La família zoarcidae, és una de les més diverses del subordre Zoarcoidei (Perciformes), comprèn 4 subfamílies (Lycozoarcinae, Zoarcinae, Gymnelinae i Lycodinae) i inclou més de 240 espècies en 54 gèneres. Aquesta família té una distribució molt àmplia ja que es troba a quasi tots els mars i oceans del món, la majoria de les espècies habiten a les zones litorals, a la plataforma continental i a la meitat superior del talús continental però algunes habiten a la zona abissal. Les espècies de la família Zoarcidae són molt abundants al Pacífic Nord i a l’Atlàntic Nord tot hi que també hi ha gèneres que es distribueixen pel sud de l’oceà Atlàntic, l’Àrtic, l’oceà Pacífic i per l’oceà Antàrctic. Probablement, l’origen dels zoàrcids va ser al nord-oest de l’oceà Pacífic, concretament al mar de Okhotsk. En aquesta zona, hi habiten representants de les 4 subfamílies, hi ha una gran diversitat d’espècies i un gran nombre d’endemismes. Aquesta tesi, està centrada en l’estudi de la subfamília Lycodinae. Aquesta subfamília és la més diversa dintre dels Zoarcidae i presenta 38 gèneres i més de 190 espècies. És un grup de peixos força desconegut com queda palès en el fet que en els últims anys s’han descrit 5 gèneres nous (Leucogrammolycus, Gosztonyia, Bellingshausenia, Santelmoa i Bentartia) i de ben segur que en queden molts més per descriure. La sistemàtica d’aquesta subfamília ha estat discutida per molts autors, i tot hi que recentment s’hi han incorporat les dades moleculars, encara hi ha alguns punts de la seva sistemàtica que no han quedat resolts. El principal objectiu d’aquesta tesi és contribuir en el coneixement de la diversitat i de la filogènia de la subfamília Lycodinae. Per tal d’assolir aquest objectiu, s’han realitzat quatre estudis. S’han estudiat exemplars de la subfamília Lycodinae procedents de la província de Magallanes, de l’oceà Antàrtic i del mar de Solomon (sud-oest de l’oceà Pacífic). Com a resultat d’aquest treball, s’han descrit 2 gèneres nous (Patagolycus i Argentinolycus) i un tercer gènere, el gènere Iluocoetes s’ha descrit de nou. Per altra banda, s’han descrit dues espècies noves del gènere Santelmoa (S. fusca i S. antarctica) de l’oceà Antàrtic i una nova espècie (Pachycara matallanasi) del mar de Solomon. L’últim treball, és una anàlisi filogenètica d’alguns gèneres de la subfamília Lycodinae realitzat mitjançant dades moleculars (Citocrom Oxidasa I i Regió Control) i dades anatòmiques. L’arbre filogenètic ens mostra que el gènere Lycodapus es troba a la base de l’arbre clarament separat de tots els altres gèneres. Els gèneres restants es troben dividits principalment en dos grups, per una banda els gèneres Antàrtics i per l’altra els gèneres Magallànics. Pachycara brachycephalum apareix clarament separat de les altres espècies de Pachycara (P. priedei i P. matallanasi ). El mateix resultat el trobem a les espècies del gènere Lycenchelys (L. bachmanni i L. wilkesi) que també es troben separades. Aquests dos casos mostren la necessitat de realitzar una revisió completa d’alguns gèneres de la subfamília Lycodinae mitjançant dades anatòmiques i moleculars. / Family Zoarcidae (eelpouts) is the largest family of the suborder Zoarcoidei (Perciformes), including 4 subfamilies (Lycozoarcinae, Zoarcinae, Gymnelinae and Lycodinae) and about 240 species in 54 genera. This family has a wide distribution and it is found in all oceans and seas of the world; it primarily inhabits mud bottoms of the continental shelves and the slopes of boreal seas, but some species are known from the abyssal zone. Species of Lycodinae are abundant in the North Pacific and North Atlantic seas but there has been some radiation into the Arctic, South America and Antarctic waters. The origin of eelpouts was probably in the North Pacific (Okhotsk Sea); this is evidenced by a very high diversity and a higher number of endemisms, and by the fact that there are representatives of all the 4 subfamilies of Zoarcidae. This thesis is focused on the taxonomic and phylogeny of Lycodinae. Subfamily Lycodinae is the largest subfamily within Zoarcidae and it includes 38 genera and about 190 species. It is a fish group little known; in the last few years, 5 new genera have been described (Leucogrammolycus, Gosztonyia, Bellingshausenia, Santelmoa and Bentartia) and there are probably still many species and genera which remain undescribed. The systematic of Lycodinae has been widely discussed by many authors, and although molecular data has been added in the last few years, there are some points that are still unclear. The aim of this thesis is to contribute to the knowledge of the diversity and the phylogeny of subfamily Lycodinae. To achieve the objectives, four studies have been carried out. Specimens from Magellan province, the Southern Ocean and the Solomon Sea (Western South Pacific) have been studied. As a result, 2 new genera, Patagolycus and Argentinolycus, have been described and a third genus (Iluocoetes) has been redescribed. Two new species of Santelmoa (S. fusca and S. antarctica) have been described from the Southern Ocean and a new species (Pachycara matallanasi) from the Solomon Sea has been described. The last study is a phylogenetic analysis of some genera of Lycodinae. It has been carried out using molecular data (Cytochrome Oxidase I and Control Region) and anatomical data. Resulting trees show that, Lycodapus is separated from all other genera and that the remaining genera are divided into Antarctic and Magellanic genera. Pachycara brachycephalum appeared in a separated clade of Pachycara priedei and Pachycara matallanasi. The same result is found in species of Lycenchelys (L.bachmanni and L. wilkesi) which are separated. These two cases show that a complete review using anatomic and molecular data is required in some genera of Lycodinae.

