Las células madre mesenquimales de tejido adiposo (ADSCs) tienen un gran potencial dentro del campo de la ingeniería de tejidos debido a su fácil obtención, capacidad de diferenciación a múltiples linajes, propiedades inmunomoduladoras y producción de factores proangiogénicos y antiapoptóticos. Asimismo, los materiales cerámicos de fosfato de calcio son ampliamente utilizados como biomateriales en la ingeniería de tejidos del hueso, debido a su similitud con la fase mineral del tejido óseo. Además, su combinación con proteínas de matriz extracelular (ECM), factores osteoinductores y otros tipos celulares, puede incrementar la bioactividad del constructo células-biomaterial. A pesar de ello, pocos trabajos existen en la literatura que evalúen la repuesta de células ADSCs frente a biomateriales cerámicos de fosfatos de calcio, empleando recubrimientos con proteínas de ECM y/o el cocultivo de células ADSCs con células endoteliales, como factores claves para el incremento de la inducción de las células hacia linajes osteogénicos. En este sentido, el objetivo del presente trabajo ha sido Evaluar la biocompatibilidad y diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales adultas derivadas de tejido adiposo (ADSCs) frente a materiales cerámicos de fosfato de calcio con o sin proteínas de matriz extracelular y células endoteliales. Los resultados mostraron que las células mesenquimales obtenidas de tejido adiposo humano (hADSCs), expresan marcadores característicos de células progenitoras (CD29, CD44, CD73, CD90 Y CD105) y se diferenciaron hacia linajes adipogénico, osteogénico, condrogénico y miogénico. Particularmente las señales de diferenciación osteogénicas de las células hADSCs fueron muy potentes y comparables en gran medida con las de otras líneas de osteoblastos ampliamente utilizadas en el campo de la ingeniería de tejidos tales como las MCT3T3 y hFOB 1.19. Por lo tanto son un excelente modelo celular para la evaluación de biomateriales diseñados con la finalidad de favorecer la regeneración ósea. El diseño de una metodología especial para el cultivo celular sobre biomateriales, permitió la cuantificación eficiente y reproducible del porcentaje de células que se adhieren específicamente al material y el seguimiento de su proliferación. Empleando fibroblastos dérmicos humanos (HDF) se demostró que el biomaterial cerámico KeraOs® (KO) es biocompatible según la ISO 10993-5. El estudio de la respuesta de las células hADSCs frente a diversos biomateriales cerámicos, evidenció que las células se adhieren, proliferan y se diferencian hacia un fenotipo osteoblástico sobre los materiales comerciales Bone Ceramic®, Cerasorb® y KeraOs®, aunque no sobre Bio-Oss®. Cada material induce una respuesta osteogénica con un perfil particular en la actividad de la enzima fosfatasa alcalina y la expresión de los genes osteonectina y osteocalcina. Aunque los biomateriales solos desencadenan la diferenciación de las células, la adición de factores inductores en el medio de cultivo potencia la respuesta osteogénica. El recubrimiento del material KeraOs® con fibronectina, colágeno o la combinación FN/COL incrementó significativamente la producción de matriz extracelular, la actividad de la enzima fosfatasa alcalina y la expresión de un mayor número de genes asociados a rutas de diferenciación osteogénicas tales como BMP1, BMP2, Runx2, SMAD1, etc. Sin embargo, respecto a las otras dos proteínas, la fibronectina indujo el mayor aumento en la adhesión celular y la respuesta osteogénica. Por otra parte se observó que el cocultivo de células hADSCs con células endoteliales también incrementó el potencial osteogénico de las células hADSCs. Adicionalmente las células endoteliales formaron estructuras tipo capilar y se incrementó la expresión de marcadores angiogénicos tales como VEGF, VE-cad, α-SMA y Ang-1. Finalmente se evaluó el efecto del biomaterial KeraOs® combinado con fibronectina y células madre autólogas de tejido adiposo sobre la regeneración ósea de perros Beagles. Similar a lo observado con las mesenquimales humanas (hADSCs), las caninas se adhieren, proliferan y se diferencian hacia un fenotipo osteoblástico, evidenciando su utilidad como modelo para el estudio de la regeneración ósea tanto in vitro como in vivo. / Human adipose derived mesenchymal stem cells (hADSCs) have great potential for tissue engineering applications. Because hADSCs are available in large number, have the ability to differentiate into multiple lineages, show immunomodulatory properties and release pro-angiogenic and antiapoptotic factors. Calcium phosphate ceramics have been widely investigated in bone regeneration as they have good compatibility, biodegradability and mimic the mineral phase of bone tissue. In addition, the combination of biomaterials with extracellular matrix proteins, osteoinductive factors and/or other cell types can increase the bioactivity of cell-biomaterial constructs. This study aims to evaluate the biocompatibility and osteogenic differentiation response of adult mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (ADSCs) on calcium phosphate materials with or without extracellular matrix proteins and endothelial cells. The results indicate that hADSCs expressed characteristic stem cells markers and were able to differentiate into adipogenic, osteogenic, chondrogenic and myogenic lineajes. In ADSCs the osteogenic differentiation signals are highly potent and comparable with other osteoblast cells lines. Thus, ADSCs are an excellent model to evaluate cell biomaterials designed in order to promote bone regeneration. ADSCs can attach and growth on different kind of biomaterials (Bone Ceramic®, Cerasorb® y KeraOs®) with exception of Bio-Oss. Results showed that the expression profile of osteogenic markers (Alkaline phosphatase (ALP), Osteocalcin (OC) and Osteonectin (ON)) depends of the material. The fibronectin and collagen coating of KeraOs® increased the expression of a wide number of genes related with the osteogenic differentiation of hADSCs, and also promoted a high ALP activity and matrix mineralization. However the fibronectin effects in the cells response are stronger than collagen and fibronectin coating. The coculture of ADSCs with endothelial cells also increased the osteogenic differentiation of hADSCs. Additionally endothelial cells formed capillary-like structures and overexpress angiogenic markers such as VEGF, VE-cad, α-SMA and Ang-1. Finally it was evaluated the effect of KeraOs® biomaterial combined with fibronectin and autologous ADSCs on Beagle dog bone regeneration. The canine stem cell’s response on the material was similar to human stem cells, demonstrating its utility as a model for the study of bone regeneration in vitro and in vivo.

