En els darrers anys, el coneixement dels mixozous (Fílum Myxozoa) al Mediterrani ha crescut gràcies a la creixent necessitat de solucionar els problemes sanitaris que aquests paràsits ocasionen en cultius de peixos d'interès comercial. En aquest sentit, Enteromyxum leei és un dels patògens més importants per a l'aqüicultura al Mediterrani tant a nivell sanitari com econòmic. Això és degut a la susceptibilitat que presenten algunes espècies d'interès per l'aqüicultura al Mediterrani com els espàrids. D'altra banda, el seu control és difícil per la capacitat d'E. leei de transmetre's horitzontalment, per l'existència de possibles reservoris de la malaltia en els sistemes sublitorals mediterranis (Padrós i col. 2001), i pel desconeixement del seu cicle de vida i la falta d'estudis sobre el seu tractament i prevenció (Yokoyama i Shirakashi 2007).Per tal d'avaluar la situació de l'enteromixosi produïda per E. leei en els cultius d'espàrids al Mediterrani i per tal de desenvolupar mesures de prevenció i control es va plantejar el projecte europeu MyxFishControl: Diagnosis, epidemiology and control of an enteric myxosporosis of commercial Mediterranean fish (QLRT-2001-00722). La present tesi doctoral contribueix als objectius generals del projecte MyxFishControl en l'estudi de la transmissió, patogènia i desenvolupament d'E. leei dins dels seus hostes. En primer lloc, s'ha realitzat una descripció dels principals estadis de desenvolupament d'E. leei observats en orades (Sparus aurata) i en morrudes (Diplodus puntazzo) mitjançant tècniques d'estudi tradicional al microscopi òptic i electrònic de transmissió i tècniques citoquímiques complementàries com la detecció d'hidrats de carboni mitja o la detecció de lípids. Aquest estudi ha permès descriure cinc estadis de desenvolupament del paràsit i, a més, ha permès establir una possible seqüència temporal d'aquests estadis basada en les observacions del seu creixement i de la seva maduració.D'altra banda, s'ha realitzat un estudi comparatiu al microscopi òptic de l'establiment, la progressió de la infecció i la patogènia d'E. leei en diferents situacions experimentals. Aquest estudi ha permès avaluar estadísticament l'efecte que tenen la metodologia usada per infectar l'hoste, la seva edat i l'espècie a la que pertany, en les característiques de la infecció. En general, s'ha pogut establir que mentre que les lesions que provoca el paràsit són independents d'aquestes variables, la resposta inflamatòria, les taxes d'infecció i la progressió de la infecció sí que en depenen.Per últim, durant el transcurs de les infeccions experimentals en orada es va detectar un organisme desconegut de morfologia semblant a la d'un mixosporidi ancorat a les microvellositats dels entèrocits de l'epiteli intestinal. Per tal de definir la seva identitat i estudiar les característiques de la infecció en el seu hoste s'ha realitzat un estudi al microscopi òptic i electrònic que ha permès descartar la possibilitat que aquest mixosporidi sigui Leptotheca sparidarum o Ceratomyxa sparusaurati. D'altra banda, com aquest mixosporidi comparteix algunes característiques (com la localització o la patogènia) amb E. fugu, s'han realitzat una sèrie proves de PCR per tal d'avaluar la hipòtesi que aquest nou mixosporidi sigui en realitat E. fugu. Aquests estudis, però, no han permès confirmar la identitat d'aquest mixosporidi. / In last years, the knowledge about Mediterranean myxozoans (Phylum Myxozoa) has grown because of the rising necessity to solve the sanitary problems that these parasites cause in cultured commercial fish species. To date Enteromyxum leei is considered a risk to the development of Mediterranean aquaculture due to the high susceptibility showed by some important cultured species like the sparids, the fish-to-fish transmission of this parasite, the difficulty to apply prevention measures and the absence of effective treatments. In order to evaluate the situation of the enteromyxosis caused by E. leei in cultured sparids in the Mediterranean basin and to establish prevention and control measures, the European project MyxFishControl: Diagnosis, epidemiology and control of an enteric myxosporosis of commercial Mediterranean fish (QLRT-2001-00722) was developed. The present PhD thesis contributes to the main objectives of the MyxFishControl project in studying the transmission, pathogenesis and development of E. leei in their fish hosts. The developmental stages of E. leei in gilthead seabream (Sparus aurata) and sharpsnout seabream (Diplodus puntazzo) were described at light and electron transmission microscopes. In addition to traditional ones, some cytochemical techniques were used to detect carbohydrates and lipid inclusions. This morphological study let us to describe five developmental stages of E. leei inside their fish hosts and to propose a life cycle based on the growth and maturation of these stages. Moreover, a comparative study about the establishment, proliferation and pathogenesis of E. leei in different experimental conditions was carried out. Some statistical analyses were performed in order to evaluate the effect of the infection methodology, fish species and size. Although inflammatory reaction, prevalence and progression of the infection depend on these variables, the main pathological changes caused by E. leei in their fish host do not.Finally, during the experimental trials conducted with gilthead seabream, an unknown organism similar to a myxosporean was detected on the epithelial surface of the intestinal mucosa. Morphological and molecular studies were conducted in order to identify this new parasite and to describe the main infection characteristics. The observations at light and electron microscopes let us to rule out the hypothesis that this organism was Ceratomyxa sparusaurati or Leptotheca sparidarum. Although this unknown mixosporean shared some characteristics with Enteromyxum fugu, molecular studies didn't show an acceptable specificity. As a result, to date this mixosporean remain without identify.

