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The role of ecological opportunity in adaptive radiation has been demonstrated by the diversification of the bacterium Pseudomonas fluorescens SBW25 in a spatially structured microcosm. This provides an ideal system for studying the genetics of adaptation and asking questions about the genes that matter in evolution. Previous studies have identified the genes that are necessary for the evolved, biofilm-forming, niche-specialist genotype, the wrinkly spreader (WS). These genes are organised in two operons: the wss operon that encodes the genes for cellulose biosynthesis, and the wsp operon that encodes a chemosensory pathway. The terminal gene in the wsp operon, wspR, encodes a novel response regulator thought to regulate the activity of the wss operon. This gene forms the basis of this study, which assesses the role of regulatory genes in adaptive evolution. The structure-function relationship of WspR is established through the phenotypic analysis of overexpressed wspR random point mutants. On this basis a model of WspR activity is proposed which is tested by molecular genetic analysis. The role of phosphorylation is demonstrated by site-directed mutagenesis, and domain liberation is used to study the interaction of WspR with the other components of the signalling pathway. As the overexpression of certain wspR mutant alleles mimics the evolutionary transition from ancestor to niche-specialist, the fitness effects of such overexpression are measured. It is found that some, but not all, wspR alleles do indeed cause adaptation. It is also found that a phenotypically-plastic genotype, with enhanced fitness, can be created by artificial manipulation, but does not occur naturally; this demonstrates the existence of a constraint on evolution. Sequence analysis of independently-isolated WS genotypes shows no evidence of wspR sequence variation, despite its capacity to enhance fitness. A further proteomic and phenotypic characterisation shows variation between ancestral and WS genotypes, and also between different WS genotypes. This demonstrates that there are different mutational routes to the same adaptation.

Infertilität stellt in unserer heutigen Gesellschaft ein zunehmendes Problem dar. Bei der Suche nach den der Infertilität zugrunde liegenden Ursachen gerät immer mehr die Epigenetik in den Fokus. Epigenetische Prozesse sind nicht nur in die Embryo-nalentwicklung und Wachstumsprozesse des Kindes involviert, sondern auch in korrekte Funktionsweisen von Gameten. Störungen können die Fertilität beeinträch-tigen. Eine besondere Rolle spielen geprägte Gene, die auf einem ihrer Allele, je nach parentaler Herkunft, ein Imprint in Form von DNA-Methylierung tragen. Fehl-regulationen solcher geprägter Gene können zu Imprinting-Erkrankungen führen. Seit Einführung der In-vitro-Fertilisation (IVF) wurden verschiedene assistierte Re-produktionstechniken (ART) entwickelt, um infertilen Paaren zu helfen. Die Sicher-heit dieser Techniken ist nicht abschließend geklärt. Immer wieder wird von nach ART-Behandlung gehäuft auftretenden Imprinting-Erkrankungen berichtet. Diese Erkrankungen stehen jedoch eher in Zusammenhang mit der zugrunde liegenden Infertilität, als mit ART selbst. Dennoch ist es notwendig zu untersuchen inwieweit sich ART eventuell auf den Gesundheitszustand dieser Kinder auswirken könnte. In der hier vorgelegten Arbeit wurde der Zusammenhang von Epigenetik, Infertilität und ART von verschiedenen Standpunkten aus beleuchtet. In humanen Spermien wurde die DNA-Methylierung verschiedener geprägter Gene hinsichtlich Epimutationen untersucht. ICSI (intracytoplasmatic sperm injection) und IMSI (intracytoplasmic morphologically selected sperm injection) sind verschiedene Techniken zur Selektion von Spermien für eine ART-Behandlung. Hier wurde un-tersucht, ob IMSI epigenetisch bessere Spermien selektiert als die konventionelle ICSI-Methode. Außerdem ist bekannt, dass in Spermienköpfen fertiler und infertiler Männer Vakuolen vorkommen können, deren epigenetische Bedeutung jedoch un-bekannt ist. Ob diese Vakuolen in Zusammenhang mit Epimutationen stehen könn-ten, wurde ebenfalls überprüft. Dazu wurde bisulfitkonvertierte DNA weniger Sper-mien (11 je Probe) mithilfe der Limiting Dilution (LD)–Technik und Pyrosequenzie-rung analysiert. Insgesamt standen 880 Spermien für diese Untersuchung zur Ver-fügung. Es konnte kein Unterschied zwischen IMSI- und ICSI-selektierten Spermien gefunden werden. Vorhandene Vakuolen im Spermienkopf beeinträchtigten nicht die DNA-Methylierung der Gene hGTL2, hLIT1 und hPEG3. Ein weiteres Projekt befasste sich mit der Frage, inwieweit die Technik der In-vitro-Maturation (IVM) DNA-Methylierung in humanen Oocyten beeinflussen könnte. Bisulfitkonvertierte DNA einzelner humaner Oocyten wurde mit LD und Pyrose-quenzierung analysiert. Verglichen wurden IVM und in vivo gereifte Oocyten. Hier-für standen 139 Oocyten zur Verfügung, wovon 90 mittels IVM und 49 in vivo gereift waren. Untersucht wurden vier geprägte Gene (hGTL2, hLIT1, hPEG3 und hSNRPN) und drei nicht geprägte Gene (hDNMT3Lo, hNANOG und hOCT4). Es konnten keine IVM-bedingten Epimutationen gefunden werden. Im dritten Projekt wurde untersucht, ob sich die DNA-Methylierung normaler Sper-mien von Spermien aus Oligozoospermie-Asthenozoospermie-Teratozoospermie (OAT)–Syndrom-Patienten unterscheidet. Eine weitere Frage war, ob Epimutationen einen Einfluss auf den ART-Ausgang haben. Untersucht wurden 54 Spermienpro-ben von Paaren in ART-Behandlung. Zur