La localització de l'anx6 ha estat sempre descrita associada a fosfolípids de membrana però el tipus de membrana discerneix segons el tipus cel.luar que s'estudia i l'anticos utilizat. En aquest estudi s'ha emprat un anticòs policlonal de conill contra la forma d'anx6 aïllada d'endosomes de fetge de rata. Concretament, en la membrana plasmàtica han classificat a l'anx6 com a proteïna estructural, unint-se per un costat a la membrana i per l'altre al citoesquelet, i també com a proteïna implicada en la transducció del senyal. També s'ha localitzat en compartiments endocítics i exocítics, així com en autofagosomes tardans. El nostre laboratori va trobar que en els hepatòcits de rata l'anx6 colocalitzava amb un marcador d'endosomes primerencs (Radb5) al voltant del canalicle biliar.

En aquesta tesi s´ha hipotetitzat sobre l´existència d´alteracions en l´expressió de gens reguladors del cicle cel.lular, de l´apoptosi i en els agents que intervenen en l´adquisició del fenotipus metastàsic a diferents nivells, des d´una fase inicial premaligna fins a les fases més avançades metastàsiques en carcinomes prostàtics de malalts en el nostre medi.Aquest estudi s´ha realitzat a partir de 168 mostres que inclouen 52 adenocarcinomes, 36 focus de PIN d´alt grau, 50 mostres de teixit normal adjacent al tumor, 19 metàstasis ganglionars i 11 mostres d´hiperplàsia nodular.S´han analitzat dos tipus de variables: les que corresponen als marcadors immunohistoquímics (p53, bcl-2, p21, p27, catepsina B i catepsina S), així com diverses variables clínico-patològiques.S´han establert les següents conclusions:1.- La sobreexpressió de p53 en el model de neoplàsia prostàtica s´ha trobat predominantment a la fase de carcinoma de pròstata, la qual cosa recolza la hipòtesi que l´expressió de p53 mutada succeeix en etapes tardanes de la carcinogènesi de la glàndula prostàtica. L´associació de la sobreexpressió de p53 amb diversos paràmetres clínico-patològics, com el marge de resecció positiu i la fase S, probablement es deu a la seva associació amb el grau histològic.2.- La freqüent sobreexpressió de bcl-2 observada en la Neoplàsia Prostàtica Intraepitelial d´alt grau suggereix un paper d´aquest gen antiapoptòtic en la tumorogènesi prostàtica inicial, on podria actuar com a factor de supervivència per contrarrestar un possible augment de l´apoptosi en lesiones premalignes i permetent la progressió tumoral.3.- La sobreexpressió aberrant de p21Waf1/Cip1 en les cèl.lules tumorals caracteritza a un subgrup de pacients amb un curs clínic desfavorable, la qual cosa podria ser deguda a la seva associació amb el grau histològic. La regulació del punt de restricció fisiològic G1/S del cicle cel.lular podria estar alterat, amb participació de mecanismes d´activació de p21Waf1/Cip1 independents de p53. D´altra banda, la mancança d´expressió de p21Waf1/Cip1 no sembla tenir un paper rellevant, al no trobar-se associada a altres paràmetres clínico-patològics.4.- p27Kip1 es troba expressat intensament en l´epiteli prostàtic normal i hiperplàsic i la regulació negativa és un fenomen comú en el carcinoma de pròstata, succeint en les fases inicials de l´evolució neoplàsica. Donada la capacitat supressora tumoral del gen de p27Kip1, la seva expressió disminuïda podria tenir un important paper en el desenvolupament i progressió del càncer de pròstata.5.- En la carcinogènesi prostàtica es produeixen alteracions, sovinit múltiples, que afecten en forma de sobreexpressió a diversos gens supressors como TP53, p21Waf1/Cip1 y p27Kip1 o genes antiapoptòtics como bcl-2, suggerint la posibilitat d´un efecte colaboratiu entre ells o la necessitat de progressives alteracions fenotípiques. Això succeeix amb una especial freqüència en tumors d´alt grau histològic i, per tant, de més gran agressivitat biològica.6.- Tant la catepsina B com la catepsina S es coexpressen freqüentment en carcinomes de pròstata i aquesta expressió sembla tenir un paper ja a fases inicials del desenvolupament. L´absència d´immunopositivitat comparable en el teixit normal suggereix un paper d´aquestes cistein proteases en la progressió del carcinoma de pròstata.7.- La catepsina B freqüentment es sobreexpressa en tumors negatius per a Bcl-2, la qual cosa planteja un possible paper de la catepsina B en la regulació d´alguna via apoptòtica en les cèl.lules tumorals.

