La infecció pel VIH ha esdevingut una malaltia crònica gràcies a la introducció del tractament antiretroviral. Tot i la disminució de la mortalitat, la incidència de complicacions metabòliques relacionades amb el tractament i la infecció adquireixen cada cop més rellevància clínica. La infecció pel VIH promou un estat pro-oxidatiu que afavoreix la mateixa replicació viral i l'aparició d'alteracions metabòliques com l'aterosclerosi o la lipodistròfia. L'aterosclerosi és reconeguda com una malaltia inflamatoria crònica. La paraoxonasa-1 (PON1) és un enzim associat a les lipoproteïnes d'alta densitat (HDL) que li confereix gran capacitat antioxidant. Tot i que el seu sustrat fisiològic encara no es coneix, s'ha estudiat el seu rol protector en diverses malaties cròniques. Per aquesta raó creiem interessant investigar la possible funció d'aquest enzim antioxidant en la evolució immunològica i virològica de la infecció pel VIH i així també en l'aparició de complicacions metabòliques com l'aterosclerosi. / HIV infection has become a chronic disease since introduction of antiretroviral treatments. Despite the decline in mortality, the incidence of metabolic complications related to treatment and the infection itself are becoming more relevant. HIV infection promotes a pro-oxidative status that favors viral replication and the emergence of the metabolic disorders such as atherosclerosis and lipodystrophy. Atherosclerosis is recognized as a chronic inflammatory disease. The paraoxonase-1 (PON1) is an enzyme bound to high-density lipoprotein (HDL), which confers high antioxidant properties. Although its physiological sustrat is not yet known, it has been studied its protective role in several chronic diseases with an increase in oxidative stress and atherosclerosis. For this reason we believe is of interest to investigate the possible role of this antioxidant enzyme in the immunological and the virological evolution of HIV infection and in the apparition of metabolic complications such as atherosclerosis.

En la presente tesis se ha pretendido avanzar en el conocimiento de la resistencia al virus de la tristeza de los cítricos (CTV) con el propósito de diseñar estrategias de mejora más eficientes.En este trabajo se ha obtenido un nuevo grupo de marcadores moleculares derivados de retrotransposones del tipo gypsy y se ha analizado la presencia, heterogeneidad y distribución de dichos elementos en especies de los géneros Citrus y Poncirus. A partir de una variedad de mandarino clementino se han aislado ocho clones que contienen una parte de la región codificante POL de los retrotransposones tipo gypsy. El análisis de sus secuencias parece indicar que cuatro de estos clones corresponden a elementos potencialmente activos, puesto que presentan intactos, sin codones de paro ni desplazamiento de la pauta de lectura correcta, todos los motivos conservados indispensables para la retrotransposición. En la mejora genética de cítricos uno de los principales objetivos es la resistencia a CTV. La tristeza de los cítricos es la principal virosis que afecta al cultivo de los cítricos en el mundo. La obtención de plantas resistentes a su agente causal (CTV) sería la forma más adecuada de combatir la enfermedad. P. trifoliata es una especie resistente al virus y sexualmente compatible con las especies del género Citrus, por lo que tradicionalmente en los programas de mejora de cítricos se le ha considerado como la mejor candidata para transferir su resistencia a los cítricos cultivados. Varios estudios anteriores han definido la resistencia de P. trifoliata a CTV como un carácter controlado por un único gen (Ctv-R) con el objetivo de obtener cítricos comerciales resistentes al virus a partir de la transformación genética con el gen de resistencia a CTV. En la presente tesis se ha saturado con distintos tipos de marcadores moleculares la región donde previamente se había situado Ctv-R. Para ello se han utilizado dos familias segregantes derivadas de P. trifoliata, una por autopolinización y la otra por cruce con C. aurantium (naranjo amargo), un patrón bien adaptado a las condiciones semi-áridas típicas de la cuenca mediterránea. El seguimiento de la infección con CTV en la familia AxPa ha proporcionado resultados sorprendentes. Amargo resulta tan resistente al aislado del virus ensayado (T-346) como P. trifoliata. Los mapas saturados resultantes de este estudio se han utilizado para localizar la resistencia al virus bajo la hipótesis de transmisión monogénica. El análisis genético de la interacción virus-planta en la familia AxPa tras la infección crónica con CTV ha revelado cinco tipos distintos de interacción lo cual es incompatible con la hipótesis de un sólo gen de resistencia. Los resultados obtenidos indican que la transferencia del gen Ctv-R de P. trifoliata al naranjo amargo podría no evitar los síntomas típicos de decaimiento ("decline") en naranjo dulce injertado sobre este nuevo patrón.Los mapas saturados obtenidos con anterioridad en este trabajo se han utilizado para localizar la resistencia a CTV considerándola como carácter cuantitativo (acumulación de virus) mediante análisis de QTLs ("quantitative trait loci"), evitando así la asunción de control monogénico de la resistencia. Los resultados revelan la presencia de tres QTLs de resistencia principales, dos en P. trifoliata y uno en naranjo amargo, en la región donde se había localizado Ctv-R en otras progenies. Además, se han detectado otros QTLs de acumulación donde se localizan genes de menor efecto. También se han detectado interacciones epistáticas implicadas en el control genético del carácter. / Citrus is an extensively apomictic genus and transposable elements might be importantly involved in its genetic instability and genome evolution. The presence of gypsy-like retrotransposons, their heterogeneity and genomic distribution in Citrus and Poncirus have been investigated. Eight clones containing part of the POL coding region of gypsy- like retrotransposons have been isolated from a commercial variety of C. clementina, one of the few sexual species in Citrus. Four of the eight clones might correspond to active elements given that they present all the conserved motifs described in the literature as essential for activity, no in-frame stop codon and no frame-shift mutation. Nested copies of gypsy-like elements are scattered along the Citrus and Poncirus genomes. IRAPs based on gypsy and copia types of retrotransposons seem to distribute differently providing a new, complementary set of molecular markers now available in Citrus to study and follow genetic variability, specially for disease resistance. Several studies have reported markers linked to a putative resistance gene from Poncirus trifoliata (Ctv-R) located at linkage group 4 that confers resistance against one of the most important citrus pathogens, citrus tristeza virus (CTV). Two progenies derived from P. trifoliata, by self-pollination and by crossing with sour orange, the well-adapted citrus rootstock to arid and semi-arid areas, were used for linkage group 4 marker enrichment. Two new methodologies were used to enrich this region with expressed sequences. The enrichment of group 4 resulted in the fusion of several C. aurantium linkage groups. Surprisingly, sour orange resulted as resistant to the CTV isolate tested as P. trifoliata was. The genetic analysis of virus-plant interaction in the family derived from C. aurantium after a CTV chronic infection showed the segregation of five types of interaction which is not compatible with the hypothesis of a single gene controlling resistance. Transferring Ctv-R from P. trifoliata to sour orange might not avoid the CTV decline of sweet orange trees. Resistance against CTV was analysed as a quantitative trait (CTV accumulation) by QTL analysis to avoid the assumption of monogenic control. Three major resistance QTLs were detected. Up to 5 minor QTLs were also detected.