Untersuchung der DNA-Methylierungsmuster der geprägten Gene hGTL2 und hPEG3 sowie der beiden nicht geprägten Pluripotenzgene hNANOG und hOCT4 wurde die Methode Deep Bisulfite Sequencing (DBS) verwendet. Dies ist eine Next Generation Sequencing (NGS)–Technik, angewandt an bisulfitkonvertierter DNA. Diese Technik ermöglicht es mehrere Proben sowie Gene gleichzeitig zu analysieren. Es zeigte sich, dass OAT-Spermien, die zu einer Lebendgeburt geführt hatten, sich epigenetisch nicht von normalen Spermien unterschieden. Besonders viele Epimutationen konnten hingegen in OAT-Spermien gefunden werden, die zu keiner Schwangerschaft ge-führt hatten. Zwischen Spermien die zu einer Lebendgeburt oder keiner Schwan-gerschaft geführt hatten, zeigten sich Unterschiede in der Häufigkeit von hGTL2-Epimutationen. Über die Häufigkeit von Epimutationen konnte eine prädiktive Aus-sage zum ART-Ausgang getroffen werden. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit festgestellt werden, dass sich eine Häu-fung von Epimutationen darauf auswirkt, ob eine Schwangerschaft erreicht werden kann oder nicht. Diese Epimutationen liegen bereits im parentalen Genom vor. Sie werden nicht durch ART verursacht. Allerdings muss man Techniken finden, mit denen man Gameten mit möglichst wenig Epimutationen selektiert, um eine Über-tragung solcher auf das Kind zu verhindern. / Infertility is an increasing problem in today’s society. The search for the underlying causes of infertility reveals more and more the role of epigenetics. Epigenetic pro-cesses are involved in embryo development and growth, but also in the proper func-tion of gametes. Disturbances have been shown to impair fertility. Imprinted genes play an important role. They carry a parental-specific DNA methylation imprint on one of their alleles. Deregulation of these genes leads to imprinting diseases. Since the introduction of in vitro fertilisation (IVF), different assisted reproductive technologies (ART) have been developed to treat infertile couples. The safety of these techniques is not finally solved. Increased rates of imprinting diseases in ART offspring have been reported, but seem more likely to be linked to the underlying parental infertility problems than to ART itself. Nevertheless it is of importance to in-vestigate how ART could affect the health of those children. In the work presented here the relations between epigenetics, infertility and ART have been investigated from different points of view. Firstly, the DNA methylation pattern of different imprinted genes has been investi-gated in human sperm with regard to the frequency of epimutations. ICSI (intracyto-plasmatic sperm injection) and IMSI (intracytoplasmic morphologically selected sperm injection) are different techniques to select sperm for ART treatment. It was analysed whether IMSI selects epigenetically superior sperm than the conventional ICSI method. Furthermore it is known that sperm from fertile and infertile men can carry vacuoles in their sperm heads. Their epigenetic relevance is unknown. Whether these vacuoles are linked to epimutations has also been investigated here. Bisulfite converted DNA of a few sperm (11 per sample) was analysed using the Limiting Dilution (LD) technique followed by pyrosequencing. In total 880 sperm were available for analysis. No difference between IMSI and ICSI selected sperm was found. Further, no influence of sperm head vacuoles on the DNA methylation patterns of the genes hGTL2, hLIT1 and hPEG3 could be observed. Secondly, it was of interest whether the in vitro maturation (IVM) technique has an influence on DNA methylation in human oocytes. Bisulfite converted DNA of single human oocytes was analysed with LD and pyrosequencing. IVM oocytes were com-pared to in vivo grown oocytes. A total of 139 oocytes were available, of which 90 oocytes were IVM treated while 49 oocytes were grown in vivo. Four imprinted genes (hGTL2, hLIT1, hPEG3 and hSNRPN) and three non-imprinted genes (hDNMT3Lo, hNANOG and hOCT4) were analysed. No IVM-induced epimutations were detected. Finally, it was investigated whether DNA methylation patterns of normal sperm would differ from sperm of oligozoospermia-asthenozoospermia-teratozoospermia (OAT) syndrome patients. Furthermore it was of interest whether epimutations would influence the ART outcome. A total of 54 sperm samples from couples undergoing ART treatment were investigated. To analyse DNA methylation of the imprinted genes hGTL2 and hPEG3 as well as the non-imprinted pluripotency genes hNANOG and hOCT4, Deep Bisulfite Sequencing (DBS) was applied. This is a Next Generation Sequencing (NGS) technique applied on bisulfite converted DNA, al-lowing the analysis of several samples and genes at once. The obtained results showed that OAT samples, which had led to a live-birth, did not differ epigenetically from normal sperm. Much more epimutations were found in OAT sperm which had failed to achieve a pregnancy. Sperm not being able to achieve a pregnancy differed from sperm that had led to a live-birth with regard to hGTL2 epimutation frequency. In addition, ART outcome can be predicted using the frequency of epimutations. Taken together this work shows that the amount of epimutations influences whether a pregnancy can be achieved or not. Epimutations already exist within the parental genome. They are not caused by ART. Nevertheless, one needs to find techniques with which gametes with as few as possible epimutations are being selected to pre-vent the transmission of these onto the offspring.