En el desarrollo de esta tesis doctoral nos hemos centrado en el estudio de diferentes vías de señalización intracelular implicadas en los procesos de supervivencia y muerte neuronal en el contexto de la enfermedad de Huntington, con el objetivo de entender cómo la presencia de la proteína "htt" mutada afecta de forma específica a la normal viabilidad y supervivencia de las neuronas GABAérgicas del núcleo estriado.En un primer trabajo se estudió la implicación de los sistemas glutamatérgicos y dopaminérgicos en la mayor vulnerabilidad de las células estriatales. Los resultados obtenidos nos demostraron que la presencia de la htt mutada potencia la muerte celular inducida por la activación de los receptores glutamatérgicos y dopaminérgicos. Asimismo, demostramos que el efecto neurotóxico asociado a la activación glutamatérgica y dopaminérgica está mediado por una aberrante activación de la vía de la quinasa Cdk5. De esta manera, la htt mutada incrementa la sensibilidad estriatal al glutamato y a la dopamina, modificando una vía de señalización común a ambos sistemas, la vía de Cdk5.En un segundo trabajo se analizó si la alteración en los niveles del receptor TrkB asociada a la expresión de la htt mutada se traduce en una anómala señalización intracelular en respuesta a BDNF. Los resultados obtenidos nos permitieron concluir que en presencia de la htt mutada se produce una específica alteración en la vía de señalización de TrkB-ERK1/2. Además, comprobamos que la menor activación de esta vía intracelular conlleva una mayor susceptibilidad de las células estriatales frente a un estímulo de estrés oxidativo inducido con H2O2.De acuerdo con los resultados obtenidos en esta tesis, la mayor vulnerabilidad de las neuronas estriatales frente a la presencia de la htt mutada podría ser el resultado de (1) una sobreactivación de vías intracelulares con un efecto neurotóxico, como sería, en este caso, la vía de Cdk5 tras una estimulación glutamatérgica y dopaminérgica, y (2) una menor activación de las vías intracelulares involucradas en el mantenimiento de la supervivencia neuronal, como es la vía de ERK1/2.La identificación y caracterización de los diferentes mecanismos moleculares responsables de la selectiva muerte neuronal en la enfermedad de Huntington puede ser de gran utilidad para el futuro diseño de nuevas terapias farmacológicas que permitan retrasar o prevenir la progresión de la enfermedad.

Els teixits d'inervació tenen una funció esencial a la regulació de les poblacions neuronals definitives mitjançant el control del fenòmen de la mort neuronal fisiològica, basat en el subministrament limitat de neurotrofines (NT's) a les neurones embrionàries. Al cas de les motoneurones (MTN's) de la medul.la espinal, encara no s'ha establert amb precissió la identitat de les molècules neurotròfiques derivades del múscul que governen aquest procès. La primera part d'aquest estudi parteix del desenvolupament d'un model de cultiu de MTN's espinals d'embrió de pollastre. La tècnica utilitzada -de sedimentació sobre un gradient de densitat- permet obtenir una població pura de MTN's embrionàries d'acord amb criteris morfològics, bioquímics i immunocitoquímics. S'ha usat aquest sistema in vitro per la caracterització del procès de mort fisiològica de les MTN's com apoptòtic, i l'estudi de la dependència de les MTN's per a la seva supervivència de les activitats tròfiques presents al teixit muscular esquelètic. Així mateix, s'han analitzat alguns dels mecanismes implicats a la mort de les MTN's per deprivació neurotròfica, rebent especial atenció la participació del metabolisme de les pirimidines al control de la supervivència de les MTN's embrionàries. Durant el desenvolupament embriològic, les MTN's espinals modifiquen els seus requeriments tròfics. A les etapes tardanes del periode de mort fisiològica, aquestes neurones adquireixen la capacitat de respondre a les NT's BDNF, NT-3 i NT-4/5. En aquest estudi, s'ha correlacionat aquesta resposta amb el patró d'expressió dels receptors TrkB i TrkC a la superfície de les MTN's espinals. La seva activació pels factors corresponents comporta la fosforilació i, presumiblement, l'activació de les kinases citosòliques MAPK's. D'altra banda, emprant com a model el receptor TrkA present a la superfície de les neurones simpàtiques del gangli cervical superior de l'embrió de rata i de les cèl.lules PC12, s'ha comprovat com l'autofosforilació dels receptores Trk és necessària per les respostes de supervivència i diferenciació neuronal induïdes per les NT's, encara que d'una manera diferent. L'activitat bioelèctrica també sembla participar a la regulació de la supervivència neuronal embrionària. La despolarització crònica de la membrana cel.lular amb concentracions elevades de K + estimula la supervivència de les MTN's espinals embrionàries mitjançant l'increment de la [Ca 2+ ]i en relació amb l'activació de canals de Ca 2+ dependents de voltatge de tipus L. Així mateix, comporta l'activació de la via de transducció p21ras-MAPK, independentment de l'estimulació dels receptors Trk presents a la superfície de les MTN's. / Los tejidos de inervación