L'expressió de la Kidney Androgen-regulated Protein (KAP) està regulada específicament y diferencialment per andrògens i hormona tiroïdal (T3) en el túbul proximal renal. Hem analitzat la transactivació del promotor del gen del KAP en cèl.lules PCT (pars convoluta) i PR (recta) derivades de ratolins transgènics L-PK/Tag1. Transfeccions transitòries amb diferents contruccions del promotor del KAP indicaven que el fragment de 224 bp era suficient per a mediar l'expressió cèl.lula específica de dit promotor. Assaigs de retardament en gel també mostraven que un putatiu element de resposta a andrògens (ARE), local.litzat a -39 bp de l'inici de transcripció, unia el receptor d'andrògens. La dihidrotestosterona (DHT) estimulava de manera androgen dependent la transactivació del KAP en cèl.lules PCT però en PR i la mutació de la putativa seqüència ARE eliminava dita activació. A més a més, l'IGF-1 però no la T3 augmentava la transactivació androgen dependent de KAP en PCT. Per tant, es suggeria que l'efecte cooperatiu de T3 en l'expressió del KAP existia in vivo podent efectar a l'activació produïda per T3 de l'hormona de creixement (GH) i al seu torn d'IGF-1. Aquests resultats demostraven l'expressió específica del curt fragment de 224 bp del promotor del KAP y suggerien interaccions sinèrgiques entre IGF-1 i andrògens en la regulació del gen del KAP en PCT.L'expressió cortical androgen dependent del KAP està afectada en hipotiroïdisme postnatal. La síntesi puntual de T3 a partir del dia 11 postnatal, comença una resposta cortical feble de KAP que va augmentant cap als dies 15-16, que és quan es produeix un pic fisiològic de T4 i el desenvolupament puberal dels ratolins. Donat que les CCAAT/Enhancer-Binding Proteins (C/EBPs) participen en respostes mitjançades per T3 i que en el promotor del KAP existeixen quatre elements de resposta consens per a C/EBPs, hem analitzat la seva participació en la resposta androgènica de KAP mitjançada per T3. La detecció de p42C/EBPa y p35C/EBPb es troba correlacionada amb l'expressió del KAP, apareixent en extractes renal nuclears de ratolins masles control i hipotiroïdals induïts amb T3 durant els dies 7-21 postnatals, però no en els hipotiroïdals no tractats. Mitjançant transfeccions transitòries es mostrava com C/EBPa i C/EBPb eren capaces d'induir respostes màximes del promotor del KAP i que la deleció de les putatives caixes d'unió a C/EBPs local.litzades a -429/-420 i -457/-448 produïa una gran disminució de l'activitat basal del promotor, irrecuperable amb la sobreexpressió de C/EBPs. Tant la depleció androgènica com al mutació de l'ARE conjuntament amb la deleció de les caixes esmentades augmentava la disminució de l'activitat basal del promotor produïda per la deleció de dites caixes. Per tant, postulem que els andrògens i la T3 mitjançant el control de C/EBPs sinergitzen en la transactivació del gen del KAP. / The kidney androgen-regulated protein (KAP) is specifically expressed and differentially regulated by androgens and triiodothyronine (T3) in proximal tubule. We have analyzed the hormonal dependent transactivation of the KAP gene promoter in PCT (pars convoluta) and PR (recta) cells derived from L-PK/Tag1 transgenic mice. Results from transient transfection studies with different KAP promoter constructs indicated that a 224 bp-truncated fragment was sufficient to mediate cell-specific expression of the KAP promoter. Gel shift assays also showed that a putative androgen-response element (ARE) located at -39 bp from the transcription initiation site was able to bind androgen receptor (AR). Dehydrotestosterone (DHT) stimulated in an androgen-dependent manner the transactivation of KAP in PCT cells but not in PR and mutation of the putative ARE sequence abolished that activation. Moreover, the IGF-1 but not T3 enhanced the androgen-dependent transactivation of KAP in PCT cells. It suggested that the cooperative effect of T3 on KAP expression existing in vivo might be effected by T3 activation of growth hormone (GH) and, in turn, of IGF-1. These results demonstrated the specific expression of a short 224 bp fragment of the KAP promoter and suggested synergistic interactions between IGF-1 and androgens for KAP gene regulation in PCT cells.The cortical androgen-dependent expression of KAP was influenced in postnatal hipothyroidism. The punctual effect of T3 in postnatal day 11 produced cortical expression of KAP gene and it was increased until days 15-16, when there is an fisiological pick of T4 and the puberal development of mice. In this point, we have analyzed the function of CCAAT/Enhancer-Binding Proteins (C/EBPs) on the enhanced androgen-dependent KAP expression by T3 because they participate in T3 responses and there are four consensous C/EBP sequences in KAP promoter. p42C/EBPa and p35C/EBPb were detected when KAP expression existed, that was in nuclear kidney extracts of euthyroid male mice and hipothyroid male mice treated with T3 from day 7 to 21 posnatal, but not in hipothyroid male mice. Transient transfections demostrated that C/EBPa and C/EBPb were able to induce the maximal KAP promoter activity achieved and the delection of putative C/EBP sequences at positions -429/-420 and -457/-448 produced an increment of the decrease observed for KAP promoter activity, that it wasn't recovered by C/EBP overexpression. Androgen deplection or ARE mutation with the deletion of mentioned C/EBP boxes decreased the basal promotor activity more than the mutation of these boxes alone. Because of these results we have postulated that the effect of androgens and T3 on KAP expression were mediated for C/EBPs.

