L'expressió de la Kidney Androgen-regulated Protein (KAP) està regulada específicament y diferencialment per andrògens i hormona tiroïdal (T3) en el túbul proximal renal. Hem analitzat la transactivació del promotor del gen del KAP en cèl.lules PCT (pars convoluta) i PR (recta) derivades de ratolins transgènics L-PK/Tag1. Transfeccions transitòries amb diferents contruccions del promotor del KAP indicaven que el fragment de 224 bp era suficient per a mediar l'expressió cèl.lula específica de dit promotor. Assaigs de retardament en gel també mostraven que un putatiu element de resposta a andrògens (ARE), local.litzat a -39 bp de l'inici de transcripció, unia el receptor d'andrògens. La dihidrotestosterona (DHT) estimulava de manera androgen dependent la transactivació del KAP en cèl.lules PCT però en PR i la mutació de la putativa seqüència ARE eliminava dita activació. A més a més, l'IGF-1 però no la T3 augmentava la transactivació androgen dependent de KAP en PCT. Per tant, es suggeria que l'efecte cooperatiu de T3 en l'expressió del KAP existia in vivo podent efectar a l'activació produïda per T3 de l'hormona de creixement (GH) i al seu torn d'IGF-1. Aquests resultats demostraven l'expressió específica del curt fragment de 224 bp del promotor del KAP y suggerien interaccions sinèrgiques entre IGF-1 i andrògens en la regulació del gen del KAP en PCT.L'expressió cortical androgen dependent del KAP està afectada en hipotiroïdisme postnatal. La síntesi puntual de T3 a partir del dia 11 postnatal, comença una resposta cortical feble de KAP que va augmentant cap als dies 15-16, que és quan es produeix un pic fisiològic de T4 i el desenvolupament puberal dels ratolins. Donat que les CCAAT/Enhancer-Binding Proteins (C/EBPs) participen en respostes mitjançades per T3 i que en el promotor del KAP existeixen quatre elements de resposta consens per a C/EBPs, hem analitzat la seva participació en la resposta androgènica de KAP mitjançada per T3. La detecció de p42C/EBPa y p35C/EBPb es troba correlacionada amb l'expressió del KAP, apareixent en extractes renal nuclears de ratolins masles control i hipotiroïdals induïts amb T3 durant els dies 7-21 postnatals, però no en els hipotiroïdals no tractats. Mitjançant transfeccions transitòries es mostrava com C/EBPa i C/EBPb eren capaces d'induir respostes màximes del promotor del KAP i que la deleció de les putatives caixes d'unió a C/EBPs local.litzades a -429/-420 i -457/-448 produïa una gran disminució de l'activitat basal del promotor, irrecuperable amb la sobreexpressió de C/EBPs. Tant la depleció androgènica com al mutació de l'ARE conjuntament amb la deleció de les caixes esmentades augmentava la disminució de l'activitat basal del promotor produïda per la deleció de dites caixes. Per tant, postulem que els andrògens i la T3 mitjançant el control de C/EBPs sinergitzen en la transactivació del gen del KAP. / The kidney androgen-regulated protein (KAP) is specifically expressed and differentially regulated by androgens and triiodothyronine (T3) in proximal tubule. We have analyzed the hormonal dependent transactivation of the KAP gene promoter in PCT (pars convoluta) and PR (recta) cells derived from L-PK/Tag1 transgenic mice. Results from transient transfection studies with different KAP promoter constructs indicated that a 224 bp-truncated fragment was sufficient to mediate cell-specific expression of the KAP promoter. Gel shift assays also showed that a putative androgen-response element (ARE) located at -39 bp from the transcription initiation site was able to bind androgen receptor (AR). Dehydrotestosterone (DHT) stimulated in an androgen-dependent manner the transactivation of KAP in PCT cells but not in PR and mutation of the putative ARE sequence abolished that activation. Moreover, the IGF-1 but not T3 enhanced the androgen-dependent transactivation of KAP in PCT cells. It suggested that the cooperative effect of T3 on KAP expression existing in vivo might be effected by T3 activation of growth hormone (GH) and, in turn, of IGF-1. These results demonstrated the specific expression of a short 224 bp fragment of the KAP promoter and suggested synergistic interactions between IGF-1 and androgens for KAP gene regulation in PCT cells.The cortical androgen-dependent expression of KAP was influenced in postnatal hipothyroidism. The punctual effect of T3 in postnatal day 11 produced cortical expression of KAP gene and it was increased until days 15-16, when