tienen una función esencial en la regulación de las poblaciones neuronales definitivas a través del control del fenómeno de la muerte neuronal fisiológica, basado en un suministro limitado de neurotrofinas (NT's) a las neuronas embrionarias. En el caso de las motoneuronas (MTN's) de la médula espinal, aún no se ha establecido con precisión la identidad de las moléculas neurotróficas derivadas del músculo que gobiernan dicho proceso. La primera fase de este estudio parte del desarrollo de un modelo de cultivo de MTN's espinales de embrión de pollo. La técnica usada -de sedimentación sobre un gradiente de densidad- permite obtener una población pura de MTN's embrionarias según criterios morfológicos, bioquímicos e inmunocitoquímicos. Este sistema in vitro ha sido utilizado para caracterizar el proceso de muerte fisiológica de las MTN's como apoptótico, y estudiar la dependencia de las MTN's para su supervivencia de las actividades tróficas presentes en el tejido muscular esquelético. Asimismo, se han analizado algunos mecanismos implicados en la muerte de las MTN's por deprivación neurotrófica, mereciendo especial atención la participación del metabolismo de las pirimidinas en el control de la supervivencia de las MTN's embrionarias. Durante el desarrollo embrionario, las MTN's espinales modifican sus requerimientos tróficos. En las etapas tardías del período de muerte fisiológica, estas neuronas adquieren la capacidad de responder a las NT's BDNF, NT-3 y NT-4/5. En este estudio, se ha correlacionado dicha respuesta con el patrón de expresión de los receptores TrkB y TrkC en la superficie de las MTN's espinales. Su activación por los correspondientes ligandos comporta la fosforilación y, presumiblemente, activación de las kinasas citosólicas MAPK's. Por otra parte, tomando como modelo el receptor TrkA presente en la superficie de las neuronas simpáticas del ganglio cervical superior del embrión de rata y de las células PC12, se ha comprobado cómo la autofosforilación de los receptores Trk es necesaria para las respuestas de supervivencia y diferenciación neuronal inducidas por las NT's, aunque de forma diferente. La actividad bioeléctrica también parece participar en la regulación de la supervivencia neuronal embrionaria. La despolarización crónica de la membrana celular con elevadas concentraciones de K + estimula la supervivencia de las MTN's espinales embrionarias a través del incremento de la [Ca 2+ ]i en relación con la activación de canales de Ca 2+ dependientes de voltaje tipo L. Asimismo, comporta la activación de la vía de transducción p21ras-MAPK, independientemente de la estimulación de los receptores Trk presentes en la superficie de las MTN's. / Neuronal targets of innervation are major determinants in the regulation of the final neuronal populations by controlling naturally-occurring cell death. Such phenomenon is based upon the limited supply of neurotrophins (NT's) to embryonic neurons. The identity of muscle-derived neurotrophic molecules involved in the control of naturally-occurring cell death of motoneurons (MTN's), has not yet been established. First, a culture system for chick embryo spinal MTN's was developed. The methodology employed -a density-gradient sedimentation technique- yields a pure population of embryonic MTN's according to morphological, biochemical, and immunocytochemical criteria. This in vitro system was then used to characterize naturally-occurring death of MTN's as apoptotic, and to study the dependence of MTN's for survival on the trophic activities derived from skeletal muscle tissue. Moreover, some of the mechanisms mediating MTN death upon trophic deprivation were analyzed. The relevance of pyrimidine metabolism to this type of neuronal death merited special attention. Spinal MTN's switch their trophic requirements throughout embryonic development. Late during naturally-occurring death, these neurons become responsive to the NT's BDNF, NT-3, and NT-4/5. In this study, this property was correlated with the presence on the surface of spinal MTN's of receptors TrkB and TrkC. Their activation by the corresponding neurotrophic factors was shown to cause the phosphorylation and, presumably, activation of cytosolic MAPK's in cultured spinal MTN's. Furthermore, by using TrkA receptors present on the membrane surface of sympathetic superior cervical ganglion neurons and PC12 cells as an experimental model, autophosphorylation of Trk receptors was demonstrated to be necessary for both survival and differentiation induced by NT's, although in not in the same manner. Bioelectric activity also seems to participate in the regulation of neuronal survival during embryonic development. Chronic cell membrane depolarization with high concentrations of K + was found to stimulate survival of embryonic spinal MTN's. This effect was mediated by a rise in [Ca 2+ ]i related to the activation of type-L voltage-gated Ca 2+ channels. Moreover, membrane depolarization caused the activation of the p21ras-MAPK signal transduction pathway, which occurred independently of the stimulation of Trk receptors present on the surface of cultured MTN's.