Les tècniques d'hibridació in situ fluorescent aplicades sobre nuclis d'espermatozoides humans prèviament descondensats permeten la seva caracterització citogenètica i, en conseqüència, determinar el risc de transmissió d'una anomalia cromosòmica a la descendència.Hem aplicat aquesta metodologia en espermatozoides procedents d'individus control, per tal de determinar la incidència basal d'anomalies en la població general, així com en individus que per les seves particularitats, sospitem que poden presentar una incidència d'anomalies cromosòmiques superior a la població control.L'anàlisi dels resultats ha posat de manifest que els mecanismes que originen gàmetes amb aneuploïdies afecten preferentment a alguns cromosomes, concretament el cromosoma 21 i els cromosomes sexuals.Els pares d'individus amb la síndrome de Down d'origen patern presenten un increment significatiu d'aneuploïdies pel cromosoma 21.En individus portadors d'anomalies cromosòmiques estructurals, la proporció dels genotips resultants de cada tipus de segregació no s'ajusta a la proporció 1:1 esperada, suggerint l'existència de punts de control al llarg de la meiosi que eliminen selectivament cèl·lules germinals en funció del seu contingut cromosòmic. Per algunes reorganitzacions, el risc de transmissió d'una anomalia cromosòmica a la descendència es pot veure incrementat per la presència d'efectes intercromosòmics.En individus amb la síndrome de Klinefelter, els nostres resultats confirmen la incapacitat de la línia cel·lular 47,XXY d'iniciar la meiosi. L'increment d'espermatozoides portadors d'anomalies numèriques pels cromosomes sexuals es podria explicar pel desenvolupament de la meiosi en un ambient testicular anormal, conduint a un increment de segregacions errònies de les cèl·lules diploides 46,XY presents al teixit testicular.En individus amb cariotip 47,XYY, algunes cèl·lules amb aquesta dotació cromosòmica tenen la capacitat d'iniciar la meiosi. Les dades en aquests individus suggereixen l'existència d'un bloqueig de les cèl·lules aneuploides en l'estadi d'espermatòcit primari, secundari o en l'estadi d'espermàtide, donant lloc a una eliminació continuada de les cèl·lules anormals al llarg de l'espermatogènesi.Les avantatges que presenten les tècniques d'hibridació in situ fluorescent per a l'estudi citogenètic de l'espermatozoide humà ha permès la seva incorporació com a eina de diagnòstic genètic en individus de risc. Tenint en compte que la majoria d'aquests individus presenten problemes de fertilitat, l'anàlisi del contingut cromosòmic dels espermatozoides permet determinar, per a cada cas en particular, el risc potencial de transmissió a la descendència. Aquesta informació pot ser utilitzada per establir el programa de reproducció assistida més adequat a les característiques de cada cas. / Fluorescent in situ hybridization methodology allows analyzing the chromosome content of spermatozoa. With the analysis of the gametes, it is possible to determine the real risk of transmission of a chromosome abnormality to the offspring.We have used this methodology in the cytogenetic study of human spermatozoa obtained from two types of men; control men, in order to determine the basal incidence of chromosome anomalies in the normal population, and high risk men, that is, patients that for different reasons, we suspect the presence of a increased incidence of chromosome anomalies.Our results underline that the biological mechanisms which are behind of the non-disjunction phenomenon affected much more some chromosomes than others.The fathers of Down syndrome children of paternal origin showed a significant increased of 21 aneuploidies, suggesting that these patients had an increase risk of transmission of a chromosomal abnormality to the offspring.In carriers of structural reorganizations, the proportion of the expected genotypes in each type of segregation differs of the 1:1 proportion. This result suggests the presence of meiotic checkpoint along meiosis eliminating selectively those cells with chromosome anomalies. In some types of reorganizations, the risk of transmission to the offspring could also be increased for the presence of interchromosomal effects.In Klinefelter patients, our results underline the inability of the 47,XXY cell line to initiate the meiotic process. The abnormal sex chromosome constitution found in spermatozoa could be attributed to segregation errors in XY cells placed in a compromised testicular environment.In 47,XYY patients, although some aneuploid cells are meiotically competent, it seems that there is a continuous elimination of chromosomal abnormal germ cells along spermatogenesis, parallel to an increase in the percentage of normal cells.Altogether, the data underline the importance of incorporating the screening of aneuploidies in sperm in the genetic screening of affected patients, in order to determine the real risk of transmission of a numerical chromosome abnormality to the offspring.Obviously, the only thing that is obtained after sperm FISH studies is information, but this information could be very useful to the affected couple, to help them and the medical team, to choose among different possibilities of assisted reproduction methodologies

En un grupo de tumores de mama se decidió estudiar si la pérdida de función de la proteína Bax podía ser debida a la existencia de mutaciones frameshift. Los resultados obtenidos sugieren que en cáncer de mama, las mutaciones del gen bax no serían críticas para la carcinogénesis y el proceso de progresión tumoral. Este tipo de mutaciones sólo se han detectado en tumores con inestabilidad de microsatélites, por lo tanto decidimos estudiar cual era la incidencia de este tipo de alteración en nuestro grupo de tumores, encontrando que un 11,6 % eran inestables. La inestabilidad detectada quedó delimitada a las secuencias que afectaban a dinucleótidos, no se encontró ninguna alteración en las secuencias de mononucleótidos analizadas. Se encontró una asociación estadísticamente significativa entre la existencia de inestabilidad de microsatélites y la pérdida de apoptosis observada en los tumores. La mayor supervivencia celular resultado de la pérdida de apoptosis podría favorecer la existencia de este tipo de alteración en los tumores.Para corroborar si la pérdida de apoptosis se podía asociar a la existencia de inestabilidad de forma genérica en los tumores de mama, se decidió estudiar si la sobreexpresión de las proteínas antiapoptóticas Bcl-2 y Bcl-xL era capaz de inducir un acúmulo de alteraciones genéticas, y el efecto que las mismas podían tener