there is an fisiological pick of T4 and the puberal development of mice. In this point, we have analyzed the function of CCAAT/Enhancer-Binding Proteins (C/EBPs) on the enhanced androgen-dependent KAP expression by T3 because they participate in T3 responses and there are four consensous C/EBP sequences in KAP promoter. p42C/EBPa and p35C/EBPb were detected when KAP expression existed, that was in nuclear kidney extracts of euthyroid male mice and hipothyroid male mice treated with T3 from day 7 to 21 posnatal, but not in hipothyroid male mice. Transient transfections demostrated that C/EBPa and C/EBPb were able to induce the maximal KAP promoter activity achieved and the delection of putative C/EBP sequences at positions -429/-420 and -457/-448 produced an increment of the decrease observed for KAP promoter activity, that it wasn't recovered by C/EBP overexpression. Androgen deplection or ARE mutation with the deletion of mentioned C/EBP boxes decreased the basal promotor activity more than the mutation of these boxes alone. Because of these results we have postulated that the effect of androgens and T3 on KAP expression were mediated for C/EBPs.

Aquesta tesi es centra bàsicament en l'estudi i caracterització de tres gens de ratolí, que comparteixen la característica d'expressar-se a ronyó i d'estar regulats pels andrògens, els quals estimulen la seva expressió renal a nivell de mRNA.El primer d'ells correspon al gen Cyp4b1 -representant dels citocroms P450, enzims implicats en el metabolisme oxidatiu tan de substàncies endògenes com en la detoxificació de fàrmacs i xenobiòtics. S'ha estudiat la seva expressió en diversos teixits murins i, mitjançant hibridació in situ, s'ha localitzat la distribució del seus transcrits en el ronyó. En aquest darrer teixit, s'ha investigat l'efecte de les hormones andrògenes en la seva expressió, utilitzant ratolins castrats i control de vàries soques. A nivell genòmic, s'ha clonat el seu gen i les dues primeres kb de promotor del Cyp4b1, determinant la seva seqüència, la seva organització genòmica i els límits exó/intró corresponents. Amb el fragment de promotor aïllat s'han preparat construccions reporteres, amb les quals s'han realitzat assaigs de transfecció transitòria per tal d'analitzar i avaluar els possibles elements reguladors presents, tan a nivell d'expressió basal en línies renals, com a nivell d'inducció i capacitat de resposta androgènica.Els dos gens restants descrits -Oatp1 i Oatp-d/MJAM- eren prèviament desconeguts, pel que s'ha hagut de clonar i seqüenciar el seu cDNA sencer en aquest treball. Un cop identificats s'ha vist que ambdós corresponien a membres de la família murina dels transportadors d'anions orgànics, OATPs, proteïnes poliespecífiques de transport amb una ampli ventall de substrats que pot incloure des de sals biliars, esteroides conjugats i eicosanoides, fins a drogues i xenobiòtics orgànics. Al igual que pel Cyp4b1, s'ha estudiat la seva distribució tissular a nivell de missatger, i també la dependència androgènica de la seva expressió renal en diferents soques murines.Per Oatp1 en particular, s'ha realitzat una caracterització preliminar a nivell funcional determinant la seva afinitat per alguns substrats, amb assaigs de transport en oòcits de Xenopus laevis. A nivell genòmic, s'ha identificat temptativament la seqüència de la possible regió 5' adjacent del seu gen.Finalment, per Oatp-d (prèviament anomenat MJAM), s'han realitzat diversos estudis comparatius entre rosegadors i humans, que inclouen el mapatge cromosòmic del gen en ratolins i del seu corresponent ortòleg en rates. El posicionament dels gens Oatp-d de rata i OATP-D -l'ortòleg humà- en sengles regions genòmiques on han estat situats possibles loci genètics d'influència en hipertensió, ha fet que exploréssim a nivell preliminar una possible implicació d'aquest gen en els processos esmentats. S'ha abordat a través de comparar la seqüències dels cDNA corresponents i l'expressió renal de Oatp-d en rates de les soques WKY(normotenses) i SHR (hipertenses genètiques).El present treball hauria d'englobar-se dins el marc d'una aproximació als mecanismes moleculars específics reguladors de l'expressió gènica, per part dels andrògens. / This thesis is centered on the study and characterization of three murine genes with kidney androgen-regulated expression. The androgenic hormones stimulate their renal expression at the level of mRNA. The first gene corresponds to Cyp4b1, a member