L'olomoucina i la roscovitina són dos inhibidors de les cinases dependents de ciclines (CDKs) que actuen competint pel lloc d'unió de l'ATP. Presenten una alta especificitat "invitro"davant de la CDK1, 2, 5, 7, 9 i les ERKs. Aquest perfil inhibidor els confereix unes amplies perspectives en la teràpia antitumoral.En aquest treball, hem mostrat que la línia neuroblàstica de les SH-SY5Y i la promielocítica de les HL60, morien apoptòticament en resposta a ambdós fàrmacs. Una caracterització més extensa del procés, va evidenciar que la sobre expressió de Bcl-2 o Bcl-XL no conferien resistència. En canvi, la inhibició general de les caspases amb z-VAD-fmk, frenava parcialment la mort. En conseqüència, vam hipotetitzar que ens trobàvem davant d'una via extrínseca d'apoptosi, dependent de l'activació de la caspasa 8 (CASP8) o de la caspasa 10 (CASP10). Tanmateix, les CASP8/10 no s'expressen a les SH-SY5Y ja que els seus gens han estat metilats, i és més, no vam observar que es reexpressessin en resposta a l'olomoucina o la roscovitina. En conclusió, la implicació al nostre paradigma experimental d'una via extrínseca canònica d'apoptosi va ser descartada. D'altra banda, la inhibició de la síntesi de proteïnes protegia les SH-SY5Y de l'apoptosi. Curiosament, vam observar l'existència de sinergisme de rescat entre el z-VAD-fmk i ,per exemple, la cicloheximida, fet que suggeria l'existència de diferents vies apoptòtiques en diferents subpoblacions del cultiu cel·lular. La manca de toxicitat del tractament amb PD98059 o UO126, dos inhibidors de la via Erk1/2, anava en contra de que la inhibició de Erk1/Erk2 fos la causa de l'apoptosi. És més, el tractament amb olomoucina i roscovitina induïa la fosforilació i subseqüent activació de les Erk1/2. Sorprenentment, al nostre model, l'isoolomoucina, un isòmer inactiu de l'olomoucina, causava els mateixos efectes sobre les ERKs. Basant-nos en els resultats d'iso-olomoucina, vam concloure que la fosforilació de les ERKs i la seua subseqüent activació, no estaven implicats en els fenòmens d'apoptosi, proliferació i diferenciació. Finalment, vam mostrar que les SH-SY5Y diferenciades esdevenien resistents a l'olomoucina i a la roscovitina, fet que recolzava el paper de la inhibició de les CDKs en tant que esdeveniment iniciador de la cascada apoptòtica. D'altra banda, l'olomoucina i la roscovitina són cada cop més estudiats en el context de la teràpia combinatòria enfront del càncer. Als nostres treballs, hem utilitzat la R-roscovitina, un dels dos estereoisòmers de la roscovitina. La combinació amb el docetaxel (DTX) no era sinèrgica induint mort. En canvi, la R-roscovitina sensibilitzava les SH-SY5Y a l'apoptosi induïda per la nutlina-3, un nou i prometedor f-armac inductor de la via p53. / La olomoucina y la roscovitina son dos inhibidores de las cinasas dependientes de ciclinas (CDKs) cuyo mecanismo de acción es competir con el ATP por la unión a la enzima. Presentan una alta selectividad"in vitro"ante la CDK1, 2, 5, 7, 9 y las ERKs. Este perfil inhibidor les confiere amplias perspectivas en la terapia antitumoral. En este trabajo, hemos mostrado que la línea de las SH-SY5Y, derivada de neuroblastoma, y la de las HL-60, derivada de una leucemia promielocítica, morían apoptoticamente en respuesta a ambos fármacos. Una caracterización más amplia del proceso apoptótico, evidenció que la expresión forzada de Bcl-2 o de Bcl-XL no conferían resistencia ante ninguna de nuestras drogas. En cambio, sí se hacían parcialmente más resistentes cuando eran tratadas con un inhibidor general de las caspasas (z-VAD-fmk). En consecuencia, nuestra hipótesis fue que nos hallábamos ante una apoptosis por vía extrínseca iniciada por la caspasa 8 (CASP8) y/o la caspasa 10 (CASP10). Curiosamente, dichas caspasas no se expresan en las SH-SY5Y debido a un proceso de metilación génica, y pudimos ver que el tratamiento tampoco inducía su reexpresión. En conclusión, descartamos que las SH-SY5Y iniciasen una vía extrínseca canónica en respuesta a nuestras drogas. Por otro lado, la inhibición de la síntesis proteica en nuestro modelo frenaba la apoptosis. Es más, el z-VAD-fmk junto con, por ejemplo, la cicloheximida, presentaban un sinergismo en el rescate. Esto sugería la coexistencia en nuestro cultivo de distintas subpoblaciones capaces de iniciar diferentes vías apoptóticas. El tratamiento con PD98059 o UO126, dos inhibidores de la via de Erk1/2, se mostró inocuo a la hora de inducir muerte, por lo cual descartamos que la inhibición de Erk1/2 fuera la responsable de la apoptosis. Sorprendentemente, el