Una de les classes de gens més interessants d'estudiar des del punt de vista de la biologia del desenvolupament són els gens Hox. Durant el desenvolupament embrionari dels Metazous els gens Hox són els encarregats d'establir les posicions dels territoris del cos al llarg de l'eix antero-posterior. Així, els gens Hox són els que determinen on és el cap, on la cua, i on els apèndix en els diferents animals. Tots els animals tenen aquesta mena de gens, essent una sinapomorfia dels Metazous. Aquests gens codifiquen per uns factors de transcripció amb un domini d'unió al DNA, l'Homeodomini, que els dóna la seva funcionalitat. En aquells fílums on s'han trobat gens Hox, aquests s'han vist organitzats en el genoma formant un cluster o agrupació de gens, posicionant-se de forma linial i consecutiva.El regne animal està format per dos grups ben diferenciats d'organismes. Aquells denominats triblàstics són els que tenen simetria bilateral, on el seu cos es pot dividir en un pla sagital quedant dues meitats especulars. En aquest grup es situen els Lofotrocozous (anèl.lids, moluscs, platihelmints, .), els Ecdisozous (nemàtodes i artròpodes majoritàriament) i els deuteròstoms (ammb equinoderms i cordats). L'altre grup, amb molts menys representants, són els Radials, amb cnidaris, ctenofors i esponges.S'ha vist que la història evolutiva dels gens Hox va lligada a l'aparició dels diferents tipus d'animals a la terra, i que la seqüència, nombre i ordenació d'aquests gens en cada fílum poden donar una bona visió d'aquesta evolució. Fins l'actualitat s'han trobat gens Hox a tots els animals triblàstics en els que s'han buscat. A partir de l'homologia de seqüències entre diferents representants dels diferents grups s'ha pogut inferir quin ha estat el camí fins a formar el cluster Hox actual. Es postula que a partir d'un gen Hox ancestral (UrProtoHox) que hauria patit una sèrie de duplicacions es va formar un cluster ancestral de 4 gens (cluster ProtoHox). Aquest va patir una duplicació formant dos clusters germans, el Hox primitiu, de 4 gens, i el ParaHox, de tres gens. El cluster Hox primitiu va patir, a mesura que apareixien els diferents grups en l'arbre filogenètic, una expansió en la seva dotació gènica, augmentant el nombre de gens Hox en els grups més nous.Un grup de cucs plans classificats clàssicament com a platihelmints, els Acelomorfs, han estat postulats com a no formant part d'aquest fílum sinó com éssent a la base dels bilaterals. Basant-nos en aquesta possible posició basal dels Acelomorfs, vam plantejar-nos trobar la dotació Hox i ParaHox d'aquests animals. Si els gens que poseeixen actualment aquests organismes són aquells que posseien ancestralment, trobar-los correspondria a trobar els clusters ancestrals. De l'estudi dels gens Hox i ParaHox hem trobat que els Acelomorfs poseeiexen una dotació Hox reduida en nombre, però amb totes les classes esperades. Així, poseeixen una dotació Hox amb un gen anterior, un central i un posterior, i una dotació ParaHox amb un gen Xlox i un Caudal. No s'han trobat representants Hox PG3 ni ParaHox Gsh, bé per problemes tècnics o perquè secundàriament s'hagin perdut en aquest grup. Tot i això, concluim que els Acelomorfs tenen una dotació Hox i ParaHox ancestral, essent coherent amb la proposada posició basal del grup i amb les teories postulades d'evolució dels gens Hox i ParaHox.