Objetivos. En el presente trabajo se han cumplido dos objetivos concretos: 1. Desarrollo de un nuevo sistema chivato basado en la luciferasa para el estudio de promotores tanto constitutivos como inducibles en el contexto de un organismo completo. 2. Estudio del papel extracurricular del componente de ARN de la telomerasa (TR) en la hematopoyesis usando el pez cebra como modelo. - Metodología. Embriones de pez cebra han sido manipulados genéticamente mediante la microinyección de plásmidos, morfolinos y ARN (solos o en combinación) en el estadío de desarrollo de 1-8 células para recrear las distintas condiciones experimentales de estudio. Para el abordaje del primer objetivo, el estudio de la actividad promotora en el contexto de un organismo completo se ha llevado a cabo mediante la medida de luminiscencia. Para el cumplimiento del segundo objetivo, el recuento de los distintos tipos de células sanguíneas en las distintas condiciones experimentales se ha abordado mediante la tinción específica con TSA (neutrófilos) o con o-dianisidina (eritrocitos), o mediante el uso de distintas líneas de pez cebra transgénico que expresan proteínas fluorescentes en neutrófilos y en macrófagos. La funcionalidad de los neutrófilos se ha estudiado mediante ensayos de reclutamiento a una herida y de respuesta a una infección bacteriana. El estudio de la actividad telomerasa se ha realizado mediante una técnica específica y cuantitativa llamada Q-TRAP basada en la amplificación de la secuencia telomérica, y la longitud de los telómeros se ha cuantificado mediante Q-FISH, que consiste en una hibridación in situ con una sonda telomérica fluorescente. El estudio de la expresión de genes se ha llevado a cabo mediante RT-PCR y PCR a tiempo real, y también mediante hibridación in situ con sondas de ARN. Peces cebra han sido mantenidos según se indica en el manual del pez cebra. Todos los experimentos cumplen con la directiva de la Unión Europea (86/609/EU) y han sido aprobados por el Comité de Bioética del Hospital Clínico Universitario “Virgen de la Arrixaca” (España) y por el Comité Institucional del Cuidado y Uso Animal del Hospital Infantil de Boston (EEUU). - Resultados y conclusiones. Para el desarrollo del primer objetivo se combinaron las ventajas que tiene el ensayo clásico de la doble luciferasa con las que tiene el pez cebra como modelo vertebrado para desarrollar una técnica que permita analizar la actividad promotora y la función génica en el contexto de un organismo completo. El resultado fue una técnica rápida y sensible que puede ser utilizada como una nueva herramienta para caracterizar in vivo la mínima región promotora de un gen, la respuesta de promotores inducibles ante distintos estímulos, la validación de construcciones genéticas y la función de un gen de interés. La técnica desarrollada resulta muy valiosa cuando se combina con las ventajas que ofrece el pez cebra para hacer escrutinios a gran escala basados en el fenotipo, convirtiéndose en un sistema muy prometedor para la identificación y la validación de fármacos o genes que, por ejemplo, reviertan el fenotipo. El desarrollo del segundo objetivo de esta tesis muestra varias evidencias que apoyan al pez cebra como modelo para estudiar el papel del componente de ARN de la telomerasa (TR) en la disqueratosis congénita, que es una enfermedad hereditaria de envejecimiento prematuro, cuyos pacientes mueren principalmente debido al fallo de la médula ósea. En este modelo, la inhibición genética de TR resultó en la afectación de la mielopoyesis, a pesar de que el desarrollo de las células madre hematopoyéticas fue normal. Sorprendentemente, la neutropenia causada por la ausencia de TR fue independiente de la longitud telomérica y de la actividad telomerasa. El análisis genetico mostró que TR modula la decisión del destino mieloide/eritroide mediante el control de los niveles de los factores de transcripción mieloide y eritroide spi1 y gata1, respectivamente, mediante la estimulación de gcsf y mcsf. Este modelo de pez cebra deficiente en TR ilumina el papel extracurricular de TR, y podría establecer dianas terapéuticas para la disqueratosis congénita. / The zebrafish (Danio rerio) as a model to study in vivo the role of telomerase in hematopoiesis - Objectives. The specific objectives of the present work are: 1. Development of a new luciferase-based reporter system for studying both constitutive and inducible promoters in the context of a whole organism. 2. Study the non-canonical role of the telomerase RNA component (TR) in hematopoiesis using the zebrafish. - Methodology. Zebrafish embryos were genetically modified by injecting plasmids, morpholinos and RNA (alone or in combination) whitin the 1- to 8-cell developmental stage to simulate the different experimental conditions. For approaching the first goal, the study of the promoter activity in the context of a whole organism was carried out by measurement of luminiscence. To addressing the second goal, the counting of the different blood cells in the different experimental conditions was carried out by specific staining with TSA (neutrophils) or o-dianisidine (erythrocytes), or by using different transgenic zebrafish lines expressing fluorescent proteins in neutrophils or macrophages. The neutrophil functionality was studied by quantifying the recruitment to a wound and the response to a bacterial infection. The telomerase activity was determined by using a specific and quantitative assay based in the amplification of the telomere sequence and called Q-TRAP, and the telomere length was quantified by a whole-mount in situ hybridization with a fluorescent telomeric probe (Q-FISH). The study of gene expression was carried out by RT-PCR and real time PCR, and also by in situ hybridization with RNA probes. Zebrafish were maintained as described in the zebrafish handbook. The experiments performed comply with the Guidelines of the European Union Council (86/609/EU). Experiments and procedures were performed as approved by the Bioethical Committee of the University Hospital “Virgen de la Arrixaca” (Spain) and by the Children's Hospital Boston institutional Animal Care and Use Committee (USA). - Results and conclusions. Firstly, we have adapted the classical dual luciferase reporter assay from cell lines to whole zebrafish embryos/larvae. The result is a rapid and sensitive technique that can be used as a new tool to characterize the minimum promoter region of a gene as well as the in vivo response of inducible promoters to different stimuli. We have illustrated the usefulness of this system for studying both constitutive and inducible promoters. This assay has several advantages compared with the classical in vitro (cell lines) and in vivo (transgenic mice) approaches. Among others, the assay allows a rapid and quantitative measurement of the effects of particular genes or drugs in a given promoter in the context of a whole organism and it can also be used in high throughput screening experiments. We have showed several evidences supporting the zebrafish as a new model to study the role of the telomerase RNA component (TR) in DC, which is an inherited premature disease whose patients usually die of bone marrow failure. In this model, genetic depletion of TR results in impaired myelopoiesis, despite normal development of hematopoietic stem cells (HSCs). Interestingly, the neutropenia caused by TR depletion is independent of telomere length and telomerase activity. Genetic analysis shows that TR modulates the myeloid-erythroid fate decision by controlling the levels of the master myeloid and erythroid transcription factors spi1 and gata1, respectively, through stimulation of gcsf and mcsf. This model of TR deficiency in the zebrafish illuminates the non-canonical roles of TR, and could establish therapeutic targets for DC.