of cytochrome P450 family (enzymes implied in the oxidative metabolism of endogenous substances and also in detoxification of diverse drugs and xenobiotics. The expression-pattern of Cyp4b1 was analyzed in several mouse tissues and, by means of in situ hybridization, the distribution of its mRNA was located into the kidney. The effect of androgenic hormones on its renal expression was evaluated, using castrated and intact control mice of different strains. At genomic level, the organization of the Cyp4b1 structural gene was determined as well as its promoter region (about 2-kb of its proximal promoter being cloned and sequenced). With the promoter fragment isolated, it has been prepared several reporter constructs, to test the presence of putative regulatory elements in the promoter, in transient transfection experiments. The level of basal expression of those constructs in renal cell lines and the responsiveness to androgen was also evaluated. For the remaining two genes described (Oatp1 and Oatp-d/MJAM) that were previously unknown, it has been cloned and sequenced his corresponding full-length cDNAs. The both genes identified belongs to the murine organic anion transporting-polypeptide family (Oatp's), polyspecific organic anion transport proteins with broad range of substrates, which can include biliar salts, conjugated steroids and eicosanoids, organic drugs and xenobiotics. Like for the Cyp4b1, its tissue distribution at messenger level has studied, and also the androgenic dependency of its renal expression in several mouse strains. For mouse Oatp1, it has been characterized at functional level, determining his affinity for some anionic substrates in transport studies using Xenopus oocytes. At genomic level, it has been identified tentatively the 5'-flanking region of their gene.Finally, for Oatp-d (previously known as MJAM), several comparative studies between rodents and humans have been made, including the chromosomal mapping of the gene in mice and its corresponding orthologous in rats. The localization of the rat and human OATP-D genes in genomic regions where they have been described genetic loci with putative influence on hypertension, makes that we considered the analysis of the Oatp-d implication, at preliminary level, in the mentioned processes. These studies consisted in the sequencing and comparation of the corresponding cDNA full coding-regions (and also its renal expression), between Oatp-d in WKY(normotensive) and SHR (spontaneous hypertensive) rats. The present work would have to be included within the general frame of the study of molecular mechanisms of kidney androgen gene-regulation mechanisms. / Esta tesis se centra básicamente en el estudio y caracterización de tres genes murinos que comparten la característica de expresarse y estar regulados por los andrógenos en el riñón, los cuales estimulan su expresión renal a nivel de mRNA. El primero de ellos corresponde al gen Cyp4b1 -representante de los citocromos P450, enzimas implicadas en el metabolismo oxidativo tanto de sustancias endògenas como en la detoxificación de fármacos y xenobióticos. Se ha estudiado su expresión en varios tejidos murinos y, mediante hibridación in situ, localizado la distribución de sus transcritos en el riñón. En este último tejido, también se ha investigado el efecto sobre su expresión de las hormonas andrógenas, utilizando ratones castrados y control de diferentes cepas. A nivel genómico, ha sido clonado el gen del Cyp4b1 así como las dos primeras kb de promotor, determinándose su secuencia, su organización genómica y las intersecciones exón/intrón correspondientes. Con el fragmento de promotor aislado han sido preparadas diversas construcciones reporteras, con las cuales se han realizado ensayos de transfección transitoria para evaluar los posibles elementos reguladores presentes en el promotor, tanto a nivel de expresión basal en líneas renales, como a nivel de inducción y capacidad de respuesta androénica. Los dos genes restantes descritos -Oatp1 y Oatp-d/MJAM- eran previamente desconocidos, por lo cual se ha clonado y secuenciado su cDNA entero a partir de riñón. Uno vez identificados los correspondientes cDNAs, se ha visto que ambos correspondían a miembros de la familia murina de los transportadores de aniones orgánicos, OATPs, proteínas poliespecíficas de transporte con una amplio abanico de sustratos que puede incluir desde sales biliares, esteroides conjugados y eicosanoides, hasta