estudio del estado de fosforilación de Erk1/2, nos permitió constatar que éstas se activaban en respuesta a la olomoucina y la roscovitina. Más sorprende aún, resultó el hecho que la iso-olomoucina, un isómero inactivo de la olomoucina, causara los mismos efectos sobre Erk1/2. Esto nos permitió afirmar que no existía correlación entre la fosforilación de Erk1/2 y la inhibición de las CDKs. En base principalmente a los resultados de la iso-olomoucina, pudimos afirmar que la fosforilación de las ERKs y su subsiguiente activación, no se correlacionaban con la apoptosis, proliferación y diferenciación celular. Finalmente, evidenciamos que las SH-SY5Y diferenciadas se volvían resistentes a la olomoucina y a la roscovitina, hecho a favor de que la inhibición de las CDKs fuera el evento iniciador de la cascada apoptótica. Alternativamente, la olomoucina y la roscovitina están siendo cada vez más estudiadas en el contexto de la terapia combinatoria frente al cáncer. En nuestros experimentos, utilizamos también la R-roscovitina, uno de los dos estereoisómeros de la roscovitina. En su combinación con el docetaxel (DTX), no observamos sinergismo. El caso contrario sucedi´o cuando fue administrada junto a la nutlina-3, un nuevo y prometedor inductor de p53. Vimos como la R-roscovitina sensibilizaba las SH-SY5Y a la apoptosis inducida por la nutlina-3. / Olomoucine and roscovitine are two ATP-competing inhibitors of cyclin-dependent kinases (CDKs) displaying a promising profile as anticancer agents. They exhibit "in vitro"selectivity against CDK1, 2, 5, 7, 9 and ERKs. In this work, we have showed that SH-SY5Y neuroblastoma and HL-60 promielocytic cell lines died by apoptosis in response to both drugs. An extensive characterization of the process in SH-SY5Y cells has shown that neither Bcl-2 nor Bcl-XL overexpression conferred any resistance to both drugs. However, a partial protective effect was detected when cells were treated with a general inhibitor of caspases (z-VAD-fmk). Therefore, the involvement of an extrinsic pathway mediated by Caspase 8 (CASP8) or Caspase 10 (CASP10) could be hypothesised. CASP8/10 are known not to be expressed in SH-SY5Y because of gene silencing and we have found no re-expression was induced by either olomoucine or roscovitine. In conclusion, a canonical extrinsic pathway has been discarded in SH-SY5Y cells facing these drugs. On the other hand, protein synthesis inhibitors protected SH-SY5Y cells from apoptosis.Interestingly, a synergism in cell protection was observed between z-VAD-fmk and, for instance cycloheximide. This suggested different apoptotic pathways occurring in distinct subpopulations of the cell culture. No lethality was found when cells were treated with either PD98059 or UO126 drugs, two inhibitors of the Erk1/2 pathway, thus discarding, this inhibition as the cause of apoptosis. Furthermore, olomoucine and roscovitine induced the phosphorylation and subsequent activation of Erk1/2 proteins.Interestingly, iso-olomoucine, an inactive isomer of olomoucine, caused the same effect in our cell model.Therefore, no correlation existed between Erk1/2 phosphorylation and CDK inhibition. Based mainly on the iso-olomoucine results, we concluded that phosphorylation and subsequent activation of Erk1/2 were not involved in apoptosis, proliferation and differentiation of the cells. Finally, we show that differentiated SH-SY5Y cells became resistant to either olomoucine or roscovitina, thus providing support for CDK inhibition as the initiating event of these apoptotic processes. Olomoucine and roscovitine are being increasingly studied in the context of combinatorial therapy for cancer. In our studies, we have also used R-roscovitine, the right stereoisomer of roscovitine. No synergism was found when combined with docetaxel (DTX). On the contrary, R-roscovitine sensitized SH-SY5Y cells to nutlin-3 induced apoptosis, being nutlin-3 a new promising inductor of the p53 functions. / Lólomoucine et la roscovitine sont deux inhibiteurs des kinases d´ependantes de cyclines (CDKs) qui agissent par inhibition competitive via le site d'union de l'ATP. Son profil inhibiteur est tr-es prometteur dans le traitement du cancer. Présentent une grande spécificité "in vitro"face aux CDK1, 2, 5, 7, 9 e aux ERKs. Dans ce travail, nous avons d´emontré que la lignée neuroblastique SH-SY5Y et la promyélocitique HL-60, mouraient apoptotiquement en réponse àces drogues. Une plus large caractérisation de l'apoptose dans les SH-SY5Y a mis enévidence que la surexpression de Bcl-2 ou de Bcl-XL ne se