MicroRNAs sind kurze, nicht-kodierende Ribonukleinsäuren, die eine wichtige Rolle bei der Genregulation spielen. Sie sind an vielen physiologischen Prozessen beteiligt und werden als vielversprechende Kandidaten für eine neue Generation von Biomarkern gehandelt. Die Quantifizierung von miRNAs aus Blut oder anderen Körperflüssigkeiten verspricht eine frühe Diagnose verschiedener Krankheitsbilder. Dazu zählen neben zahlreichen Krebsformen unter anderem auch Autoimmun- oder Herz-Kreislauferkrankungen. Um diese Biomarker schnell, sensitiv und spezifisch detektieren zu können, werden geeignete Detektionssysteme benötigt. Dabei liegt ein besonderer Fokus auf der Entwicklung von Point-of-Care-Systemen, die eine automatisierte Durchführung mit einfacher Handhabung verlangen. Mikrochips können als leistungsfähige technische Hilfsmittel für eine robuste und miniaturisierte Signalerfassung an biochemischen Grenzflächen dienen. Auf der Grundlage eines CMOS-Chips mit einem Sensorarray aus interdigitalen Gold-Elektroden sollte in dieser Arbeit eine quantitative und multiplexfähige miRNA-Detektionsmethode mit elektrochemischer Signaltransduktion entworfen und untersucht werden. Weitere wichtige Zielfaktoren waren eine einfache und schnelle Durchführbarkeit, eine hohe Spezifität und eine gute Sensitivität bei gleichzeitigem Verzicht auf Amplifikation und Vormarkierung des Ausgangsmaterials. Es wurden verschiedene Methoden entworfen, überprüft, untersucht, optimiert und weiterentwickelt. Das beste Ergebnis wurde letztlich mit einem als Sandwich-Ligations-Methode bezeichneten Verfahren erzielt. Dabei wird zunächst ein aus zwei doppelsträngigen Assay-Komponenten und der Ziel-miRNA bestehender dreiteiliger Hybridisierungskomplex gebildet, der eine beidseitige spezifische Ligation der miRNA mit einem auf der Sensoroberfläche immobilisierten Fängerstrang und einem enzymmarkierten Reporterstrang vermittelt. Durch einen anschließenden Waschschritt werden alle überschüssigen Markierungen vom Detektionsbereich entfernt, so dass bei der Detektion nur Reporterenzyme ausgelesen werden, die über die Ziel-miRNA kovalent mit dem immobilisierten Strang verbunden sind. Dieses Signal ist daher proportional zur Ausgangskonzentration der gesuchten miRNA. Die Methode wurde mit Hilfe von synthetischen miRNAs etabliert und optimiert. Sie erreichte eine analytische Sensitivität von unter 1 pM Ziel-Nukleinsäure bei einer Gesamt-Versuchsdauer von nur 30 Minuten. Konzentrationsreihen demonstrierten einen linearen dynamischen Messbereich zwischen 1 pM und 1 nM, der eine verlässliche Quantifizierung der detektierten miRNAs in diesem Bereich ermöglicht. Die sehr gute Spezfifität des Assays zeigte sich bei der Untersuchung des Einflusses verschiedener IsomiRs auf das Messergebnis sowie im Rahmen von Experimenten mit miRNAs der let-7-Familie. Dabei konnten Ziel-Nukleinsäuren mit Einzelbasenunterschieden klar differenziert werden. Die Multiplexfähigkeit der vorgestellten Methode wurde durch die gleichzeitige Quantifizierung von bis zu acht miRNAs auf einem CMOS-Chip demonstriert, zuzüglich Kontrollen. Die Validierung der Detektionsmethode erfolgte mit Gesamt-RNA-Extrakten aus Vollblutproben. Dazu wurde ein kardiales Panel aus acht miRNAs, die auf Basis von Studien zu zirkulierenden miRNAs bei Herzerkrankungen ausgewählt wurden, festgelegt. Mit Hilfe der entsprechenden optimierten Detektionskomponenten wurden aus Spenderblut gewonnene endogene miRNAs analysiert. Dabei zeigte sich für fünf der acht Kandidaten sowohl eine solide Korrelation zwischen eingesetzter Gesamt-RNA-Menge und Messsignal, als auch eine gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Die Konzentrationen der übrigen drei miRNAs lagen nah am unteren Detektionslimit und lieferten daher keine verlässlichen Daten. Mit Hilfe sogenannter branched DNA zur Signalamplifikation könnte bei Bedarf die Sensitivität des Assays noch verbessert werden, was durch weitere Experimente dieser Arbeit demonstriert wurde. Ein Vergleichsexperiment zwischen der Sandwich-Ligations-Methode und qRT-PCR zeigte nur eine schwache Korrelation der Messergebnisse. Dies ist jedoch konsistent mit anderen Studien zur Vergleichbarkeit unterschiedlicher Detektionsmethoden. Abschließend wurden die miRNAs des kardialen Panels in Gesamt-RNA-Extrakten aus Vollblut von Herzinfarktpatienten und Kontrollen mit der entwickelten Detektionsmethode analysiert und die Ergebnisse verglichen. Dabei konnten Abweichungen in den Konzentrationen von miR-15a und miR-425 aufgedeckt werden. Eine entsprechende diagnostische Untersuchung mit der hier vorgelegten und validierten Detektionsmethode könnte eine Alternative oder Ergänzung zu aktuell eingesetzten proteinbasierten Tests bieten. / MicroRNAs are short, non-coding ribonucleic acids that play an important role in gene regulation. They are involved in many physiological processes and therefore considered as auspicious candidates for a new generation of biomarkers. The quantification of miRNAs from blood or other body fluids promises early diagnosis of various diseases, including autoimmune disorders, cardiovascular disease as well as different types of cancer. For a fast, sensitive and specific detection of these biomarkers, suitable detection systems are needed. A particular focus is thereby on the development of point-of-care systems, which require an automatized work-flow with easy handling. Microchips are powerful technical tools for a robust and miniaturized signal acquisition at biochemical interfaces. Based on a CMOS chip providing an array of interdigitated gold electrode sensors, a quantitative multiplex miRNA detection method with electrochemical readout should be designed and investigated in this work. A fast and easy workflow, a high specificity and a good sensitivity without amplification or prelabeling of the target material were additional important goals. Several approaches were designed, tested, investigated, optimized and refined. In the end a method labeled as Sandwich Ligation Assay provided the best results. In this procedure, a tripartite hybridization complex is created by two double-stranded assay components and the target nucleic acid. This formation mediates a specific both-sided ligation of the miRNA to an immobilized capture strand on the sensor surface and to an enzyme-linked reporter strand. A subsequent washing step removes all excessive label conjugates from the sensor array. Thus only reporter enzymes that are covalently bound to the immobilized capture strand via the target miRNA are measured during detection. The acquired signal is therefore proportional to the initial concentration of the respective target. The Sandwich Ligation Assay was established and optimized using synthetic miRNAs. A sensitivity of less than 1 pM nucleic acid target could be achieved at a time to result of only 30 minutes. Generated concentration curves showed a linear dynamic range between 1 pM and 1 nM allowing a reliable quantification of detected miRNAs in this scope of measurement. Experiments with miRNAs of the let-7 family that exhibited only one or two nucleotide differences demonstrated a very good specificity of the presented method, as did the investigation of the influence of IsomiRs on the measurement signal. The ability of multiplex measurement was verified by the simultaneous quantification of up to eight miRNAs plus controls on one CMOS chip. The detection method was validated using total RNA extracts gained from whole blood samples. Therefore a cardiac panel composed of eight miRNA candidates was assorted by leveraging the results of studies about circulating miRNAs in heart disease. The optimized corresponding detection components were used to analyze endogenous miRNAs from donor blood. Five of the eight candidates showed a solid correlation between the applied amount of total RNA and the measurement signal as well as a good reproducibility of results with CV values ranging from 0.04 to 0.13. The concentrations of the three remaining miRNAs were too close to the lower detection limit and hence didn’t provide reliable data. A signal amplification using so-called branched DNA can be integrated into the measurement procedure to further enhance the sensitivity of the assay, if required. This was demonstrated by additional experiments of this thesis. A comparison between the Sandwich Ligation Assay and qRT-PCR showed only weak correlation of measurement results, which is in line with previous studies about interplatform comparability. Finally, the miRNAs of the cardiac panel were analyzed in total RNA samples extracted from whole blood of patients with myocardial infarction and controls using the established detection method. By comparison of the results dysregulations of the particular miRNAs miR-15a and miR-425 could successfully be identified. A respective diagnostic test using the proposed measurement procedure could provide an alternative or a complement to the currently applied immunoassays.