Els antiinflamatoris no esteroidals (AINEs) són fàrmacs que actuen inhibint l'activitat de les dues issoformes de l'enzim ciclooxigenassa (COX-1 i COX-2) i s'utilitzen principalment en clínica pel tractament del dolor i la inflamació, tot i que també s'ha descrit el seu ús com a antitumorals. El principal inconvenient d'aquests compostos és que el seu ús regular causa efectes secundaris, en gran part com a conseqüència de la inhibició de COX-1. Per a resoldre aquest problema, s'han desenvolupat compostos que inhibeixen específicament COX-2 de manera que, mantenint els efectes terapèutics conseqüència de la inhibició de COX-2, redueixen els efectes adversos causats per la inhibició de COX-1. El mecanisme d'acció d'aquests compostos com antitumorals no està ben establert i és actualment objecte de molta controvèrsia. Mentre que alguns autors defensen que el seu efecte antitumoral seria causat per la inhibició de COX-2, d'altres recolzen que actuarien a través de mecanismes independents.En aquesta tesi doctoral, s'ha estudiat el mecanisme d'acció de diversos compostos inhibidors selectius de COX-2 en cèl·lules de carcinoma de còlon humà. D'una banda, s'ha determinat que l'activitat antitumoral d'aquests compostos, in vitro, és independent de la capacitat d'inhibició de l'enzim COX-2. Així, compostos amb la mateixa capacitat d'inhibició de l'enzim presenten diferent activitat antitumoral mentre que, compostos d'estructura relacionada que no inhibeixen COX-2 són efectius com antitumorals. D'altra banda, els nivells d'expressió i activitat de COX-2 de les cèl·lules tampoc condicionen la seva sensibilitat als compostos. En conseqüència, l'efecte antitumoral dels inhibidors selectius de COX-2 és independent de la inhibició de l'enzim.A continuació, s'ha estudiat el mecanisme d'acció "in vitro" del Celecoxib, un inhibidor selectiu de COX-2 utilitzat en clínica. El Celecoxib indueix apoptosi, caspassa dependent, en cèl·lules de carcinoma de còlon humà. La inducció d'apoptosi es dóna per la via mitocondrial amb sobreexpressió de Bax, alliberament de citocrom c de la mitocòndria i activació de la caspassa iniciadora 9 i de les caspasses executores 3 i 7. A més, el Celecoxib altera les proteïnes de les adhesions focals produint la pèrdua d'ancoratge de les cèl.lules i, en conseqüència, la mort de les cèl·lules per Anoikis. Una de les principals alteracions produïdes pel Celecoxib és la proteolisi de p130Cas generant un fragment de 31KDa que és translocat al nucli. La localització nuclear del fragment de 31KDa podria tenir un paper rellevant en la inducció de l'apoptosi en regular de transcripció de determinats gens com p21WAF/CIP1. A més, la sobreexpressió de p130Cas silvestre redueix, en part, l'efecte del Celecoxib posant de manifest la importància d'aquesta proteïna en l'efecte del Celecoxib.D'altra banda, també s'ha estudiat l'efecte del Celecoxib in vivo, en un model de xenotrasplantament en ratolins atímics. S'ha implantat un tumor provinent d'un carcinoma de còlon humà en localització subcutània i ortotòpica (en el mateix òrgan del qual deriva el tumor) en ratolins atímics. El lloc d'implantació no altera l'efecte del fàrmac ja que en ambdós casos el tractament diari, amb 150mg/Kg de Celecoxib per via oral durant 16 dies, redueix el volum tumoral final. El mecanisme d'acció del fàrmac varia depenent del lloc d'implantació del tumor. En els tumors implantats subcutàniament, el Celecoxib indueix necrosi macroscòpica i microscòpica. En el tumors ortotòpics, l'efecte del Celecoxib és similar a l'observat in vitro, doncs indueix apoptosi amb activació de la caspassa-9 i desregulació de proteïnes de les adhesions focals.Finalment, s'han desenvolupat nous compostos d'estructura química relacionada amb el Celecoxib que també tenen activitat antitumoral in vitro essent alguns d'ells més efectius que el Celecoxib. L'efecte antitumoral d'aquests nous compostos és independent de la seva capacitat d'inhibició de COX-2 i es dóna per un mecanisme d'acció similar al del Celecoxib

Els gens que formen el cluster ParaHox són factors de transcripció, que a l'origen dels metazous s'originaren per duplicacions d'un gen ancestral comú amb homeodomini. A l'origen dels vertebrat i per duplicacions cromosòmiques o del genoma sencer, aquest cluster es duplicà formant fins a quatre clusters. En el genoma humà trobem un cluster sencer format pels gens Cdx2/3, Pdx1 i Gsh1 en el cromosoma 13 humà. El gen Gsh2 es troba en el cromosoma 4. Cdx4 en el cromosoma X i Cdx1 en el cromosoma 5. La hipòtesi de treball a l'inici d'aquesta recerca (abans de la seqüenciació del genoma humà) era que existien, molt probablement, d'un a tres gens paràlegs a Pdx1 en el genoma humà, que no havien estat identificats. Les estratègies utilitzades basades en la cerca per homologia de seqüència entre els gens duplicats, portà a l'aillament repetides vegades de Pdx1. Finalment la publicació del genoma humà confirmà la no existència de gens Pdx1 duplicats identificables en el genoma humà. Ja que la majoria d'estudis fets sobre l'expressió dels gens ParaHox s'havien realitzat en embrions, es va decidir analitzar l'expressió dels gens ParaHox en diversos teixits adults de ratolí. Això va permetre descriure l'expressió de Pdx1 en testicle; Cdx1 s'expressa a pulmó i muscle i a nivells baixos a cervell; Cdx2/3 a testicle, fetge, pulmó, muscle i també, a nivells baixos a cervell; Cdx4 s'expresa en tots els teixits adults analitzats menys en muscle; finalment tan Gsh1 com Gsh2 s'expressen a testicle i a cervell. Per tal de veure si els gens ParaHox podien estar implicats en la regulació de l'homeostasi de la glucosa de l'organisme adult, es va analitzar la seva expressió en el pàncrees del ratolí adult, utilitzant les tècniques de hibridació in situ, i es va confirmar la seva expressió en el pàncrees endocrí. Per analitzar en quin tipus cel.lular dels illots s'expressava es va realitzar una doble immunodeteció amb els anticossos anti-insulina i anti-glucagó i es va confirmar l'expressió en cèl.lula "alfa" de tots els gens ParaHox. El gen Pdx1 a més d'expressar-se en les cèl.lules "beta" tal com ha estat ampliament descrit, s'expressa en cèl.lules de la perifèria positives pel glucagó, i en algunes cèl.lules aquest marcatge queda retingut a nucli proposant un procés de regulació postranscripcional o pretraduccional. Finalment per tal d'analitzar l'acció que els gens ParaHox podien tenir sobre la regulació del promotor del gen de la insulina, es van realitzar construccions de tots els gens ParaHox en vectors d'expressió i es van cotransfectar -en cultius de cèl.lules alfa-TC1 i beta-TC6- juntament amb el promotor del gen de la insulina que dirigia l'expressió del gen reporter de la luciferasa. Les transfeccions es realitzaren a dues concentracions diferents de glucosa (0'5 mM i 25 mM) i a diferents concentracions de factors de transcripció. En les cèl.lules beta-TC6, CDX1 és capaç d'activar aquest promotor a elevades concentracions, independentment de la concentració de glucosa. CDX2/3, a elevades dosis transactiva el promotor en presència de glucosa, mentre que CDX4 provoca una forta inhibició depenent de dosi. Ni CDX2/3, ni CDX4 afecten la transactivació del promotor a baixes concentracions de glucosa. En les cèl.lules alfa-TC1, CDX1, a elevades concentracions, transactiva moderadament el promotor en presència de glucosa, i no té cap efecte aparent en absència. CDX2/3 té un efecte inhibidor en absència de glucosa i cap efecte aparent en presència de glucosa. L'efecte més rellevant és l'observat amb CDX4 que, en presència de glucosa, provoca una forta activació del promotor del gen la insulina, més evident a baixes concentracions de factor de transcripció. / ParaHox genes, homeobox transcription factors, are expressed at different stages during mouse development and in different adult tissues. In the adult mouse pancreas, all ParaHox genes are expressed in  cells, the only exception being Pdx1, that is expressed in beta-cells. In some cells, localised at the periphery of the islets, Pdx1 mRNA is retained at the nucleus and does not always colocalise with PDX1 protein, suggesting a postranscriptional regulatory mechanism. In some cells, PDX1 colocalise with glucagon staining. We transfected all ParaHox genes with the insulin promoter in alpha-TC1 and beta-TC6 cultured cells and we show that they can act as activators or repressors on the insulin promoter. The most interesting result is observed with the transfection of CDX4, where we observe a strong inhibition at high glucose concentration, whereas the opposite result is observed when we transfected CDX4 at high glucose concentration in alpha-TC1 cultured cells. We proppose that ParaHox genes expressed in adult pancreas may be involved in glucose homeostasis regulation, hence they may be good candidates to be involved in diabetes.