El complejo de Golgi participa en el procesamiento, la distribución y el transporte de lípidos y proteínas hacia su destino final dentro de la célula. El transporte desde el Golgi está mediado por intermediarios de transporte (ITs), principalmente vesículas y túbulos. La formación de ITs se inicia con la gemación de la vesícula o el túbulo, a continuación se produce su elongación y finalmente tiene lugar su fisión. Este proceso requiere de una compleja maquinaria molecular en la que intervienen las llamadas proteínas de cubierta, proteínas motoras asociadas al citoesqueleto, y los lípidos de las membranas. Respecto al papel de los lípidos, éstos pueden actuar tanto en el reclutamiento de proteínas citosólicas que participan en la formación de los ITs, como dotando a la membrana de las propiedades físicas óptimas para su deformación en vesículas o túbulos. La curvatura de membrana está facilitada por lípidos con estructura cónica como el ácido lisofosfatídico (LPA), el ácido fosfatídico (PA) y el diacilglicerol (DAG). El DAG cumple una doble función en la formación de ITs desde el Golgi: por una parte actúa en el reclutamiento y la activación de la proteína cinasa D (PKD), necesaria para la correcta fisión de vesículas desde la red trans-Golgi (TGN). Por otra parte ayuda a la formación de curvatura negativa. El DAG en el Golgi está estrechamente regulado por diferentes vías que controlan su formación y metabolismo. Una de estas vías está mediada por las llamadas fosfatasas del ácido fosfatídico (PAPs), que producen DAG a partir de defosforilar el PA. Existen dos familias de proteínas que actúan como fosfatasas del ácido fosfatídico. Las enzimas de la familia PAP1son citosólicas, su actividad catalítica es dependiente de Mg+2, se inhiben por N-etilmaleimida (NSF) y el PA es su único sustrato. Las enzimas PAP2 son proteínas transmembrana, independientes de Mg+2 e insensibles a NSF. Las PAP2 también se conocen como fosfatasas de lípidos fosfato (LPPs), ya que además del PA pueden también catalizar la defosforilación de otros lípidos como la ceramida-1-fosfato (C1P), la esfingosina-1-fosfato (S1P) y el ácido lisofosfatídico (LPA), aunque con diferentes afinidades (PA ~ LPA > C1P > S1P). La inhibición de las PAP por el agente farmacológico propanolol, indica que el DAG que proviene de esta vía es necesario para la formación de ITs desde el Golgi al retículo endoplasmático (RE). En esta tesis hemos demostrado que uno de los miembros de la familia PAP2, la enzima PAP2b, también conocida como LPP3, se localiza en diferentes compartimentos de la vía secretora, desde los sitios de salida del RE (ERES) hasta el complejo de Golgi. El silenciamiento de LPP3: (i) reduce la formación de túbulos desde el compartimento intermedio entre el RE y el Golgi (ERGIC) y el complejo de Golgi, y a su vez incrementa la longitud de aquéllos túbulos formados desde el Golgi; (ii) causa un retraso en el transporte dependiente de Rab6 de la subunidad B de la toxina Shiga desde el Golgi al RE, sin afectar al transporte anterógrado de RE a Golgi; y (iii) a nivel ultraestructural incrementa el número de perfiles vesiculares asociados a las cisternas del Golgi. El silenciamiento de la LPP3 también reduce la síntesis de novo de DAG y los niveles de DAG en el Golgi. Además, también hemos demostrado que la sobreexpresión de un mutante catalíticamente inactivo de la LPP3 reproduce los efectos observados tanto con el silenciamiento de la LPP3, como al inhibir la actividad catalítica de las PAP2 por el propanolol. De forma conjunta, nuestros resultados demuestran que la LPP3, a partir de regular la homeostasis de DAG, participa en la formación de ITs en diferentes compartimentos de la vía secretora, regulando el transporte retrógrado entre el RE y el Golgi. / The Golgi complex is involved in the processing, sorting and transport of membrane components (lipids and proteins) to appropriate subcellular destinations, and is also a membranous platform for signalling, metabolic and cytoskeleton proteins. Transport to and from the Golgi complex is mediated by transport carriers (vesicles and/or tubules), which are generated in sequential stages beginning with the formation of a bud, followed by its elongation, constriction and final fission. Lipids play an essential role in this process through different mechanisms: they can recruit cytosolic proteins, modulate protein functions and modify the architecture and physical properties of the membrane bilayer. Thus, membrane curvature is facilitated by conical lipid molecules such as lysophosphatidic acid (LPA), phosphatidic acid (PA) and diacylglycerol (DAG). In previous results of our group we have demonstrated that the DAG produced by the phosphatidic acid phosphatase type 2 family of proteins (PAP2) is necessary for the retrograde transport from the Golgi to the endoplasmic reticulum (ER). In this thesis we have demonstrated that that the PAP2 family member lipid phosphate phosphatase 3 (LPP3, also known as PAP2b) localizes in compartments of the secretory pathway from ER export sites to the Golgi complex. The depletion of human LPP3: (i) reduces the number of tubules generated from the ER–Golgi intermediate compartment and the Golgi, with those formed from the Golgi being longer in LPP3-silenced cells than in control cells; (ii) impairs the Rab6-dependent retrograde transport of Shiga toxin subunit B from the Golgi to the ER, but not the anterograde transport of VSV-G or ssDsRed; and (iii) induces a high accumulation of Golgi-associated membrane buds. LPP3 depletion also reduces levels of de novo synthesized DAG and the Golgi-associated DAG contents. Remarkably, overexpression of a catalytically inactive form of LPP3 mimics the effects of LPP3 knockdown on Rab6-dependent retrograde transport. We conclude that LPP3 participates in the formation of retrograde transport carriers at the ER–Golgi interface, where it transitorily cycles, and during its route to the plasma membrane.

El teixit adipós blanc (WAT) exerceix un paper crític en el control del metabolisme de l'energia. En efecte, modificacions en la seva capacitat d'emmagatzematge o la seva funció endocrina, com en cas de l'obesitat i lipodistròfia, estan associades al desenvolupament de desordres metabòlics com resistència de la insulina i diabetis del tipus 2. Múltiples factors de transcripció i coreguladors modulen el desenvolupament apropiat i la funció del WAT. A més d'estar expressat en WAT, el paper de PGC-1β en aquest teixit encara no s'ha descrit. Per estudiar la seva funció en WAT, hem generat ratolins que manquen PGC-1β en teixits adiposos (PGC1β-FAT-KO) així com també un model in vitro en el qual PGC-1β es va silenciar en adipòcits 3T3-L1. L'anàlisi del perfil d'expressió gènica de WAT de ratolins de PGC1β-FAT-KO va revelar que PGC-1β regula gens mitocondrials implicats en la fosforilació oxidativa (OxPhos) i en el cicle de Krebs (TCA). Els nostres resultats mostren una correlació entre nivells mRNA disminuïts de gens de OXPHOS i els nivells de proteïnes codificades per aquests gens. A més, hem estudiat l'efecte down-regulació de gens diana de PGC-1β en la funció de mitochondrial. Hem