sobre el proceso de progresión tumoral.Al analizar el daño genómico en las líneas transfectadas con respecto a la línea parental, los transfectantes con genes antiapotóticos tenían un GDF mayor que los transfectantes con el gen control. Por lo tanto, la inhibición de la apoptosis era capaz de inducir un aumento en el número de alteraciones genéticas detectables por AP-PCR, contribuyendo así a la inestabilidad genética que caracteriza a las células tumorales. El análisis filogenético de las líneas transfectadas, con respecto a la línea parental indicaba que los transfectantes con genes antiapoptóticos tenían un parentesco más cercano, originado por una mayor similitud de las alteraciones genéticas, mientras que las alteraciones de la línea control presentaban un mayor grado de divergencia. El análisis de los resultados mediante un programa de clusters mostraba la presencia de 3 zonas donde el tipo de alteraciones presentes en las líneas transfectadas con los genes antiapoptóticos y con el gen control son divergentes.Al analizar el GDF de las diferentes variantes tumorales y metastáticas, tomando como referencia las líneas derivadas de la generación anterior los resultados indicaban que a medida que avanzaba el proceso de progresión tumoral, el número de alteraciones genéticas detectadas iba en aumento, tanto a nivel de tumores como de metástasis. Este aumento de inestabilidad se correlaciona con una mayor capacidad tumorigénica y metastática de las líneas celulares. Sin embargo, las variantes celulares con mayor capacidad tumorigénica y metastática no son las que presentan un mayor número de alteraciones. Estos resultados indicarían que sólo una parte de las alteraciones detectadas son responsables del fenotipo tumoral y metastático. Por lo tanto quizá las alteraciones detectadas en el control son más aleatorias y sin repercusión biológica, mientras que la sobreexpresión de moléculas antiapopotóticas da de entrada una ventaja de crecimiento, con lo cual la célula es capaz de progresar con un menor número de alteraciones genéticas, pero de mayor efectividad biológica.El daño genómico de las metástasis con diferente organoespecificidad mostraba un comportamiento diferencial, tanto en relación con el número como la naturaleza de las mismas, en función del órgano de origen. Finalmente, decidimos estudiar si la organoespecificidad de las metástasis podía ser debida a cambios en la expresión génica. Estos estudios se hicieron utilizando la técnica de microarrays. Una vez hecho el análisis estadístico se determinaron genes asociados a actividad metastática, que serían aquellos genes que aparecían diferencialmente expresados en las cuatro variantes metastáticas analizadas. También se identificaron los genes cuya expresión se modificaba conjuntamente en las dos metástasis ganglionares, y aquellos cuya expresión diferencial se asociaba a la presencia de metástasis ósea. / We studied in a group of breast cancer samples if the loss of function of Bax protein was due to frameshift mutations. Our results show that in breast cancer, bax mutations are not relevant for tumoral progression. This kind of alterations was only found in tumors with microsatellite instability, so we decide to know the incidence of this kind of instability in our samples, the result was that 11,6 % of the tumors show instability. The instability was detected only in dinucleotide sequences, no alteration was found in the mononucleotides analyzed. There was an association, with stadistic significance, between the microsatellite instability and the loss of apoptosis detected in the tumors. Loss of apoptosis can promote survival and this could favour the induction of this kind of alteration in tumors.To confirm if there is an association between loss of apoptosis and genetic instability in breast cancer cells, we studied if the overexpression of the antiapoptotic proteins Bcl-2 and Bcl-xL was able to induce an accumulation of genetic alterations, and which will be the effect of this alterations in tumor progression.The analysis of the genomic damage in transfected cells with regard to the parental line, show that cell lines overexpressing antiapoptotic genes have a greater GDF than control cells. So, the inhibition of apoptosis can induce an increase in the amount of genetic alterations detectable by AP-PCR, and can contribute to the genetic instability of tumoral cells.The philogenetic analysis of the transfected cells with regard to the parental line show that cell lines overexpressing antiapoptotic genes have a nearest relationship, due to a greater similarity between the genetic alterations. On the other hand, the alterations of the control cells are more divergent. The analysis of these results with a cluster software shows the existence of at least 3 regions with different kind of genetic alterations between cells transfected with antiapoptotic genes and control cell.The GDF analysis in the tumoral and metastatic variants, taking as a reference the cell lines derived from the previous generation, show that with the advance of tumor progression, there was an increase in the number of genetic alterations, both, in tumors and in metastasis. This increase in the detected instability correlates with a greater tumorigenic and metastatic ability of the cell lines. Nevertheless, the cell variants with a greater tumorigenic and metastatic ability show less genetic alterations. These results indicate that only some of the genetic alterations detected are responsible of the tumoral and metastatic phenotype. So, perhaps the alterations detected in the control cells are more random, and without biological significance. On the other hand, the overexpression of antiapoptotic genes could give the cells and inicial advantage, so the tumoral cell will be able to progress with less alterations, but more eficient ones.The genomic damage in metastasis with different organospecificity show a differential behaviour with regard to the organ of origin both, with regard to the number and the nature of the genetic alterations detected.Finally, we studied if the organospecificity of metastasis could be due to changes at gene expression level. These experiments have been performed using microarrays. After the analysis of the data, we have determined wich genes were associated to the metastatic ability of the cells. These genes will be those whose expression was modified simultaneously in the 4 metastatic variants studied. We have also determined wich genes were differentially expressed in lymh node metastasis, and those that were associated to bone metastasis.