La toxina epsilon de Clostridium perfringens és la toxina clostridial més potent després de les neurotoxines tetànica i botulínica. Provoca una enterotoxèmia general en animals de granja, provocant greus pèrdues econòmiques.La toxina es sintetitza en forma de protoxina inactiva que requereix de dos talls proteolítics per a la seva activació.En aquest treball hem clonat i expressat amb èxit en E. coli diferents formes de la protoxina i de la toxina, conjugades o no a la Green Fluorescent Protein (GFP), per el seu ús com a eina molecular d'estudi dels efectes de la toxina en els sistemes renal i nerviós de ratolí.Hem pogut demostrar que la toxina epsilon s'acumula en grans quantitats al ronyó, de manera inespecífica als túbuls proximals de la nefrona, i de manera específica als túbuls distals, on a més, provoca mort cel·lular de les seves cèl·lules epitelials.Pel que fa referència al cervell, hem pogut detectar acumulació específica tant de la protoxina com de la toxina epsilon a l'endoteli capil·lar arreu del cervell, i a més hem pogut comprovar que la toxina és capaç de travessar la Barrera Hemato-Encefàlica i acumular-se sobre cèl·lules de la glia neuronal.En estudis in vitro hem demostrat que la toxina és capaç de produïr mort cel·lular sobre cultius tant de cèl·lules endotelials com d'astroglia i microglia, suggerint que la seva acció sobre aquests tipus cel·lulars podria estar implicada en els efectes nerviosos que provoquen la mort última dels animals afectats. / "Clostridium perfringens" epsilon toxin is the most potent clostridial toxin after tetanus and botulinum neurotoxins. It causes general enterotoxemia in livestock leading to death, and is responsible for great economic losses every year.It is sintesized as a non-active prototoxin which needs txo proteolitic cleavages for becoming the mature active form of the toxin.In this study we have succesfully cloned and expressed in "E. coli" different recombinant forms of both the prototoxin and toxin, conjugated with Green Fluorescent Protein (GFP), for their use as a molecular tool in the study of epsilon toxin effects in mouse renal and nervous systems.We have demonstrated large accumulation of the toxin in the kidney. It accumulates in a non-specific way on the proximal tubules, and specifically in the luminal surface of the distal tubules of the nephron. It also causes the death of the epithelial cells of the distal tubules.On the brain, we detected specific accumulation of both the prototoxin and the toxin on the luminal surface of the endothelial cells. We found that the toxin is able to cross the Blood Brain Barrier and accumulate on glial cells.In vitro studies shown that the toxin causes the death of endothelial cell cultures and also of both astroglial and microglial cell cultures, suggesting that the action on these kind of cells could be implicated in the neural effects leading to affected animals death.

La enfermedad de Parkinson es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por desórdenes motores debido a la afectación del sistema nervioso central. En esta enfermedad, por un lado se pierden neuronas de la substantia nigra produciendo, en consecuencia, un déficit en dopamina a los núcleos que proyecta, y por otro lado, las neuronas que quedan pueden presentar los característicos cuerpos de Lewy. Además de la afectación central, el sistema nervioso periférico también está afectado en estos enfermos. Entre los síntomas derivados se dan la hipotensión ortostática, problemas de sudoración, disminución en la salivación, problemas urinarios y/o de estreñimiento e impotencia. Hasta el momento, se conocen tanto razones ambientales como genéticas causantes de la aparición de la enfermedad. Entre los genes, el de la alfa-sinucleína, aparece como gen central en la enfermedad ya que su mutación produce su aparición y su producto es el constituyente mayoritario en los cuerpos de Lewy. Para tratar de entender la enfermedad se utilizan modelos tóxicos y/o genéticos. En la presente tesis doctoral se ha estudiado la afectación periférica en distintos modelos de enfermedad de Parkinson mediante diferentes aproximaciones. En primer lugar, hemos caracterizado el patrón de expresión de la alfa-sinucleína y su identificación celular en el sistema nervioso periférico durante el desarrollo embrionario y postnatal en el ratón. En segundo lugar, hemos estudiado el desarrollo de los ganglios SCG, de modalidad simpática, o nodoso, de modalidad sensorial, inmunorreactivos para alfa-sinucleína, en ratones deficientes en alfa-sinucleína así como la supervivencia tras privación neurotrófica, daño genotóxico, o inhibición de las vías de supervivencia PI3K/Akt o PLC/PKC. En tercer lugar, hemos estudiado la interacción entre alfa-sinucleína y el tóxico parkinsoniano MPTP/MPP+ tanto en cultivos primarios, líneas celulares como en el sistema nervioso simpático in vivo en ratones mutantes nulos para alfa-sinucleína y transgénicos para alfa-sinucleína humana. Este trabajo resulta clave para entender la implicación de la alfa-sinucleína en el sistema nervioso periférico y su relación con la enfermedad de Parkinson y las disfunciones simpáticas derivadas. / Parkinson's disease (PD) is a neurodegenerative disorder characterized by motor dysfunction due to defects in the central nervous system. Abnormalities of the peripheral nervous system characterized by autonomic dysfunction and cardiac sympathetic failure have also been described in patients with PD. Although etiology of the PD remains unknown, evidence points to a role for alpha-synuclein, a presynaptic protein of undetermined function. This protein is the major component of Lewy bodies, typical intraneuronal inclusions in PD brains, and mutations in the alpha-synuclein gene are associated with autosomal dominant forms of the disease. In our study, we have observed that alpha-synuclein is highly expressed in the peripheral nervous system of prenatal and newborn mice. The effect of alpha-synuclein deficiency on sensory and sympathetic neurons was studied by various methods in vivo and in vitro. Proliferation and differentiation studies were developed in alpha-synuclein knockout embryos and neonates along with neuronal survival analyses in cultures of nodose and superior cervical ganglia (SCG). Different paradigms such as neurotrophic, pharmacological and toxic insults have been used to elucidate the role of alpha-synuclein in the survival of peripheral neurons in culture. The effects of overexpressing human alpha-synuclein on cell survival have also been evaluated in cultures of mouse peripheral neurons and PC12 cells, alone or in combination with the parkinsonian toxin MPP+. Differentiation hallmarks such as neuritic growth were evaluated in alpha-synuclein-deficient neurons. In addition to developing ganglia, we have also investigated a role for alpha-synuclein in sympathetic innervation of adult mouse heart with an in vivo approach using a parkinsonian toxin such as MPTP in alpha-synuclein knockout and transgenic mice.