Eine intrauterine Gestationsdiabetes (GDM) Exposition induziert in den betroffenen Nachkommen eine lebenslang erhöhte Prädisposition für metabolische und komplexe Erkrankungen. Die Krankheitssuszeptibilität wird dabei durch epigenetische Veränderungen vermittelt, die sich über die Regulation der Genaktivität auch auf das Expressionsniveau und den Phänotypen auswirken. Um neue Gene zu finden, die eine Rolle in der fetalen Programmierung spielen, wurden in dieser Arbeit genomweite Methylierungsmuster von Nabelschnurbluten (FCBs) aus GDM-Schwangerschaften und Kontrollen miteinander verglichen. Mit Illumina Infinium HumanMethylation 450K Arrays konnten signifikante Gruppenunterschiede für insgesamt 65 CpG-Stellen (52 davon genassoziiert) festgestellt werden, die multiplem Testen standhielten. Mittels Pyrosequenzierung wurden vier dieser Kandidaten-Loci (ATP5A1, MFAP4, PRKCH, SLC17A4), sowie ein Gen aus der Literatur (HIF3A) genauer untersucht und die Effekte erfolgreich validiert. Für das zugrundeliegende multivariate Regressionsmodell wurden die potenziellen Störfaktoren Gestationsalter, kindliches Geschlecht und mütterlicher BMI berücksichtigt. Der GDM-Effekt zeigte sich stärker in der insulinbehandelten Subgruppe (I-GDM) als in der diätisch behandelten (D GDM) und scheint insgesamt multifaktoriell bedingt zu sein, da viele Gene betroffen waren, jedoch alle mit einer vergleichsweise niedrigen Effekt-Größe. Zusätzlich konnten für den MEG3 Promotor, MEST und PEG3, drei von vier geprägten Genen, die mittels Deep Bisulfite Sequencings (DBS) analysiert wurden, ebenfalls signifikante Methylierungs-unterschiede zwischen der GDM- und Kontroll-Gruppe detektiert werden. Die identifizierten Gene stellen labile Zielregionen für die GDM-induzierte intrauterine Programmierung dar und können zukünftig nützliche Biomarker für Krankheitsdiagnosen und Prognosen sein. Mittels DBS können darüber hinaus Einzelmolekül-Analysen durchgeführt werden, für die in differentiell methylierten Regionen (DMRs) anhand eines informativen SNPs die parentale Allel-Herkunft bestimmt und bei der Berechnung von Epimutationsraten einbezogen werden kann. Epimutationen wurde als solche gewertet, wenn sie ein > 50 % abnormal (de)methyliertes Methylierungsprofil aufwiesen. Die DBS-Daten wurden mit zwei verschiedenen Sequenzierplattformen generiert (Roche GS Junior und Illumina MiSeq). Für Zweitere wurde ein eigenes, unabhängiges Library-Präparations-Protokoll entwickelt. In Nabelschnurblut, adultem Blut und Viszeralfett wurden für die paternal exprimierte MEST Promotor DMR und die maternal exprimierte MEG3 intergenic (IG) DMR hohe Epimutationsraten für das jeweils unmethylierte Allel detektiert. Die geprägten (methylierten) Allele wiesen dagegen nur niedrige Epimutationsraten auf. Da MEST und MEG3 invers geprägte Gene sind, war die Hypermethylierung des nicht geprägten Allels (HNA) demnach unabhängig von der parentalen Allel-Herkunft. Die HNA scheint außerdem erst nach der Fertilisation aufzutreten, da in Spermien nur sehr wenige Epimutationen gefunden wurden. Für die sekundäre MEG3 Promotor DMR (deren Prägung von der primären MEG3 IG-DMR reguliert wird) wurde ein deutlich schwächerer, wenngleich signifikanter HNA-Effekt im FCB gemessen, für die paternal exprimierte PEG3 Promotor DMR konnte dagegen kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden parentalen Epimutationsraten festgestellt werden. Der HNA-Effekt für die MEST DMR, MEG3 IG-DMR und MEG3 Promotor DMR war weder mit GDM noch mit Adipositas assoziiert und zeigte allgemein eine große interindividuelle Varianz. Die Aufrechterhaltung differenzieller Methylierungsmuster in Imprinting Kontrollregionen (ICRs) scheint in manchen Entwicklungs-Zeitspannen von großer Bedeutung und damit streng kontrolliert zu sein, später jedoch redundant zu werden, was sich in der Anreicherung von stochastischen sowie umweltinduzierten Fehlern auf dem nicht geprägten Allel äußern kann. HNA-suszeptible geprägte Gene ähneln in mancherlei Hinsicht metastabilen Epiallelen. Diese Studie zeigt, dass sowohl stochastische Faktoren als auch Umweltstimuli während der frühen embryonalen Entwicklung u.a. über HNA-Effekte geprägte Gen-Netzwerke programmieren, die in Wachstumsprozesse involviert sind. Um tiefere Einblicke in allelspezifische Prägungsprofile zu erhalten, wären umfangreiche DBS HNA-Längsschnittstudien aller 50-100 human geprägten Gene in unterschiedlichen Gewebetypen und Differenzierungsstadien wünschenswert. / Intrauterine exposure to gestational diabetes mellitus (GDM) induces lifelong increased predisposition for metabolic and complex diseases in the exposed progeny. The elevated disease susceptibility is transmitted via epigenetic alterations that influence gene expression levels and phenotypes through regulation of gene activity. Genome-wide methylation profiles of fetal cord bloods (FCBs) were investigated in GDM and control pregnancies in order to identify new genes susceptible to fetal programming. After multiple testing correction, we found 65 significantly differentially methylated CpG sites between GDM and control groups (52 of which were gene associated) within the Illumina Infinium HumanMethylation 450K array data. Using pyrosequencing, we successfully confirmed the observed results in four of these candidate loci (ATP5A1, MFAP4, PRKCH, SLC17A4) and one gene from the literature (HIF3A). A multivariate regression model was adjusted for the confounding factors gestational age, fetal sex and maternal BMI. The GDM effect was stronger within the insulin treated subgroup (I-GDM) compared to the dietary subgroup (D GDM), suggesting that GDM is a multifactorial disease evidenced by changes of small effect size in multiple genes. Significant mean methylation differences were detected between the GDM group and controls in three out of four imprinted genes (MEG3 promoter, MEST and PEG3) that were analyzed with Deep Bisulfite Sequencing (DBS). The identified genes represent labile target regions for GDM-induced intrauterine programming and could represent future biomarkers for disease diagnosis and prognosis. Furthermore, DBS enables sequencing at a single allele resolution and the calculation of allele specific epimutation rates by differentiating the parental origin of alleles via an informative SNP within differentially methylated regions (DMRs). Epimutations were characterized as alleles showing > 50 % aberrantly (de)methylated CpG sites. DBS data were generated using two different sequencing platforms (Roche GS Junior and Illumina MiSeq). An independent library preparation protocol was established for Illumina MiSeq sequencing. The paternally expressed MEST promoter DMR and the maternally expressed MEG3 intergenic (IG) DMR showed high epimutation rates for the unmethylated alleles in FCB, as well as adult blood and visceral adipose tissue. On the contrary, only minor epimutation rates were displayed by the imprinted (methylated) alleles. Thus, hypermethylation of the non-imprinted allele (HNA) was independent of parental origin, as MEST and MEG3 are opposingly imprinted genes. Very low epimutation rates in sperm indicate that the HNA effect arises after fertilization. A weak but significant HNA was also found for the secondary MEG3 promoter DMR (which is known to be regulated by the MEG3 IG-DMR). The paternally expressed PEG3 promoter DMR showed no HNA and no difference in parental epimutation rates. The observed HNA effect (for the MEST DMR, the MEG3 IG-DMR and the MEG3 promoter DMR) was neither associated with GDM nor obesity and exhibited a large interindividual variance. Maintenance of differential methylation profiles in imprinting control regions (ICRs) seems to be of great importance during some developmental periods and is therefore strictly controlled in germ cells. Later on, it might become redundant manifested in the accumulation of stochastic as well as environmentally-induced errors on the non-imprinted allele. There is evidence that HNA-susceptible imprinted genes resemble metastable epialleles in many aspects. Therefore, we suggest that stochastic as well as environmental stimuli program imprinted gene networks that are important for growth related processes during early development using HNA. Further longitudinal studies of all 50 – 100 imprinted genes would benefit in a deeper insight in allele-specific imprinting patterns of various human tissues.

Die Evolution der Primaten zeigt eine Verbindung zwischen der zunehmenden Komplexität des sozialen Verhaltens und der Vergrößerung des humanen Gehirns, insbesondere des präfrontalen Cortex. Deshalb stellt der präfrontale Cortex bezüglich der Evolution des Menschen eine der interessantesten Strukturen im humanen Gehirn dar. Es wird angenommen, dass nicht allein die Größe, sondern auch die Funktion, vor allem das Zusammenspiel von Neuronen und nicht-neuronalen Zellen, wie z.B. Gliazellen, zur Differenzierung des menschlichen Gehirns von dem rezenter Primaten geführt hat. Daraus lässt sich schließen, dass die Gehirnfunktionen über eine ausgeglichene und gut aufeinander abgestimmte transkriptionelle Landschaft kontrolliert werden, die durch ein zugrundeliegendes genetisches und epigentisches Rückgrat organisiert ist. In dieser Studie wurden das Methylierungsprofil neuronaler und nicht-neuronaler Zellen des präfrontalen Cortex (Brodmann-Areal 10) von drei Menschen und drei Schimpansen miteinander verglichen. Die intra- und interspezifischen differenziell methylierten Regionen (DMRs) waren in bestimmten genomischen Regionen angereichert. Intraspezifische Methylierungsunterschiede zwischen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen konnten dreimal häufiger beobachtet werden als interspezifische Unterschiede in den einzelnen Zelltypen. Rund 90% der humanen intraspezifischen DMRs wiesen eine Hypomethylierung in den neuronalen Zellen im Vergleich zu den nicht-neuronalen Zellen auf. In den intraspezifischen DMRs (Mensch und Schimpanse) waren Gene angereichert, die mit verschiedenen neuropsychiatrischen Erkrankungen assoziiert sind. Der Vergleich zwischen Menschen und Schimpanse in den neuronalen und nicht-neuronalen Zelltypen zeigte eine Anreicherung von Genen mit human-spezifischer Histonsignatur. In den nicht-neuronalen Zellen konnten mehr interspezifische DMRs (n=666) detektiert werden als in den neuronalen Zellen (n=96). Ungefähr 95% der nicht-neuronalen interspezifischen DMRs waren im Menschen, im Vergleich zum Schimpansen, hypermethyliert. Daraus ergibt sich der Eindruck, dass mehrere hundert der nicht-neuronalen Gene während der humanen Gehirnevolution einer Methylierungswelle unterlagen. Dies führt zu der Annahme, dass der Einfluss dieser Veränderungen in den nicht-neuronalen Zellen auf die Vergößerung des menschlichen Gehirns bisher stark unterschätzt wurde. Die bekannteste genetische Ursache für erblichen Brust- und Eierstockkrebs sind Mutationen in den Tumorsuppressorgenen (TSG) BRCA1 und BRCA2. Dennoch können nur rund 20-25% der familiären Brustkrebserkrankungen über Keimbahnmutationen in BRCA1/BRCA2 erklärt werden, besonders bei Frauen, deren Erkrankung vor dem vierzigsten Lebensjahr auftritt. Epigenetische Veränderungen, die zu einer aberranten Genexpression führen, spielen ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Karzinogenese und der Entwicklung einer Brustkrebserkrankung. Es ist bekannt, dass TSG nicht nur durch den Verlust der Heterozygotie (engl. loss of heterozygosity, LOH) oder homozygote Deletionen, sondern auch durch transkriptionelle Stilllegung via