Entre els gens sotmesos a regulació androgènica al ronyó de ratolí i amb una expressió pràcticament exclsuiva al túbul proximal es troba el de la Kidney Androgen-regulated Protein (KAP). L'mRNA del gen de la KAP és el més abundant del ronyó de ratolí mascle i la hibridació in situ sols es detecta en les cèl·lules epitelials dels túbuls corticals (Meseguer et al., 1987). L'especificitat tan restringida de l'expressió del gen de la KAP així com el dimorfisme sexual que manifesta ha permès distingir dos patrons diferents dins les cèl·lules S1/S2 i S3 que integren el túbul proximal. En les cèl·lules S3 l'expressió de KAP és dependent de l'hormona tiroïdal i en les cèl·lules S1/S2 l'expressió sols present en mascles respon a andrògens i és dependent de la presència puntual de l'hormona tiroïdal durant la maduració gonadal. La mutació de dues putatives seqüències d'unió per a factors C/EBP situades a -429 i -457 del promotor del gen suposa en assajos de transfeccio transitòria en la línia cel·lular PCT3 derivada dels segments S1/S2 amb constructes de 638 pb del promotor, una caiguda de la inducció per andrògens de -40 cops. En aquesta Tesi s'ha comprovat mitjançant assajos EMSA que el receptor d'andrògens (RA) és capaç d'unir l'element de reposta a andrògens (ARE) situat a -39bp de l'inici de transcripció. Assajos de transfecció transitòria han mostrat que la mutació A<G de la primera adenina de la caixa TATA situada a -28 pb solapada parcialment amb l'ARE suposa una caiguda dramàtica en l'activitat del promotor del gen. Mitjançant assajos EMSA hem vist que la unió de RA a l'ARE mutat que incorpora el canvi de nucleòtid en la caixa TATA no es veu afectada per aquest. Hem pogut concloure que el gen de la KAP presenta una caixa TATA funcional necessària per a què es produeixi la inducció per andrògens que té lloc per unió de RA a l'ARE solapat i que el gen no es comporta com un gen TATA-less en els contextos d'inducció androgènica. Hem comprovat que la seqüència GC situada a -100 pb del promotor és un lloc d'unió pel factor Sp1 que és capaç d'induir l'activitat del constructe que incorpora els primers 638 pb del promotor. La caixa GC també és unida pel factor Sp3 que al seu torn no és capaç d'induir l'activitat del promotor i competeix amb Sp1 fent disminuir el seu efecte inductor. Mitjançant assajos de transfecció transitòria s'ha vist que Sp1 sinergitza amb RA en la resposta a andrògens del promotor. S'ha comprovat per assajos EMSA la possible unió dels factors C/EBP a les caixes -429 i -457. Així s'ha vist que que la caixa -457 és unida per C/EBP&#61538; en cèl·lules PCT3 i pels factors C/EBP&#61537; i &#61538; al ronyó de ratolí. La caixa -429 no és unida per cap dels factors C/EBP testats. S'han realitzat cromatografies d'afinitat per la caixa -429 i se n'ha aïllat l' ATP-dependant RNA helicase DDX20, helicasa que s'uneix al factor Steroidogenic Factor 1, possible candidat a regular la KAP. La predicció in silico per a la caixa -429 apunta la possible unió per Receptor de Glucocorticoides (GR) fet que ha permès constatar la col·laboració que en el promotor del gen ocorre entre andrògens, glucocorticoides i Sp1. L'escenari final descrit en aquesta Tesi per a la regulació del gen de la KAP apunta a una resposta androgènica del promotor dependent de la presència simultània de l'ARE, la caixa GC i la caixa -429 suggerint la col·laboracio entre AR, Sp1 i el factor que uneix la caixa -429. La caixa -457 (C/EBP&#61538;&#61481; sembla no tenir implicació en aquesta la resposta androgènica. / The Kidney Androgen-regulated Protein (KAP) gene is exclusively expressed in proximal tubules of mouse kidney. It displays a differential regulation of expression by steroid and thyroid hormones (THs) in different proximal tubule segments. Whereas the pars recta (PR cells) responds to thyroid and sexual hormones, the pars convoluta (PCT cells) represents a truly androgen-dependent compartment because expression occurs only in the presence of androgens and functional androgen receptors. Using several genetically deficient mouse models it was determined that thyroid and GH modulate CCAAT/enhancer binding protein &#61537; and &#61538; levels that, in turn, control KAP expression in PCT cells in a developmentally dependent manner. In this thesis we demonstrated that C/EBP &#61538; actually binds to CAAT box located at -457 bp of the KAP promoter meanwhile the putative CAAT situated at -429 bp is not bound by a C/EBP protein. We have proved that AR binds to an Androgen Response Element located at -39 bp that is overlapping with the TATA box of the gene. We saw that the androgenic response of KAP promoter is mediated and increased by Sp1 factor. The GC box, Sp target sequence, is found at -110 bp and we have seen Sp3 is also able to bound it eventhough this factor competes with Sp1 for the binding decreasing the androgen promoted transcription. With the aim of determining which factor is bound to box -429 promoting KAP transcription we performed DNA affinity chromatograpy. With these assays we could isolate ATP-dependant RNA helicase DDX20, an helicase that interacts with Steroidogenic Factor 1 (SF-1) a new candidate for KAP gene regulation. The in silico predictions for box -429 indicated the possible binding of Glucocorticoid Receptor (GR). Eventhough GR is not bound to -429 sequence, we could see a strong collaboration of glucorticoids in the AR-Sp1 response in KAP promoter. The final scenario for KAP regulation we could describe in this Thesis is an androgenic response of the promoter depending on the simultaneous presence of ARE, GC box and box -429 suggesting a collaboration between AR, Sp1 and the transcription factor that is bound to -429 box.