traduisait par une augmentation de la résistance au traitement. Cependant, le traitement avec un inhibiteur général des caspases (z-VAD-fmk) présentaient des effets protecteurs partiels. Au vu de ces résultats, notre hypothèse reposait sur límplication d'une voie extrinsèque d'apoptose qui d´ependait de l'activation de la caspase 8 (CASP8) ou de la caspase 10 (CASP10). Néanmoins, la m´ethylation des gènes des CASP8 et 10 dans les SH-SY5Y empèche l'expression de ces protéines et, plus encore, l'olomoucine et la roscovitine nínduiraient pas la réexpression de ces caspases. En conclusion, l'apoptose par une voie extrinsèque classique pouvait ètreécartée dans notre paradigme expérimental. D'un autre coté, les inhibiteurs de la synthèse des protéines protégeaient les SH-SY5Y de l'apoptose. De manière surprenante, on avait observé l'existence de synergie dans la protection avec z-VAD-fmk et, par exemple, le cycloheximide.Ce fait suggérait la présence de différents sous-poupulations cellulaires dans les SH-SY5Y qui engageaient des voies apoptotiques distinctes. Le manque d'effets toxiques du PD98059 or UO126, deux inhibiteurs de la voie d'Erk1/2, avait écarté l'inhibition de Erk1/Erk2 comme la responsable de l'apoptose.Plus encore, l'olomoucine et la roscovitine induisaient la phosphorylation et subséquente activation d'Erk1/Erk2. De manière surprenante, l'iso-olomoucine, un isomère inactif de l'olomoucine, induisait aussi la phosphorylation et l'activation dans notre modèle cellulaire. Sur base de ces résultats, nous avons conclu que la phosphorylation d'Erk1/Erk2 et son activation, n'avait pas un corr´elat avec l'apoptose, la prolifération et la différentiation cellulaire. Finalement, nous avons mis en évidence que les SH-SY5Y différentiées devenaient résistantes à l'olomoucine ou à la roscovitine. Ce fait suggérait que l'inhibition des CDKs avait un role dans le d´eclenchement de l'apoptose. Alternativement, l'olomoucine et la roscovitine sont de plus en plus étudiées dans le contexte de la th´erapie combinatoire face au cancer.J'ai utilisé la R-roscovitine dans nos expériences, l'un des deux stéréoisomères de la roscovitine. La combinaison avec le docétaxel (DTX) n'avait pas des effets l´etaux synergiques, en revanche la R-roscovitine sensibilisait les SH-SY5Y à lápoptose par la nutline-3, un nouvel agent inducteur de la voie p53.

No description available.

Membrane Computing:Traces, Neural Inspired Models, ControlsAutor: Armand-Mihai IonescuDirectores: Dr. Victor Mitrana (URV)Dr. Takashi Yokomori (Universidad Waseda, Japón)Resumen Castellano:El presente trabajo está dedicado a una área muy activa del cálculo natural (que intenta descubrir la odalidad en la cual la naturaleza calcula, especialmente al nivel biológico), es decir el cálculo con membranas, y más preciso, a los modelos de membranas inspirados de la funcionalidad biológica de la neurona.La disertación contribuye al área de cálculo con membranas en tres direcciones principales. Primero, introducimos una nueva manera de definir el resultado de una computación siguiendo los rastros de un objeto especificado dentro de una estructura celular o de una estructura neuronal. A continuación, nos acercamos al ámbito de la biología del cerebro, con el objetivo de obtener varias maneras de controlar la computación por medio de procesos que inhiben/de-inhiben. Tercero, introducimos e investigamos en detallo - aunque en una fase preliminar porque muchos aspectos tienen que ser clarificados - una clase de sistemas inspirados de la manera en la cual las neuronas cooperan por medio de spikes, pulsos eléctricos de formas idénticas.English summary:The present work is dedicated to a very active branch of natural computing (which tries to discover the way nature computes, especially at a biological level), namely membrane computing, more precisely, to those models of membrane systems mainly inspired from the functioning of the neural cell.The present dissertation contributes to membrane computing in three main directions. First, we introduce a new way of defining the result of a computation by means of following the traces of a specified object within a cell structure or a neural structure. Then, we get closer to the biology of the brain, considering various ways to control the computation by means of inhibiting/de-inhibiting processes. Third, we introduce and investigate in a great - though preliminary, as many issues remain to be clarified - detail a class of P systems inspired from the way neurons cooperate by means of spikes, electrical pulses of identical shapes.