DNA-Methylierung inaktiviert werden können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde überprüft, welchen Einfluss aberrante Methylierungsmuster im Promotorbereich von TSG auf die Brustkrebskarzinogenese und die Expression der Gene haben. Für die Quantifizierung der Epimutationen wurden die Promotorbereiche von acht TSG (BRCA1, BRCA2, RAD51C, ATM, PTEN, TP53, MLH1, RB1) und des estrogene receptor (ESR1) Gens, welches eine Rolle in der Tumorprogression spielt, mittels Deep Bisulfite Amplicon Sequencing (DBAS) analysiert. Es wurden Blutproben von zwei unabhängigen BRCA1/BRCA2-mutationsnegativen Brustkrebs (BC)-Patientenkohorten, sowie von zwei unabhängigen alters-gematchten, gesunden Kontrollkohorten untersucht. BC-Kohorte 1 beinhaltet early-onset (EO) BC-Patientinnen. Kohorte 2 enthält BC-Patientinnen mit einem Risiko von >95% eine heterozygote Mutation in BRCA1/BRCA2 (high-risk, HR) zu tragen. Allele mit >50% methylierten CpGs werden als funktionell relevante Epimutationen erachtet, da bekannt ist, dass TSG über eine Methylierung im Promotorbereich transkriptionell stillgelegt werden. Im Vergleich zu ESR1 (Ø Methylierung, 3%), welches die Methylierungslevel eines durchschnittlichen Promotors wiederspiegelt, zeigten die TSG sehr geringe durchschnittliche Methylierungswerte von weniger als 1%. Zudem waren die durchschnittlichen Epimutationsraten (EMR; <0,0001-0,1%) der TSG sehr gering. Mit der Ausnahme von BRCA1, welches eine erhöhte EMR in der BC-Kohorte verglichen zu den Kontrollen (0,31% gegen 0,06%) zeigte, gab es keine signifikanten Gruppenunterschiede zwischen BC-Patientinnen und Kontrollen. Eine von 36 HR BC-Patientinnen zeigte im Vergleich zu den restlichen Proben eine stark erhöhte EMR von 14,7% in BRCA1. Rund ein Drittel (15/44) der EO BC-Patientinnen wiesen eine erhöhte Rate an Einzel-CpG Fehlern in mehreren TSG auf. Die nachfolgenden Expressionsanalysen ergaben eine erniedrigte Expression vieler TSG je analysierter Patientin. Diese Ergebnisse führen zu der Annahme, dass epigenetische Veränderungen in normalen Körperzellen als ein möglicher Indikator für einen gestörten Mechanismus, der für die Aufrechterhaltung des unmethylierten Status und der daraus resultierenden normalen Genexpression zuständig ist, angesehen werden können. Dies kann mit einem erhöhten BC-Risiko assoziiert werden. / The increasing complexity of social behavior along the ascending scale of primates, peaking in human spoken language, is accompanied by an impressive expansion of the human brain, particularly of the prefrontal cortex. Hence, prefrontal cortex appears to be one of the most interesting structures of the human brain, at least from an evolutionary perspective. But not only size but also function, in particular the interplay of neurons and glia cells, are suspected to distinguish the human brain from great apes and other primates. It is plausible to assume that proper brain function is controlled by a coordinated and well balanced transcriptional landscape, orchestrated by the underlying genetic and epigenetic backbone. Using reduced representation bisulfite sequencing (RRBS), we have compared the methylation profiles of neuronal and non-neuronal cells from three human and three chimpanzee prefrontal cortices (Brodmann area 10). Bioinformatic analyses revealed a genome-wide significant enrichment of differentially methylated regions (DMRs) in specific genomic areas. Intraspecific methylation differences between neuronal and non-neuronal cells are about three times more abundant than the interspecific methylation differences. More than 90% of human intraspecific DMRs were hypomethylated in neuronal cells, compared to non-neuronal cells. Intraspecific DMRs showed enrichment of genes associated with different neuropsychiatric disorders. Comparison between humans and chimpanzees yielded enrichments of genes showing human-specific brain histon modification. Interspecific DMRs were much more frequent in non-neuronal cells (n=666) than in neurons (n=96). Approximately 95% of interspecific DMRs in non-neuronal cells were hypermethylated in humans, compared to chimpanzees. It can be assumed that several hundreds of non-neuronal genes underwent a wave of methylation during human brain evolution. The impact of these changes in non-neuronal cells on the extension of the human brain may have been largely underestimated so far. The most prominent genetic cause for inherited breast and ovarian cancer are mutations in the BRCA1 and BRCA2 tumor suppressor genes (TSG). However, BRCA1/BRCA2 germline mutations explain less than 50% of all familial breast cancers, even for women diagnosed before the age of 40 years. It has also been reported that epigenetic abnormalities, which contribute to changes in gene expression, play an important role in carcinogenesis and breast cancer development. To rapidly quantify the number of epimutations in different TSG, in both a qualitative and quantitative manner, we have developed a deep bisulfite sequencing assay targeting the promoter regions of eight TSG (BRCA1, BRCA2, RAD51C, ATM, PTEN, TP53, MLH1 and RB1) and the estrogene receptor (ESR1) gene, which plays a role in tumor progression. We have analyzed blood samples of two independent BRCA1/BRCA2-mutation negative breast cancer (BC) cohorts and two independent age-matched healthy control cohorts. BC cohort 1 represents patients with early-onset BC and BC cohort 2 patients with a high risk to carry a heterozygous mutation. Since it is well known that tumor suppressor genes are transcriptionally silenced by promoter methylation, alleles with >50% methylated CpGs are considered as functionally relevant epimutations. Compared to ESR1, which is representative for an average promoter, TSG exhibited very low (<1%) average methylation levels and also very low mean epimutation rates (EMR; <0.0001% to 0.1%). With exception of BRCA1, which showed an increased EMR in BC (0.31% vs. 0.06%), there was no significant difference between patients and controls detectable. One of 36 HR BC patients showed a dramatically increased EMR (14.7%) in BRCA1. We identified in approximately one third (15 of 44) of EO BC patients increased rates of single CpG methylation errors in multiple TSG. Both EO and HR BC patients exhibited global underexpression of blood TSG. We propose that epigenetic abnormalities in normal body cells are indicative of disturbed mechanisms for maintaining low methylation and appropriate expression levels and may be associated with an increased BC risk.

Includes bibliographical references. / 1v. (various pagings) ; / Title page, contents and abstract only. The complete thesis in print form is available from the University Library. / Comprises four sections: published research papers; abstracts of major conference presentations; mycoplasmological subject and book reviews; and, academic theses. The published research papers comprising the main basis of the submission predominantly report original findings of laboratory investigations within microbiology dealing with Micobacteria, microbial water requirements, and Mollicutes (mycoplasms). / Thesis (D.Sc.)--University of Adelaide, Dept. of Microbiology and Immunology, 1995

El càncer de pròstata (CP), és la segona causa de mort per malaltia oncològica en els homes del món occidental. S’estima que un de cada sis homes desenvoluparà un càncer d’aquest tipus al llarg de la seva vida. El CP afecta com el seu nom indica, a la pròstata. La pròstata, és un òrgan glandular de l’aparell genital-urinari masculí. Té la mida d’una nou i es localitza sota de la bufeta, envoltant la uretra i davant del recte. La seva funció és secretar productes que s’afegiran al líquid seminal amb la finalitat de nodrir i protegir els espermatozous. El actual diagnòstic del CP es basa en una triada diagnòstica que consta de; l’anàlisi dels nivells de PSA (Prostate Specific Antigen) en sèrum, el tacte rectal (TR) i finalment la biòpsia prostàtica. Quan els nivells de PSA en sèrum es situen per sobre de 4 ng/mL i/o el TR és sospitós, l’uròleg pot estimar quina és la probabilitat que el pacient estigui afectat per un CP i per tant decidir la necessitat de practicar o no una biòpsia prostàtica, que permetrà establir el diagnòstic definitiu. La introducció del test del PSA, a finals dels anys 80, s'ha traduït en una millora del diagnòstic precoç del CP, moment en el qual les opcions de tractament per el són eficaces. No obstant això, malgrat aquesta detecció primerenca, la mortalitat per CP no ha disminuït significativament en els últims anys. El principal problema del PSA com a marcador d’screening és que aquest presenta un nivell d’especificitat baix (30% aprox) i alhora, un valor predictiu negatiu baix. Això es tradueix en que al voltant d'un terç de tots els homes sotmesos a una biòpsia seran positius per CP. Com a resultat dels seus persistents nivells sèrics de PSA, però els resultats negatius de la biòpsia, aquests homes es sotmeten a repetides biòpsies. Tot i el importants avenços en la investigació de biomarcadors de CP, alguns homes encara estan sobre-diagnosticats de CP “indolent”, mentre que d’altres moren de malaltia agressiva que s'ha diagnosticat massa tard. Aquesta situació es coneix com "dilema diagnòstic". És per tot això, que el càncer de pròstata, es beneficiaria de l’existència de nous marcadors d’screening més específics i alhora d’un diagnòstic menys invasiu. Per altra banda, una millora en el diagnòstic evitaria un gran nombre de biòpsies innecessàries i conseqüentment un important estalvi econòmic en el cost sanitari actual. La recerca de nous marcadors en el càncer de pròstata suposa un camp de treball important en la detecció precoç d’aquest tipus de càncer. Donada la situació de la pròstata a l’organisme, sota la bufeta i envoltant la uretra, les secrecions i inclús les mateixes cèl·lules prostàtiques, ja siguin normals o malignes, poden trobar-se presents en l’orina. És per això que considerem l’orina com una font important d’informació, a través de la qual es podria arribar a determinar quina situació s’està donant a l’òrgan en qüestió. Altres estudis evidencien l’existència de potencials biomarcadors en l’orina que podrien ajudar en la millora del diagnòstic del CP. A nosaltres ens ocupa l’estudi d’aquelles molècules de RNA així com de les molècules protèiques que es troben a l’orina. Suposem doncs, que un massatge prostàtic enriqueix la mostra d’orina de tot tipus de molècules proteiques. Així doncs, la nostra hipòtesi de treball recolza que, l’orina després d’un massatge prostàtic pot ser el fluid ideal per a la recerca de nous biomarcadors capaços de discriminar entre pacients amb o sense càncer de pròstata. L’objectiu principal de l’estudi és diagnosticar el CP assimptomàtic per us sistema minimament invasiu, que consisteix en l’anàlisi de l'ARN o de la proteïna en l'orina obtinguda després d’un massatge prostàtic i, superar la baixa especificitat de l’actual sistema d’screening (PSA en sèrum) mitjançant l'ús de biomarcadors addicionals (RNA o proteina) per tal de reduir el nombre de biòpsies innecessàries (reduir els costos socio-econòmics, així com la reducció dels efectes secundaris no desitjats). 1. ANÀLISI TRANSCRIPTÒMICA: 1a) “PSGR and PCA3 as Biomarkers for the Detection of Prostate Cancer in Urine” Rigau M et al., Prostate. 