplotype information. Although statistical inference of haplotypes frequencies is a good solution to reconstruct the haplotypes sample researchers have to take into account the error propagation in posterior analysis. This is an encouraging situation to apply e orts in order to minimize unwanted e ects. Even though there are some programs to do haplotypic analysis over unrelated individuals, most of them have unresolved questions as could be the estimation of association between disease and low frequency haplotypes. In this work we develop and implement a method to infer haplotypes and association with many types of phenotypes. The theoretical frame- work in which we based our algorithm is the bayesian inference and Markov Chain Monte Carlo techniques. The resulting application is an R package called BayHap available from de repository of packages of this free statistical environment. The program was validated through computational simulations and also applied over real data. The application shows better performance than other algorithms in case of low frequencies haplotypes. In addition, the package o ers the chance of make analysis through a bayesian point of view, with all the strength this fact can suppose.

Els elements transposables (TEs) són seqüències repetitives amb el tret definitori de canviar la seva posició al genoma. Ocupen fraccions importants dels genomes eucariotes, y, tot i que solen considerar-se paràsits genètics, també s'especula amb la possibilitat de que tinguessin alguna funció cel·lular que encara ens és desconeguda. Tot i així, sembla evident que tenen un paper important com facilitadors de l'evolució, ja que generen variabilitat al genoma de l'hoste. El TE Galileo està implicat en la generació de reordenacions cromosòmiques adaptatives naturals a l'espècie Drosophila buzzatii, en la que hauria generat variabilitat amb valor adaptatiu per a l'hoste. A més, tots els elements Galileo trobats en treballs anteriors eren defectius – composats bàsicament d'estructures similars a la dels elements Foldback – i no es van poder establir relacions d'homologia amb ninguna seqüència coneguda. Amb aquest rerefons, en aquesta tesi es va plantejar caracteritzar l'element genètic mòbil Galileo en diferents espècies de Drosophila i analitzar la seva dinàmica evolutiva. D'aquesta forma, en una primera fase es van buscar elements Galileo complets en diferents espècies del gènere Drosophila: D. buzzatii, D. mojavensis, D. virilis, D. willitoni, D. ananassae, D. pseudoobscura i D. persimilis, fent servir tant mètodes bioinformàtics com experimentals (depenent de si el genoma analitzat estava seqüenciat o no). Les còpies trobades presenten llargues Repeticions Invertides Terminals (TIR) de fins a 1,2 Kb, una elevada identitat amb seqüències de Galileo descrites anteriorment i, a més, contenen una zona codificant que ha permès classificar Galileo com a membre de la superfamília de l'element P. Posteriorment, mitjançant anàlisis filogenètiques, hem trobat l'existència de subfamílies de Galileo en tres espècies (D. buzzatii, D. mojavensis, D. virilis) i evidència d'activitat transposicional recent (D. willitoni, D. ananassae, D. pseudoobscura, D. persimilis i D. mojavensis). En una segona fase de la tesi, hem dut a terme experiments amb part de la proteïna que es codifica a Galileo i hem comprovat que interacciona amb les TIR de Galileo, confirmant que aquesta seqüència és la responsable de la reacció de transposició. Finalment, hem analitzat en detall la diversitat de Galileo al genoma de D. mojavensis i hem detectat una diversitat estructural molt important, on l'intercanvi de seqüències entre elements pareix força freqüent per l'evolució dels TEs. / Los elementos transponibles (TEs) son secuencias repetitivas cuya característica definitoria es la capacidad de cambiar de posición en el genoma. Ocupan fracciones muy importantes de los genomas de eucariotas, y aunque se suelen considerar parásitos genéticos, también se especula con la posibilidad de que pudieran tener alguna función celular que aún nos es desconocida. No obstante, parece evidente que tienen un papel importante como facilitadores de la evolución, al generar variabilidad en el genoma del huésped. El TE Galileo está implicado en la generación de reordenaciones cromosómicas adaptativas naturales en la especie Drosophila buzzatii, con lo que habría generado variabilidad adaptativa para el huésped. Además, todos los elementos Galileo encontrados en trabajos anteriores eran defectivos – compuestos básicamente de estructuras similares a las de los elementos Foldback – y no se pudieron establecer relaciones de homología con ninguna secuencia conocida. Con este trasfondo, en esta tesis se planteó caracterizar el elemento genético móvil Galileo en diferentes especies de Drosophila y analizar su dinámica evolutiva. De esta manera, en una primera fase se buscaron elementos Galileo completos en en diferentes especies del género Drosophila: D. buzzatii, D. mojavensis, D. virilis, D. willitoni, D. ananassae, D. pseudoobscura y D. persimilis, utilizando métodos tanto bioinformáticos como experimentales (dependiendo de si el genoma analizado estaba secuenciado o no). Las copias encontradas presentan largas Repeticiones Invertidas Terminals (TIR) de hasta 1,2 Kb, una elevada identidad con secuencias de Galileo descritas con anterioridad y, además, contienen una zona codificante que ha permitido clasificar Galileo como miembro de la superfamilia del elemento P. Posteriormente, mediante análisis filogenéticos, hemos encontrado la existencia de subfamilias de Galileo en tres especies (D. buzzatii, D. mojavensis, D. virilis) y evidencias de actividad transposicional reciente (D. willitoni, D. ananassae, D. pseudoobscura, D. persimilis y D. mojavensis). En una segunda fase de la tesis, hemos llevado a cabo experimentos