Durant la transició Epiteli-Mesènquima (TEM), el factor de transcripció Snail reprimeix la transcripció de l'E-cadherina unint-se a les caixes E presents en el promotor d'aquest gen.Les cèl·lules que expressen Snail presenten un fenotip fibroblastoide amb pocs contactes cel·lulars: els gens epitelials són reprimits (E-cadherina, MUC1 i VDR) i els gens mesenquimals són induïts (Zeb1).La sobre-expressió de Snail en varies línies cel·lulars donarà lloc a un augment en els nivells de RNA i de l'activitat del promotor de Zeb1. A més, Zeb1 reprimeix l'E-cadherina i MUC1.Estàvem interessats en el mecanisme de repressió i inducció de gens per Snail. Snail necessita de HDAC per a realitzar el seu mecanisme de repressió. A més, es va estudiar el mecanisme de inducció del promotor de Zeb1. El promotor de Zeb1 era activat en línies cel·lulars que responien a estímuls de TEM, com la sobre-expressió de ILK, de l' oncogen Ha-Ras o de la cPK-Ca. Finalment es va descriure que el promotor de Zeb1 responia a NF-kB, b-catenina/TCF4 i Twist. / During Epithelial mesenchymal transition (EMT), the transcriptional factor Snail represses E-cadherin transcription by binding to E-box sequence of the E-cadherin promoter. Cells expressing Snail presented a scattered flattened phenotype with low intercellular contacts: epithelial gene are repressed (E-cadherin, VDR and Muc-1) and mesenchymal genes are induced (Zeb1). Snail overexpression in several lines raised ZEB1 RNA levels and increased the activity of ZEB1 promoter. ZEB1 repressed E-cadherin and MUC1.We were interested in Snail repression and induction mechanism. We analysed whether Snail needs other proteins for its repression function and we found HDAC such as partners in Snail repression. In addition, we are studying its activation activity upon Zeb1 promoter. The human Zeb1 promoter was activated in cell lines that respond to agents that induce mesenchymal phenotype, as overexpression of integrin-linked kinase (ILK) or oncogenes such as Ha-ras or cPK-Ca. Moreover, Zeb1 promoter was activated by different proteins implicated in EMT, such as, NF-kB, b-catenin/TCF4 and Twist.

El objetivo principal de esta tesis ha sido el desarrollo de nuevos poliuretanos a partir de ácidos grasos como fuentes renovables, utilizando química “click” en la síntesis de los dioles y polioles correspondientes. La primera parte del trabajo describe la preparación de los monómeros “vía” acoplamiento tiol-eno ó tiol-ino, su caracterización y las propiedades de los poliuretanos sintetizados. Como los polímeros a partir de ácidos grasos provienen de macromoléculas biológicas y pueden ser potencialmente biocompatibles, la segunda parte del trabajo está dirigida a incrementar la biocompatibilidad de los poliuretanos a través de diversas estrategias de funcionalización con moléculas bioactivas, para su implementación en ingeniería de tejidos. Tres metodologías fueron investigadas: mezclas con gelatina; inmovilización covalente de colágeno sobre la superficie mediante plasma; e inmovilización iónica de sulfato de condroitina sobre la superficie mediante aminólisis. / The main objective of this thesis has been the development of new polyurethanes from renewable sources such as fatty acids, using "click" chemistry in the synthesis of the corresponding diols and polyols. The first part of this study describes the preparation of monomers "via" thiol-ene or thiol-yne coupling, characterization and properties of the synthesized polyurethanes. As the polymers from fatty acids derived from biological macromolecules and can be potentially biocompatible, the second part of this work is focused on the enhancement of polyurethanes biocompatibility through bioactive molecules functionalization strategies, for tissue engineering purposes. Three approaches have been investigated: blends of polyurethanes and gelatin; covalent surface modification of polyurethanes with collagen by plasma treatment; and ionic surface modification of polyurethanes with chondroitin sulfate by aminolysis treatment.