El óxido nítrico es un gas que actúa como neuromensajero en el sistema nervioso central. En el bulbo olfatorio, el óxido nítrico es producido por diferentes tipos de interneuronas que contienen la isoforma neuronal de la enzima sintasa del óxido nítrico (nNOS). En la capa de los glomérulos olfatorios, esta enzima se expresa en algunas células superficiales de axón corto y en algunas células periglomerulares. En la capa de las células granulares, se expresa en algunas células profundas de axón corto y en algunos granos. A pesar de que se conocen muy bien los elementos productores de óxido nítrico en el bulbo olfatorio, no hay estudios que analicen sobre qué dianas actúa este gas. Existen dos grandes vías de actuación del óxido nítrico en el cerebro. Una de ellas implica la unión a la enzima guanilato ciclasa soluble (GCs). La otra implica la actuación directa del óxido nítrico sobre proteínas, nitrosilándolas. En condiciones fisiológicas, la GCs es el receptor más importante del óxido nítrico en los seres vivos. Cuando esta enzima es activada por la unión de óxido nítrico, produce grandes cantidades de GMPc en el interior celular; a su vez, este nucleótido cíclico puede activar como segundo mensajero tres rutas de transducción intracelular diferentes: (a) la de las proteínas kinasas dependientes de GMPc (PKGs); (b) la de las fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos (PDEs); y (c) la de los canales iónicos activados por la unión de nucleótidos cíclicos (CNGs). En este trabajo, nos hemos propuesto determinar qué células del bulbo olfatorio responden al óxido nítrico, tanto por la vía de la GCs/GMPc (determinando además en este caso la ruta de transducción intracelular utilizada por el GMPc) como por la vía de la S-nitrosilación de proteínas. Hemos enfocado nuestro estudio con dos perspectivas diferentes. Por un lado, analizando la acción del óxido nítrico sobre los circuitos neuronales del propio bulbo olfatorio. Por otro, analizando su acción sobre las células de la corriente migratoria rostral que llegan al bulbo olfatorio desde la zona subventricular. Después de analizar los resultados, podemos decir que en el bulbo olfatorio, en condiciones fisiológicas, el óxido nítrico actúa principalmente mediante la vía de la activación de la GCs y la producción de GMPc, siendo muy minoritaria y muy localizada la vía de actuación de la S-nitrosilación de proteínas, que sólo afecta a unas pocas células de la corriente migratoria rostral. En los circuitos neuronales del bulbo olfatorio, el óxido nítrico ejerce su función sólo sobre interneuronas, nunca sobre células principales. Estas interneuronas han sido caracterizadas como células periglomerulares y células profundas de axón corto. Entre las células periglomerulares, las que actúan como diana para la acción del óxido nítrico constituyen una subpoblación muy concreta de células periglomerulares de tipo 2 que expresan la proteína ligante de calcio calbindina D-28k. Entre las células profundas de axón corto que son dianas para la acción del óxido nítrico tenemos células horizontales, células verticales de Cajal (todas ellas expresancalbindina D-28k) y algunas células de Blanes o de Golgi (que expresan la proteína ligante de calcio parvalbúmina o la nNOS). En todas estas interneuronas, la transducción intracelular de las señales del óxido nítrico esta mediada por GMPc que puede actuar sobre algunos CNGs y PDEs, excluyéndose la participación de las PKGs en esta vía de señalización. En las células que integran la corriente migratoria rostral, el óxido nítrico actúa sobre los neuroblastos migrantes utilizando también la vía de la activación de la GCs y la producción de GMPc. En estas células, el GMPc actúa sobre CNGs en cuya composición participa al menos la subunidad A3 y no participa la A2. / Nitric oxide is a gas that plays as a neuromessenger in the central nervous system. In the olfactory bulb, it is produced by different type of interneurons containing the neural isoform of the nitric oxide synthase. It is well known which elements are producing nitric oxide in this brain area, but there are very few studies focused on its targets. Nitric oxide could act by two different pathways: i) it can nitrosylate some proteins (modifying their function) or ii) it can activate the soluble guanylyl ciclase (sGC) enzyme. When this last thing happens, sGC enzyme will produce high levels of second messenger cGMP, which will activate cGMP-dependent protein kinases and/or cGMP-dependent phosphodiesterases and/or cyclic nucleotide-gated ion channels. In this work, our aim was determinate which cell of the olfactory bulb are responding to the nitric oxide following any of the two pathways previously described. We have focused our study in both neuronal circuitry and rostral migratory stream cells. Based in our results, we can say that, in the olfactory bulb, nitric oxide mainly acts activating the sGC enzyme. Nitrosylation of proteins happens only in a very few cells of the rostral migratory stream. In neuronal circuitry, nitric oxide exerts its function in interneurons (a very specific subpopulation of type 2 periglomerular cells and different morphological types of deep short axon cells). In the rostral migratory stream, nitric oxide acts in the migrating neuroblasts activating sGC enzyme; cGMP produced in these cells will activate cyclic nucleotide-gated ion channels mainly assembled with A3 subunit.