Artritis reumatoidea Juvenil (ARJ) es una enfermedad inflamatoria crónica, autoinmune que afecta a mas de una articulación en lugar y numero. Es una de las enfermedades más comunes en la consulta pediátrica reumatológica y una de las menos estudiadas desde el punto de vista inmunogenetico. En la literatura se ha reportado varias asociaciones de (HLA) Antigenos de Leucocitos Humanos y ARJ con diferentes grupos étnicos, sobre todo con los antigenos HLA clase II: HLA-DR1 y DR4 asociándolos con el subgrupo clínico poliarticularLo contrario a la arthritis reumatoidea del adulto, la ARJ presenta variante clinicas el cual la hace mas interesante desde el punto de vista genetico (fenotipo). Desde el punto de vista patogénesis se han encontrado varios posibles factores que podrían estar en parte, determinados por alteraciones a nivel trimolecular compuesto por un antigeno putativo, el receptor del linfocito T CD4+ y las moléculas HLA.Este estudio se realizo en un grupo de mestizos Colombianos el cual contiene una mezcla génica de amerindio, europea y africana que padecían de ARJ. Se estudio la asociación de los antigenos de leucocitos humanos HLA-DRB1 y HLA -DQB1 en 65 pacientes con ARJ y 65 controles sanos de Colombia En resumen, en este estudio lo hallazgos encontrados fueron la presencia de los alelos HLADRB1*1104 y DRB1*1602 asociados como marcadores de susceptibilidad y los alelos HLA-DRB1*1501 y HLA DRB1*1402 se comportaron como alelos asociados con protección. Al comparar las asociaciones entre alelos y los diferentes subgrupos clínicos se encontró asociación entre ARJ oligoarticular con HLA-DRB1* 1104, ARJ poliarticular se asoció con el alelo HLA-DRB1* 0404 y en el grupo sistémico, el alelo más expresado fue el HLA-DRB1*1602. La presencia de Factor Reumatoide estuvo asociado con los alelos HLA-DRB1*0407 y HLA-DRB1*1302. En el grupo de pacientes con ANA+ solo hubo significancia estadística para el HLA-DRB1* 0701. El subgrupo poliarticular mostró asociación con la secuencia aminoacidica 70 QRRAA74 el cual incluye los alelos HLA DRB1*04, 01 y 1402. Con relación a la asociación haplotipos y subgrupos clínicos, se destacan dos nuevos hallazgos de interés: ARJ oligoarticular se asoció con el haplotipo cacausoide DRB1*1104, DQB1*0301, y el haplotipo amerindio DRB1*1602, DQB1*0602, con AR sistémico. Es de resaltar que le alelos DRB1 de estos dos haplotipos comparten el epitope 70 DRRAA 74. La información obtenida en nuestros pacientes mestizos colombianos son relevante s e importantes por que desde el punto de vista molecular a nivel de presentación antigénica el aminoácido 70 en el motivo 67-73 podría estar activando las células TH1 o TH2 el cual estaría comprometida en la patogénesis de la enfermedad.Nuestros resultados sugieren que los estudios de asociación y susceptibilidad con enfermedades llevados a cabo en poblaciones mestizas, deben considerar la carga genética mixta de estos grupos, étnicos con el objeto de evitar factores de estratificación genética. Nuestros estudios muestran que utilizando técnicas de alta resolución para la tipificación de los alelos HLA-DRB1 y DQB1 serian de gran información para la detección de epitopes específicos de los alelos HLA DRB1 el cual estarían participando no solo en la susceptibilidad a desarrollar ARJ en estos pacientes mestizos, sino también contribuyen en la expresión clínica de la enfermedad. / Juvenile rheumatoid arthritis is the most prevalent pediatric rheumatic diagnosis among children. The term designates a group of diseases that have in common chronic idiopathic inflammation of one or more joints. Substantial evidence points to an autoimmune pathogenesisThe clinical features are paralleled by immunogenetic characteristics that have been found to involve primarily, the major histocompatibility complex (MHC). There are over 50 series reporting HLA associations in JRA. The class II genes, HLA-DR1 and HLA-DR4, have been reported to increase risk for polyarticular JRA in many populations. Contrary to JRA the adult rheumatoid arthritis (RA), JRA has certain clinical variants which make it more interesting from the genetic point of view (phenotypes). In its pathogenesis several factors have been identified, which as a whole would explain the onset and the perpetuation of the inflammatory response affecting joints and nearby tissue as well as its imminent destruction given no control of it as in the case in other autoimmune diseases. The disease pathogenesis can be determined by alterations at the trimolecular level formed by a putative antigen the lymphocyte T receptor and the MHC.We studied the association of human leukocyte antigen HLA-DRB1 and HLA-DQB1 alleles and HLA haplotypes with juvenile rheumatoid arthritis in 65 patients and 65 controls from Colombia. The distribution of these alleles was examined in a group of Colombian mestizo children (genetic admixture of Amerindians, Europeans and Africans) suffering from clinically distinct JRA subsets in order Two alleles were associated with protection, HLA-DRB1*1501and HLA-DRB1*1402. HLA-DRB1*1602 was associated with susceptibility for systemic JRA and HLA-DRB1*1104 for pauciarticular JRA. The relationship between some HLA-DRB1 alleles and clinical features was also compared. The presence of rheumatic factor was associated with the alleles HLA-DRB1*0407 and HLA-DRB1*1302. There was also an association between HLA-DRB1*0701 with expressing ANA+. We found that in the expressed most commonly. In the polyarticular group, the alleles most frequently expressed were HLA-DRB1*0404. It is important to highlight that all the alleles linked to susceptibility share the Asp amino acid in position 70, and those shown as protection markers have Val in the same position.Amino acid sequences at residues 70-74 of DRB1 chain shared by HLA-DRB1 alleles (shared epítope) were also informative. The polyarticular JRA subset revealed association with 70QRRAA74, which includes HLA-DRB1*04, 01, and 70DRRAA74, which includes DRB1*1601, 1602, 1101, and 1104. Two new findings of interest were the association of the haplotypes DRB1*1104, DQB1*0301 with pauciarticular JRA and DRB1*1602, DQB1*0301 association with systemic JRA. The DRB1 alleles of these two haplotypes share the epítope 70DRAA74 and were associated with both the pauciarticular and the systemic subset of JRA. Our results suggest that studies of disease susceptibility in populations of admixed genetic background should take into account the contribution of different ethnic groups or nationalities in the recruitments of controls and patients studied in order to rule our genetic stratification.The information obtained from our findings in our series of Colombian patients are relevant and important because from the molecular point of view, at an antigenic presentation level, the amino acid in position 70 in the motif 67 to 73, at HLA molecule level, could activate TH1 or TH2 cells, which would be compromised in the immunopathology of this entity . Other genetic or/and environmental factors linked to these molecular characteristics expressed at the level of the HLA molecule and compromised in the antigenic response could interact and its result would be influencing the development and the expression of JRA In conclusion, our results demonstrated that the use of high-resolution typing for HLA-DRB1 and DQB1 alleles were informative for detecting specific epitopes of the HLA-DRB1 alleles to produce either protection from JRA susceptibility for pauciarticular or systemic subsets in Colombian mestizos.