analitzat l'activitat d'alguns enzims mitochondrials i hem trobat que l’activitat citrat sintasa i cytochrome c oxidasa disminueixen en WAT de ratolins PGC1β-FAT-KO, suggerint una disfunció mitochondrial. WAT és també el principal objectiu de les tiazolidinediones (TZDs), que es creu exerceixen el seu efecte sobre la sensibilització a la insulina mitjançant l'augment de la biogènesi mitocondrial en adipòcits. Un dels objectius d'aquest treball és el d'elucidar la contribució de PGC-1β per a aquest procés. Els nostres resultats mostren que PGC-1β s'indueix en WAT per estímuls farmacològics com TZDs, i també que PGC-1β, però no PGC-1α, és el principal mediador de l'augment de l'expressió de gens mitocondrials i la funció oxidativa induïda per TZDs en adipòcits blancs. De fet, l'ús de siRNA cobtra PGC-1β va demostrar que aquest coregulator es requereix per a l'augment d'expressió dels gens mitocondrials, el consum d'oxigen i l’oxidació de palmitat dependents de TZDs en cèl·lules 3T3-L1. A més, la supressió de PGC-1β en WAT va confirmar que PGC-1β és necessari per mediar el efectes de les TZDs sobre la inducció dels gens mitocondrials OxPhos, TCA i l'oxidació dels àcids grassos. No obstant això, els nostres resultats mostren que PGC-1β no és necessari per intervenir els efectes de les TZDs sobre biogènesi mitocondrial malgrat el seu paper de regulació transcripcional en processos oxidatius, ja que els ratolins augmenten normalment el seu mtDNA en resposta a la TZDs. D'altra banda, el treball actual és el primer a demostrar que no cal un ple metabolisme oxidatiu en WAT per la capacitat sensibilitzant de la insulina de les TZDs. A més dels adipòcits blancs, una proporció variable de adipòcits brite (cèl·lules capaces de dur a terme termogènesi) poden trobar-se en WAT. Per estudiar el paper de PGC-1β en el reclutament d'adipòcits marrons en WAT, hem exposat ratolins PGC1β-FAT-KO a CL-316,234, un β3-adrenergic agonista que és un potent inductor del reclutament de brite. Diverses evidències exposades en aquest treball donen suport al requisit de PGC-1β per a l'expressió de marcadors tipics d’adipocit marró en WAT. Per exemple, el tractament amb CL-316,234 indueix l’expressió de PGC-1β en paral·lel a l'expressió gens termogènics a WAT. Així mateix, l’estimulació β3-adrenèrgica millora l'expressió de gens OxPhos, TCA i de l’oxidació de lipids, a causa del elevat contingut mitocondrial dels adipòcits brite. L'absència de PGC-1β en WAT impedeix l’up-regulació β-adrenèrgic-dependent d'aquests mateixos gens, suggerint un paper de PGC-1β en l'expressió de marcadors de l'adipòcit marró en els adipòcits brite. En conjunt els nostres resultats indiquen que PGC-1β és important per a la funció mitocondrial basal i induïda per TZDs en WAT, que la capacitat oxidativa mitocondrial completa no és essencial per als efectes insulinosensibilitzants de les tiazolidinediones. D'altra banda, els nostres resultats suggereixen que PGC-1β és necessàri per a la diferenciació d'adipòcits brite en WAT induïda per diversos estímuls com les TZD i els β-adrenèrgics. / White adipose tissue (WAT) plays a critical role in the control of energy metabolism. Indeed, alterations in its storage capacity or its endocrine function, as in the case of obesity and lipodystrophy, are associated with the development of metabolic disorders such as insulin resistance and type 2 diabetes. Multiple transcription factors and coregulators modulate proper development and function of WAT. Besides being expressed in WAT, the role of the coactivator PGC-1β in this tissue has not been addressed yet. To study its function in WAT, we have generated mice that lack PGC-1β in adipose tissues (PGC1β-FAT-KO mice) as well as an in vitro model in which PGC-1β was knocked down in 3T3-L1 adipocytes. Gene expression profiling analysis of WAT from PGC1β-FAT-KO mice revealed that PGC-1β regulates mitochondrial genes involved in Oxidative Phosphorylation (OxPhos) and Tricarboxylic Acid Cycle (TCA). Our results show a correlation between decreased mRNA levels of OxPhos genes and the levels of proteins encoded by these genes. In addition, we have studied the effect of down-regulation of PGC-1β-target genes on mitochondrial function. We have analyzed the activity of some mitochondrial enzymes and have found that citrate synthase and cytochrome c oxidase activity are decreased in WAT of PGC1β-FAT-KO mice, suggesting a mitochondrial dysfunction. WAT is also the main target of thiazolidinediones (TZDs), which are thought to exert their insulin-sensitizing effects by promoting mitochondrial biogenesis in adipocytes. One of the objectives of this work is to elucidate the contribution of PGC-1β to this process. Our results show that PGC-1β is highly inducible in WAT by pharmacological stimuli like TZDs, and also that PGC-1β, but not PGC-1α, is the main mediator of the increase in mitochondrial gene expression and oxidative function induced by TZDs in white adipocytes. Indeed, the use of short interfering RNA against PGC-1β demonstrated that this coregulator is required for TZDs-dependent increases in mitochondrial gene expression, oxygen consumption and palmitate oxidation in 3T3-L1 cells. Additionally, targeted deletion of PGC-1β in WAT confirmed that PGC-1β is necessary to mediate TZDs-induction of mitochondrial genes related to OxPhos, TCA cycle and fatty acid oxidation. However, our results show that PGC-1β is not necessary to mediate the effects of TZDs on mitochondrial biogenesis despite its role in transcriptional regulation of oxidative pathways, since mice normally increase mtDNA in response to TZDs. Moreover, the current work is the first to show that full mitochondrial gene expression and oxidative metabolism in WAT is not required for the insulin-sensitizing capacity of TZDs. In addition to white adipocytes, a variable proportion of brite adipocytes (cells capable of carrying on thermogenesis) can be found in WAT. To study the role of PGC-1β in recruitment of brown adipocytes within WAT, we have exposed PGC1β-FAT-KO mice to the β3-adrenoceptor agonist CL-316,234, a potent inductor of brite recruitment. Several evidences exposed in this work support the requirement of PGC-1β for the expression of brown-characteristic markers in white adipose tissue. For instance, CL-316,234 treatment up-regulated PGC-1β in parallel to thermogenic gene expression in WAT. Likewise, β3-adrenergic stimulation enhanced the expression of OxPhos, TCA and lipid oxidation genes, owing to the elevated mitochondrial content of brite adipocytes. The absence of PGC-1β in WAT prevented β-adrenergic-dependent up-regulation of these same genes, suggesting a role of PGC-1β in the expression of brown adipocyte markers in brite adipocytes. Taken together our findings indicate that PGC-1β is important for basal and TZDs-induced mitochondrial function in WAT, and that induction of mitochondrial oxidative capacity is not essential for the insulin-sensitizing effects of thiazolidinediones. Moreover, our results suggest that PGC-1β is required for the differentiation of brite adipocytes within WAT induced by diverse stimuli like TZDs and β-adrenergic agonists.