"D. subobscura" ha colonitzat molt ràpidament l'oest dels dos continents americans extenent-se per la zona equivalent a la seva distribució en la zona Paleàrtica, clima mediterrani en el centre de la distribució, marítim occidental a latituds superiors i desèrtic a latituds inferiors.Eureka és la localitat que presenta una freqüència més elevada de "D. subobscura" al llarg de tot l'any, mentre que Davis presenta una freqüència intermitja i Gilroy una freqüència baixa, en el cas d'aquestes tres localitats hi ha un increment de la freqüència de l'espècie amb la latitud; l'abundància de "D. pseudoobscura" presenta un patró invers al de l'espècie colonitzadora essent més freqüent a Gilroy i menys a Eureka. Utilitzant totes les poblacions nord-americanes en que s'ha col.lectat "D.subobscura" en els últims 10 anys veiem que la freqüència de "D. subobscura" augmenta amb la latitud, essent més freqüent al nord; això pot ser un factor històric ja que va ser en el nord-oest (port Townsend, WA) on per primer cop es va detectar la colonització.Davis és la població que presenta uns majors índexs de diversitat i Eureka la que presenta uns majors índexs d'uniformitat al llarg de les captures; en relació a la temperatura a Davis hi ha variacions estacionals molt marcades mentre que a Eureka les condicions climàtiques són bastant constants al llarg de l'any. En l'estudi de la contribució de les variables ambientals a la diversitat observem que el component estació és el que contribueix més a explicar les diferències en la diversitat total de les poblacions (39.4%-50.4%) i oscil.la segons les variacions estacionals siguin més o menys marcades. La importància del component població representa el 26.4% de la diversitat total, essent les poblacions més diferents les més llunyanes i les que difereixen més pel que fa al clima i a la vegetació. El component any explica un percentatge molt baix de la diversitat total (1.5%-9.4%).Mitjançant l'anàlisi factorial de correspondències s'ha vist una associació entre les espècies del grup "obscura" de les tres localitats i els mesos de febrer i d'abril dels dos anys de captures, a excepció de "D. pseudoobscura" a Eureka que té una freqüència molt baixa i un minipic en el mes d'octubre. També s'ha observat associació entre les espècies del grup "melanogaster" i el mes d'octubre. Aquesta agrupació reflexa unes preferències ecològiques similars de les espècies del grup "obscura" sense importar de quina localitat provenen.Quan les poblacions mixtes de "D. subobscura" i "D. pseudoobscura" es mantenen en el laboratori mitjançant la tècnica de les transferències seriades allIarg del temps (Tipus I), hi ha sempre eliminació de "D. subobscura" a totes les temperatures (16º C, 18º C, 20º C i 22º C) i freqüències inicials (80%sub / 20%pse i 20%sub / 80%pse). En canvi els cultius monoespecífics de "D. subobscura" es mantenen perfectament en el laboratori utilitzant la mateixa tècnica i assoleixen valors de la seva capacitat de suport fins i tot superiors als de "D. pseudoobscura". L'eficàcia biològica de "D. subobscura" en els cultius mixtos començats alhora és la mateixa independentment de la temperatura a la que es manté el cultiu i de la freqüència inicial de l'espècie. El patró de desaparició de "D. subobscura" està molt influenciat per les condicions de laboratori (tipus de menjar, oscil.lacions de temperatura a les incubadores... ) o ritmes genètics interns de l'espècie (estacionalitat).Quan les poblacions mixtes de "D. subobscura" i "D. pseudoobscura" es mantenen en el laboratori mitjançant la tècnica del serial transfer Tipus 2 s'observa facilitació de "D. pseudoobscura" i inhibició de "D. subobscura" a qualsevol temperatura (18º C i 22º C),freqüència inicial (80%sub / 20%pse, 50%sub / 50%pse i 20%sub/ 80%pse) i densitat (200 i 600 individus). En els cultius control (Tipus 2) tant sols hi ha diferències entre espècies en relació a la productivitat a baixa densitat i 22 ºC, on la productivitat de "D. subobscura" és significativament superior a la de "D. pseudoobscura". Per tant en els cultius monoespecífics "D. subobscura" es desenvolupa sense cap problema. La supervivència i la productivitat de les dues espècies a baixa densitat presenten diferències significatives entre les dues temperatures, essent la supervivència major a 18ºC i la productivitat major a 22ºC. Les diferències degudes a la temperatura es veuen minimitzades quan la densitat de la població està al voltant de la seva capacitat de suport. L'anàlisi multivariant del factor densitat indica diferències significatives, essent la supervivència i la productivitat menors a alta que a baixa densitat. La productivitat augmenta a "D. subobscura" directament amb la freqüència inicial, mentre que a "D. pseudoobscura" augmenta inversament a la freqüència inicial. La competència intraespecfíca a "D.pseudoobscura" és major que la competència interespecífica, mentre que la competència interespecífica a "D. subobscura" és superior que la intraespecífica. La procedència de la soca de "D. subobscura" (Eureka, Davis o Gilroy) no afecta l'èxit competitiu d'aquesta espècie envers "D. pseudoobscura", la qual cosa es pot esperar donat el curt perfode de temps transcorregut des de l'inici de la colonització.En els experiments realitzats mitjançant la tècnica del serial transfer Tipus I però mantenint els cultius a diferents intèrvals de temperatures variables, s'ha observat també eliminació de "D. subobscura" en els cultius mixtos, en aquest cas degut a la prácticamente nul.la productivitat d'aquesta espècie.Analitzant les dades recollides a Nord-Amèrica a totes les poblacions col.lectades, observem que aquelles localitats que presenten freqüències elevades de "D. subobscura" presenten alhora freqüències baixes de "D. pseudoobscura" i viceversa. Això ens fa pensar que "D. subobscura" sols ha pogut colonitzar amb més eficàcia aquelles àrees en que la freqüència de "D. pseudoobscura" era baixa i per tant podríem dir que ambdues espècies competeixen quan estan a la natura a l'igual que fan en el laboratori. Un aïllament en l'espai, ocupant "D. subobscura" nínxols ecològics buits o al menys no ocupats per "D. pseudoobscura", i l'aïllament en el temps poden haver estat els mecanismes que han permès la colonització de Califòrnia per part