Recentment s’ha descrit que la pràctica intensa d’exercici pot provocar anomalies en la morfologia, funcionalitat i bioquímica del cor, incrementant el risc de patir arítmies. Tot i aquesta associació entre la pràctica intensa d’exercici físic i l’aparició d’arítmies auriculars i ventriculars, no existeix un consens absolut respecte si aquests fenòmens es deuen a malalties cardíaques no diagnosticades (on l’exercici podria ser un factor desencadenant) o en realitat l’exercici és la causa primària que els origina. Per avaluar la hipòtesi de que l’exercici intens provoca el desenvolupament de fibrosi en el miocardi i facilita l’aparició d’arítmies, l’objectiu principal d’aquest treball va ser establir un model animal que permetés estudiar els efectes que l’exercici intens té sobre el cor al llarg del temps. El model experimental va consistir en un fer córrer rates sobre una cinta corredora seguint un protocol d’entrenament intens durant 4, 8 o 16 setmanes. Tots els temps d’estudi comptaven amb un grup control, format per animals de vida sedentària. Posteriorment, es va avaluar l’evolució dels canvis en la morfologia del cor, la deposició de col•lagen en els ventricles i l’expressió d’mRNA i nivells proteics de TGF-beta.1, Fibronectina, MMP-2, TIMP-1, i col•lagen tipus I i tipus III en cada una de les cambres cardíaques. Desprès de 16 setmanes d’exercici els animals havien desenvolupat hipertròfia excèntrica i dilatació auricular, juntament amb aquests canvis també es van observar diferents graus de disfunció diastòlica. Els resultats obtinguts en l’anàlisi de la deposició de col•lagen van mostrar increments significatius en el ventricle dret dels animals sotmesos a 16 setmanes d’exercici intens. A més, es va confirmar la presència de miofibroblasts en aquelles zones on es s’havia observat un increment en la deposició de col•lagen. De la mateixa manera, l’expressió per mRNA i els nivells proteics de la majoria de marcadors de fibrosi estudiats van mostrar increments significatius en el grup d’animals de 16 setmanes d’exercici a ambdues aurícules i al ventricle dret. Finalment, quan es va avaluar la susceptibilitat a la inducció d’arítmies es va observar una major vulnerabilitat a la taquicàrdia ventricular en els animals sotmesos a 16 setmanes, en comparació amb el grup d’animals de vida sedentària. Per tant, mitjançant aquest model animal s’ha confirmat que l’exercici intens i continuat inicia un remodelat per fibrosi, provocant canvis en la funció ventricular i afavorint l’aparició d’arítmies. Una vegada confirmada la hipòtesi inicial, es va avaluar la capacitat de reversió del remodelat cardíac produït en els nostres animals esportistes. Després de 8 setmanes de repòs, es va evidenciar que pràcticament tots els paràmetres cardíacs alterats tornaven a la normalitat. Per tant, els nostres resultats van demostrar que un determinat període de repòs va ser capaç d’aturar i revertir el procés patològic originat per la pràctica d’exercici intens i de llarga durada. El darrer objectiu d’aquest treball va ser avaluar l’efecte de l’administració d’un antagonista del receptor AT1 de l’angiotensina (Losartan) en la prevenció de la formació de fibrosi cardíaca induïda per l’exercici. L’activació del sistema renina-angiotensina es troba alterat en diferents patologies cardíaques i intervé en la formació de fibrosi. El tractament amb Losartan va ser capaç de prevenir la inducció inicial de TGF-beta-1 i el posterior desenvolupament de fibrosi cardíaca induïda per l’exercici. Per tant, aquests resultats obren la porta a la possibilitat d’utilitzar tractaments farmacològics per la prevenció dels efectes adversos de l’exercici sobre el teixit cardíac. / Recent clinical studies suggest that endurance sports may promote cardiac arrhythmias. The aim of this study was to use an animal model to evaluate whether sustained intensive exercise training induces potentially adverse myocardial remodeling and thus creates a potential substrate for arrhythmias. Male Wistar rats were conditioned to run vigorously for 4, 8, and 16 weeks; time-matched sedentary rats served as controls. Serial echocardiograms and in vivo electrophysiological studies at 16 weeks were obtained in both groups. After euthanasia, ventricular collagen deposition was quantified by histological and biochemical studies, and messenger RNA and protein expression of transforming growth factor-_1, fibronectin-1, matrix metalloproteinase-2, tissue inhibitor of metalloproteinase-1, procollagen-I, and procollagen-III was evaluated in all 4 cardiac chambers. At 16 weeks, exercise rats developed eccentric hypertrophy and diastolic dysfunction, together with atrial dilation. In addition, collagen deposition in the right ventricle and messenger RNA and protein expression of fibrosis markers in both atria and right ventricle were significantly greater in exercise than in sedentary rats at 16 weeks. Ventricular tachycardia could be induced in 5 of 12 exercise rats (42%) and only 1 of 16 sedentary rats (6%; p<0.05). The fibrotic changes caused by 16 weeks of intensive exercise were reversed after an 8-week exercise cessation. In this animal model, we documented cardiac fibrosis after long-term intensive exercise training, together with changes in ventricular function and increased arrhythmia inducibility. If our findings are confirmed in humans, the results would support the notion that long-term vigorous endurance exercise training may in some cases promote adverse remodeling and produce a substrate for cardiac arrhythmias.