La cresta dorsal ventricular posterior (PDVR) y áreas vecinas del telencéfalo de reptiles han sido propuestas como homólogas de la amígdala de mamíferos, ya que, al igual que esta, reciben proyecciones unimodales y multimodales desde regiones del palio, del tálamo y del rombenecéfalo y proyectan al hipotálamo, a través de la stria terminalis, y al tronco cerebral. En mamíferos, la amígdala también presenta proyecciones masivas a todo el estriado, pero los datos de estas proyecciones en reptiles son escasos. Para testar esta hipótesis de homologías, trazamos retrógrada y anterógradamente las proyecciones amígdalo-estriatales en la lagartija Podarcis hispanica y en el ratón. Su comparación nos permitió proponer homologías entre las distintas divisiones amigdalinas de amniotas y mostrar un esquema funcional de la amígdala y el papel que esta ha tenido en la evolución del telencéfalo de los tetrápodos.La amígdala lateropalial contiene regiones corticales y núcleos profundos. En los reptiles, el córtex amigdalino lateropalial está formado por partes del córtex lateral, mientras que en mamíferos está constituido por el núcleo posterolateral cortical y por las áreas de transición con el córtex piriforme. Por otro lado, la amígdala lateropalial profunda la componen el núcleo dorsolateral amigdalino en reptiles y el núcleo basal y el área de transición amígdalo-piriforme en mamíferos. Mientras que el córtex lateropalial presenta proyecciones moderadas al núcleo accumbens, densas al tubérculo olfativo e islotes de Calleja y escasas al estriado dorsal, la amígdala lateropalial profunda presenta proyecciones bilaterales y masivas a todo el estriado. La amígdala ventropalial, también contiene regiones corticales y profundas. El córtex ventropalial está compuesto por el núcleo del tracto olfativo lateral, la amígdala ventral anterior y el núcleo esférico en reptiles y por el núcleo del tracto olfativo lateral, y los núcleos corticales anterior y posteromedial en mamíferos. Por su parte, la amígdala ventropalial profunda incluye en reptiles partes de la PDVR, la amígdala lateral y el área ventral posterior y en mamíferos los núcleos lateral y basal accesorio y el área amígdalo-hipocámpica. Las principales proyecciones estriatales del córtex ventropalial se originan en el córtex vomeronasal (núcleo esférico de reptiles y núcleo posteromedial cortical de mamíferos), que definen una porción del estriado ventral conocida como olfatoestriado en reptiles, y que en mamíferos está constituida por el tubérculo olfativo medial, los islotes de Calleja y los puentes celulares estriatales adyacentes. En la amígdala ventropalial profunda, la porción dominada por estímulos vomeronasales (área amígdalo-hipocámpica en mamíferos, amígdala ventral posterior de reptiles) muestra proyecciones al estriado similares al córtex vomeronasal. La amígdala lateral de mamíferos y las porciones de la PDVR de reptiles homólogas, presentan proyecciones tanto al estriado ventral como al estriado dorsal adyacente. Por último, la amígdala basal accesoria de los mamíferos y su homólogo en los reptiles (amígdala lateral y partes de la PDVR) presentan proyecciones amplias al estriado ventral y a parte del estriado dorsal. Este esquema puede aplicarse al telencéfalo aviar, permitiéndonos entender la organización de la amígdala palial a pesar de la desaparición del sistema vomeronasal y la reducción del olfativo. La amígdala aviar incluye estructuras nombradas como amigdalinas (núcleo posterior de la amígdala, amígdala subpalial y núcleo taeniae) y todo el arcopalio, parte del nidopalio caudal y estructuras lateropaliales adyacentes como el área temporo-parieto-occipital.Todos estos datos sugieren que la amígdala ha evolucionado de forma muy conservadora en los amniotas y que sus conexiones con el estriado apenas han cambiado, indicando su importancia funcional. El telencéfalo ancestral ya incluía un cerebro emocional con la amígdala y sus proyecciones al estriado como elementos fundamentales. En el cerebro emocional de mamíferos ha aparecido una porción del córtex frontal (isocórtex) con el circuito amígdalo-estriatal. / In reptiles, the posterior dorsal ventricular ridge (PDVR) and neighbouring areas have been proposed as the homologous of the mammalian amygdala. One of the properties of the amygdala is its massive connections to the striatum, but the data about theses projections in reptiles are scarce. To test this hypothesis of homologies, we traced retrogradely and anterogradely the amygdalo-striatal projections in the lizard Podarcis hispanica and in mouse. This allowed us to make a proposal of homologies between the amygdaloid divisions of amniotes and a functional diagram of the amygdala and of its role in the evolution of the telencephalon.The amygdaloid lateropallial cortex (Reptiles: parts of the lateral cortex; Mammals: posterolateral cortical nucleus) shows moderated projections to the ventral striatum and scarce to the dorsal striatum. The deep lateropallial amygdala (Reptiles: dorsolateral amygdaloid nucleus; Mammals: basal nucleus) shows bilateral and massive projections to the striatum. The ventropallial cortex origins the striatal projections mainly in the vomeronasal cortex (Reptiles: nucleus sphericus; Mammals: posteromedial cortical nucleus) which reach specific areas in the ventral striatum (olfatostriatum in reptiles and islands of Calleja in mammals). The deep ventropallial amygdala projects in a complex way to the striatum. Its vomeronasal portion (Reptiles: ventral posterior amygdala; Mammals: amygdalo-hippocampal area) projects to the striatum in a similar way to the vomeronasal cortex. The lateral amygdala and its homologous in reptiles (portions of the PDVR) and the basal accessory amygdala and its homologous in reptiles (lateral amygdala and parts of the PDVR) show wide projections to the ventral and the dorsal striatum. This diagram could be applied to the avian amygdala, which includes structures named as amygdaloid regions (posterior nucleus of the amygdala, subpallial amygdala and nucleus taeniae) and the arcopallium, part of the caudal nidopallium and adjacent lateropallial estructures (temporo-parieto-occipitalis area).All these data suggest that the amygdala of amniotes has evolved in a very conservative way and that its connections with the striatum have hardly changed. This is indicative of its functional importance. The ancestral telencephalon included already an emotional brain with the amygdala and its projections to the striatum as essential elements.