La integridad del ADN del espermatozoide es de vital importancia, dado que puede comprometer la viabilidad del embrión. Para cuantificar la fragmentación en el ADN espermático se han desarrollado distintas técnicas, que han servido para relacionar dicha fragmentación con la esterilidad de origen masculino. Teniendo en cuenta que algunos de los individuos estériles van a someterse a técnicas de reproducción asistida, se ha valorado si la fragmentación en el ADN espermático i) disminuye tras procesar el eyaculado mediante gradientes de densidad, ii) tiene algún impacto sobre los resultados clínicos tras un ciclo de Fecundación In Vitro, iii) se correlaciona con la presencia de anomalías meióticas en espermatocitos y/o anomalías cromosómicas en espermatozoides y iv) puede disminuir utilizando columnas MACS® para procesar la muestra seminal o acortando el periodo de abstinencia sexual. Los distintos resultados han concluido que el porcentaje de fragmentación en el ADN disminuye al procesar el eyaculado mediante gradientes de densidad, es independiente de los resultados clínicos obtenidos tras un ciclo de Fecundación In Vitro, no se correlaciona con la presencia de anomalías meióticas en espermatocitos ni anomalías cromosómicas en espermatozoides y disminuye tanto procesando la muestra seminal mediante MACS como acortando el periodo de abstinencia. Estos resultados nos han permitido un mejor asesoramiento a los pacientes que presentan un alto porcentaje de fragmentación en el ADN espermático y ofrecer herramientas para disminuirlo. / Sperm DNA integrity is of vital importance, since it may jeopardize the viability of the embryo. To quantify the sperm DNA fragmentation various techniques have been developed which have been used to correlate the said fragmentation with male sterility. Given that some of the sterile individuals will undergo assisted reproductive techniques, it has been assessed whether the fragmentation in the sperm DNA i) decreases after processing the ejaculate by means of density gradients, ii) has any impact on clinical outcomes after an IVF cycle iii) correlates with the presence of abnormal meiotic spermatocytes and/or chromosomal abnormalities in sperm and iv) may decrease using MACS columns to process the semen sample or shortening the period of sexual abstinence. Our results have concluded that the percentage of fragmented DNA decreases if the ejaculate is processed by means of density gradient, is independent of the IVF cycle outcome, does not correlate with the presence of meiotic abnormalities in spermatocytes and chromosomal abnormalities in sperm, and can decrease by processing the ejaculate with MACS or shortening the period of abstinence. These results have allowed us to give a better advice to the patients with a high percentage of sperm DNA fragmentation and to provide tools to decrease it.

El Teixit adipós epicàrdic (TAE) és un dipòsit de greix visceral inusual amb continuïtat anatòmica i funcional amb les artèries coronàries i amb el miocardi. S’ha vist que en condicions fisiològiques el TAE mostra propietats cardioprotectores però en condicions patològiques el TAE pot afectar localment a les artèries coronàries a través de la secreció de substancies proinflamatòries i pot estar implicat en la patogènesi de l'aterosclerosi. L’objectiu d’aquest estudi es determinar el paper del TAE en la fisiopatologia de l’aterosclerosi i l’efecte de la senyalització dels receptors Toll like (TLR). S’analitzen en el TAE i en el teixit adipós subcutani (TAS) els tipus de poblacions, la secreció de citocines i d’adipocines, l’activació dels STATs i els nivells d’expressió gènica dels pacients amb aterosclerosi (CAD) i individus control (NCAD) en estat basal i després de l’estimulació amb lligands TLR. A més també s’analitza la secreció de citocines i adipocines en mostres de sang perifèrica dels dos tipus de pacients. Els resultats van mostrar que el TAE dels pacients amb CAD presenta importants infiltrats compostos per limfòcits B, limfòcits T i macròfags i més producció de citocines inflamatòries i menys producció de adiponectina i leptina comparat els individus NCAD. En el TAE dels pacients amb CAD els nivells d’activació basals de STAT1 es troben més elevats i els nivells d’activació basals de STAT3 es troben més baixos comparat els individus NCAD. Es detecten per immunohistoquímica presencia de cèl·lules mesotelials en el TAE i s’observa major expressió gènica de IL18, IL13-RA2, de queratines (KRT7, KRT8, KRT18, KRT19) i de microRNAs (MIR-492 i MIR-622) en el TAE dels pacients amb CAD que reforcen la implicació de les cèl·lules mesotelials en la regulació del TAE i la seva implicació en la patologia CAD. A més en el TAS dels pacients amb CAD s’observa menor expressió gènica de varis membres de la família de RNAs petits nucleolar (snoRNAs): SNORD i SNORA. A mes, s’observa un perfil més proinflamatori del TAE en comparació el TAS, més marcat en els pacients amb CAD, tan a nivell basal com desprès de la resposta inflamatòria induïda pel lligands TLR. L’efecte de l’estimulació del teixit adipós a nivell d’expressió gènica mostra que la via canònica de l’interferó es trobava induïda exclusivament per LPS i no per FSL-1 i la xarxa integrada del PPAR-γ es troba reprimida exclusivament en el TAE i no en el TAS. A més en els pacients amb CAD mostren que els gens induïts tan a nivell basal com desprès de l’estimulació amb lligands TLR estan relacionats funcionalment amb la immunitat i per altra banda els individus NCAD inclouen gens induïts relacionats en el metabolisme Els nostres resultats mostren que tan el TAE com el TAS són capaços de respondre de manera adequada a l’estimulació dels lligands TLR, encara que el TAE mostra un perfil més inflamatori i disminució de l’expressió de gens relacionats amb el metabolisme. Per altra banda hem vist que la presència de cèl·lules immunes en el TAE dels pacients amb CAD pot alterar el metabolisme normal amb major producció de citocines inflamatòries, menor producció de adipocines i diferent activació dels STATs. Aquestes dades semblen indicar que en el TAE dels pacients amb CAD l’augment de l’estat inflamatori provocaria una disminució de l’activitat metabòlica normal, sembla que l’estimulació del TAE aproparia els mecanismes fisiològics que ocorrien en la patologia de l’aterosclerosi. Aquestes dades recolzen la idea que el TAE dels pacients amb CAD estaria amb un estat de inflamació que es caracteritzaria per l’augment de les respostes immunes i una disminució de l’activitat metabòlica normal. / Epicardial adipose tissue (TAE) is an unusual visceral fat depot with anatomical and functional continuity with the coronary arteries and myocardium. Under physiological conditions TAE shows cardioprotective properties but in pathological conditions TAE can affect locally the coronary arteries by secretion of proinflammatory substances and may be involved in the pathogenesis of atherosclerosis. The aim of this study was to determine the role of TAE in the pathophysiology of atherosclerosis and the effect of Toll-like receptor signaling (TLR). We analyzed in TAE and subcutaneous adipose tissue (TAS) types of cells, cytokine and adipokines production, STAT activation and gene expression in patients with atherosclerosis (CAD) and control subjects (NCAD) in the basal state and after stimulation with TLR ligands. In addition, we also analyzed cytokine and adipokines secretion of peripheral blood samples in both types of patients. The results showed that the TAE of patients with CAD has lymphocyte infiltrates composed of B and T lymphocytes and macrophages and produce more inflammatory cytokines and less production of adiponectin and leptin compared NCAD subjects. We detected in TAE of patients with CAD higher activation of STAT1 and lower activation of STAT3 compared to NCAD subjects. We detected by immunohistochemistry mesothelial cells in TAE and higher gene expression of IL18, IL13-RA2, keratins (KRT7, KRT8, KRT18, KRT19) and microRNA (MIR-492 and MIR-622) in TAE of patients with CAD, this results reinforce the involvement of mesothelial cells in the regulation of TAE and its implication in the disease of CAD. Furthermore, we observed in TAS of patients with CAD lower gene expression of several members of the small nucleolar RNAs family (snoRNAs): SNORD and SNORA. We detected that TAE has higher proinflammatory profile compared to TAS, more marked in patients with CAD, both baseline and after stimulation by TLR ligands. The effect of stimulation with TLR ligands in adipose tissue gene expression shows that the canonical pathway of interferon was induced only by LPS and not by FSL-1 and integrated network of PPAR-γ is suppressed only in TAE and not in the TAS. Also, in patients with CAD genes induced at both baseline and after stimulation with TLR ligands are functionally related to immunity and in NCAD subject induced genes related to metabolism Our results show that TAE and TAS are able to respond appropriately to stimulation of TLR ligands, although the TAE shows more inflammatory profile and decreased expression genes related to metabolism. Furthermore, we have seen that the presence of immune cells in the TAE of patients with CAD may alter the normal metabolism with increased production of inflammatory cytokines, with lower production of adipokines and different activation of STATs. These data suggest that patients with CAD, has increased TAE inflammatory profile would cause a decrease in the normal metabolic activity, it appears that stimulation TAE approaching physiological mechanisms that happened in the pathology of atherosclerosis. These data support the idea that the TAE patients with CAD would be a state of inflammation characterized by increased immune responses and decreased of normal metabolic activity.