Diacylglycerol (DAG) is required for the generation of transport carriers at the Golgi complex. Several enzymatic reactions have been found to contribute to the maintenance of DAG levels at this organelle. However, the specific metabolic pathways that, under physiological conditions, are regulated to produce the DAG required for the membrane trafficking at the Golgi complex are not known. In the first part of this work we worked on the hypothesis that phospholipid synthesis can control DAG levels at the Golgi complex for the generation of transport carriers at the Golgi complex. To study this, we altered phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylinositol synthesis for a short period of time in CHO cells to evaluate the changes in DAG and its effects in membrane trafficking at the Golgi. We found that cellular DAG rapidly increased when PC synthesis was inhibited at the non-permissive temperature for the rate-limiting step of PC synthesis in CHO-MT58 cells. DAG also increased when choline and inositol were not supplied. The major phospholipid classes and triacylglycerol remained unaltered for both experimental approaches. The analysis of Golgi ultrastructure and membrane trafficking showed that 1) the accumulation of the budding vesicular profiles induced by propanolol was prevented by inhibition of PC synthesis, 2) the density of KDEL receptor-containing punctated structures at the endoplasmic reticulum-Golgi interface correlated with the amount of DAG, and 3) the post-Golgi transport of the yellow fluorescent temperature-sensitive G protein of stomatitis virus and the secretion of a secretory form of HRP were both reduced when DAG was lowered. We confirmed that DAG-consuming reactions of lipid synthesis were present in Golgi-enriched fractions. We conclude that phospholipid synthesis pathways play a significant role to regulate the DAG required in Golgi-dependent membrane trafficking. In the second part of this work we investigate the role of phospholipase Cγ1 (PLCγ1), a DAG-producing signalling enzyme, on the membrane traffic at the Golgi complex and in the maintenance of its structure in HeLa cells. We based our work on the effects of the silencing and overexpression of PLCγ1. We found that PLCγ1 is required for post-Golgi trafficking of transmembrane and soluble proteins, that the catalytic activity of PLCγ1 is necessary to maintain the morphology of the Golgi complex, in particular the trans-Golgi compartments, and that PLCγ1 contributes to DAG homeostasis at the Golgi, measured by the localization of the DAG-sensing construct C1-PKCθ-GFP to the Golgi complex. Finally we show that cargo arrival at the Golgi complex increases the DAG production and that PLCγ1 is required for this increase of DAG localized at the Golgi. Our results show for the first time that a physiologic event along the secretory pathway, such as cargo arrival at the Golgi complex, triggers DAG production at this organelle for membrane traffic. We also provide evidence for a pivotal role of PLCγ1 at the Golgi: PLCγ1 mediates the DAG production triggered by cargo arrival and is required for the Golgi structure and membrane traffic at the trans-Golgi compartment. The main conclusions of this work are that: 1- Metabolic pathways for the synthesis of phospholipids that consume DAG regulate its levels at the Golgi complex. 2.- Phospholipid synthesis controls the levels of DAG needed for both retrograde and anterograde trafficking at the Golgi complex. 3.- Cargo arrival at the Golgi complex promotes DAG production. 4.- PLCγ1 is involved in the production of DAG triggered by cargo arrival at the Golgi complex. 5.- PLCγ1 is needed for post-Golgi transport and maintenance of the structure of the Golgi complex.

El carcinoma d'endometri (CE) és la neoplàsia més freqüent del tracte genital femení en els països desenvolupats. El CE és una malignització de les cèl·lules epitelials que revesteixen l'úter en el seu interior. Tot i que quan està confinat l’úter té bon pronòstic, quan surt de la cavitat uterina es torna una malaltia pràcticament incurable, per la qual cosa requereix la recerca de nous fàrmacs. La identificació de noves dianes terapèutiques a més dels mecanismes moleculars d’actuació d’aquests fàrmacs en aquesta neoplàsia, té una gran rellevància translacional. Si es compara amb els tractaments tradicionals, quimioteràpia o radioteràpia, la teràpia contra dianes moleculars presenta un gran avantatge per la seva especificitat, tant en la relació fàrmac‐diana com diana‐tumor. Això permet reduir la toxicitat indiscriminada dels tractaments anticancerosos, i addicionalment, actuar de forma dirigida contra determinats subgrups de tumors. Per altra banda, aquests fàrmacs poden actuar de forma sinèrgica entre ells o en combinació amb tractaments clàssics. L’augment del coneixement sobre l’etiologia del càncer ha permès descobrir noves dianes alterades específicament en les cèl·lules tumorals, com és el cas de les HDACs. Aquest fet ha motivat, per exemple, el desenvolupament del Vorinostat, un inhibidor de les HDACs. Els resultats obtinguts en aquesta tesi demostren que el Vorinostat és efectiu i selectiu per a les cèl·lules tumorals de CE. A nivell molecular, el Vorinostat en el CE indueix l’acetilació de les histones i altres proteïnes cooperant en el procés d’apoptosi caspasa-dependent. A més a més, el Vorinostat és eficient a l’hora de reduir la viabilitat, proliferació i induir una parada en el cicle cel·lular. El tractament juntament amb antioxidants rescata la mort induïda pel Vorinostat, fet que conclou que l’efecte letal del Vorinostat està relacionat amb l’estrès oxidatiu a través de la producció de ROS. Estudis previs demostren que la vitamina D (VD) és un factor d’inhibició tumoral en molts tipus de neoplàsies, però, la relació causa-efecte de presentar baixos nivells de VD en sèrum i desenvolupar càncer segueix estan incompleta. Els nostres estudis fets amb tissues microarrays (TMA) demostren que els casos de CE presentaven nivells baixos de CYP24A1 (enzim mitocondrial que degrada els metabòlits de la VD) juntament amb nivells baixos de VDR (receptor de la VD) nuclear i citoplasmàtic; els casos més agressius de CE, el tipus III, podien presentar nivells baixos de CYP27A1 (enzim que converteix la VD en 25(OH)D) o nivells alts de CYP24A1 en comparació amb els endometris normals (EN) analitzats. El tractament amb VD3, colecalciferol, de les línies cel·lulars de CE va ser suficient a l’hora de disminuir la capacitat clonogènica