La fresa es uno de los frutos con mayor cuota en la exportación de frutas y hortalizas en nuesto país. Sin embargo, la naturaleza octoploide de su genoma ha lastrado históricamente las investigaciones genéticas en esta especie. La fresa diploide constituye un excelente modelo para el estudio de las bases genéticas que gobiernan la calidad del fruto de fresa y de otras especies de la familia Rosaceae, dado que es una planta pequeña, de ciclo de vida corto, posee un genoma muy pequeño, es susceptible de ser transformada y regenerada con facilidad, se reproduce tanto de manera sexual como asexual y produce gran cantidad de descendientes en una sóla generación. Además, los genomas diploide y octoploide del género Fragaria presentan un alto grado de sintenia y colinearidad. Es por ello que en este trabajo de Tesis Doctoral se ha escogido Fragaria vesca como modelo para el desarrollo de herramientas genómicas encaminadas a localizar en su genoma los factores genéticos que determinan las principales características agronómicas y nutricionales que más interesan al sector fresero, de cara a la mejora genética de la especie. Este trabajo se compone de dos partes. En la primera parte se detalla el desarrollo de herramientas moleculares para el estudio del genoma de Fragaria diploide como la mejora del mapa genético de referencia del género, mediante la transformación de algunos marcadores moleculares en marcadores de tipo PCR y la incorporación de nuevos marcadores, la generación y caracterización de una genoteca de BACs para la confección de un mapa físico del género y el mapeo genético de genes candidatos, seleccionados para la calidad del fruto y obtenidos mediante la transferencia de marcadores del género Prunus al género Fragaria. En la segunda parte, se detalla el desarrollo de una serie de poblaciones segregantes generadas con objeto de crear una colección de líneas de introgresión a partir de las especies diploides Fragaria vesca var. ‘Reine des Vallées’ (conocida como Reina de los Valles en nuestro país) y la especie silvestre Fragaria bucharica. Esta colección de líneas ha sido obtenida tras dos rondas de retrocruzamientos seguidas de una autofecundación, mediante selección asistida por marcadores. La colección consta de 30 líneas cuyo genoma es esencialmente igual al del parental recurrente, F. vesca, a excepción de un segmento definido por marcadores moleculares, heredado del parental donante, F. bucharica. Cada una de las líneas posee un segmento o introgresión diferente, de manera que la suma de todas las introgresiones cubre más del 97% del genoma de Fragaria diploide. Las introgresiones tienen un tamaño medio de 43 cM, proporcionando una resolución media para el mapeo de 16,9 cM. Dado que la mayoría de las líneas ha heredado más del 90% del genoma del parental recurrente, y puesto que éste es un cultivar comercial, la genoteca presentada aquí es, además, un recurso precompetitivo que puede ser usado en mejora genética. La caracterización preliminar de algunas de las líneas obtenidas mediante el análisis de algunos caracteres agronómicos como el tiempo de floración, la fenología de la planta, la resistencia a enfermedades, así como el tamaño y la forma de sus hojas y frutos ha permitido identificar ciertas regiones genómicas que parecen estar controlando estos caracteres en el género Fragaria, demostrando que ésta colección de líneas de introgresión es una herramienta muy eficaz para la identificación y disección de caracteres complejos. Además, se ha localizado un nuevo locus implicado en la autoincompatibilidad asociada a algunas especies del género y se han desarrollado líneas que pueden propagarse vegetativamente ya que, pese a ser comercial, la variedad ‘Reine des Vallées’ no produce estolones.

El desarrollo y la progresión de los cánceres de mama, y especialmente de aquellos que son hormono-dependientes están ampliamente influenciados y determinados por los receptores de estrógenos y progesterona (ER y PR respectivamente). Aproximadamente un 70% de todos los cánceres mamarios son ER+ y más de la mitad también son PR+. Está aceptado ampliamente que el estado del ER es un importante factor predictivo de buena respuesta a las terapias endocrinas (TEs), sin embargo la positividad del ER no es una garantía de la sensibilidad al tratamiento ya que algunos tumores ER+ no presentan una buena respuesta. Las observaciones clínicas indican que los tumores ER+PR- presentan una pobre respuesta a la TE y un fenotipo más agresivo que los ER+PR+. El objetivo de este estudio es identificar diferencias genéticas entre los subtipos de tumores ER+PR+ y ER+PR-. La técnica de CGH-array fue aplicada a 25 tumores ER+PR+ y 23 tumores ER+PR-. Los genes de interés obtenidos a partir del análisis de los resultados de dicha técnica fueron analizados por la técnica de hibridación in situ fluorescente (FISH) en una serie de validación formada por 50 tumores ER+PR+ y 50 tumores ER+PR- localizados en varios arrays de tejidos (TMAs). Como resultado se observó que los tumores ER+PR- tienen un ligero pero diferente perfil genético respecto a los tumores ER+PR+. Los tumores ER+PR- presentaban un mayor perfil genómico aberrante, con los cromosomas 17 y 20 como los más diferentemente alterados con ganancias solapadas, y los cromosomas 3, 8, 9, 14, 17, 21 y 22 como los más diferentemente alterados con pérdidas solapadas respecto al grupo ER+PR+. Las regiones ganadas solapadas 17q23.2-q23.3 y 20q13.12, y las regiones perdidas solapadas 3p21.32-p12.3, 9pter-p13.2, 17pter-p12 y 21tel-q21.1 estaban alteradas de forma estadísticamente significativa en los tumores ER+PR-. Las regiones de pérdida incluyen genes (RASSF1A, FHIT, CDKN2A, TP53 y BTG3) con funciones supresoras de tumores y están involucrados en apoptosis, mitosis, angiogénesis y dispersión celular. Mientras que las regiones de ganancia incluyen genes (MAP3K3, RPS6KB1 y ZNF217) involucrados en el control del ciclo celular, angiogénesis, resistencia a la apoptosis, metástasis y dispersión celular y en la activación de las vías de señalización de la PI3K/Akt/mTOR. Todas estas alteraciones podrían contribuir, al menos en algunos casos, a explicar la mayor inestabilidad genómica, la pérdida de la expresión del PR, el fenotipo más agresivo y la mayor resistencia a las ETs, todo ello tradicionalmente observado en los tumores ER+PR-. / Development and progression of all types of breast cancer, and especially the hormone-dependent ones are widely influenced and determined by estrogen and progesterone receptors (ER and PR, respectively). Approximately 70% of all breast cancers are ER+ and more than half of them are also PR+. It is widely accepted that ER status is a strong predictive factor of good response to endocrine therapy (ET), but ER positivity is not a guarantee of sensitivity to the treatment and some tumors fail to respond. Clinical observations indicate that ER+PR- breast cancers present a poorer response to ET and more aggressive phenotype than ER+PR+ ones. The aim of this study was to identify genetic differences between ER+PR+ and ER+PR- subgroups. An array CGH technique was applied to 25 ER+PR+ breast tumors and 23 ER+PR- ones. Genes of interest were analyzed by Fluorescence in situ hybridization (FISH) in a validation series composed by 50 ER+PR+ tumors and 50 ER+PR- ones on TMAs. As a result, it was observed that ER+PR- breast tumors have a smaller but different genetic profile. ER+PR- group presented a higher genomic aberrant profile with chromosomes 17 and 20 as the most differently altered with overlapped gains, and chromosomes 3, 8, 9, 14, 17, 21 and 22 as the most differently altered with overlapped losses respect to ER+PR+ group. The overlapped gained regions 17q23.2-q23.3 and 20q13.12, and the overlapped lost regions 3p21.32-p12.3, 9pter-p13.2, 17pter-p12 and 21tel-q21.1 were found in a significant way in ER+PR- breast tumors. Significant lost regions included genes (RASSF1A, FHIT, CDKN2A, TP53 and BTG3) with tumor suppressor functions and involved in apoptosis, mitosis, angiogenesis and cell spreading. Significant gained regions included genes (MAP3K3, RPS6KB1 and ZNF217) involved in cell cycle control, angiogenesis, resistance to apoptosis, metastasis and cellular spread, and activation of PI3K/Akt/mTOR pathways. All these alterations could contribute, at least in some cases, to explain the higher genomic instability, loss of PR expression, more aggressive phenotype and higher resistance to ETs, traditionally observed in ER+/PR- tumors.