drogas y xenobióticos orgánicos. Al igual que para el Cyp4b1, se ha estudiado su distribución tisular de ambos genes a nivel de mensajero, y también la dependencia androgénica de su expresión renal en diferentes cepas murinas. Para Oatp1 en particular, se ha caracterizado a nivel funcional de manera preliminar, determinando su afinidad por algunos sustratos mediante ensayos de transporte en oocitos de Xenopus laevis. A nivel genómico, ha sido identificada tentativamente la secuencia de la región 5' adyacente de su gen.Finalmente, por Oatp-d (previamente denominado MJAM), se han realizado varios estudios computacionales comparativos entre roedores y humanos, que incluyen el mapage cromosómico del gen en ratones y de su correspondiente ortólogo en ratas. El posicionamiento de los genes Oatp-d de rata y OATP-D -su ortólogo humano- en sendas regiones genómicas dónde se han descrito posibles loci genéticos con posible influencia sobre la hipertensión, ha hecho que exploráramos a nivel preliminar una posible implicación de este gen en los procesos mencionados. Dichos estudios se han abordado a través de la comparación de la secuencias de los cDNA correspondientes (y también su expresión renal) entre Oatp-d en ratas de las cepas WKY(normotensas) y SHR (hipertensas genéticas). El presente trabajo debería englobarse dentro del marco general de una aproximación a los mecanismos moleculares específicos reguladores de la expresión génica renal, por parte de los andrógenos.

El trasplante renal es la mejor opción disponible para el tratamiento de la enfermedad renal crónica avanzada, tanto en términos de supervivencia como de calidad de vida de los pacientes. La escasez de órganos disponibles para el procedimiento es la mayor limitación de este tipo de terapéutica y por tanto prolongar la vida útil de los injertos renales es la principal prioridad en el contexto del trasplante renal. Después del primer año de funcionamiento del trasplante, la disfunción crónica del injerto (DCI) constituye la principal causa de daño y perdida injerto renal. Esta tesis es un análisis de la correlación del estudio del proteoma urinario mediante espectrometría de masas con la severidad y subtipo histológico de la disfunción crónica del injerto. Los sujetos fueron agrupados según el resultado de la biopsia del injerto y el análisis proteómico mediante espectrometría de masas se realizó en una muestra obtenida antes de realizar la biopsia por indicación clínica. Se realizaron dos tipos de estrategias mediante espectrometría de masas: un primer abordaje, utilizando MALDI- TOF, previa extracción del muestra mediante cromatografía de fase reversa mostró diferencias en el perfil proteómico urinario entre sujetos sanos, pacientes trasplantados con buena función del injerto renal y pacientes con disfunción crónica del injerto. Un segundo estudio mediante LC-MS-MS cuantificó estas diferencias y además aportó información acerca de la secuencia de los péptidos diferenciales. Péptidos específicos derivados de uromodulina y bradiquinina son candidatos a biomarcadores de buen funcionamiento del injerto renal, ya que su presencia en la orina puede ser utilizada para discriminar entre pacientes trasplantados con disfunción del injerto renal y pacientes trasplantados con buena función del injerto. Los niveles elevados del ión 642.5 y niveles bajos del ión 638.0 derivado de uromodulina son característicos de la orina proveniente de pacientes con disfunción crónica del injerto y permiten detectar sus subtipos histológicos. Los iones de m/z 645.59 y m/z 642.61 estaban aumentados de forma significativa en pacientes con rechazo crónico activo mediado por anticuerpos respecto a pacientes con fibrosis intersticial y atrofia tubular aislada (4.4-2.7 fold change) y pacientes trasplantados con función estable del injerto (5.3-14.6 fold change) permitiendo cuantificar las diferencias entre estos dos subtipos de disfunción crónica del injerto ya demostradas en los análisis cualitativo con MALDI-TOF. Este trabajo es la primera prueba de concepto de la utilidad de la proteomica urinaria para detectar biomarcadores y el futuro diseño de una herramienta diagnóstica no invasiva en la disfunción crónica del injerto y en dos de sus subtipos histológicos: Fibrosis intersticial y atrofia tubular sin evidencias de otras lesiones y el Rechazo crónico activo mediado por anticuerpos. / Despite optimal immunosuppressive therapy, more than 50% of kidney transplants fail