de les cèl·lules i la seva viabilitat a més d’induir efectes antiproliferatius. Globalment, els treballs que constitueixen aquesta tesi doctoral suposen una contribució important en el coneixement del mecanisme molecular d’acció del Vorinostat, antioxidants i la VD, fàrmacs que podrien ser efectius pel tractament/prevenció/atenuació del CE. / El carcinoma de endometrio (CE) es la neoplasia más frecuente del aparato genital femenino en los países desarrollados. El CE incluye un conjunto de variantes malignas que provienen de las células epiteliales que revisten el útero en su interior. Aunque cuando se encuentra confinado en el útero, tiene buen pronóstico, cuando sale de la cavidad uterina se transforma en una enfermedad prácticamente incurable, por lo que requiere la búsqueda de nuevos fármacos. La identificación de nuevas dianas terapéuticas además de los mecanismos moleculares de actuación de estos fármacos en esta neoplasia, tiene una gran relevancia translacional. Si se compara con los tratamientos tradicionales, quimioterapia o radioterapia, la terapia contra dianas moleculares presenta una gran ventaja por su especificidad, tanto en la relación fármaco-diana como diana-tumor. Esto permite reducir la toxicidad indiscriminada de los tratamientos anticancerosos, y adicionalmente, actuar de forma dirigida contra determinados subgrupos de tumores. Por otra parte, estos fármacos pueden actuar de forma sinérgica entre ellos o en combinación con tratamientos clásicos. El aumento del conocimiento sobre la etiología del càncer ha permitido descubrir nuevas dianas alteradas específicamente en las células tumorales, como es el caso de las HDAC. Este hecho ha motivado, por ejemplo, el desarrollo del Vorinostat, un inhibidor de las HDACs. Los resultados obtenidos en esta tesis demuestran que el Vorinostat es efectivo y selectivo para las células tumorales de CE. A nivel molecular, el Vorinostat en el CE induce la acetilación de las histonas y otras proteínas cooperando en el proceso de apoptosi caspasa-dependiente. Además el Vorinostat es eficiente a la hora de reducir la viabilidad, proliferación e inducir una parada en el ciclo celular. El tratamiento junto con antioxidantes revierte la muerte inducida por el Vorinostat, hecho que sugiere, que el efecto letal de Vorinostat está relacionado con el estrés oxidativo de las células mediante la producción de ROS. Estudios previos demuestran que la vitamina D (VD) es un factor de inhibición tumoral en muchos tipos de neoplasias, sin embargo, la relación causa-efecto de presentar bajos niveles de VD en suero y desarrollar cáncer sigue siendo incompleta. Nuestros estudios hechos con tissues micro arrays (TMA) demuestran que los casos de CE presentaban niveles bajos de CYP24A1 (enzima mitocondrial que degrada los metabolitos de la VD) junto con niveles bajos de VDR (receptor de la VD) nuclear y citoplasmático; los casos más agresivos de CE, el tipo III, podían presentar niveles bajos de CYP27A1 (enzima que convierte la VD 25(OH)D) o niveles altos de CYP24A1 en comparación con los endometrios normales (EN) analizados. El tratamiento de las líneas celulares de CE con VD3, colecalciferol, es suficiente para disminuir la capacidad clonogénica de las células y su viabilidad además de inducir efectos antiproliferativos. Globalmente, los trabajos que constituyen esta tesis doctoral suponen una contribución importante en el conocimiento del mecanismo molecular de acción del Vorinostat, antioxidantes y la VD, fármacos que podrían ser efectivos para el tratamiento/atenuación/prevención del CE. / Endometrial carcinoma (EC) is the most common malignancy of the female genital tract in developed countries. EC implicates the epithelium inside the uterine cavity, and has a good prognosis when confined to the uterus. However, once outside the uterine cavity, EC becomes an incurable disease by current available drugs. Therefore, the identification of new therapeutic targets for this neoplasm as well as the molecular mechanisms of action of these drugs in this neoplasm is an issue of high translational relevance. Indeed, therapy against specific molecular targets presents an important advantage over chemotherapy or radiotherapy for their specificity. Thereby reducing their indiscriminate cellular toxicity and, more significantly, acting against specific subsets of tumors, or acting synergistically when administered in combination with traditional treatments. Increased understanding of the etiology of cancer has uncovered new targets specifically altered in tumor cells, such as the HDACs. This has led to the development of drugs as Vorinostat, an inhibitor of HDCAs. This thesis work demonstrates that Vorinostat is an effective and selective anti EC agent. At the molecular level, Vorinostat induces acetylation of histones and other proteins helping in the process of caspase-dependent apoptosi. Besides Vorinostat treatment is efficient in reducing the viability, proliferation and induces cell cycle arrest. Co-treatment with antioxidants rescues Vorinostat-induced cell death suggesting that the lethal effect of Vorinostat results from oxidative stress caused by ROS production. An additional contribution of this thesis work is the anti-EC actions of vitamin D (VD). Numerous epidemiological studies have linked VD deficiency with a higher cancer risk, but the cause-effect link low serum levels of VD and an accelerated development of cancer is still incomplete. In vitro studies in EC cell lines demonstrated that VD3 (cholecalciferol) treatment was sufficient to reduce their viability, proliferation rates and clonogenic capacity because these cells express CYP27A1 and CYP2R1, the enzymes that can convert VD3 into 25-hydroxyVD3/25(OH)D, a direct activator of VDR antiproliferative actions. Furthermore, tissue micro arrays (TMA) analysis revealed higher expression of both CYP27A1 and CYP2R1 but low VDR in EC compared to normal endometrium. These findings together with the low levels of CYP24A1 (the enzyme that degrades VD metabolites) in early stages of EC support the potential for effective antiproliferative actions with appropriate VD supplementation. Both reductions in CYP27A1 and CYP2R1 and increases in CYP24A1 limit VD inhibition of EC growth in more advanced stages. Overall, this thesis work provides an important contribution to our understanding on the molecular mechanisms of action of Vorinostat, antioxidants and VD, all of which might be effective for the treatment/attenuation/prevention of EC.