El desarrollo de biomateriales para ingeniería de tejido es un campo muy complejo y prolífico que en el que se combinan la ingeniería de materiales, la química, la biología celular y la medicina. Cada año se publican nuevas y prometedoras ideas que requieren de estudios in vivo e in vitro antes de realizar pruebas clínicas. Por desgracia, las condiciones in vitro son muy diferentes a las de la vida real y muchas de estas prometedoras ideas fracasan cuando son probadas en animales. El número de combinaciones posibles de tipos celulares, factores y biomateriales es inmenso, por lo que sería de gran ayuda establecer plataformas que permitan identificar las combinaciones óptimas para la obtención de características clave, como podría ser la capacidad angiogénica, o la inducción de la diferenciación celular a un determinado linaje. En esta tesis se demuestra el gran potencial de la imagen bioluminescente no invasiva (BLI) para analizar las interacciones célula‐scaffold in vivo. BLI permite monitorizar en tiempo real el número de células y su distribución en el scaffold, así como cambios en la expresión de ciertos genes mediante el uso de promotores inducibles tejido‐específicos. Esto proporciona información muy útil sobre el comportamiento in vivo del scaffold y sobre qué características deberían ser mejoradas para obtener los resultados deseados. Combinando esta información en tiempo real con otras tecnologías de imagen es posible obtener una visión completa sobre el comportamiento del material. Como “prueba de principio” de la aplicación de BLI para la evaluación de scaffolds para reparación tisular se han utilizado dos materiales muy diferentes, desarrollados por nuestros colaboradores. En el primer caso se ha demostrado la capacidad angiogénica de un nuevo material compuesto de ácido poliláctico (PLA) y vidrio de fosfato cálcico (CaP). Los resultados de BLI, que muestran que la inclusión de las partículas de CaP mejora la capacidad angiogénica del material, fueron validados mediante inmunohistoquímica. En el segundo caso se ha evaluado un scaffold de fibrina diseñado para liberar factores de crecimiento (GFs) utilizando un modelo murino de regeneración ósea. Los resultados de BLI mostraron que este scaffold induce la diferenciación osteoblástica, pero no endotelial, en células mesenquimales (MSCs) centinela. Estos resultados fueron corroborados mediante μCT, que mostró que la liberación de GFs da lugar no sólo a la formación de hueso más grueso, sino también a la formación de estructuras vasculares más densas. Mediante la combinación de BLI y μCT se pudo comprobar que las MSCs centinelas no se diferencian a linaje endotelial pero tienen un papel relevante en la inducción de conexiones intravasculares. Entender la respuesta de las células a cambios físicos (fuerzas de cizalla, hipoxia, etc.) dentro de los scaffolds puede ayudar al desarrollo de scaffolds para aplicaciones específicas. Inspirados por estas consideraciones iniciamos un ambicioso proyecto para desarrolla un minibioreactor para el análisis de las interacciones entre scaffolds y las células sin tener que recurrir a animales vivos. Este biorreactor, basado en la misma plataforma de bioluminiscencia, permite el análisis en tiempo real de la supervivencia y la diferenciación celular dentro de los biomateriales bajo flujo dinámico, pudiendo ser utilizado como paso intermedio entre los estudios in vitro e in vivo, agilizando los ciclos de diseño ‐ prueba‐rediseño de los scaffolds. Por otra parte, los biorreactores son cada vez más importantes en la ingeniería de tejidos ya que permiten la producción segura y reproducible de tejidos para aplicaciones clínicas. Este dispositivo, monitorizado por BLI, puede ser una herramienta muy útil para optimizar la siembra de células en los scaffolds, permitiendo la cuantificación de la supervivencia celular y la visualización de su distribución a lo largo del scaffold bajo condiciones de cultivo customizables. Se ha diseñado un prototipo de biorreactor utilizando un scaffold modelo y se ha utilizado para visualizar satisfactoriamente la siembra de MSCs, su distribución y su supervivencia bajo diferentes condiciones, así como su diferenciación en respuesta a agentes inductores. / Biomaterial development for Tissue Engineering is a very complex and prolific research field overlapping material engineering, chemistry, cell biology and medicine fields; every year promising new devises comprising materials, growth factors and cells are reported that require in vitro and in vivo studies previous to clinical evaluation. Unfortunately, in vitro conditions are very far removed from those in real life and many initially promising devices fail when tested in live animals. The number of possible combinations between cell types, factors and biomaterials is so large that testing platforms that can rapidly screen and identify optimal formulas, e.g., that emphasize key characteristics such as angiogenic capacity or promotion of differentiation to specific lineages would facilitate devise development. In this thesis we demonstrated the potential of noninvasive bioluminescence imaging (BLI) to analyze cellscaffold interactions in live animals. BLI allows the real‐time monitoring of cell number and distribution within the scaffolds. Furthermore, by using tissue‐specific inducible promoters, changes in expression of specific genes related to cell differentiation or hypoxic state can also be monitored. This provides very useful information about the scaffold behavior in vivo and about what characteristics should be improved to obtain the desired results. By combining the real‐time data from this bioluminescence platform with other end point imaging technologies, it is possible to obtain a full vision of the biomaterial behavior. We used two very different biomaterials developed by collaborators to illustrate as “proof of principle” the application of in vivo BLI technology in the evaluation of bio‐engineered scaffolds for tissue repair. In the first case we proved the angiogenic capacity of a new composite biomaterial comprising poly(lactic acid) (PLA) and calcium phosphate (CaP) glass. Our BLI results, indicating that inclusion of CaP particles on PLA improved the angiogenic capacity of the material, were also validated using standard immunofluorescent staining