de "D. subobscura". / "D. subobscura" is well established in the three populations studied from California (Eureka, Davis and Gilroy); and reaches its pick of maximum abundance in winter or spring depending upon the locality. The frequency of the three "obscura" group species varies with the locality; in Eureka (the northern population) "D. subobscura" and D. azteca" are the more abundant, Davis (in the Central Valley) bas a medium percentage of "D. subobscura" and a higher percentage of "D. pseudoobscura", and Gilroy (the southern population) has a very high frequency of "D. pseudoobscura" being the dominant species through the year with the exception of autumn. With the correspondence analysis a clear association bas been noticed between the "obscura" group species of the three localities and the months of February and April 88-89, which shows similar ecological preferences for those species. The interspecific competition between "D. pseudoobscura" and "D. subobscura" has been studied in the 1aboratory with the serial transfer technique Type 1 (long-time experiments), Type 2 (short-time experiments) and Type 3 (long-time experiments with variable temperatures). In Type I and Type 3 experiments "D. subobscura" is eliminated in a few weeks, quicker in Type 3 due to the almost null productivity of this species. In Type 2 experiments "D. subobscura" is at a great disadvantage al all the temperatures, densities and initial frequencies of each species used, especially regarding the productivity variable. The control populations of "D. subobscura" for the three experiments don't show any problems and some time even reach higher numbers than those of "D .pseudoobscura". The colonization of areas where "D. pseudoobscura" presents a low frequency can be one of the mechanisms shown by "D. subobscura" in order to avoid competition in natural populations.

El melanoma (MM) és la neoplàsia cutània més estudiada per la seva incidència creixent, per la seva agressivitat, perquè comporta una mortalitat del 20% i perquè está relacionat amb l'exposició al sol. Les famílies amb diversos casos de MM ténen sovint un fenotip especial; per tant, el millor coneixement de la base genètica del MM ha de permetre una millor prevenció, un diagnòstic precoç i el tractament del MM.

El descobriment d’un gran ventall de SNPs arrel dels projectes de seqüenciació de genomes, juntament amb les ràpides millores en el seu genotipatge a gran escala, van permetre el desenvolupament en moltes espècies animals de xips d’alta densitat de SNPs distribuïts pel genoma. Aquesta tesi presenta dos exemples de l’aplicació dels xips de SNPs per tal d’entendre malaltia i evolució en el gos, la història evolutiva del qual el converteix en un model animal apropiat per al mapatge de caràcters i en un fascinant cas de selecció artificial. En el primer exemple, motivats pel fet que només una certa proporció dels individus afectats per Leishmania són susceptibles a desenvolupar clínicament la malaltia leishmaniasi, hem intentat disseccionar com, i fins a quin punt, la genètica de l’hoste determina que els individus infectats progressin cap a la malaltia clínica. Primer, hem intentat localitzar loci que afectin el fenotip, i per les associacions més fortes, analitzat si la seva estructura haplotípica correlaciona amb l’estat d’afectació, alhora que hem examinat el seu contingut genètic més proper. Segon, hem estimant la heretabilitat del caràcter i avaluat la capacitat de predir el fenotip a partir de la informació genòmica. En el segon cas, hem buscat empremtes genòmiques causades per la selecció en la raça Bòxer. Presentem un nou selective sweep de >8 Mb en el cromosoma 26. Guiats per la presència d’un altre selective sweep en el cromosoma 1 prèviament associat amb la braquicefàlia canina, caracteritzada per un escurçament sever del musell i un tret característic del Bòxer, hem investigat sobre la relació del selective sweep en el cromosoma 26 i aquest tret. Hem intentat demostrar que el selective sweep és representatiu de la raça Bòxer i que està també present en altres races braquicèfales però absent en races no braquicèfales i en el llop. Finalment, hem examinat el contingut genètic del selective sweep per tal de trobar dianes per a la selecció així com conseqüències no desitjades per a la salut de les races que presenten el fenotip. / The generation of vast SNP repertoires from genome sequencing projects together with rapid improvements in large-scale SNP genotyping allowed the development of high-density genome-wide SNP microarrays in many animal species. This thesis presents two examples of the application of SNP arrays to understanding disease and evolution in the dog, whose evolutionary history makes it a suitable animal model for trait mapping and a fascinating case of artificial selection. In the first example, motivated by the fact that only a certain proportion of individuals infected with Leishmania are susceptible to develop clinical leishmaniasis disease we tried to dissect how and to what extent host genetics determines whether infected individuals progress to clinical disease. Firstly, we tried to map loci affecting the phenotype and for the strongest associations we tested whether their haplotype structure correlated with the affection status and examined their nearby genetic content. Secondly, we estimated the heritability of the trait and assessed the capability to predict the phenotype from genomic information. In the second case, we searched for genomic footprints of selection in the Boxer breed. We presented a novel selective sweep of >8 Mb on chromosome 26. Hinted by the presence of another selective sweep on chromosome 1 previously associated with canine brachycephaly, characterized by severe shortening of the muzzle and a breed-defining trait of the Boxer, we investigated on the relationship between the selective sweep on chromosome 26 and this trait. We tried to prove the selective sweep is representative of the Boxer breed and that it is also present in other brachycephalic breeds but absent in non-brachycephalic breeds and wolf. Finally, we examined the genetic content of the selective sweep to find putative targets of selection and potential undesired health consequences for the breeds bearing the phenotype.