2010 Dec 1;70(16):1760-7. En el primer estudi, mitjançant l’anàlisi de transcripts per RTqPCR en 215 (34% amb CP) mostres de sediements d’orines de pacients (obtingudes després d’un massatge prostàtic), es va determinar la utilitat de PSGR (Prostate Specific G-coupled receptor), previament descrit com a sobre-expressat en mostres de teixit de CP, com un nou biomarcador, comparable a PCA3 (ja conegut), per a la detecció del CP en orines (taula 1). Per l'anàlisi de la corba ROC vàrem determinar els valors de l’Area sota la corba (AUC) de PSGR (AUC 0,68) i PCA3 (AUC 0,66). Fixant la sensibilitat a 95%, aconseguim un valor d’especificitat de 15% per PSGR i el 17% de PCA3. Alhora vàrem veure que al combinar els dos biomarcadors (PSGRvPCA3) mitjançant un anàlisi “multiROC”, els resultats van millorar significativament en termes de rendiment del biomarcador (AUC 0,73) com de la seva especificitat (34%). En conclusió, podem dir que PSGR presenta un comportament similar al biomarcador estàndard per CP en orina (PCA3), però, és necessàri la realització d’estudis futurs per millorar encara més el rendiment d'aquesta prova. 1b) “A Three-Gene panel on urine increases PSA specificity in the detection of prostate cancer” Rigau et al., Prostate. 2011 Apr 25. doi: 10.1002/pros.21390. En un segon estudi, vàrem estudiar la possibilitat de multiplexar diferents biomarcadors, per tal de ser capaços de guanyat especifcitat sense perdre sensibilitat en la detecció del CP. Donada l’heterogeneïtat del CP la idea d’utilitzar diferents marcadors per a la seva detecció es presenta atractiva. Mitjançant l’anàlisi de transcripts, per RTqPCR, en 215 (37% amb CP) mostres de sediements d’orines de pacients (obtingudes després d’un massatge prostàtic), vàrem determinar la utilitat de PSMA (Prostate Specific Membrane Antigen), un marcador descrit anteriorment com a sobre-expressat en el CP, com a biomarcadors per a la detecció de CP en orina. L’anàlisi de corbes ROC revela un rendiment similar PSMA (AUC 0,62), PSGR (AUC 0,65) i PCA3 (AUC 0,60) (Taula 1). Per tal de millorar l'eficàcia diagnòstica d'aquests biomarcadors es van combinar PSMAvPSGRvPCA3 (3M), utilitzant un anàlisi de multiROC. L’AUC del 3M (AUCm) (0,74) millora notablement, en comparació amb els valors individuals per a cada un dels marcadors. D'altra banda, si combinem 3M amb el valor de PSA en sang l’AUCm (0,77) va ser encara millor (taula 11). Si fixem la sensibilitat a 96%, l'especificitat del model 3M manté una especificitat del 34%, mentre que no es va observar augment en d’aquest valor quan ho combinem amb PSA en sang (34%) (Taula 11). El comportament d'aquests tres marcadors en una subpoblació de l’estudi que presentava nivells de PSA en sang entre 4-10 ng/mL i sense informació d’una biòpsia prèvia "zona gris del PSA" és de PSMA (AUC 0,74), PSGR (AUC 0,66) i PCA3 (AUC 0,61). Per al model combinat (3M), l’AUCm és de 0,82 (Taula 11). Fixant la sensibilitat al 96%, l'especificitat del model combinat (3M) manté una especificitat del 50%. En conclusió, aquests resultats demostren que la combiació de diferents marcadors proporciona una major especificitat a la prova sense comprometre el valor de sensibilitat. Expresat en el nombre de biopsies que s’haurien pogut estalviar, els valors se situen al voltant del 34% de biòpsies estalviades. 1c) “Behavior of PCA3 gene in the urine of men with high grade prostatic intraepithelial neoplasia” Morote and Rigau et al., World J Urol. 2010 Dec;28(6):677-80. El tercer estudi, està centrat en la utilitat, del ja conegut biomarcador per CP en orina (PCA3), per a l’identificació una lessió pre-maligna a la pròstata, així com la seva utilitat en la selecció dels homes amb biòpsies negatives, que requereixen la repetició del procediment. La troballa de les lesions de HGPIN (High grade preneoplastic intraepithelial lesion) és una indicació freqüent de la repetició de la biòpsia. Tot i la controvèrsia al voltant de la definició de HGPIN com a lessió pre-maligna i la necessitat de repetició de la biòpsia, encara avui en el nostre hospital s’indica el control exhaustiu del pacient, així com la repetició de la biòpsia en un periode de relativament curt de temps. Per a aquest estudi es van seleccionar un subgrup de pacients amb HGPIN (n=64) i com a grups control, es van seleccionar els homes amb CP (n=83) i homes amb patologia benigne de la pròstata (BP) (n=97). Després de l’anàlisi dels transcripts de PCA3 per RTqPCR en mostres de sediements d’orines de pacients (obtingudes després d’un massatge prostàtic), i de l'anàlisi de la corba ROC, es van obtenir els següents resultats; HGPIN vs CP (AUC 0,63) i BP vs PC (AUC 0,71). Aquests resultats demostren la capacitat dels transcripts de PCA3, en orina obtinguda deprés d’un massatge prostàtic, per a l’identificació d’homes amb CP així com la identificació de pacients amb HGPIN. 2. ANÀLISI PROTEÒMICA COMPARATIVA L’objectiu principal d’aquesta segona part és determinar un perfil proteòmic a l’orina capaç de diferenciar entre pacients amb CP i controls sans. Per dur a terme aquest objectiu ens vàrem plantejar fer una part inicial de discovery, que vàrem complementar amb “data mining” i finalment vàrem verificar mitjançant una tècnica proteòmica independent. 2a) Per la part de discovery es va dur a terme l’anàlisi comparativa de “Differential in Gel Electrophoresis (DIGE). Es van fer dos experiments independents, amb mostres de sobrenedants d’orines (on trobem la fracció soluble de les proteïnes). En el primer experiment es van comparar 6 mostres de proteïna total de pacients amb CP i 6 mostres controls. En el segon experiment es van comparar 9 mostres, de proteïna pre-tractada amb una tècnica de depleció per les proteïnes majoritàries, de pacients amb CP i 9 mostres de pacients control. Un total de 24 proteïnes (9 sobre- i 15 infra-expresades) vàren ser identificades per MALDI-TOF. Una anàlisi informàtic de les proteïnes va mostrar que la majoria d'aquestes proteïnes identificades es secreten els components de diverses xarxes ben conegudes, el càncer funcionals i la inflamació, com ara NFКB, PDGFBβ i β-catenina. D'altra banda, a causa del fet que hem utilitzat sobrenadants d'orina, on podem trobar proteïnes solubles secretades, la majoria de les proteïnes identificades (62%) es van localitzar en l'espai extracelular. Mitjançant una tècnica de proteòmica dirigida (Selected Reaction Monitoring: SRM) es van quantificar de forma relativa, sense l’adició d’estandards interns marcats, un total de 15 (dels 24 biomarcadors) en una població independent de 50 mostres (38% amb CP). Després d'una anàlisi de regressió logística de les dades obtingudes a través de l'assaig de SRM, es va obtenir un panell de set pèptids que corresponen a 5 proteïnes, capaços de distingir entre les mostres de CP i mostres controls amb una sensibilitat del 95% i una especificitat del 78 %. 2b) La segona part de l’estudi de proteómicas es basa en la verificació de les proteïnes prèviament qualificades i alhora l’estandarització dels mètodes de preparació de mostres per al seu posterior anàlisis mitjançant la tècnica de SRM. Les 5 proteïnes que formen part del panell identificat, juntament amb altres proteïnes biologicament rellevants, definides a la nostre fase de discovery, i juntament amb altres proteïnes descrites a la literatura, vàren ser escollides per una segona fase de qualificació i verificació en una població independent de 107 pacients, mitjançant un assaig de SRM en el qual es pretén quantificar de forma absoluta (adició de pèptids estàndards marcats), un total de 42 proteïnes. Prèviament a l’evaluació d’aquestes proteïnes, es va dur a terme una estandarització del protocol d’extracció de proteïna en mostres d’orina, amb l’objectiu de maximitzar la senyal obtinguda en els experiments de SRM. La precipitació amb Acetonitril (a temperatura ambient) seguida de la digestió de les proteïnes en solució amb condicions de ratio 1:10 (trypsine:protein), “over-night” i l’adició de “NAcetyl cysteine”, proporcionen els millors valors de quantificació absoluta. L’anàlisi estadístic de les dades generades d’aquesta segona fase de qualificació i verificació de les proteïnes està encara inacabat, de manera que ara per ara no podem conclou-re res. En conclusió, les dos linies experimentals que aquí es presneten (ARN i proteïnes) represeten resultats prometedors. No obstant això, estudis de validació en poblacions independents (del tipus estudi multicèntric) són necessaris per acabar amb un biomarcador o un panell de biomarcadors vàlid per al diagnòstic del CP. Per altra banda, el seguiment dels pacients ja analitzats poden relevalar dades interessant, com la utilitat pronòstica d’aquests biomarcadors. Els resultats obtinguts haurien de tenir una aplicació clínica ràpida que, juntament amb els paràmetres d’screening actual (nivells sèrics de PSA i DRE), podrien ajudar en la pressa de decisions per CP. / The prostate gland is a walnut-sized organ of the male urinary-genital tract that is located below the bladder surrounding the urethra and in front of the rectum. The most important disease affecting prostate is prostate cancer (PCa). PCa is the most common cause of cancer death, and it is the second most common cause of cancer death among men in the Western world. The risk of developing this type of cancer during a lifetime is estimated at 1 in 6 men in the US, and the risk of death due to this disease is 1 in 36. The current diagnosis of PCa is based on a triad consisting of diagnosis, analysis of the levels of PSA (Prostate Specific Antigen) in serum, the digital rectal examination (DRE) and finally the prostate biopsy (PB). When serum PSA levels are above 4 ng/mL and / or when DRE is suspected, the urologist can estimate how likely the patient is affected by PCa and therefore decided the need to practice or not a PB, which is the gold standard for PCa diagnosis. The introduction of PSA testing in the late 80s, has resulted in an improvement of early diagnosis of PCa, at which time options for treatment are effective. However, despite this early detection, mortality PCa has not decreased significantly in the last 50 years. The main limitation of serum PSA as a tumor marker is its lack of specificity (around 30%) at the cut-off value of 4 ng/mL, and also a low negative predictive value (NPV), which results in a high rate of negative biopsies. Elevated PSA levels can also be attributed to other factors such as benign prostatic hyperplasia (BPH), prostatitis, etc. As a consequence of the current screening parameters, around 2/3 of the approximately 1,300,000 biopsies made yearly in the United States and 390,000 in Europe are unnecessary. In contrast, the false positive rate of a biopsy is about zero, although the false negative rate in the first biopsy may oscillates around 20%. As a result of their persistently elevated PSA levels, but negative biopsy results, these men undergo repeated biopsies to rule out PCa. This situation is called the “PSA dilemma”. For these reasons, PCa would benefit from the existence of new markers for screening and also a more specific diagnosis less invasive. Furthermore, an improvement in diagnosis would avoid many unnecessary biopsies and consequently a significant savings in the cost of health today. The search for new markers in PCa is an important field of work in the early detection of this cancer. Urine has been defined as a liquid biopsy of the urogenital tract, and it can provide much more information about these organs (including the prostate) than a tissue biopsy. Urine obtained after DRE can easily serve as a mirror of what is happening within the prostate. Furthermore, urine collection can be accomplished without disruption of clinical standard practice. It can also be repeated several times throughout the course of the prostatic disease. For all of these reasons, urine can serve as a potential source of prostate disease biomarkers. Nevertheless, using urine for biomarker discovery represents an important technical challenge, both in transcriptomic and proteomic approaches. Although there are some studies that focus on those approaches and biomarker discovery and identification, there still exists some controversy regarding the standardization of collection procedures, sample processing, storage and normalization. We hypothesized that the utilization of targeted genomic and proteomic techniques on urine samples from patients suspected of having PCa can provide a pattern of biomarkers able to efficiently distinguish between the presence or absence of a prostate carcinoma and, further, can help to identify clinically significant prostate cancer patients. The main objective of this study is to diagnose asymptomatic PCa by non/minimally-invasive means using RNA or Protein in urine after prostate massage, and to overcome the low specificity of PSA by the use of additional biomarkers to reduce the number of unnecessary biopsies (reduce financial costs for society, reduction in unwanted secondary effects). 