and histological procedures for vessel quantification. In the second case, we evaluated a GF‐delivering fibrin scaffold engineered for bone repair using a mice bone regeneration model. Our BLI results indicated that the GF‐delivering material had the capacity to induce osteoblastic, but not endothelial, differentiation in sentinel mesenchymal stem cells. Our BLI results were corroborated by μCT analysis that showed not only that thicker bone, but also denser vascular structures were induced by the delivery of GF. Again, the combination of BLI and μCT analysis indicated that sentinel cells while not differentiating to the endothelial lineage, did have a relevant paracrine role inducing abundant intervascular connections. Understanding the response of cells within biomaterials to changing physical parameters (e.g.: response to shear stress, hypoxia etc.) is valuable information to guide the development of scaffolds for specific applications. Inspired by these considerations we initiated an ambitious approach to develop a minibioreactor system useful for the analysis of cell‐scaffold interactions without having to resort to live animals. This bioreactor system, based in the same bioluminescent platform, allows real‐time analysis of cell survival and differentiation within the biomaterial under dynamic flow conditions and it could be considered as an intermediate step between in vitro and in vivo studies, facilitating the biomaterial design‐test‐redesign cycle. This type of device is important due to additional considerations. Bioreactors are becoming increasingly more important as they allow safe and reproducible production of scaffold‐tissue composites for clinical applications. Thus, BLI monitored system could also be a useful tool for designing and optimizing cell seeding of scaffolds; allowing the quantification of cell survival, and the visualization of cell distribution along the scaffold under customizable culture conditions. We have made progress in this area also, and a small bioreactor prototype comprising a model biomaterial was constructed and successfully used to illustrate cells distribution and survival under dynamic seeding conditions, as well as proliferation and differentiation in response to inducing agents.

Durante el ictus, los niveles elevados de glutamato extracelular, el principal neurotransmisor excitador en el sistema nervioso central, aumentan y se unen al receptor de NMDA promoviendo la excitotoxicidad. Esta situación genera que un flujo excesivo de Ca2+ pase a través del receptor de NMDA aumentando sus concentraciones intracelulares activando toda una serie de cascadas de señalización que pueden actuar directamente sobre las mitocondrias, promoviendo varios programas de muerte celular. Las mitocondrias son orgánulos muy dinámicos que constantemente se fusionan y dividen, cambiando de forma y localización. El equilibrio entre la fisión y la fusión es importante para la función mitocondrial y es un regulador clave de la progresión de la muerte celular. Las proteínas que conforman el proceso de fusión mitocondrial y de fisión están formadas por un grupo de GTPasas. La fusión de la membrana mitocondrial interna está mediada por OPA1. Dos mitofusinas (Mfn1 y 2) median la fusión de la membrana externa mitocondrial. Por otro lado, la fisión mitocondrial está mediada por Drp1, una proteína citoplasmática que es reclutada a la superficie mitocondrial después de ser modificada a nivel post-traduccional. Los problemas relacionados con la dinámica mitocondrial se han descrito en múltiples enfermedades neurodegenrativas así como también en cáncer y sida. En esta Tesis hemos demostrado que Mfn2 juega un papel muy importante en el mantenimiento de la funcionalidad mitocondrial y la supervivencia neuronal. En excitotoxicidad es la única proteína de la maquinaria de fusión/fisión que disminuye su expresión en dos modelos in vitro distintos y también en un modelo in vivo. Hemos identificado dos fases de fragmentación mitocondrial en excitotoxicidad. La primera y que cursa en poco tiempo depende de la activación y reclutamiento de Drp1 mientras que la fase tardana que se inicia 4 horas después del insulto, parece depender de la reducción de los niveles proteicos de Mfn2. Esta fase tardía es irreversible y parece condenar a la neurona. La disminución de Mfn2 genera alteraciones en la homeóstasis del Ca2+, disminuye el potencial de membrana mitocondrial, empeora la comunicación entre las mitocondrias y el retículo endoplasmático, aumenta la traslocación de Bax a las mitocondrias y favorece la liberación del citocromo c. Hemos encontrado que la reducción en la expresión de Mfn2 durante la excitotoxicidad se da a nivel transcripcional y depende del factor de transcripción MEF2 que regula a Mfn2 a nivel basal en neuronas. En excitotoxicidad, MEF2 es degradado y causa la disminución de Mfn2. Este contexto hace pensar que Mfn2 podría ser una diana a tener en cuenta para futuros desarrollos de drogas y poder, de este modo, incrementar la pequeña ventana terapéutica que existe actualmente para el ictus. / Mitochondrial fusion and fission is a dynamic process critical for the maintenance of mitochondrial function and cell viability. During excitotoxicity neuronal mitochondria are fragmented, but the mechanism underlying this process is poorly understood. Here, we show that Mfn2 is the only member of the mitochondrial fusion/fission machinery whose expression is reduced in in vitro and in vivo models of excitotoxicity. Whereas in cortical primary cultures, Drp1 recruitment to mitochondria plays a primordial role in mitochondrial fragmentation in an early phase that can be reversed once the insult has ceased, Mfn2 downregulation intervenes in a delayed mitochondrial fragmentation phase that progresses even when the insult has ceased. Downregulation of Mfn2 causes mitochondrial dysfunction, altered calcium homeo- stasis, and enhanced Bax translocation to mitochondria, resulting in delayed neuronal death. We found that transcription factor MEF2 regulates basal Mfn2 expression in neurons and that excitotoxicity- dependent degradation of MEF2 causes Mfn2 downregulation. Thus, Mfn2 reduction is a late event in excitotoxicity and its targeting may help to reduce excitotoxic damage and increase the currently short therapeutic window in stroke.