because of chronic allograft dysfunction. A noninvasive means to diagnose chronic allograft dysfunction may allow earlier interventions that could improve graft half-life. In this proof-of-concept study, we used mass spectrometry to analyze differences in the urinary polypeptide patterns of patients with chronic allograft dysfunction ( with pure interstitial fibrosis and tubular atrophy and with chronic active antibody-mediated rejection) and control subjects (stable recipients and healthy control subjects). Unsupervised hierarchical clustering showed good segregation of samples in groups corresponding mainly to the four biomedical conditions. Moreover, the composition of the proteome of the pure interstitial fibrosis and tubular atrophy group differed from that of the chronic active antibodymediated rejection group, and an independent validation set confirmed these results. Specific peptides derived from uromodulin and kininogen were found to be significantly more abundant in control than in CAD patients and correctly identified the two groups. These peptides are therefore potential biomarkers that might be used for the diagnosis of CAD. In addition, ions at m/z 645.59 and m/z 642.61 were able to differentiate between patients with different forms of CAD with specificities and sensitivities of 90% in a training set and, significantly, of 70% in an independent validation set of samples. Interestingly low expression of uromodulin at m/z 638.03 coupled with high expression of m/z 642.61 diagnosed CAD in virtually all cases. Multiple reaction monitoring experiments further validated the results, illustrating the power of our label-free quantitative LC-MS approach for obtaining quantitative profiles of urinary polypeptides in a rapid, comprehensive, and precise fashion and for biomarker discovery. In summary, this study establishes a pattern for two histologic lesions associated with distinct graft outcomes and constitutes a first step to designing a specific, noninvasive diagnostic tool for chronic allograft dysfunction.

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Antecedentes: aunque por estudios en animales se conoce que el incremento de la ingesta proteica favorece el crecimiento renal y que el Insulin-like Growth Factor (IGF-1) puede ser el mediador de este proceso, no existen ensayos clínicos controlados en humanos que aporten evidencia científica a estas teorías. Metodología: este ensayo multicéntrico Europeo (EU Childhood Obesity Project) examinó a los 6 meses de vida a 601 lactantes sanos asignados aleatoriamente durante las 8 primeras semanas de vida (mediana=14 días) a consumir una fórmula infantil con mayor o menor contenido proteicos. Estos lactantes fueron comparados con un grupo alimentado con lactancia materna. Conclusiones principales: a los 6 meses, la ingesta proteica se asociaba de forma directa al tamaño renal y corporal, así como la secreción de IGF-1. IGF-1 puede ser un mediador del crecimiento corporal y renal inducido por la proteína dietética, posiblemente mediante un mecanismo hiperplásico. . / Background: Protein intake has been associated with kidney growth and function in human observational studies, and Insulin-like Growth Factor (IGF-1) has been postulated as a mediator of this process. Although this mechanism has been shown by animal models, randomized control trials have not been published in healthy infants. Methods: this multicenter European clinical trial (EU Childhood Obesity Project) examined 601 healthy 6-month-old formula-fed infants randomly assigned within the first 8 weeks of life (median 14 days) to receive an infant formula with higher or lower protein content. For comparison, 204 breastfed infants were also followed. Conclusions: higher protein content of infant formula increases kidney size at 6 months of life, whereas a lower protein supply achieves a normal kidney size relative to healthy breastfed infants. Protein intake has a direct significant relation with IGF-1 secretion. IGF-1 is a mediator of body and kidney growth, induced by protein intake