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRB) / Ack1 es una proteína tirosina quinasa citoplasmática que pertenece a la familia de proteínas Ack que está formada por 9 miembros. Ack1 está compuesta por varios dominios de interacción proteína-proteína y un dominio catalítico tirosina quinasa cuya autofosforilación regula parcialmente la función de la proteína (Lougheed et al., 2004). Ack1 se encuentra altamente expresada en cerebro (Urena et al., 2005; La Torre et al., 2006), principalmente en las zonas del hipocampo, corteza cerebral, bulbo olfativo y cerebelo (Urena et al., 2005). Además, se ha demostrado que Ack1 se localiza tanto en dendritas como en regiones presinápticas y su expresión se regula a la alza por un incremento de actividad neuronal (Urena et al., 2005). Las funciones fisiológicas de Ack1 son bastante desconocidas. En conjunto, los datos publicados hasta la actualidad destacan la capacidad de la proteína Ack1 para interaccionar con una gran variedad de proteínas, que indica que Ack1 puede participar en diferentes rutas de transducción de señales, y por tanto, participar en diferentes procesos fisiológicos de las células. Por ejemplo, se ha descrito que puede participar en la regulación del citoesqueleto de actina (Burbelo et al., 1995), en los procesos de endocitosis (Teo et al., 2001), en las cascadas de señalización que resultan de la adhesión celular (Bourdoulous et al., 1998), en la migración celular (Modzelewska et al., 2006), en la proliferación (Nur et al., 2005) y en la supervivencia (Mahajan et al., 2005). La mayoría de funciones de Ack1 conocidas se deducen de las interacciones moleculares de ésta y hasta la actualidad se dispone de muy pocos datos respecto a las competencias biológicas de esta proteína, especialmente a nivel de SNC. Por eso, en esta tesis hemos intentado determinar el papel de la tirosina quinasa Ack1 en las funciones del SNC mediante 5 capítulos de resultados. En el capítulo I explicamos la producción de un anticuerpo monoclonal contra Ack1 que produjimos con el objetivo de poder estudiar la proteína Ack1 a nivel funcional. Este anticuerpo lo produjimos contra la región rica en prolinas de Ack1 con el fin que nos permitiera aumentar la especificidad de nuestros experimentos. En el capítulo II caracterizamos la proteína Ack1 a nivel más funcional. Demostramos que Ack1 es un componente de la vía de señalización de las neurotrofinas, siendo fosforilada en respuesta a neurotrofinas e interaccionando con sus receptores Trk. Además, también describimos que cambios de expresión de Ack1 alteran la neuritogénesis en células PC12 y los patrones de ramificación axonal y dendrítico en neuronas de hipocampo y células granulares de cerebelo. En el capítulo III examinamos la interacción de Ack1 con las proteínas de la densidad postsináptica CaMKII y PSD-95, su fosforilación en respuesta a los estímulos excitadores NMDA y glutamato, y la afectación de los botones axonales de las ramas colaterales de Schaffer por una falta de expresión de Ack1. Los resultados obtenidos en este capítulo apuntan a una posible implicación de Ack1 a nivel de terminales sinápticos. En el capítulo IV nos centramos en estudiar la interacción de Ack1 con la proteína FAK y su participación en procesos de quimioatracción mediados por Netrina-1. Los datos obtenidos sugieren una interacción entre ambas proteínas, que Ack1 se fosforila en respuesta a Netrina-1 y una implicación de la proteína Ack1 en los procesos de quimioatracción mediados por Netrina-1 en células de hipocampo. Finalmente, siendo las proteínas Ack1 y FAK unas proteínas que dependen de su estado de fosforilación para regular su actividad, en el capítulo V de resultados de esta tesis estudiamos las dianas de fosforilación y posibles proteínas de interacción de ambas proteínas, mediante la técnica de espectrometría de masas en muestras de cerebro de ratón en desarrollo, de cerebro de ratón adulto y de cerebro de ratón adulto hiperestimulado. - Bibliografía Bourdoulous S, Orend G, MacKenna DA, Pasqualini R, Ruoslahti E (1998) Fibronectin matrix regulates activation of RHO and CDC42 GTPases and cell cycle progression. The Journal of cell biology 143:267-276. Burbelo PD, Drechsel D, Hall A (1995) A conserved binding motif defines numerous candidate target proteins for both Cdc42 and Rac GTPases. The Journal of biological chemistry 270:29071-29074. La Torre A, del Rio JA, Soriano E, Urena JM (2006) Expression pattern of ACK1 tyrosine kinase during brain development in the mouse. Gene Expr Patterns 6:886-892. Lougheed JC, Chen RH, Mak P, Stout TJ (2004) Crystal structures of the phosphorylated and unphosphorylated kinase domains of the Cdc42-associated tyrosine kinase ACK1. The Journal of biological chemistry 279:44039-44045. Mahajan NP, Whang YE, Mohler JL, Earp HS (2005) Activated tyrosine kinase Ack1 promotes prostate tumorigenesis: role of Ack1 in polyubiquitination of tumor suppressor Wwox. Cancer research 65:10514-10523. Modzelewska K, Newman LP, Desai R, Keely PJ (2006) Ack1 mediates Cdc42-dependent cell migration and signaling to p130Cas. The Journal of biological chemistry 281:37527-37535. Nur EKA, Zhang A, Keenan SM, Wang XI, Seraj J, Satoh T, Meiners S, Welsh WJ (2005) Requirement of activated Cdc42-associated kinase for survival of v-Ras-transformed mammalian cells. Mol Cancer Res 3:297-305. Teo M, Tan L, Lim L, Manser E (2001) The tyrosine kinase ACK1 associates with clathrin-coated vesicles through a binding motif shared by arrestin and other adaptors. The Journal of biological chemistry 276:18392-18398. Urena JM, La Torre A, Martinez A, Lowenstein E, Franco N, Winsky-Sommerer R, Fontana X, Casaroli-Marano R, Ibanez-Sabio MA, Pascual M, Del Rio JA, de Lecea L, Soriano E (2005) Expression, synaptic localization, and developmental regulation of Ack1/Pyk1, a cytoplasmic tyrosine kinase highly expressed in the developing and adult brain. The Journal of comparative neurology 490:119-132. / Ack1 is a cytoplasmic tyrosine kinase highly expressed in Central Nervous System (Urena et al., 2005; La Torre et al., 2006) that has several protein-protein interaction domains and a catalytic domain that is autophosphorylated, and this process regulates, at least in part, the action of this protein (Lougheed et al., 2004). Moreover, it has been demonstrated that Ack1 is localized in dendrites and presynaptic regions and that its expression is up-regulated by an increase of neuronal activity (Urena et al., 2005). Most of the known functions of Ack1 have been elucidated from interactions of Ack1 with several proteins. But, most of the physiologically functions of Ack1 remain to be described, especially in CNS. For this reason, the aim of this thesis has been to unravel some of these functions on CNS that are described through 5 chapters. In the 1st chapter we have explained the production of a monoclonal antibody against Ack1 that allowed us to improve the specificity of our experiments and to study Ack1 at a functional level. In the 2nd chapter we have demonstrated that Ack1 is a component of the neurotrophin pathway, because it is phosphorylated as a response to neurotrophins and interacts with Trk receptors. Moreover, we also have described how changes in Ack1 expression alter neuritogenesis and axonal and dendritic ramification. In the 3th chapter we have analyzed the interaction of Ack1 with the postsynaptical proteins CaMKII and PSD-95, its phosphorylation in response to excitatory stimulus such as NMDA or glutamate and we have described that a lack of Ack1 expression decrease the size of axonal buttons. These data suggest an implication of Ack1 at a synaptic level. In the 4th chapter we focused on the determination of the interaction of Ack1 and FAK, the Ack1 phosphorylation in response to Netrin-1 and the effect of Ack1 in chemoattraction regulated by Netrin-1. Finally, in the 5th chapter we studied the phosphorylation sites and the possible interacting proteins of FAK and Ack1 by mass spectrometry in samples of mice brain in development, of adult mice brain and of adult mice overstimulated brain. - Bibliography La Torre A, del Rio JA, Soriano E, Urena JM (2006) Expression pattern of ACK1 tyrosine kinase during brain development in the mouse. Gene Expr Patterns 6:886-892. Lougheed JC, Chen RH, Mak P, Stout TJ (2004) Crystal structures of the phosphorylated and unphosphorylated kinase domains of the Cdc42-associated tyrosine kinase ACK1. The Journal of biological chemistry 279:44039-44045. Urena JM, La Torre A, Martinez A, Lowenstein E, Franco N, Winsky-Sommerer R, Fontana X, Casaroli-Marano R, Ibanez-Sabio MA, Pascual M, Del Rio JA, de Lecea L, Soriano E (2005) Expression, synaptic localization, and developmental regulation of Ack1/Pyk1, a cytoplasmic tyrosine kinase highly expressed in the developing and adult brain. The Journal of comparative neurology 490:119-132.