A part of the plant kingdom consists of a variety of carnivorous plants. Some trap their prey using sticky leaves, others have pitfall traps where prey cannot escape once it has fallen inside. A rare trap type is the snap-trap: it appears only twice in the plant kingdom, in the genera Aldrovanda and Dionaea. Even Charles Darwin himself described Dionaea muscipula, the Venus flytrap, with the following words “This plant, commonly called Venus' fly-trap, from the rapidity and force of its movements, is one of the most wonderful in the world”. For a long time now, the mechanisms of Dionaea’s prey recognition, capture and utilization are of interest for scientists and have been studied intensively. Dionaea presents itself with traps wide-open, ready to catch insects upon contact. For this, the insect has to touch the trigger hairs of the opened trap twice within about 20-30 seconds. Once the prey is trapped, the trap lobes close tight, forming a hermetically sealed “green stomach”. Until lately, there was only limited knowledge about the molecular and hormonal mechanisms which lead to prey capture and excretion of digestive fluids. It is known that the digestion process is very water-consuming; therefore, the interplay of digestion-inducing and digestion inhibiting substances was to be analyzed in this work, to elucidate the fine-tuning of the digestive pathway. Special attention was given to the impact of phytohormones on mRNA transcript levels of digestion-related proteins after various stimuli as well as their effect on Dionaea’s physiological responses. Jasmonic acid (JA) and its isoleucine-conjugated form, JA-Ile, are an important signal in the jasmonate pathway. In the majority of non-carnivorous plants, jasmonates are critical for the defense against herbivory and pathogens. In Dionaea, this defense mechanism has been restructured towards offensive prey catching. One question in this work was how the frequency of trigger hair bendings is related to the formation of jasmonates and the induction of the digestion process. Upon contact of a prey with the trigger hairs in the inside of the trap, the trap closes and jasmonates are produced biosynthetically. JA-Ile interacts with the COI1- receptor, thereby activating the digestion pathway which leads to the secretion of digestive fluid and production of transporters needed to take up prey-derived nutrients. In this work it could be shown that the number of trigger hair bendings is positively correlated with the level and duration of transcriptional induction of several digestive enzymes/hydrolases. Abscisic acid (ABA) acts, along with many other functions, as the plant “drought stress hormone”. It is synthesized either by roots as the primary sensor for water shortage or by guard cells in the leaves. ABA affects a network of several thousand genes whose regulation prepares the plant for drought and initiates protective measurements. It was known from previous work that the application of ABA for 48 hours increased the required amount of trigger hair bendings to achieve trap closure. As the digestion process is very water-intensive, the question arose how exactly the interplay between the jasmonate- and the ABA-pathway is organized, and if ABA could stop the running digestion process once it had been activated. In the present work it could be shown that the application of ABA on intact traps prior to mechanically stimulating the trigger hairs (mechanostimulation) already significantly reduced the transcription of digestive enzymes for an incubation time as short as 4 h, showing that already short-term exposure to ABA counteracts the effects of jasmonates when it comes to initiating the digestion process, but does not inhibit trap closure. Incubation for 24 and 48 hours with 100 μM active ABA had no effect on trap reopening, only very high levels of 200 μM of active ABA inhibited trap reopening but also led to tissue necrosis. As the application of ABA could reduce the transcription of digestive hydrolases, it is likely that Dionaea can stop the digestion process, if corresponding external stimuli are received. Another factor, which only emerged later, was the effect of the wounding-induced systemic jasmonate burst. As efficient as ABA was in inhibiting marker hydrolase expression after mechanostimulation in intact plants, the application of ABA on truncated traps was not able to inhibit mechanostimulation-induced marker hydrolase expression. One reason might be that the ABA-signal is perceived in the roots, and therefore truncated traps were not able to react to it. Another reason might be that the wounding desensitized the tissue for the ABAsignal. Further research is required at this point. Inhibitors of the jasmonate pathway were also used to assess their effect on the regulation of Dionaea´s hunting cycle. Coronatine-O-methyloxime proved to be a potent inhibitor of mechanostimulation-induced expression of digestive enzymes, thus confirming the key regulatory role of jasmonates for Dionaea´s prey consumption mechanism. In a parallel project, the generation of in vitro cultures from sterilized seeds and single plant parts proved successful, which may be important for stock-keeping of future transgenic lines. Protoplasts were generated from leaf blade tissue and transiently transformed, expressing the reporter protein YFP after 24 h of incubation. In the future this might be the starting point for the generation of transgenic lines or the functional testing of DNA constructs. / Ein Teil des Pflanzenreiches besteht aus einer Vielfalt fleischfressender Pflanzen. Einige fangen ihre Beute mit klebrigen Blättern, andere haben Grubenfallen, aus denen die Beute nicht mehr entkommen