con parte de la proteína que codifica Galileo y hemos comprobado que interacciona con las TIR de Galileo, confirmando que esta secuencia es la responsable de la reacción de transposición. Finalmente, hemos analizado en detalle la diversidad de Galileo en el genoma de D. mojavensis y hemos detectado una diversidad estructural muy importante, lo que sugiere que el intercambio de secuencias entre elementos podría ser bastante frecuente para la evolución de los TEs. / Transposable elements (TE) are repetitive sequences whose ability to change their location in the genome defines them. They made up a important proportion of the eukaryotic genomes, and although they are often considered as genetic parasites, it has been also argued that they might have some still unknown cellular function. Nevertheless, it is clear that they play a role as drivers of their host evolution, due to the fact that TEs generate genetic variability. The TE Galileo is involved in the generation of adaptive chromosomal rearrangements in natural populations of Drosophila buzzatii, indicating that it would be a driver of adaptation in its host. Moreover, all Galileo elements found in previous works were incomplete – mainly composed by Foldback-like structures – and homology relationships could not be established with any known sequence. With this background, this thesis was proposed to characterise the mobile genetic element Galileo in different Drosophila species and analyse its evolutionary dynamics. Thus, in a first phase we searched for complete copies of Galileo in different species of the Drosophila genus: D. buzzatii, D. mojavensis, D. virilis, D. willitoni, D. ananassae, D. pseudoobscura and D. persimilis, using both bioinformatic and experimental methods (depending on whether the analysed genome was available or not). The copies found present long TIR (up to 1.2 Kb), high sequence identity with previously found Galileo sequences and, moreover, they harbour coding sequences that have allowed the classification of Galileo as a member of the P-element superfamily. Subsequently, by means of phylogenetic analyses, we have found that there are Galileo subfamilies in three different species (D. buzzatii, D. mojavensis, D. virilis) and evidence of recent transpositional activity (in D. willitoni, D. ananassae, D. pseudoobscura, D. persimilis and D. mojavensis). In a second phase of the thesis, we have conducted experiments with part of the Galileo protein and detected specific binding to the Galileo TIR, confirming that this sequence is responsible for the transposition reaction. Finally, we have thoroughly studied the Galileo variability in the D. mojavensis genome and found a striking structural variation, suggesting that the exchange of sequences among different Galileo copies might be quite common and important for TEs evolution.

El genoma de los híbridos interespecíficos y las especies parentales D. buzzatii y D. koepferae ha sido estudiado utilizando marcadores moleculares AFLP. En el genoma de los híbridos segregan de novo marcadores AFLP de inestabilidad que no segregan en las especies parentales, señal de que el genoma híbrido es inestable. La caracterización de los marcadores AFLP de inestabilidad ha revelado que un amplio porcentaje, que va desde el 16%, en la primera generación de híbridos, hasta un 90% en las generaciones de híbridos segmentales, está asociado a la movilización de al menos 34 elementos transponibles de clase I y II. Las tasas de transposición estimadas en los híbridos y las especies parentales para los elementos Osvaldo, Helena y Galileo confirman que hay un incremento estadísticamente significativo de la transposición del retrotransposon Osvaldo (10-2) en las tres generaciones analizadas, mientras que la tasa de transposición de Helena y Galileo se incrementa (10-2) en la generación R1 pero decrecen en la generación R3 hasta el nivel de la transposición basal de las especies parentales D. buzzatii y D. koepferae (10-3). Las inserciones de los elementos Osvaldo, Helena y Galileo observadas por FISH y por transposon display señalan que la mayor parte de las inserciones se encuentran en la heterocromatina, región en la que se encuentran silenciados. La movilización de los 34 elementos transponibles en el genoma de los híbridos evidencia que en estos genomas ocurre una reorganización genómica inducida por la movilización de los elementos transponibles, y pone de manifiesto que el estrés genómico generado por la hibridación inhibe momentáneamente los mecanismos que controlan la transposición de los ETs en el genoma híbrido, permitiendo su movilización. / The genomes of the species D. buzzatii and D. koepferae and their interspecific hybrids have been studied using AFLPs markers. In the hybrids genome markers that are absent in the parental species have been detected unveiling genome instability. High amount of AFLP instability markers, ranging from 16 % in hybrids R1 to 90 % in segmental hybrids, are related to mobilization of at least 34 transposable elements of classes I and II. Transposition rates of Osvaldo retrotransposon confirm the increase of transposition in the three generations of hybridization, however Helena and Galileo transposable elements only increase transposition in generation R1 (10-2), but show transposition rate at the basal level (10-3) in generation R3 as in parental species. Insertions of Osvaldo, Helena and Galileo observed by FISH and by the transposon display technique indicate that most of the insertions are located in the heterocromatic regions, where they are silenced. Mobilization of 34 transposable elements in the hybrid genome bolsters that a genome reorganization is occurring in the hybrids. This reorganization is probably induced when hybrid genomic stress inactivates the control mechanisms of transposable elements mobilization.