1. TRANSCRIPTOMIC APPROACH: In recent years, the explosion of genomic and transcriptomic approaches have resulted in increased biomarker discovery. The recent discovery of Prostate Cancer Gene 3 (PCA3) in urine as a biomarker for the detection of PCa and studies to determine its applicability in routine diagnosis represent a significant success for the scientific community in this field. First, we wanted to characterize a new urine candidate biomarker (PSGR) to be compared with PCA3, and second, we planned to use a panel of biomarkers, in order to improve diagnostic accuracy. Finally, we proposed to better characterize the well-known biomarker PCA3 as a tool for the early detection of pre-neoplastic PCa lesions, such as High grade prostatic intraepithelial neoplasia (HGPIN). 1a) “PSGR and PCA3 as Biomarkers for the Detection of Prostate Cancer in Urine” Rigau M et al., Prostate. 2010 Dec 1;70(16):1760-7. PSGR is a member of the G-protein coupled OR family. PSGR has previously been described to be highly prostate tissue-specific and over-expressed in PCa tissue. Our aim was to test whether PSGR could also be detected by RTqPCR in urine sediment obtained after prostate massage (PM). A total of 215 urine samples were collected from consecutive patients (34% with PCa), who presented for PB due to elevated serum PSA levels (> 4 ng/mL) and/or an abnormal DRE. These samples were analyzed by RTqPCR. By univariate analysis we found that PSGR and PCA3 were significant predictors of PCa. A Reciever Operator Characteristics (ROC) curve was used to assess the outcome predictive values of the individual biomarkers. We obtained the following Area Under the Curve (AUC) values: PSGR (0.68) and PCA3 (0.66). Both markers individually overcame the AUC value for serum PSA (0.60). Finally, we combined those markers to test if a combination of both biomarkers could improve the sensitivity of PCA3 alone. By using a multivariate extension analysis, multivariate ROC (MultiROC), the outcome predictive values of the paired biomarkers were assessed. We obtained an AUC value of 0.73 for the combination of PSGR and PCA3 (PSGRvPCA3). Then, we tested whether a combination of PSGR and PCA3 could improve specificity by fixing the sensitivity at 95%. We obtained specificities of 15% (PSGR) and 17% (PCA3) for each individual marker and 34% for PSGRvPCA3. In summary, a multiplexed model that included PSGR and PCA3 improved the specificity for the detection of PCa, especially in the area of high sensitivity. This could be clinically useful for determining which patients should undergo biopsy. 1b) “A Three-Gene panel on urine increases PSA specificity in the detection of prostate cancer” Rigau et al., Prostate. 2011 Apr 25. doi: 10.1002/pros.21390. Much evidence points to the fact that a single marker may not necessarily reflect the multifactorial and heterogeneous nature of PCa. The principle that underlies the combined biomarker approach is consistent with tests offered for the detection of PCa in tissue specimens and takes into consideration the heterogeneity of cancer development based on a diagnostic profile. The combined model that results from these combinations provides overall increased sensitivity without decreasing the specificity. Following the same approach than in our previous work, we combined three biomarkers to maximize individual specificities. Prostate Specific Membrane Antigen (PSMA), another well-known PCa biomarker, was used to test whether a combination of PSGR, PCA3 and PSMA was able to improve the specificity of the current diagnostic technique. We analyzed post-PM urine samples from 154 consecutive patients (37% with PCa), who presented for PB due to elevated serum PSA levels (>4 ng/mL) and/or an abnormal DRE. We tested whether the putative PCa biomarkers PSMA, PSGR, and PCA3 could be detected by RTqPCR in the post-PM urine sediment. By univariate analysis, we found that the PSMA, PSGR, and PCA3 scores were significant predictors of PCa. We then combined these findings to test if a combination of these biomarkers could improve the specificity of an actual diagnosis. Using a multiplex model (PSGRvPCA3vPSMA), the area under the MultiROC curve (AUCm) was 0.74, 0.77 with PSA and 0.80 with PSA density (PSAD). Fixing the sensitivity at 96%, we obtained a specificity of 34%, 34% with PSA and 40% with PSAD. Afterwards, we specifically tested our model for clinical usefulness in the PSA diagnostic ‘‘gray zone’’ (4–10 ng/mL) on a target subset of 82 men with no prior biopsy (34% with PCa) and a target subset of 77 men with the PSAD information (35% with PCa). Using a multiplex model, the AUCm was 0.82, 0.89 with PSAD. Fixing the sensitivity at 96%, we obtained a specificity of 50% and 62% with PSAD in the gray zone. This model would allow 34% of the patients to avoid unnecessary biopsies in the gray zone (42% when using PSAD). 1c) “Behavior of PCA3 gene in the urine of men with high grade prostatic intraepithelial neoplasia” Morote and Rigau et al., World J Urol. 2010 Dec;28(6):677-80. An ideal biomarker for the early detection of PCa should also differentiate between men with isolated HGPIN and those with PCa. PCA3 is a highly specific PCa gene, and its score in post-PM urine seems to be useful in ruling out PCa, especially after a negative PB. The biopsy finding of an HGPIN is a frequent indication that the PB should be repeated. The aim of this study was to determine the efficacy of post-PM urine PCA3 scores for ruling out PCa in men with previous HGPIN. The PCA3 score was assessed by RTqPCR in 244 post- PM urine samples collected from men subjected to PB (64-isolated HGPIN, 83-PCa, and 97-benign pathology findings (BP)). The median PCA3 score was 1.56 in men with BP, 2.01 in men with isolated HGPIN and 9.06 in men with PCa. A significant difference was observed among the three scores (p < 0.001) and also between HGPIN and PCa (p = 0.008); however, no differences were observed between HGPIN and BP (p = 0.128). The AUC in the ROC analysis was 0.71 in the subset of men with BP and PCa, while it decreased to 0.63 when only men with isolated HGPIN and PCa were included in the analysis. Finally, the median of the PCA3 scores was assessed in men with previously diagnosed unifocal HGPIN (2.63) and in men with previously diagnosed multifocal HGPIN (1.59). No differences were observed between unifocal and multifocal HGPIN (p = 0.56). In conclusion, the efficacy of post-PM urine PCA3 scores in ruling out PCa in men with HGPIN is less than in men with BP. For this reason, when HGPIN is found at PB, these results should be taken into consideration, in order to establish the clinical usefulness of the PCA3 score as a tool for avoiding unnecessary repeated biopsies. 2. PROTEOMIC APPROACH: The high-throughput proteomic analysis of urine samples has recently become a popular approach for the identification of novel biomarkers. Proteins secreted by cancer cells, also referred to as "cancer cell secretomes," are a promising source for biomarker discovery. A great advantage to these cancer-secreted proteins and/or their fragments is that in most cases, they enter body fluids, such as blood or urine, and therefore, can be measured via non-invasive assays. Since the protein products of PCa cells can be detected in urine, their use as a proximal body fluid in the detection of PCa is very attractive. 2a.“The Discovery and Qualification of a Panel of Urine Biomarkers for Prostate Cancer Diagnosis”. In this study we used DIGE proteomic analysis on 30 age-matched, post-PM urine supernatant specimens, in order to identify the differentially expressed proteins in patients with PCa. 24 potential biomarkers were identified, the majority of which were secreted proteins associated with several wellknown, functional cancer pathways. Qualification of 15 of the 24 identified biomarker candidates was then undertaken by relative quantification using an SRM-based assay (target) on 50 post-PM urine supernatant samples (38% with PCa). After statistical analysis, 7 peptides, corresponding to 5 different proteins, were selected. A multiplex ROC curve using those 7 peptides showed an AUC value of 0.93. Fixing the sensitivity at 95%, we achieved a specificity of 78%. 2b. “Qualification and Verification of Urine PCa Candidate Biomarkers with Selected Reaction Monitoring”. The qualification and verification of candidate biomarkers is a critical stage in the great biomarker discovery pipeline. Credentialed biomarkers that have successfully passed through this stage are considered verified biomarkers, which are of high value for translation into large-scale, clinical validation studies. The evaluation of biomarkers in body fluids necessitates the development of robust methods to quantify proteins in body fluids, using large sets of samples. In the present study, we performed the qualification of a set of 42 candidate biomarkers for PCa diagnosis on a set of 107 post- PM urine supernatant samples (36% with PCa) using SRM-based absolute quantification. Before that, urine sample preparation and analytical procedures were optimized for SRM methodology. We standardized preparation of the urine protein samples for SRM analysis by using 9 different protocols. Our final goal was to obtain a panel of biomarkers that alone, or in combination with the existing PCa biomarker, would help us to better define patients with PCa. In addition, due to the large number of samples and their pathological conditions, we would also be able to define candidate prognostic markers. However, this study has yet to be completed. In conclusion, the data presented in this dissertation represent a significant advance in the standard care for PCa diagnosis. Our two approaches (RNA- and Protein-based) have begun to yield promising results, as both have levels of specificity that exceed those of PSA. However, validation studies on larger, multi-centric cohorts of urine samples are needed to end up with a valid PCa biomarker. The obtained results should have a rapid application in the clinics and potentially influence, together with actual screening parameters (serum PSA and DRE), decisions that could improve the health system, as well as clinical, managerial and/or public practices for health outcomes in PCa.