La superfamília de receptors scavenger rics en cisteïna (SF-SRCR) és un grup de proteïnes de membrana i/o secretades molt antic i conservat al llarg de l’evolució. Els membres de la SF-SRCR es caracteritzen per la presència d’una o més repeticions d’un domini anomenat SRCR, d’aproximadament 100 aminoàcids (aa) i ric en cisteïna. Malgrat l’alt grau de conservació del domini SRCR, no s’ha descrit una funció o lligand comú per tots els membres de la SF-SRCR. Els estudis realitzats a llarg d’aquesta tesi han permès caracteritzar molecular i funcionalment dos membres solubles relativament nous de la SF-SRCR, S5D-SRCRB (soluble 5 domains-SRCR of group B) i S4D-SRCRB (soluble 4 domains-SRCR of group B). A més, s’ha aprofundit en la descripció del paper que juga DMBT1/Hensin en la diferenciació terminal de les cèl•lules intercalades de ronyó. S5D-SRCRB és una glicoproteïna secretòria altament glicosilada, formada per cinc dominis SRCR, espaiats per pèptids rics en els aa Pro, Ser, Thr (PST), a més d’un domini C terminal de tipus mucina. Les glicosilacions que S5D-SRCRB presenta són del tipus N i O. Al seu torn, S4D-SRCRB és una glicoproteïna formada per quatre dominis SRCR també espaiats per pèptids PST, però únicament conté glicosilacions de tipus O. A més de la caracterització bioquímica dels dos membres, la generació d’anticossos monoclonals contra S5D-SRCRB va permetre estudiar el patró d’expressió tissular d’aquesta proteïna. L’estudi va desvetllar que S5D-SRCRB s’expressava principalment als epitelis, on el tracte urogenital presentava els nivells d’expressió més importants a nivell protèic i d’ARN. Pel que fa la funció de S5D-SRCRB i S4D-SRCRB, es va observar que ambdues proteïnes s’unien de manera dosi-depenent a proteïnes de la matriu extracel•lular (fibronectina i laminina). S5D-SRCRB, a més, interaccionava amb galectina-1 i galectina-3, mitjançant els seus dominis d’unió a lectines. D’altra banda, S5D-SRCRB i S4D-SRCRB interactuaven amb components de la paret bacteriana (peptidoglicà i lipopolisacàrids) i fúngica (glucans lineals), actuant com a reconeixedors dels patrons moleculars associats a patògens (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs). Les dues proteïnes eren també capaces d’agregar cultius bacterians (E. coli i S. aureus) i fúngics (C. albicans). Per tant, S5D- i S4D-SRCRB podien actuar com a receptors duals capaços de reconèixer estructures endògens i exògenes, i participar en el manteniment de la homeòstasi de l’organisme. La possibilitat que S5D-SRCRB jugués un paper en la defensa dels epitelis contra infeccions es va estudiar amb més detall en el tracte urogenital, emprant models in vitro i in vivo. Els resultats van revelar que l’expressió de S5D-SRCRB augmentava tant en cultius de la línia cel•lular clone C tipus ß expossats a components de la paret bacteriana, com en els ronyons de ratolins a un model d’infecció en el tracte urinari (urinary tract infection, UTI). El patró d’expressió de S5D-SRCRB també canviava durant el procés de diferenciació terminal de les cèl•lules intercalades de ronyó, i durant l’espermatogènesi en els túbuls seminífres. Per aquest motiu s’ha proposat que S5D-SRCRB pot jugar un paper en la diferènciació cel•lular, com s’ha demostrat que passa en el cas de DMBT1/Hensin. La secreció de DMBT1/Hensin és clau en el procés de diferenciació terminal que pateixen les cèl•lules intercalades en condicions d’acidosi, i pel qual passen d’expressar un fenotip de cèl•lula intercalada tipus ß a un de tipus α. / The scavenger receptor cysteine-rich superfamily (SRCR-SF) members are transmembrane and/or secreted receptors exhibiting one or several repeats of a cysteine-rich protein module of +/-100 aa, named scavenger receptor cysteine-rich (SRCR). Despite the high degree of conservation of SRCR domain, non a shared function neither a ligand has been described for all the SRCR-SF members. Studies conducted on this work characterized two relatively new members of the SRCR-SF: S5D-SRCRB (soluble 5-SRCR domains of group B) and S4D-SRCRB (soluble 4-SRCR domains of group B). In addition, we better described the role of DMBT1/Hensin in terminal differentiation of renal intercalated cells. S5D-SRCRB is a highly glycosylated secretory glycoprotein, consisting of five SRCR domains, spaced by peptides rich in Pro, Ser, Thr (PST), and a mucin-like domain at the C terminal extreme. S5D- SRCRB contains N- and O- glycosylations. On the other hand, S4D-SRCRB is a glycoprotein consisting of four SRCR domains also spaced by PST peptides, but only contains O-glycosylations. S4D- and S5D-SRCRB were shown to bind endogenous extracellular matrix proteins (laminin fibronectin), as well as Pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) present on Gram-positive and Gram-negative bacteria and fungi. PAMP binding by S4D- and S5D-SRCRB induced microbial aggregation and changes in PAMP-induced cytokine release. These abilities suggest that S4d- and S5D-SRCRB might play a role in the innate defense and homeostasis of certain specialized epithelial surfaces. Immunohistochemical and real-time PCR analysis showed significant S5D-SRCRB expression in murine genitourinary and digestive tracts. S5D-SRCRB expression increased when collecting duct cells were infected. S5D-SRCRB expression pattern also changed during terminal differentiation of renal intercalated, and during spermatogenesis in the seminiferous tubule. It has been proposed that S5D-SRCRB may play a role in cell differentiation, in a similar way it does DMBT1/Hensin. This work has shown that DMBT1/Hensin secretion is required during terminal differentiation carried out by intercalated cells in conditions of acidosis, which drives type ß- intercalated cells to α- intercalated cells.