Las feromonas sexuales masculinas atraen a de manera innata a las hembras de ratón. Estos estímulos no sólo son explorados intensa y preferentemente por las hembras sino que inducen preferencia condicionada de lugar (PCL), lo cual constituye una prueba de que la detección de las feromonas de macho es una recompensa para las hembras. Así pues, la utilización de feromonas sexuales proporciona un modelo novedoso para para el estudio de los mecanismos y las bases neurales de los procesos de refuerzo. En la tesis doctoral "Neuroquímica del refuerzo inducido por feromonas" se pretendió explorar cuales son los neurotransmisores que regulan el comportamiento de atracción innata por feromonas de macho y la adquisición de PCL, así como investigar sobre qué estructuras cerebrales estan actuando estos neurotransmisores. Para ello, se utilizó una aproximación farmacológica sobre protocolos comportamentales, y se complementó la información derivada de estos experimentos con lesiones de ciertos núcleos cerebrales. Adicionalmente, se compararon los resultados obtenidos con estos experimentos con el papel de algunos de los neurotransmisores estudiados en el refuerzo inducido por otras recompensas naturales, como el sabor dulce. En primer lugar, el estudio de los sistemas catecolaminérgicos (dopamina y noradrenalina) reveló que los fármacos agonistas dopaminérgicos, principalmente a través del receptor D1 de la dopamina, inhiben la atracción innata por feromonas de macho, mientras que ni los antagonistas dopaminérgicos ni los agonistas noradrenérgicos afectan al refuerzo de feromonas. A continuación se estudiaron diversos fármacos opioidérgicos, lo cual mostró que un antagonista genérico de opioides no afecta ni a la atracción innata ni a la adquisición de PLC, mientras que un agonista de los receptores µ de opioides elimina la preferencia innata por feromonas de macho. Los mismos fármacos produjeron un efecto opuesto sobre el consumo preferente de una solución azucarada, sugiriendo que estímulos químicos naturales recompensantes (sacarosa y feromonas sexuales), que son detectados por distintos sistemas sensoriales, utilizan diferentes mecanismos neurobiológicos para ejercer su efecto reforzante. Se estudiaron asimismo los efectos de fármacos serotonérgicos, pero los resultados obtenidos no arrojaron conclusiones sólidas acerca del papel de la serotonina en el refuerzo de feromonas. Por el contrario, al investigar el papel del óxido nítrico se demostró que la inhibición farmacológica de la síntesis de este neurotransmisor gaseoso bloquea la atracción innata por feromonas de macho. En el contexto de los datos anatómicos y neuroquímicos disponibles, se procedió por último a investigar el efecto de lesiones electrolíticas de la zona de proyección de la corteza vomeronasal (el sistema que detecta las feromonas atractivas en ratones) sobre el estriado ventral, que se supone el centro del sistema del refuerzo. Estas lesiones, comprendiendo la zona de los islotes de Calleja mediales, eliminaron la respuesta de atracción innata por feromonas de macho.En resumen, los resultados de esta tesis revelan que el comportamiento de atracción innata que muestran las hembras de ratón por feromonas sexuales de macho depende de las proyecciones de la corteza vomeronasal sobre el estriado ventral, que se inhiben por la activación farmacológica de los sistemas dopaminérgicos y opiáceos, y se facilitan por la acción del óxido nítrico. Este estudio tiene implicaciones para la comprensión profunda de los procesos del refuerzo, cuyo mal funcionamiento deriva en estados patológicos como las adicciones a drogas o a comportamientos compulsivos, así como para la comprensión de los mecanismos de la comunicación social en roedores. / Female mice display an innate attraction towards male sexual pheromones, which in addition are reinforcing to them, as demonstrated by the induction of conditioned place preference rewarded by male-soiled bedding. Thus, male sexual pheromones provide an original and advantageous model to study reward mechanisms and neural basis. The thesis "Neurochemistry of pheromone-induced reward" aimed to explore what neurotransmitters control innate attraction and place preference acquisition conditioned by male pheromones, as well as the brain nuclei where they are acting. To do so, it was used a pharmachological approach and lesions of brain nuclei upon behavioural protocols involving pheromone-elicited behaviours. Additionally, the results from these experiments were compared with the role of studied neurotransmitters in sweet reward. First, studies involving catecholaminergic systems revealed that dopaminergic agonists, through D1 receptor, inhibit innate attraction towards male pheromones, whereas dopaminergic or noradrenergic antagonists do not affect pheromone reward. Similarly, opioidergic agonists abolish innate attraction towards male pheromones, but this behavoiour and place preference acquisition are not affected by opioidergic antagonists. Quite the opposite, opioidergic antagonists reduce, and agonists do not affect, preference for a sucrose solution in front of plain water. On the other hand, nitric oxide synthesis inhibition blocked innate attraction towards male pheromones, whereas serotonergic drugs use gave rise to inconclusive results. Finally, electrolytic lesions of the zone of the ventral striatum which receives direct projections from the vomeronasal cortex (centred at the medial islands of Calleja) abolished innate attraction as well. Taken together, the results of the thesis reveal that innate attraction behaviour that show female mice for male sexual pheromones depends on vomeronasal projections upon ventral striatum, which are inhibited by dopamine and opioids and facilitated by nitric oxide.