La fosfo-defosforilación de aminoácidos es uno de los procesos de regulación reversible más extendidos en los seres vivos. Este tipo de reacciones es llevado a cabo por la acción opuesta de las proteínas quinasas y las proteínas fosfatasas. A pesar de ello, el genoma de la levadura codifica un número mayor de Ser/Thr quinasas. Por ello, algunas fosfatasas han desarrollado un mecanismo de regulación distinto, que se basa en la unión de la subunidad catalítica a una o más subunidades reguladoras. Éstas determinan la localización subcelular, la especificidad por el sustrato y, en definitiva, la función de la fosfatasa. Éste es el caso de la fosfatasa de tipo 1, que está codificada por GLC7 en la levadura Saccharomyces cerevisiae, un enzima esencial que desarrolla funciones muy importantes en la biología de la célula y cuya función está regulada por la unión de la subunidad catalítica a multitud de subunidades reguladoras distintas.El genoma de la levadura codifica dos fosfatasas, conocidas con el nombre de Ppz1 y Ppz2 y cuya mitad carboxiterminal está relacionada estructuralmente con Glc7. A pesar de no ser esenciales, estas fosfatasas desarrollan un papel importante en la biología de la levadura Saccharomyces cerevisiae. En concreto, ejercen un control negativo sobre la tolerancia salina y la progresión del ciclo celular y positivo en el mantenimiento de la integridad celular. En el momento de iniciar este trabajo sólo se conocía una subunidad reguladora de estas fosfatasas, conocida con el nombre de Hal3 o Sis2. Esta proteína actúa como inhibidora de todas las funciones conocidas de Ppz1. Sin embargo, su mecanismo de actuación es desconocido.El primer objetivo de este trabajo ha sido intentar profundizar en la regulación que lleva a cabo la fosfatasa Ppz1 en el control del ciclo celular de la levadura. Para ello, se ha generado un doble mutante condicional sit4 hal3 que presenta una parada entre las fases G1 y S del ciclo. Esta cepa se ha transformado con dos genotecas multicopia diferentes. Gracias a ello se han podido aislar una serie de genes que, en multicopia son capaces de suprimir el fenotipo de esta cepa. Entre ellos se encuentran elementos reguladores del ciclo celular ya conocidos, algunas fosfatasas, elementos involucrados en homeostasis salina y tres genes cuya función era desconocida por el momento, que han sido renombrados VHS1, VHS2 y VHS3. En segundo lugar, se ha investigado el mecanismo de acción de Hal3 sobre la fosfatasa Ppz1. Para ello se han estudiado elementos hallados en la secuencia de Hal3 posiblemente relevantes para la función de esta proteína. Además, se ha realizado una estrategia de mutagénesis al azar de la zona más conservada de Hal3 seguida de una búsqueda de pérdida de función. Esto ha permitido hallar una serie cambios aminoacídicos únicos que interfieren en la función de Hal3. La caracterización bioquímica posterior ha permitido determinar dos regiones en la secuencia de Hal3 importantes para la unión a Ppz1 y una tercera región importante para inhibir a la fosfatasa.Finalmente, se ha estudiado el papel biológico de YFR003c, un ORF cuya función era desconocida por el momento. Estos estudios han demostrado que codifica una proteína con características afines a los inhibidores de la fosfatasa de tipo 1 humana. Además, se ha podido demostrar que Yfr003c es capaz de unirse e inhibir in vitro a Glc7 y, con menor eficiencia, a Ppz1. Estudios posteriores in vivo refuerzan la hipótesis del papel de Yfr003c como inhibidor de Glc7. Por este motivo, ha recibido el nombre de Ypi1 (Yeast Phosphatase 1 Inhibitor) y se ha propuesto como el primer inhibidor conocido de Glc7 en la levadura Saccharomyces cerevisiae. / Phospho-dephosphorylation of amino acids is one of the most extended mechanisms of reversible regulation found in living organisms. This kind of reactions is driven by the opposite action of kinases and phosphatases. In spite of this fact, yeast genome encodes more Ser/Thr protein kinases. For this reason some phosphatases have developed a different regulatory mechanism based on the union of the catalytic subunit to one or more regulatory proteins which in turn regulate the subcellular location, the specificity for substrate and thus, the function of the phosphatase. This is the case of Protein Phosphatase 1, encoded by the essential gene GLC7 in the yeast Saccharomyces cerevisiae. This enzyme plays an important role in the yeast and it is tightly regulated by the union of the catalytic subunit to different regulatory proteins.The genome of the yeast also encodes two phosphatases, named Ppz1 and Ppz2 that are structurally related to Glc7. Although they are not essential, they also play an important role in the biology of the yeast. These phosphatases act negatively in the control of the progression of cell cycle and in the maintenance of the salt tolerance and positively in the control of osmotic integrity. In the early steps of this work there was described only one regulatory subunit of these phosphatases named Hal3 or Sis2. Although its specific mechanism of function is still unknown it has been described that this protein acts as an inhibitor for all the known functions of Ppz1.In this work we tried to deepen in the regulation of the cell cycle progression driven by Ppz1. For this reason, we created a conditional sit4 hal3 double mutant, which presents, in non-permissive conditions, a blockade between the G1 and S phases of the cell cycle. This strain was transformed with two different multicopy libraries and colonies able to grow in non-permissive conditions were selected and plasmidic DNA extracted and sequenced. This procedure allowed us to identify a total of 13 genes that, when overexpressed, were able to suppress the phenotype of this strain under non-permissive conditions. They include well-known cell cycle regulatory elements but also some phosphatases, some genes that develop different roles in the control of salt tolerance and three genes with no known function until now that we renamed VHS1, VHS2 and VHS3. We also investigated the regulatory interaction between Hal3 and Ppz1. For this reason, we studied some elements found in the sequence of Hal3 that could be relevant for the function of this protein. Furthermore, we developed a strategy of random mutagenesis of the most conserved region of Hal3 followed by a screening of loss of function of the protein. This procedure allowed us to identify several amino acidic changes that affect Hal3 function in vivo. Biochemical characterization shows the presence of two regions in Hal3 that are important for the union to Ppz1 and a third one that is relevant in the inhibition of the phosphatase activity.Finally, we studied the biological role of YFR003c, an uncharacterized ORF with no known function. Our work demonstrated that YFR003c encodes a protein that shares characteristics commonly found in some inhibitors of the human protein phosphatase 1. We have shown that YFR003c is able to interact with Glc7 and Ppz1 in vitro. Furthermore, YFR003c acts as an inhibitor of Glc7 and, in a lesser degree, of Ppz1. Overexpression studies have shown that YFR003c can act in vivo as an inhibitor of Glc7. For this reason we renamed it YPI1 (for Yeast Phosphatase 1 Inhibitor) and it has been proposed to be the first endogenous inhibitor of Glc7 in the yeast Saccharomyces cerevisiae.