El cromosoma humà 21 (HSA21), és el cromosoma autosòmic humà més petit. La trisomia total o parcial del HSA21 està associada a síndrome de Down (SD). El fet de tenir la seqüència del HSA21 pràcticament complerta, ha accelerat molt el procés d'identificació de gens, pas previ per a l 'establiment de relacions causa-efecte entre els gens del HSA21 i els fenotips clínics de la SD.L'objectiu final d'aquesta tesi és la identificació i caracterització de nous gens del HSA21. Els resultats obtinguts es poden resumir en :· S'ha participat en la construcció d'un contig de cosmidis de tres regions del HSA21, cobrint al voltant de 3 Mb. · S' ha participat en la construcció d'un mapa transcripcional de les tres regions. Es va realitzar una selecció de cDNAs, aïllant en total 45 cDNAs parcials no redundants, dels quals 25 no mostraven similitud amb cap seqüència de les bases de dades. Tots s'expressaven en una barreja de RNA poliA+ de cervell, pulmó, fetge i ronyó fetals. Els intents d'aïllar els cDNAs complerts corresponents a cada un dels clons varen resultar negatius. · S' ha aïllat un nou gen del HSA21, KCNE2, identificat inicialmente mitjançant una anàlisi computacional de la seqüència genòmica AP000052. El cDNA complert té 850 pb. KCNE2 codifica per a una proteïna de 123 aa amb elevada homologia a KCNE1, una subunitat ß de canals de potassi depenents de voltage. L'estructura genòmica té un únic exó codificant i mapa a 21q22.1. KCNE2 s'expressa com un RNA de 1.2 kb, majoritàriament a estómac. La seqüència de la proteína KCNE2 conté 2 llocs consens de N-glicosilació, es prediu una regió transmembrana i un lloc consens de fosforilació per PKC. En experiments de western amb extractes de cèl·lules de mamífer transfectades, la proteïna es detecta com a tres bandes entre 16 kDa i 20 kDa, essent la més petita la del pes molecular esperat. Experiments amb tunicamicina han demostrat que KCNE2 es glicosila en asparagines, in vivo. Es van generar dos mutants en els llocs consens de glicosilació, N6Q i N29Q, que han demostrat que ambdós llocs són susceptibles de ser glicosilats. Experiments d'immunofluorescència indirecta suggereixen que KCNE2 s'inserta en la membrana amb el seu extrem N-terminal cap al medi extracel·lular i que amb un únic residu glicosilat n'hi ha prou per integrar-s'hi. Experiments de RT-PCR semiquantitativa indiquen que no hi ha sobre-expressió en SD ni de KCNE1 ni de KCNE2, a cors fetals SD. Es van buscar mutacions a KCNE2 en pacients de sordesa no sindròmica i es va trobar un canvi de nucleòtid A22G, que dóna lloc a un canvi d'aminoàcid T8A. Aquest canvi afectaria el punt de glicosilació.· Es va identificar un nou gen, por homologia a KCNE1 i KCNE2, al qual se li va donar el nom de KCNE3. El cDNA complert té 1646 pb i conté una pauta de lectura oberta de 103 aa. L'estructura genòmica és similar a la de KCNE1 i KCNE2, amb un únic exó codificant, per tant podria tractar-se d'una família de gens paràlegs. KCNE3 es va mapar a la regió 11q13-14, utilitzant el pannell d'híbrids de radiació G3 d'Stanford. KCNE3 s'expresa com a un mRNA de 3 Kb a colon, intestí prim, ovari i a sang perifèrica. La seqüència de aminoácidos conté 3 llocs consens de N-glicosilació, es prediu una regió transmembrana i un lloc consens de fosforilació per PKC. S' ha demostrat que KCNE3 es N-glicosila en cèl·lules de mamífer i que s'inserta a la membrana amb l'extrem N-terminal dirigit cap al medi extracel·lular. S'ha trobat un polimorfisme T198C, que provoca el canvi d'aminoàcid F66L, amb una freqüència del 15% en la población general.