En el presente proyecto se estudió el efecto de dos drogas adictivas, el tolueno y la cocaína, sobre la neurogénesis hipocámpica. Los experimentos diseñados para ambas drogas, abordaron el estudio de la neurogénesis, a través de la medida de proliferación, supervivencia, diferenciación y migración. Además se analizó el efecto ultraestructural que ambas drogas causan sobre el giro dentado. De forma más exhaustiva, se estudió el efecto producido por una administración crónica del tolueno, durante el desarrollo del animal. Por último, se estudiaron los efectos de este tratamiento sobre la memoria y el aprendizaje. En los experimentos con cocaína, se estudió el efecto sobre la proliferación, supervivencia y maduración, tras una exposición a corto plazo (8 días) y largo plazo (24 días) a la cocaína. Para ello, se realizó un experimento de proliferación, en el que se determinó que tanto a los 8 días como a los 24 días de tratamiento, se producía una reducción de la tasa de proliferación celular. En el segundo experimento, se determinó que la exposición crónica a la cocaína no alteraba la supervivencia de las nuevas células generadas. En el tercer experimento, se observó que el tratamiento con cocaína no afectaba la amplitud de las arborizaciones dendríticas, ni modificaba el desarrollo neuronal. Mediante el uso del microscopio electrónico, se observó que no existían cambios en las diferentes características analizadas, relativas a la ultraestructura de los botones sinápticos de la proyección de las fibras musgosas del CA3 provenientes del giro dentado hipocámpico. Los experimentos con tolueno se realizaron bajo dos protocolos de administración diferentes. En el primero, los animales inhalaron tolueno durante 24 días, mientras que en el segundo se estudió el efecto de una exposición crónica al tolueno durante 72 días y los efectos en sus crías, que fueron expuestas al tolueno durante su gestación y en la etapa postnatal temprana mediante la leche materna. De estos experimentos con tolueno, se pudo concluir que el solvente induce estrés oxidativo en el cerebro del animal, que a su vez produce un aumento de la muerte celular, y como respuesta, se produce un aumento de la supervivencia celular, de la maduración, una activación de la microglía, y una astrogliosis reactiva. Además, el análisis de la ultraestructura del giro dentado de los animales expuestos al tolueno, mostró la desorganización de la capa granular, la modificación de la morfología de las células granulares, y variaciones en su tamaño. Aunque no se encontraron diferencias en los nichos neurogénicos entre animales control y los tratados con tolueno. Como complemento a los análisis hechos, se realizaron estudios de conducta, para el experimento de exposición al tolueno durante 72 días. Estos estudios mostraron que no se producía una hiperactivación en la actividad locomotora, tanto de las madres como de las crías expuestas al tolueno. Además, se realizaron pruebas de reconocimiento de lugar y de objetos, que mostraron resultados diferentes para las madres y las crías. Las ratas madres, expuestas al tolueno durante su etapa adulta,no mostraron diferencias estadísticamente significativas, por lo que se puede concluir que no vieron afectadas sus capacidades cognitivas ni de percepción. En cambio, en las crías expuestas al solvente durante su desarrollo, si que se vieron afectadas ambas capacidades. En conclusión, la cocaína y el tolueno, bajo estos modelos de exposición y dosificación empleados, tienen efectos evidentes sobre la neurogénesis en el hipocampo, aunque será necesario seguir investigando, para conocer con mayor detalle los efectos de ambas drogas sobre la neurogénesis y el hipocampo. / Recent observations indicate that drugs of abuse, including alcohol and opiates, impair adult neurogenesis in the hippocampus. The purpose of this work was studying the impact of cocaine and toluene treatment on cell proliferation, survival and maturation in rats. Furthermore the ultrastructural effects caused by these two drugs have also been analyzed in the dentate gyrus. And finally the behavioural study of the effect of a chronic administration of toluene. The studies with cocaine focused on the effect of treatments following shortterm (8-day) and long-term (24-day) exposure. With this drug one concluded that both short- and long-term cocaine exposures significantly reduced cell proliferation in the dentate gyrus (DG) of the hippocampus, but the survival, the maturation and the ultrastructural of the dentate gyrus was not affected by this drug. In register with this finding, cocaine chronic exposure did not increase the number of apoptotic cells, so this drug did not alter the cell death. Moreover, cocaine did not produce significant morphological alterations of the mossy fiber projection system to “stratum lucidum” in the CA3 area of the hippocampus. On the other hand, two experiments were carried out with toluene. In the first one the toluene was administered for 24 days and, in the second one, the drug was inhaled by adult rats for 72 days and by their pups during their development and postnatal early stage. In the study of toluene for 24 days an increase in the cell survival and in maturation was observed in treated rats. And in comparison with these in the experiment for 72 days a decrease on cell survival was observed in pups but not in the adult rats, and in concordance with these the cell differentiation was affected by toluene. In addition to this, the length of the dendritic arborization was increased in the brain of the animals treated with toluene, in both, pups and adult rats. With these experiments we can conclude that the toluene induces oxidative stress in the brain of the treated animals, and this stress produces an increase in the cell death and as result of this an activation of the cells of astroglia and microglia takes place. In addition, the ultrastructural analyses using an electron microscopy showed a disorganization of the granular layer of the dentate gyrus of the animals treated with toluene, and an alteration was observed in the morphology of the granular cells and variability in the shape of these cells. Basing on the results of the behaviour experiments, it can be concluded that the animals treated with toluene were showing hyperactivity, and their results in the objects and place recognition test were worse than the ones obtained by the control rats in pups, and no effect was observed in the adult rats. To sum up, cocaine and toluene, under these specific treatments, affect the neurogenesis of the hippocampus, but it would be necessary to r carry out further experiments with these drugs to know the effects on the hippocampal neurogenesis better.