L'objectiu primordial d'aquest estudi de tesi doctoral, va ser intentar veure si existia una associació, en espermatozoide humà, en relació amb l'edat de l'individu, respecte de:(1) La incidència de diploidia, disomia pels cromosomes sexuals, i disomia pels cromosomes 6, 9 y 21(2) La incidència d'anomalies estructurals del cromosoma 9(3) El ràtio sexual en espermatozoides normals i portadors d'una anomalia numèrica pels cromosomes 6, 9, 21, o per a qualsevol anomalia estructural del cromosoma 9.S'emprà la tècnica d'hibridació in situ fluorescent (FISH) simultània, amb sondes de DNA específiques per a la regió subtelomèrica 9q (9qter), les regions centromèriques pels cromosomes 6, 9, 21 i X, i una sonda per la regió satèl·lit III del braç llarg del cromosoma Y, en mostres de semen procedents de 18 individus normals sense historial d'exposició a mutàgenos o drogues, d'edats compreses entre els 24 i els 74 anys (mitjana = 48.8 años). S'analizaren un total de 384.141 espermatozoides, contabilizant un mínim de 10.000 espermatozoides per cada donante.Els nostres resultats indiquen un increment linial significatiu del nivel de diploidia (P =0.002), de la freqüència de totes les duplicacions i delecions per a les regions centromèrica i subtelomèrica del cromosoma 9 (P =0.002), de la disomia 9 (P =0.0001), i una significació marginal de la freqüència conjunta del total de disomia dels cromosomes sexuals (P =0.055), en relació amb l'edat. No es va observà cap increment per a les disomies XX, YY, XY, 6 o 21.Es va detectar heterogeneïtat interindividual en les freqüències, però el test estadístic utilizat ens va permetre minimitzar aquest efecte, eliminant tota la sobredispersió atribuible a l'edat, per tal de poder analitzar la relació de la freqüència d'anomalies cromosòmiques amb aquest paràmetre.El percentatge d'increment per a cada període de 10 anys, va ser del 29% per a la disomia del cromosoma 9, del 18.8% per a la diploida, i entre el 14.6% i el 28% per a les anomalies estructurals.No es va observar una segregació preferencial dels cromosomes 6 o 21, ni amb el cromosoma X, ni amb el cromosoma Y. Però sí es va determinar una segregació preferent tant de la disomia 9, com de les anomalies estructurals d'aquest cromosoma, amb el cromosoma X (P = 0.042), resultat que estaria d'acord amb l'elevat percentatge a la població general de dones portadores d'una inversió pericèntrica (inv(9)) d'aquest cromosoma.Els nostres resultats mostren doncs una forta tendència linial entre l'edat de l'individu i les anomalies estructurals i disomia del cromosoma 9, així com per a la diploidia, en espermatozoides humans. / The aim of this Thesis study was to searching if in human sperm there was a relationship of paternal age associated with: (1) The incidence of diploidy and of disomy for the sex chromosomes and for chromosomes 6, 9 and 21(2) The incidence of structural aberrations chromosome 9(3) The sex ratio in both normal spermatozoa and spermatozoa with a numerical aberration for chromosomes 6, 9 and 21, or any structural abnormality of chromosome 9.We used simultaneous fluorescence in situ hybridisation (FISH) with specific probes for probes for the subtelomeric 9q region (9qter), centromeric regions of chromosomes 6 and 9, 21, X, and the satellite III region of the Y chromosome chromosomes, in sperm samples collected from18 healthy donors, with no know exposure to any mutagens or drugs, aged 24 - 74 years (mean 48.8 years). A total of 384,141 sperm were analysed, with a minimum of 10 000 sperm scored for each donor. Our results indicate a significant linear increase of the level of diploidy (P=0.002), in the overall level of duplications and deletions for the centromeric and subtelomeric regions of chromosome 9 (P=0.002), chromosome 9 disomy (P=0.0001), and a marginal significance of total sex chromosome disomy (P=0.055) in relation to age. No increase was observed for disomies XX, YY, XY, 21 or 6. An interindividual heterogeneity in data was detected but, the statistical test employed, allow us to minimize this effect, eliminating all overdispersion due to age, in order to explore the relationship of chromosome abnormalities with this parameter.The percentage of increase for each 10-year period was 29% for chromosome 9 disomy, 18.8% for diploidy, and ranged from 14.6 to 28% for structural aberrations.Chromosomes 6 and 21 did not segregate preferentially with the X or Y chromosomes. But, there was detected a significant segregation of 9 structural chromosome abnormalities and 9 disomy, with X chromosome (P = 0.042), in agreement with the increased percentage in the general population of women carrying a pericentric inversion of this chromosome (inv(9)).Our findings show a strong linear trend association between age and structural aberrations and disomy for chromosome 9, as well as for diploidy in human males. / El objetivo primordial de éste estudio de tesis doctoral fué intentar hallar si existía una asociación, en espermatozoide humano en relación con la edad del individuo, respecto de: (1) La incidencia de diploidía, disomía para los cromosomas sexuales, y disomía para los cromosomas 6, 9 y 21(2) La incidencia de anomalías estructurales del cromosoma 9(3) El ratio sexual en espermatozoides normales y portadores de una anomalía numérica para los cromosomas 6, 9, 21, o para cualquier anomalía estructural del cromosoma 9.Se empleó la técnica de hibridación in situ fluorescente (FISH) simultánea, con sondas de DNA específicas para la región subtelomérica 9q (9qter), las regiones centroméricas para los cromosomas 6, 9, 21 y X, y una sonda para la región satélite III del brazo largo del cromosoma Y, en muestras de semen procedentes de 18 individuos normales sin historial de exposición a mutágenos o drogas, de edades comprendidas entre los 24 y los 74 años (media = 48.8 años). Se analizaron un total de 384.141 espermatozoides, contabilizando un mínimo de 10.000 espermatozoides por cada donante.Nuestros resultados indican un incremento lineal significativo del nivel de diploidía (P =0.002), de la frecuencia de todas las duplicaciones y deleciones para las regiones centromérica y subtelomérica del cromosoma 9 (P =0.002), de la disomía 9 (P =0.0001), y una significación marginal de la frecuencia conjunta del total de disomía de los cromosomas sexuales (P =0.055), en relación con la edad. No se observó ningún incremento para las disomías XX, YY, XY, 6 o 21.Se detectó heterogeneidad interindividual en las frecuencias, pero el test estadístico utilizado nos permitió minimizar éste efecto, eliminando toda la sobredispersión atribuible a la edad, para poder analizar la relación de la frecuencia de anomalías cromosómicas con éste parámetro.El porcentaje de incremento para cada período de 10 años, fue del 29% para la disomía del cromosoma 9, del 18.8% para la diploidía, y entre el 14.6% y el 28% para las anomalías estructurales.No se observó una segregación preferencial de los cromosomas 6 o 21, ni con el cromosoma X, ni con el cromosoma Y. Pero sí se determinó una segregación preferente tanto de la disomía 9, como de las anomalías estructurales de éste cromosoma, con el cromosoma X (P = 0.042), resultado que estaría de acuerdo con el elevado porcentaje en la población general de mujeres portadoras de inversión pericéntrica (inv(9)) de éste cromosoma.Nuestros resultados muestran una fuerte tendencia lineal entre la edad del individuo y las anomalías estructurales y disomía del cromosoma 9, así como para la diploidía, en espermatozoides humanos.

La importància de les anomalies cromosòmiques en els problemes d'infertilitat ha estat àmpliament confirmada per diversos autors. S'ha estimat que la freqüència d'aberracions cromosòmiques dels zigots humans pot anar des d'un 8-10% (Kajii i Mikamo, 1978) fins a un 50% (Boué i col., 1975) al moment de la concepció. Una estimació directa de la incidència primària d'aparició de les anomalies cromosòmiques després de la fecundació en humans és molt difícil d'obtenir pels problemes de tipus tècnic i ètic que comporta. De la mateixa manera és difícil de realitzar una anàlisi directa de les característiques cromosòmiques dels gametes, fonamentalment els femenins, a causa de la seva inaccessibilitat inherent. De tota manera s'ha suggerit (Bond i Chandley, 1983) que l'espècie humana presenta un major nombre d'anomalies cromosòmiques al moment de la fecundació que no pas altres espècies de mamífers. Aquest fet ha passat malgrat que les noves tècniques de fertilització in vitro (FIV), cada cop més exteses en el tractament de determinats tipus d'infertilitat, podrien carregar l'espècie humana amb una font extra d'aberracions cromosòmiques derivades dels processos de fecundació fora del tracte genital femení. L'estudi de la freqüència primària d'aparició d'anomalies cromosòmiques en una població de mamífers (els ratolins), mitjançant l'anàlisi de la primera divisió embrionària, ha permès abordar aquest problema a través d'un enfocament experimental lliure de les limitacions ètiques i tècniques a les que ja hem fet esment. Per aquesta raó s'ha desenvolupat un mètode (Fraser i Maudlin, 1979) consistent en el cultiu dels zigots de ratolí recent fecundats en un medi amb antimitòtic que impedeix la singàmia, de manera que els complements d'origen matern i patern romanen separats i fàcilment distingibles l'un de 1'altre. Mercès a aquest sistema es pot atribuir l'origen, masculí i femení, de cada anomalia cromosòmica observada alhora que s'obté la incidència d'aberracions cromosòmiques en el moment de la concepció. Mitjançant la comparació de les característiques cromosòmiques de la primera divisió zigòtica d'una població d'embrions de ratolí fecundats in vivo amb una de fecundats in vitro, s'ha pogut esbrinar quin és l'efecte de la tècnica de FIV sobre la dotació cromosòmica dels embrions que se'n deriven. D'altra banda la possibilitat de manipular els donants dels gametes amb substàncies de suposat efecte genotòxic ofereix l'oportunitat d'utilitzar aquests estudis com a test de mutagenicitat per a certs tipus de compostos amb unes característiques concretes. Seguint aquest disseny experimental s'han detectat un total d'anomalies cromosòmiques al moment de la concepció que representen un 20.74% dels zigots fecundats in vivo, dels quals un 8.41% són aneuploides, un 10.37% poliploides i un 1.76% presenten anomalies estructurals.Pel que fa a l'aportació dels gamètes, la incidència d'aneuploïdies (un 4%) i d'anomalies estructurals (al voltant del 0.7%) s'ha observat que és igual en ambdós sexes.D'altra banda l'anàlisi dels embrions fecundats in vitro mostra que un 21.39% presenten anomalies cromosòmiques, dels quals el 5.42% són aneuploïdies, el 14"23% són poliploïdies i el 1.74% tenen anomalies estructurals. Aquest resultats indiquen que, en general, les tècniques de FIV no augmenten el nombre d'anomalies detectades en la primera divisió, tret d'un increment significatiu del nombre de dispèrmies i del nombre d'espermato zoides diploides que intervenen en la fecundació. Aquesta darrera observació confirma l'existència d'una selecció pre-zigòtica exercida pel tracte genital femení en contra dels espermatozoides morfològicament anòmals. Pel que fa a la utilització de la primera divisió embrionària com a test de mutagenicitat es confirma llur interès, en detectar-se un tipus d'acció de la substància emprada (la I3PL) difícilment observable a través d'altres proves clàssiques de detecció del caràcter genotòxic d'un compost, com és la formació d'oòcits diploides a causa.de la no-extrusió del segon corpuscle polar. / The importance of chromosomal abnormalities in reproductive failures has been confirmed by several authors. It is estimated that the frequen cy of chromosomally abnormal human zygotes at the time of conception may range from 8-10% (Kajii and Mikamo, 1978) to 50% (Boue et al.,1975). A direct estimate of the number of chromosomally abnormal human conceptus is difficult to obtain because of ethical and technical difficulties. Likewise, a direct study of human gametes has been limited, mainly for human oocytes, because of the problems involved in their obtention. It has been suggested that more conceptions are lost through chromosome imbalance in man than in other mammalian species (Bond and Chandley, 1983). This has led to the concern that in vitro fertilization (IVF) procedures, which have become a common technique for some infertility problems, would load the human species with an extra source of chromosome abnormalities. Fraser & Maudlin (1979) developed a mouse experimental system, of first embryonic cleavage chromosome analysis which can be used as a model for man. It involves the culture of mouse embryos in a medium containing antimitotic to arrest the cleaving process before singamy is reached.Thus the male and female chromosome sets do not mingle, but remain in separate clusters, which permits to assess the parental origin and incidence of chromosomal abnormalities at conception. Comparing the characteristics of first cleavage in vivo and in vitro fertilized embryos, it is possible to evaluate whether IVF techniques enhance the proportion of chromosomally abnormal embryos.On the other hand, the possibility of injecting genotoxic compounds to gametic donors, permit the use of the first cleavage system as a mutagenic test for specific substances. After the analysis of 1022 in vivo fertilized embryos we have seen that, in the mouse, 20.74% are chromosomally abnormal, among them, 8 show aneuploidy, 10.37% polyploidy and 1.76% structural rearrangments. Comparing the origin of the abnormalities, the incidence of aneuplody (4%) and structural rearrangments (0.7%) is the same for both sexes. After the analysis of 1033 in vitro fertilized embryos, we have seen that 21.39% have a chromosome abnormality, among them 5.42% are aneuploid 14.23% are polyploid and 1.74% have structural rearrangments. These results indicate that, in mice, the exposure of the fertilizing gametes to an in vitro environment is not a source of extra chromosomal abnormalities, except for an increase in the level of polispermy and of diploi spermatozoa that fertilize in vitro. The later confirms the existence of a form of prezygotic selection exerted by the genital female tract against the morphologically abnormal spermatozoa. Upon the use of first cleavage analysis as a mutagenic test, our data stress its importance. We have detected a type of action that would be hard to assess through a classic mutagenic test: the production of diploid oocytes due to the non extrusion of second polar body.