The process that gives rise to all the mature blood cells from the HSCs (Hematopoietic Stem Cells) is known as hematopoiesis. In the adult, hematopoiesis takes place in the bone marrow although the HSCs are likely generated during embryonic life (reviewed in Cumano and Godin, Ann. Rev. Immunol 2007). Mouse embryonic hematopoiesis starts at embryonic day 7-7.5 in the extraembryonic yolk sac, whereas intraembryonic hematopoiesis starts at 9.5 in the aorta surrounded by gonad and mesonephros (a region known as AGM). The current knowledge is that both hematopoietic tissues can generate either pre-HSCs or adult HSCs that will seed the fetal liver by day 12 (that expands the pool of HSCs) and finally, near birth, the bone marrow, which will sustain adult-life hematopoiesis (reviewed in Cumano and Godin, Ann. Rev. Immunol, 2007). The Notch signaling pathway regulates tissue homeostasis and development not only in the embryo but in the adult as well (reviewed in Lai, Development 2007). Notch controls proliferation, differentiation and cell death in a wide variety of tissues including the nervous system, the vascular system and the hematopoietic system. In the latter, Notch has been described to regulate HSC proliferation, cell fate decisions and inhibition/induction of programmed cell death by apoptosis (reviewed in Radtke, Febs Letters 2006). Our results from the analysis of knock-out mice for some of the members of the Notch signaling pathway such as RBPjk (Oka, Development 1995), Jagged1 (Xue, Hum Mol Genet 1999) and Jagged2 (Jiang, Genes Dev 1998) and the usage of pharmacological inhibitors such as DAPT or L-685, indicate that Notch is dispensable for yolk sac hematopoiesis, although induces cell death by apoptosis in the compartment of erythroid Ter119+ cells generated in this tissue (Robert-Moreno, Leukemia 2007). On the other hand, Notch signaling pathway is required for the generation of hematopoietic progenitors and HSCs in the AGM since directly regulates the expression of the hematopoietic transcription factor GATA2 (Robert-Moreno, Development 2005). Finally, we propose that Notch activation through the ligand Jagged1 (but not Jagged2) is required for the activation of GATA2 expression and the generation and/or amplification of a pool of HSCs with high repopulation ability (Robert-Moreno, manuscript in preparation). / El procés de generació de cèl.lules sanguínies madures a partir de les cèl.lules mare hemopoètiques o HSCs (de l'anglès Hematopoietic Stem Cells) rep el nom d'hemopoesi. A l'adult, l'hemopoesi ocòrre en el moll de l'òs tot i que es creu que les HSCs es generen durant el desenvolupament embrionari (revisat a Cumano y Godin, Ann. Rev. Immunol 2007). En el ratolí l'hemopoesi embrionària comença a dia 7-7.5 de gestació, en el sac extraembrionari, mentres que a dia 9.5 comença l'hemopoesi intraembrionària en l'aorta rodejada de gònada i mesonefros (regió denominada AGM). Actualment, es creu que ambdós teixits hemopoètics són capaços de generar pre-HSCs o HSCs adultes, que colonitzaran el fetge fetal a dia 12 de gestació (amplificant-se el nombre de HSCs) i finalment, prop del naixement, el moll de l'òs, on donaran lloc als diferents tipus cel.lulars hemopoètics durant la vida adulta (revisat a Cumano y Godin, Ann. Rev. Immunol, 2007). La via de senyalització cel.lular a través del receptor de membrana Notch regula processos d'homeostasi i desenvolupament de teixits, tant en l'embrió com en l'adult (revisat a Lai, Development 2007). La via de Notch controla processos de proliferació, diferenciació i mort cel.lular en teixits tant diferents com el sistema nerviós central, sistema vascular o el sistema hemopoètic. En aquest últim, s'ha descrit funcions de Notch en la proliferació de cèl.lules mare, presa de decisions de destí cel.lular o prevenció i/o inducció de mort cel.lular per apoptosi (revisat a Radtke, Febs Letters 2006). Els nostres resultats mitjançant l'anàlisi de ratolins mutants en alguns dels components de la via de Notch, com RBPjk (Oka, Development 1995), Jagged1 (Xue, Hum Mol Genet 1999) i Jagged2 (Jiang, Genes Dev 1998) i l'ús d'inhibidors farmacològics de la via de Notch (tals com DAPT i L-685) indiquen que la via de Notch no és indispensable per l'hemopoesi del sac embrionari, tot i que regula l'homeostasi en el compartiment de cèl.lules eritroides Ter119+ que es generen en aquest, mitjançant la inducció de mort cel.lular programada o apoptosi (Robert-Moreno, Leukemia 2007). En canvi, la via de Notch és requerida per la generació de progenitors hemopoètics i HSCs en la regió de l'AGM i demostrem que aquest procés és degut a que Notch1 regula directament l'expressió del factor de transcripció GATA2 en les cèl.lules endotelials de la paret ventral de l'aorta (Robert-Moreno, Development 2005). Finalment, també proposem que l'activació del receptor Notch a través del lligand Jagged1 (però no Jagged2) és necessària per l'activació de l'expressió de GATA2 i la generació i/o amplificació de HSCs amb gran capacitat repobladora (Robert-Moreno, manuscrit en preparació).