kann, wenn sie erst einmal hineingefallen ist. Ein seltener Fallentyp ist die Klappfalle: Sie kommt im Pflanzenreich nur zweimal vor, in den Gattungen Aldrovanda und Dionaea. Charles Darwin selbst beschrieb Dionaea muscipula, die Venusfliegenfalle, als "eine der schönsten Pflanzen der Welt". Die Mechanismen der Erkennung, des Fangs und der Nutzbarmachung von Beutetieren durch Dionaea sind seit langem von Interesse für die Wissenschaft und wurden intensiv untersucht. Dionaea hat weit geöffnete Fallen, die bei Kontakt Insekten fangen können. Dazu muss das Insekt innerhalb von ca. 20-30 Sekunden zweimal die Triggerhaare der geöffneten Falle berühren. Sobald die Beute gefangen ist, schließen sich die Fallenhälften fest und bilden einen hermetisch verschlossenen sogenannten „grünen Magen“. Bis vor einigen Jahren gab es nur wenige Informationen über die molekularen und hormonellen Mechanismen, die zu Beutefang und Sekretion von Verdauungsflüssigkeiten führen. Es ist bekannt, dass der Verdauungsprozess sehr viel Wasser verbraucht; daher sollte in dieser Arbeit das Zusammenspiel von verdauungsauslösenden und verdauungshemmenden Substanzen untersucht werden, um die Feinabstimmung des Verdauungsweges aufzuklären. Ein besonderes Augenmerk wurde auf den Einfluss von Phytohormonen auf die mRNATranskriptzahlen von Verdauungsproteinen nach verschiedenen Stimuli sowie auf deren Auswirkungen auf die physiologischen Reaktionen von Dionaea gelegt. Jasmonsäure (JA) und ihre mit Isoleucin konjugierte Form, JA-Ile, sind ein wichtiges Signal in pflanzlichen Signaltransduktionsprozessen. In der Mehrzahl der nicht-karnivoren Pflanzen sind Jasmonate entscheidend für die Abwehr von Herbivoren und Pathogenen. In Dionaea wurde dieser Abwehrmechanismus für den offensiven Beutefang umstrukturiert. Eine Frage in dieser Arbeit war also, wie die Häufigkeit der Triggerhaarberührungen mit der Bildung von Jasmonaten und dem Verdauungsvorgang miteinander in Verbindung steht. Beim Kontakt von Beute mit den Triggerhaaren im Inneren der Falle schließt sich diese, und es werden durch Biosynthese Jasmonate gebildet. JA-Ile interagiert mit dem COI1-Rezeptor und aktiviert so den Verdauungsweg, der zur Sekretion von Verdauungsflüssigkeit und zur Produktion von Transportern führt, welche zur Aufnahme von aus Beute gewonnenen Nährstoffen benötigt werden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Anzahl der Triggerhaarberührungen positiv mit der Höhe und der Dauer der Transkriptionsinduktion mehrerer Verdauungsenzyme bzw. Verdauungshydrolasen korreliert. Abscisinsäure (ABA) fungiert neben vielen anderen Funktionen als pflanzliches „Trockenstresshormon“. Es wird entweder von Wurzeln als primärem Sensor für Wassermangel oder von Schließzellen in den Blättern synthetisiert. ABA beeinflusst ein Netzwerk von mehreren tausend Genen, deren Regulation die Pflanze auf Dürre vorbereitet und entsprechende Schutzmaßnahmen einleitet. Aus früheren Arbeiten war bekannt, dass die 48-stündige Inkubation einer Dionaea-Falle mit ABA die erforderliche Anzahl an Triggerhaarberührungen erhöhte, die für einen Fallenschluss notwendig sind. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Aufbringen von ABA auf intakte Fallen vor der mechanischen Stimulierung der Triggerhaare (Mechanostimulation) die Expression von Verdauungsenzymen bereits bei einer Inkubationszeit von nur 4 Stunden signifikant reduzierte. Das zeigte eindeutig, dass die kurzzeitige Einwirkung von ABA bereits die Effekte von Jasmonaten blockiert, wenn es um den Beginn des Verdauungsprozesses geht, aber keinen Einfluss auf den Fallenschluss hat. Eine Inkubation für 24 und 48 Stunden mit 100 μM aktiver ABA hatte keine Auswirkung auf das Wiederöffnen der Falle, nur sehr hohe Konzentrationen von 200 μM aktiver ABA hemmten das Wiederöffnen der Falle, führten aber auch zu Gewebenekrose. Da ABA die Transkription der Verdauungsenzyme reduzieren konnte, ist es wahrscheinlich, dass Dionaea den Verdauungsvorgang stoppen kann, wenn entsprechende externe Signale empfangen werden. Ein weiterer Einflussfaktor, welcher erst später erkannt wurde, war die Auswirkung des verwundungsbedingten, sprunghaften systemischen Anstiegs der Jasmonatkonzentration auf die Wirkung von extern aufgegebenen Phytohormonen. So wirksam ABA bei der Hemmung der Markerhydrolasen-Expression nach Mechanostimulation in intakten Pflanzen war, so konnte diese Inhibition nach Anwendung von ABA auf abgeschnittenen Fallen nicht mehr beobachtet werden. Ein Grund könnte sein, dass das ABA-Signal in den Wurzeln wahrgenommen wird und daher abgeschnittene Fallen nicht darauf reagieren konnten. Ein anderer Grund könnte sein, dass die Verwundung das Gewebe für das ABA-Signal desensibilisiert hat. An dieser Stelle besteht weiterer Forschungsbedarf. Ebenfalls wurden Inhibitoren des Jasmonat-Weges verwendet, um ihre Wirkung auf die Regulation des Beutefangzyklus von Dionaea zu untersuchen. Coronatine-O-methyloxim erwies sich als wirksamer Inhibitor der durch Mechanostimulation induzierten Expression von Verdauungsenzymen und bestätigte damit die zentrale regulatorische Rolle von Jasmonaten für den Beutefangmechanismus von Dionaea. Ein parallel laufendes Projekt war die Erzeugung von in vitro-Kulturen aus sterilisiertem Saatgut und einzelnen Pflanzenteilen, das sich als sehr erfolgreich erwies, was für die Erzeugung zukünftiger transgener Linien wichtig sein kann. Ebenfalls wurden Protoplasten aus Blattgewebe erzeugt, diese wurden transient transformiert und exprimierten YFP nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden. In Zukunft könnte dies der Ausgangspunkt für die Generierung transgener Linien sein und der Funktionsüberprüfung von DNA-Konstrukten sein.