Els limfòcits T autorreactius, responsables de la destrucció de les cèl.lules beta pancreàtiques en la DT1, presenten un repertori TCR esbiaixat segons s’ha demostrat al model experimental del ratolí NOD. Per a definir el repertori TCR autorreactiu en la diabetis humana, hem estudiat les poblacions i expansions monoclonals intra-illot d’un pàncrees de debut i les hem comparat amb les de la sang perifèrica i a la melsa del mateix individu. L’estudi de les cèl.lules T intra-pancreàtiques ha mostrat un repertori divers però amb cinc expansions monoclonals per a les famílies gèniques Vβ1, Vβ7, Vβ11, Vβ17, i Vβ22. Mitjançant el -CDR3, s’ha identificant la mateixa expansió monoclonal Vβ22 als illots i a la melsa, i també se n’ha detectat la seqüència en PBMCs. Per a valorar el biaix als TCR, s’ha analitzat 139 seqüències CDR3 de cadena beta de diferents clons infiltrants i s’ha observat una prevalença d’alguns aminoàcids a l’ NDN, que indica una restricció allunyada de l’atzar. Les seqüències CDR3 de les cinc expansions monoclonals pancreàtiques (incloent la comú a la melsa) s’ajusten a la restricció en NDN definida a partir dels limfòcits del pàncrees. El sub-clonatge i la expansió in–vitro (amb extracte d’illots i anti-CD3) de l’infiltrat pancreàtic, ha mostrat una alteració del repertori original però ha permès aïllar un clon present a l’infiltrat que expressa un doble TCR i que manté també els paràmetres de restricció definits a l’infiltrat original. El clon V22 s’ajusta a la restricció de -CDR3 establerta a l’infiltrat, i representa la única expansió monoclonal del pàncrees observada a la sang perifèrica i la melsa de l’individu. Aquest clon, es podria haver expandit o acumulat in situ per la presència d'un autoantigen comú en ambdós òrgans i d’aquesta manera es postula que la melsa de l’individu podria contribuir a la perpetuació de la malaltia per expansió o retenció d’alguns clons T autorreactius. / Autoreactive T cells, responsible for the destruction of pancreatic beta cells in type 1 diabetes (T1D), have a biased TCR repertoire as has been demonstrated by the NOD mouse experimental model. To define the TCR repertoire of autoreactive cells in human diabetes, we have studied intra-islet populations and monoclonal expansions of a pancreas in diabetic onset and compared them with peripheral blood and spleen populations from the same patient. The study of intra-pancreatic T cells, showed a diverse repertoire but with five monoclonal expansions in the gene families Vβ1, Vβ7, Vβ11, Vβ17, and Vβ22. By TCR’s  chain CDR3 (-CDR3) analysis, the same Vβ22 monoclonal expansion could be identified in the spleen and islets, and the same sequence was detected in PBMCs. To evaluate the existance of a bias in the pancreatic TCR repertoire, we analyzed 139 -CDR3 sequences from different infiltrating clones and prevalence of certain amino acids in the NDN was observed, thus indicating the existance of non-random restriction. CDR3 sequences from that five pancreatic monoclonal expansions (including the one equal in spleen) adjusted to the restrictions defined in NDN from the pancreas lymphocytes. The sub-cloning and in vitro expansion of pancreas infiltrating cells (with islets’ extract and anti-CD3) showed an alteration of the original repertoire, but allowed to isolate a clone expressing two TCRs that did also maintain the restriction parameters defined in the original infiltrate. The clone V22, fits that -CDR3 restriction established for infiltrating cells, and represents the only monoclonal expansion in the pancreas that is also observed in the peripheral blood and spleen of the patient. That clone should have been expanded, or accumulated, in situ in the presence of an autoantigen common to both organs, so is postulated that the spleen could contribute to the perpetuation of the disease by expansion or retention of some T autoreactive T cell clones.

Per a poder entendre la dinàmica evolutiva dels genomes és imprescindible conèixer com estan organitzats els cromosomes de les diferents espècies i determinar quins tipus de reorganitzacions cromosòmiques estan implicades en els processos d’especiació i en esdeveniments macroevolutius que afecten als grans grups taxonòmics. És per això que en aquesta tesi ens hem plantejat definir el cariotip ancestral de mamífers, amniotes i tetràpodes per a poder determinar les regions conservades (Homologous Syntenic Blocks, HSBs) i les regions de trencament evolutiu (Evolutionary Breakpoint Regions, EBRs) partint del genoma humà com a referència. Gràcies a la inclusió del genoma d’espècies outgroup (granota i gall), hem pogut millorar el cariotip ancestral de tetràpodes i amniotes, definint noves associacions sintèniques com a caràcters sinapomòrfics dels amniotes i dels mamífers. Igualment, hem analitzat la distribució de les EBRs en el genoma humà, veient que aquestes regions no estan distribuïdes a l’atzar i un 20% d’elles han estat re-utilitzades al llarg de l’evolució. Hem relacionat la distribució de les EBRs amb l’abundància de seqüències repetitives en el genoma humà, trobant un enriquiment de repeticions en tàndem en aquestes EBRs i una co-localització amb certs elements mòbils o transponibles (AAAT-Alus). A més a més, hem estudiat el paper del constrenyiment selectiu sobre el manteniment de les regions conservades i hem vist que certes reorganitzacions cromosòmiques no es troben en la natura ja que disrupcions en les regions afectades provocarien canvis d’expressió gènica possiblement letals per la progènie. Finalment, hem estudiat el paper de les reorganitzacions cromosòmiques en el procés d’especiació, on hem posat de manifest que regions genòmiques implicades en inversions són regions de baixa recombinació en relació a les regions no reorganitzades i per tant podrien donar lloc a un procés d’aïllament reproductiu per l’acúmul d’incompatibilitats genètiques en els híbrids. Per poder explicar les nostres observacions hem proposat un model on la presència d’heterocariotips flotants en el node d’especiació provocaria una supressió de recombinació en les regions invertides encara observable en les espècies actuals. / The study of the genome organization as well as how chromosomal reorganizations are involved in speciation and adaptation processes are the key points to better understand the evolutionary dynamics of vertebrate genomes and their inter- and intra-specific phylogenetic relationships. In this thesis we described the ancestral karyotype for mammals, amniotes and tetrapods in order to determine the homologous synteny blocks (HSBs) and evolutionary breakpoint regions (EBRs) in the human genome. Using the chicken and frog genomes as outgroups, we were able to improved previously described ancestral karyotypes for tetrapods and amniotes and we defined new syntenic associations as an amniote or mammal synapomoprhies. We also analysed the distribution of EBRs in the human genome, showing that EBRs are not randomly distributed and 20% are reused during the evolutionary period. The distribution of EBRs is related to the abundance of repetitive sequences, exhibiting an enrichment of specific tandem repeats in EBRs and co-localizing with mobile elements (AAAT-Alu). Furthermore, we studied the selective constrain on the maintenance of conserved regions. We observed that certain reorganizations are not found in natural populations because disruptions of the regions involved in reorganizations would lead to changes in gene expression probably lethal for the progeny. Finally, we studied the relation between chromosomal reorganizations and speciation. We showed that regions affected by reorganizations have lower recombination rates than regions not rearranged, thus, an increase of genic incompatibilities in these regions could lead to reproductive isolation by the existence of a barrier of gen flow. In order to explain our observations we proposed the floating heterokaryotypes model, where the presence of heterokaryotypes in the speciation node resulted on a suppression of recombination in the rearranged regions, which is still detected on the extant species.