Sp1 i Sp3 pertanyen a la família de factors de transcripció Sp que controla la transcripció de gens implicats en gairebé tots els processos cel.lulars. Estudis previs al nostre grup van estudiar la regulació del promotor del gen Sp1 i van demostrar que la transcripció de Sp1 estava regulada principalment de forma positiva per Sp1 i NF-Y, i que Sp3 era capaç de contrarrestar l'activació produïda per Sp1 sobre el seu propi promotor. Donat que la relació Sp1/Sp3 a la cèl·lula és important per a la regulació dels gens diana, en aquest treball ens vam proposar estudiar la regulació del promotor de Sp3.Vam clonar una regió de 546 bp que corresponia al promotor de Sp3 i vam procedir a la seva caracterització. Sp3 presenta múltiples inicis de transcripció localitzats entre les posicions -132 i -70 respecte de l'inici de traducció i la seva màxima activitat promotora es localitza a la regió fins a -281bp respecte de l'inici de traducció. Mitjançant les tècniques de retardament de la movilitat electroforètica (EMSA) i Immunoprecipitació de la Cromatina (ChIP) hem demostrat la unió dels factors Sp1, Sp3, NF-Y, NF-1, c-Myb, B-Myb i c-Jun al promotor de Sp3. D'altra banda hem estudiat l'efecte de la sobreexpressió i la inhibició d'aquestes proteïnes sobre l'activitat d'aquest promotor utilitzant assajos d'activitat luciferasa, i sobre els nivells endògens de mRNA utilitzant RT-Real Time-PCR. Sp3 activa la transcripció del seu propi promotor. El promotor de Sp3 també és activat de forma més potent per Sp1, Sp3 i NF-Y; tot i que NF-1, c-Myb, B-Myb, c-Jun i c-Fos també poden activar aquest promotor. Un altre fet remarcable és que E2F1 es comporta com a repressor del promotor de Sp3. Tots els resultats observats a nivell de l'activitat del promotor es van confirmar amb la mesura dels nivells endogens de mRNA per Sp3.Addicionalment, s'ha estudiat la interacció de Sp1 amb diferents proteïnes implicades en la regulació del cicle cel·lular i s'ha caracteritzat l'efecte de la seva sobreexpressió sobre l'activitat del promotor de Sp1, ja que està regulat per Sp1. Utilitzant un array d'anticossos, es va fer un cribatge de proteïnes que poguessin interaccionar amb Sp1, i algunes d'elles es van confirmar per co-immunoprecipitació. Això ens va permetre demostrar que Sp1 és capaç d'interaccionar amb CDK4, p21, SKP2 i BRCA2. Posteriorment, vam analitzar l'efecte d'aquestes i altres proteïnes que interaccionen amb Sp1 sobre el promotor de Sp1, i vam observar que el promotor de Sp1 és regulat de forma positiva per la sobreexpressió de CDK4, SKP2, BRCA2, Ciclina D1, E2F1/DP1 i Stat3; mentre que és reprimit per la sobreexpressió de p53 i NFB. Per tal d'analitzar si hi havia una correlació entre els efectes sobre el promotor de Sp1 i una alteració dels nivells endogens de Sp1, vam confirmar tots els efectes observats a nivell de l'activitat del promotor tot emprant la tècnica de RT-Real Time-PCR. A més, els efectes sobre el promotor de Sp1 es produeixen mentre aquestes proteïnes estan unides, directa o indirectament, al promotor tal com van demostrar els assajos de ChIP. També vam estudiar l'efecte de la sobreexpressió d'aquestes proteïnes sobre un promotor que només contenia caixes Sp1 i, en general, vam observar efectes equivalents als observats per al promotor de Sp1. La interacció entre Sp1-p21 va ser objecte d'estudi en més detall i vam determinar que l'expressió de p21 en cèl·lules de fibrosarcoma indueix el promotor de Sp1 així com els nivells de mRNA, però, al mateix temps, indueix la degradació de Sp1.Com a conclusió final, hem vist que el procés de transcripció és un mecanisme molt complex que involucra un gran número de factors de transcripció, així com d'altres proteïnes que puguin interaccionar amb aquests factors. / Sp1 and Sp3 belong to the Sp family of transcription factors that controls transcription of genes involved in almost all processes in the cell. We performed a detailed analysis of the promoter region of the Sp3 transcription factor, including the identification of its transcriptional start sites and the putative binding sites for transcription factors. Multiple transcriptional starts sites were located at position sranging from -70 to -132 relative to the translational start of the gene. We defined the minimal promoter region cooresponding to 281 bp relative to the translational start. Along the promoter sequence we demonstrated the binding of Sp1, Sp3, NF-Y, NF-1, c-Myb, B-Myb and c-Jun. Moreover, we studied the effect of the overexpression or knocking down of these factors on the Sp3 promoter activity and the endogenous mRNA levels. Sp3 is positively autoregulated and it is also activated by Sp1, NF-Y, Myb, AP-1 and NF-1. On the contrary, Sp3 transcription is repressed by E2F/DP1 overexpression.Additionally, we studied the interaction of Sp1 with other proteins involved in the cell cycle regulation and we characterized the effect the overexpression of these proteins on the Sp1promoter activity, given that this promoter is regulated by Sp1. Sp1 is able to interact with CDK4, p21, SKP2 and BRCA2. The Sp1 promoter is positively regulated by the overexpression of CDK4, SKP2, BRCA2, Ciclina D1, E2F1/DP1 and Stat3 whereas the overepression of p53 and NFB represses the promoter. The effects of all these proteins were also analyzed at the Sp1 mRNA level and by using an artificial promoter containing only Sp1 binding sites. The interaction between Sp1 and p21 was further analyzed and we demonstrated that, in fibrosarcoma cells, p21 induces the Sp1 promoter and its mRNA expression but, at the same time, it induces the degradation of Sp1 protein.The process of transcription is a very complex mechanism that involves a great number of transcription factors and other proteins interacting with these factors.

Es coneix com era post-genòmica els anys posteriors a la seqüenciació massiva dels genomes d'organismes i espècies superiors (entre elles la humana) i que ens permeten per primer cop, tenir una visió global dels mecanismes biològics que regulen la vida de cèl·lula. En aquests primers anys d'aquesta nova era, s'ha donat especial rellevància a la identificació i estudi funcional de motius de seqüència en el genoma, assumint la hipòtesi que la capa física (la molècula d'ADN) es un mer suport per a un codi que és interpretat per la cèl·lula. El treball exposat en aquesta memòria posa en relleu la importància del nivell físic de l'ADN (ja sigui en la molècula de doble hèlix o en estructures d'ordre superior), en tots els aspectes funcionals de la molècula. Els resultats exposats en les publicacions científiques que integren aquest treball es demostra la relació entre la estructura de l'ADN i les regions reguladores dels gens (els promotors). Es prova també la viabilitat de l'ús d'estructures no canòniques de l'ADN (com per exemple les triple hèlices) en teràpies anti-gèniques. Finalment es descriu la implementació d'una plataforma bioinformàtica que permet per primer cop, l'estudi dels factors fisicoquímics en escala genòmica. / The post-genomics era is known as the years before the massive sequencing of genomes (the human between others) and that allow us for the first time have a global vision of biological systems that regulates the cellular activity. The main studies of the first years of this new era prioritized the identification of sequence motives and the study of their functionality, assuming the hypothesis that the physical layer behind (the DNA molecule) is just a support for code that is interpreted by the cell.The work presented in this document highlight the relevance of the DNA physical layer (from the double helices to higher level structures and chromatin) in all the cellular aspects.The results of this thesis prove the relationship between DNA structure and gene regulatory regions (the promoters). The feasibility of using non-canonic DNA conformations (as DNA triple helices) in anti-gene therapies is also shown. Finally the implementation of a bioinformatics platform to study for the first time the physicochemical factors of DNA at genomics scale is described.