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRBB) / Els trastorns mentals com l’esquizofrènia o els trastorns de l’humor i l’ansietat són unes patologies amb un gran impacte i una alta prevalença en la nostra societat. Una de les característiques d’aquestes patologies són els problemes de plasticitat sinàptica, com per exemple, la neurogènesi del gir dentat, que a més s’ha relacionat amb problemes cognitius i també amb patologies psiquiàtriques. En els darrers anys s’ha suggerit que la desregulació de processos del desenvolupament neuronal, ja sigui per alteracions genètiques o factors ambientals, poden ser la clau per explicar l’etiologia d’aquestes malalties. La Reelina és una proteïna de matriu extracel·lular essencial pel desenvolupament neuronal, a més de regular processos de plasticitat sinàptica i transmissió glutamatèrgica, tant en el cervell en desenvolupament com a l’adult, a més d’estar disminuïda en patologies com l’esquizofrènia o els trastorns de l’humor, tot i que el paper que aquesta hi juga encara no està descrit. L’objectiu d’aquesta tesi ha estat investigar el paper de la Reelina en les malalties psiquiàtriques, tant el possible paper en l’etiologia com en la protecció d’aquestes malalties, a més d’investigar si tenia un paper en la correcta generació de noves neurones. Per tal de portar a terme aquest objectiu, vam utilitzar un ratolí que sobreexpressa Reelina al cervell anterior adult i el vam sotmetre a una bateria de testos de comportament per modelar aspectes de malalties psiquiàtriques com el cap obert, la caixa blanca i negra, el test de natació forçada després d’un tractament crònic de corticosterona, la sensibilització a la cocaïna o dèficits en la inhibició per pre-pols induïda per l’administració d’antagonistes dels receptors N- metil-D-aspartat (NMDAR). Amb aquests testos vam comprovar que la sobreexpressió de Reelina protegia de l’aparició de comportaments esquizofrènics i depressius i que aquesta resiliència es produïa per un una disminució de la transmissió glutamatèrgica a través de la subunitat NR2B dels receptors NMDA. A més de demostrar-ne un paper protector, amb la utilització d’un ratolí transgènic floxed dab1 hem comprovat que una disminució transitòria durant el desenvolupament de l’efector intracel·lular de la via de senyalització de la Reelina, Dab1, provoca alteracions permanents en la laminació del còrtex i hipocamp. A més, la regulació transitòria a la baixa durant el desenvolupament d’aquesta via provoca alteracions de comportament en els ratolins adults com dèficits de memòria, cura maternal, inhibició per pre-pols o sensibilització a la cocaïna, i que alguns d’aquests dèficits ja estaven presents durant l’adolescència. A més, hem pogut rescatar els dèficits cognitius amb un potenciador de la neurotransmissió glutamatèrgica com és la D-cicloserina. Per acabar, vam voler comprovar si un procés de plasticitat alterat en patologies psiquiàtriques com la neurogènesi adulta estava regulat pels nivells de Reelina. Amb la utilització del marcatge específic de les noves neurones mitjançant retrovirus, vam poder veure que la Reelina també controla aquest procés. Hem vist que la via de senyalització és essencial pel correcte desenvolupament, ja que la manca de senyalització d’aquesta via provoca la formació de neurones aberrants, molt menys complexes i amb una gran quantitat de dendrites basals pròpies de processos patològics, i tot i aquesta morfologia alterada, aquestes neurones aconseguien integrar-se en el circuit. A més, hem comprovat que un augment dels nivells de Reelina provoca l’acceleració del procés de maduració. En resum, hem vist que la Reelina té un paper essencial en la protecció envers el desenvolupament de malalties psiquiàtriques, ja que mentre la falta de senyal provoca l’aparició de fenotips, l’augment en provoca la resistència. A més, hem comprovat que un procés alterat en aquestes patologies com és la neurogènesi adulta, també està regulat per la Reelina. / Schizophrenia, mood, and anxiety disorders are devastating diseases with high prevalence and comorbidity rates in our society. Dysregulation of key developmental processes, caused by environmental and/or genetic risk factors, is associated with the pathogenesis of neuropsychiatric diseases. One feature of these diseases are alterations in synaptic plasticity like adult neurogenesis. Reelin is an extracellular matrix protein essential for the neurodevelopment, and has been shown to regulate glutamatergic neurotransmission in both developing and adult neurons. Moreover, Reelin expression is decreased in psychiatric disorders. The aim of this thesis was to rule out the role of Reelin in psychiatric disease, in the aetiology and a possible protection role, and study how Reelin pathway regulates adult neurogenesis. To do that, we used a transgenic mouse that overexpress Reelin in the adult forebrain and we subjected it to a battery of behavioural tests to model some aspects of psychiatric disorders such as schizophrenia, mood, and anxiety disorders. Interestingly, overexpression of Reelin lead to a resistance against behaviours related to psychiatric diseases, thanks to a reduction of NMDA NR2B-mediated synaptic transmission. Next we used a floxed dab1 allele to study whether a transient decreased in Dab1 during development, a key component of the Reelin pathway, is sufficient to induce behavioural deficits related to psychiatric disorders. We found that transient Dab1 downregulation during perinatal stages leads to permanent abnormalities of structural layering and behaviour impairments in the adult mice. Finally, using retroviral reporters in our two model mouse we show that whereas overexpression of Reelin accelerate adult neurogenesis, cell-autonomous inactivation of Dab1 in the new granule cells resulted in aberrant migration, decreased dendrite development, formation of ectopic dendrites in the hilus and the establishment of aberrant circuits. All together these data points an important role of Reelin against the development of neuropsychiatric, overexpression of Reelin protects against this disorders and the disruption of Reelin pathway leads to the development of them. Moreover, Reelin is a key regulator of adult neurogenesis, a process related to the pathogenesis of several neurological and psychiatric disorders.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS) / Los cuerpos lipídicos (CLs) son los principales orgánulos encargados del almacén de lípidos, siendo el mayor reservorio energético de las células. Están formados por un núcleo de lípidos neutros hidrófobos separados del citoplasma por una monocapa de fosfolípidos en la que se anclan determinadas proteínas. Fueron descritos a finales del siglo XIX por Hanstein, Altmann y Wilson en diferentes publicaciones y originalmente fueron llamados liposomas o microsomas. Desde entonces estos orgánulos han sido denominados de múltiples maneras: cuerpos lipídicos, gotas lipídicas, adiposomas, gránulos, inclusiones lipídicas, triglicéridos intramiocelulares, partículas lipídicas, oleosomas o cuerpos de aceite. Inicialmente fueron considerados como simples orgánulos estáticos únicamente implicados en el almacén lipídico y básicamente importantes en tejidos especializados como el tejido adiposo. No obstante, la presencia de CLs no es exclusiva de tejidos especializados como el adiposo, sino que sucede en todas las células eucariotas y en muchos procariotas. En la última década el número de estudios sobre estos orgánulos ha incrementado exponencialmente especialmente desde el descubrimiento de la perilipina, la primera proteína residente en CLs descrita, en el laboratorio de C. Londos en 1991. Poniendo de manifiesto que se trata de orgánulos complejos, recientemente se ha descrito la implicación de los CLs en múltiples procesos como el metabolismo energético, la síntesis de lípidos y hormonas, la señalización celular, el almacén y la degradación de proteínas, la secreción de lipoproteínas, la respuesta inflamatoria, el ciclo vital de algunos patógenos, el cáncer o la longevidad. Además, la acumulación excesiva de CLs es una característica común en múltiples patologías asociadas con la obesidad como el síndrome metabólico, la esteatosis hepática y la ateroesclerosis, subrayando la relevancia del estudio de la biología de estos orgánulos.