DE LA TESISHIPOTESIS Y OBJETIVOS1. El diagnóstico analítico de la nefropatía lúpica (en adelante, NL) continua basándose en la determinación de proteínas en orina de 24 horas, en el análisis del sedimento urinario y en la detección de anticuerpos anti-DNA y el descenso de los niveles de complemento.2. Los subtipos histopatológicos presentan una evolución y pronóstico diferente.3. La realización de biopsias renales repetidas posee una utilidad, respecto al ajuste de medicación, superior al 90%, y un porcentaje de complicaciones inferior al 5%. 4. Un porcentaje elevado de pacientes con NL pueden transformar su subtipo histológico a lo largo de su evolución.5. El subgrupo anatomoclínico de NL tipo IV es la forma más frecuente de NL, y la de mayor morbilidad y mortalidad. 6. El mejor tratamiento para inducir la remisión de la NL proliferativa es la combinación de corticoides a dosis altas y bolus endovenosos de ciclofosfamida (en adelante, CFM).7. La HTA es el principal factor de riesgo cardiovascular que aparece en el paciente con NL.8. La edad de inicio de la NL, la presencia de insuficiencia renal al inicio y el fracaso al tratamiento de inducción son los principales factores pronósticos en el paciente con NL.METODOLOGIAEstudio prospectivo y descriptivo de una cohorte de pacientes con NL. Se ha analizado la cohorte de pacientes diagnosticados de lupus eritematoso sistémico (en adelante, LES) en el Servicio de Enfermedades Autoinmunes del Hospital Clínic de Barcelona durante el periodo comprendido entre el 1 de Enero de 1972 al 31 de Diciembre de 2006 (35 años).RESULTADOSEn el 90% de los casos, el diagnóstico de NL se realiza en el transcurso de los primeros 5 años tras el diagnóstico de LES. En un 20% de los casos el paciente con NL presenta insuficiencia renal. Los pacientes con LES y NL presentan una mayor frecuencia de anemia hemolítica autoinmune, hipocomplementemia y A-antiDNA>20 respecto a los pacientes lúpicos sin NL. El tratamiento de inducción consiguió la remisión completa de la NL en dos tercios de los pacientes de la cohorte. La tasa de remisión difiere ampliamente según el tipo histológico (83% en las formas mesangiales, 32% en la forma membranosa). En los pacientes en remisión se observó un rebrote renal en un 39% de los casos, situándose la incidencia anual de rebrote renal entorno al 5%. La pauta terapéutica más utilizada para inducir la remisión de la NL proliferativa difusa fue la CFM-NIH. Es también la que ha demostrado un mejor resultado en la inducción de la remisión, en el mantenimiento de la remisión a largo plazo, en el rebrote, y en unas menores cifras de evolución a IRC e IRCT. Los principales factores predictores de fracaso terapéutico en el tratamiento de inducción fueron la presencia de A-antiDNA a títulos >20UI y la presencia de una NL proliferativa. Los principales factores predictores de rebrote o recaída renal al diagnóstico fueron una edad temprana en el momento del diagnóstico de la NL, la elevación al diagnóstico de las cifras de creatinina, la hipocomplementemia y la presencia de niveles elevados de A-antiDNA. El 37% de los pacientes con NL fueron rebiopsiados, bien para evaluar la respuesta al tratamiento de inducción, bien por presentar un nuevo rebrote renal. De los pacientes rebiopsiados por recaída, el 46% evolucionaron a un subtipo histológico de peor pronóstico (generalmente del subtipo II al IV) mientras un 41% presentaban el mismo tipo histológico pero con un mayor índice de cronicidad. El 80% de los pacientes que son seguidos durante 10 años mantienen una función renal normal, aunque dicho porcentaje desciende al 55% en aquellos pacientes seguidos durante más de 20 años. Uno de cada 3 pacientes con NL desarrolló una IRC tras un periodo medio de seguimiento de 15 años. Un 52% de los pacientes desarrolló algún FRCV, siendo la HTA la más frecuente (45% de todos los casos). El principal factor pronóstico asociado a la aparición de enfermedad cardiovascular fue el diagnóstico de la NL a edades más tardías. El tratamiento con antipalúdicos previo al diagnóstico de NL se asoció con una disminución en el desarrollo de HTA y una menor evolución a IRCT. También se asoció a una menor proporción de infecciones, eventos trombóticos, y una menor tasa de mortalidad. La supervivencia general de la cohorte a los 10 años de seguimiento fue del 92%, del 80% a los 20 años y del 72% en los pacientes seguidos durante más de 30 años. La causa más frecuente de muerte fue la propia enfermedad renal, siendo las formas histológicas de tipo proliferativo las que concentran la mayor tasa de mortalidad. El aumento de la creatinina en el momento del diagnóstico de la NL debe considerarse el principal factor predictivo de morbimortalidad en el paciente con NL, al asociarse a una mayor probabilidad de desarrollar IRC, IRCT, HTA, y a una disminución significativa de la supervivencia.