La patogénesis de la fasciolosis depende de la carga parasitaria y del tamaño de los trematodos adultos. En zonas de hiperendemia, las intensidades individuales de parasitación humana pueden alcanzar niveles muy altos, estando la mayoría de los individuos parasitados en la fase de cronicidad avanzada. En este estudio se ha utilizado el modelo experimental de fasciolosis en rata Wistar por ser un modelo animal útil que mimetiza la fasciolosis crónica avanzada en humanos. Se ha infectado un total de 169 ratas con 20 metacercarias/rata vía oral, llevándose a cabo los siguientes análisis: A) Estudio la influencia de la intensidad individual de infección por rata (entendiendo la intensidad de infección como el número de trematodos por hospedador en el canal biliar principal) sobre: a) el desarrollo del adulto; b) el tiempo comprendido entre la ingestión de metacercarias y la presencia de huevos en heces (el periodo prepatente, pp) y c) el número de huevos por gramo de heces y por adulto (hgh/adulto). B) Estudio la influencia de la presencia de litiasis sobre el desarrollo del adulto. C) Estudio la influencia del género del hospedador definitivo experimental sobre la producción de huevos (hgh). Se ha calculado las trayectorias ontogenéticas de las siguientes medidas biométricas: área corporal (AC), perímetro corporal (P), anchura corporal (AnC) y longitud corporal (LoC). En los grupos analizados las trayectorias ontogenéticas de las medidas siguen un modelo logístico [y = ym / {1 + z0 exp (-kt)}, donde ym es el valor máximo al cual tiende la variable biométrica y; z0 y k = parámetros de las trayectorias; t= tiempo]. Los resultados obtenidos muestran que cuando el número de adultos aumenta, el valor de ym de estas medidas (AC, P, LoC y AnC) disminuye. El “crowding effect” se manifiesta cuando las medidas corporales del Trematodo adulto se aproximan a los valores máximos alcanzados en la fase de cronicidad avanzada. En las últimas fases de desarrollo, las tasas de crecimiento de las medidas corporales son más altas cuando menor es la carga parasitaria. El pp y los hgh/adulto se muestran dependientes del nivel de infección, disminuyendo cuando la carga parasitaria aumenta. Esto significa que el número de huevos por gramo de heces tiende a desestimar la carga parasitaria. En todas las medidas biométricas analizadas, los valores del tiempo en el punto de inflexión en el modelo logístico son similares a los datos empíricos sobre el pp, es decir, el momento donde empieza la emisión de huevos. Los resultados muestran que los adultos de F. hepatica alcanzan un menor desarrollo corporal cuando existe la presencia de litiasis concomitante en los conductos hepáticos. El estudio de la influencia del género del hospedador definitivo experimental revela que, en la fasciolosis crónica avanzada, en hembras Wistar (con una intensidad individual de infección de Trematodos adultos por rata similar a los machos) existe una mayor producción de hgh que en machos. Los resultados obtenidos muestran que la intensidad de infección, la litiasis y el género del hospedador definitivo son factores a tener en consideración cuando estudiamos el desarrollo de los adultos de F. hepatica en el modelo Wistar en la fase crónica avanzada. La consideración de estos factores es de interés tanto en estudios epidemiológicos, como en estudios experimentales in vivo sobre la acción de fármacos antihelmínticos y vacunas, patología, inmunología y resistencia. / Fascioliasis pathogenesis depends on fluke burden and size. In human hyperendemic zones, individual infection intensities can reach very high levels being the majority of infected subjects in the advanced chronic phase. Wistar rat model has been used due to the fact it offers a useful approach for pathological research in the advanced chronic period in humans. 169 rats have been orally infected with 20 metacercariae/rat, developing the following tests: (i) influence of infection intensity per rat on fluke development (adult’s development, time between metacarcariae intake and presence of eggs in faeces, and number of eggs per gramme of faeces and adult); (ii) influence of lytiasis on the adult’s development; and (iii) influence of the experimental definitive host genus on egg production. Ontogenetic trajectories of fluke body measurements (AC, P, AnC and LoC), followed a logistic model. Results showed that (i) when burden increases, maximum values of fluke body measurements decrease; (ii) crowding effect is apparent when fluke measurements approximate their maximums in the advanced chronic stage; (iii) pre-patent period (pp) and egg production (hgh) decrease when fluke burden increases, meaning that measurements of eggs per gramme of faeces tend to underestimate the fluke burden; (iv) adults of F. hepatica reach a lower body development when concomitant lytiasis is observed in liver ducts; (v) when fasciolasis chronic stage, egg production is higher in Wistar rat females. Thus, intensity of infection, lytiasis and definitive host genus are factors to take into consideraction when studying the development of the adults of F. hepatica in Wistar model on an advanced fasciolasis chronic stage. This quantification may be of great interest in both, epidemiological studies and experimental research on the in vivo actions of different anthelminthic drugs and vaccines, pathology, immunology and resistance studies.