Alzheimer’s disease (AD) is the most common cause of dementia in the elderly, with more than 25 million people affected worldwide. First described in 1907 by the German physician Alois Alzheimer, AD is a neurodegenerative disease characterized by a dramatic progressive loss of synapses and neuronal populations, initially affecting medial temporal lobe structures and finally resulting in diffuse cortical atrophy. The earliest clinical symptoms are episodic memory loss, especially in remembering new items (anterograde amnesia). As the disease progresses, amnesia occurs in conjunction with major executive dysfunctions, such as impairment of language (aphasia), object use (apraxia), recognition of faces or objects (agnosia), abstract reasoning, step-by-step planning, and decision making. This gradual erosion of cognition slowly increases in severity until the symptoms eventually become incapacitating, and at the histological level it is reflected by the progressive spread of specific pathological lesions in a non-random manner across various brain regions. At the histopathological level AD shows two main hallmarks: amyloid plaques and neurofibrillary tangles, occurring in a context of vascular damage, inflammation, oxidative stress, synaptic loss and neurodegeneration. Reelin is an extracellular matrix protein crucial for neural development. In addition, recent studies have shown that in the adult brain Reelin controls distinct plasticity events, including synaptic plasticity and adult neurogenesis. The Reelin signalling cascade has been previously related to Alzheimer Disease (AD) pathogenesis. However, the exact role that Reelin itself plays on the disease is not fully understood. The main aim of this thesis is to investigate the involvement of Reelin in AD aetiology, addressing the question of whether Reelin could act as a protective factor, with eventual therapeutic implications, or rather if it might favour the onset of the pathology. To this end established an strategy to purifiy Reelin protein and to study in vitro its involvement in the process of amyloid fibrils formation. By this approach we found in vitro that Reelin delays amyloid- (Aβ42) fibril formation until it is recruited into amyloid fibrils. Further, Reelin protects against both Aβ42-oligomer induced neuronal death and synaptic loss. We also generated AD mouse models overexpressing Reelin, to address in vivo the impact of Reelin overexpression on the main hallmarks of the disease, such as amyloid fibril formation and phosphorylation of Tau. In detail, we crossed a model of conditional Reelin overexpression (TgRln) from our lab (Pujadas et al., 2010) with two models of AD pathology: J20 and Tet/GSK-3β mice. J20 mice constitutionally express a mutated form of human APP, bearing both the Swedish and the Indiana mutation (hAPP we/Ind) (Mucke et al., 2000), thus being a good model to analyse Aβ pathology. The generated J20 mice overexpressing Reelin are referred to as TgRln/J20. Tet/GSK-3β is a conditional transgenic model of overexpression of GSK-3β, the main kinase for Tau protein, thus being a good model of Taupathology. In TgRln/J20 we showed that Reelin transgene expression delays amyloid plaque formation in vivo. The generated Tet/GSK-3β mice overexpressing Reelin are referred to as TgRln/GSK-3β. Moreover, we show that overexpression of Reelin in J20 AD mice rescues the dendritic spine loss documented for this mouse strain with consequent rescue of the cognitive deficits associated to this AD model, such as non-spatial recognition tasks (assessed by Novel Object Recognition test). Additionally, both aged TgRln and TgRln/J20 mice behaved better than aged wild-type mice, indicating that Reelin protects also from the impairments due to physiological aging. In TgRln/GSK-3β mice we show that Reelin decreases Tau phosphorylation and reduces cognitive deficits in a non-spatial recognition task (Novel Object Recognition). All together these data indicate that by delaying Aβ plaque formation, protecting against neuronal death and synaptic loss, reducing Tau phosphorylation and preventing AD cognitive deficits the Reelin pathway should be considered a therapeutic strategy for the treatment and amelioration of AD pathogenesis and cognitive deficits in normal aging. / La Reelina es una proteína de la matriz extracelular crucial para el desarrollo neural. Además, estudios recientes han demostrado que en el cerebro adulto Reelina controla eventos de plasticidad sináptica y neurogénesis. La cascada de señalización de Reelina ha sido previamente relacionada con la enfermedad de Alzheimer (EA). Sin embargo, aún no se conoce exactamente el papel que Reelina juega en la enfermedad. La EA es la forma más común de demencia en personas mayores y se caracteriza por una dramática pérdida progresiva de sinapsis y poblaciones neuronales. A nivel histopatológico se han descrito dos características principales: los ovillos neurofibrilares (paquetes intracelulares de la proteína Tau hiperfosforilada ) y las placas amiloides (depósitos extracelulares de péptido Aβ). El péptido Aβ se genera por el corte proteolítico de la proteína transmembrana APP (Amyloid precursor protein) por la acción secuencial de las proteasas de membrana β- y γ-secretasa. El Aβ monomérico comienza a agregarse en especies oligoméricas solubles, capaces de provocar disfunción sináptica en la EA. El proceso de agregación termina con la formación de fibrillas amiloides, los constituyentes principales de las placas. En esta tesis se demuestra que Reelina retrasa in vitro la formación de fibrillas amiloides, hasta que queda secuestrada en las mismas, perdiendo su actividad biológica. Además, Reelina protege contra la muerte neuronal y el daño sináptico inducidos por oligómeros de Aβ. También se generan modelos murinos de EA sobreexpresantes de Reelina. En uno de estos modelos (TgRln/J20) se demuestra que la expresión transgénica de Reelina disminuye in vivo la deposición de placas amiloides, previene la pérdida de espinas dendríticas y rescata el deterioro cognitivo asociado a este modelo de EA. En otro modelo (TgRln/GSK-3β) la sobreexpresión de Reelina reduce la fosforilación de Tau. El conjuntos de datos presentados en esta tesis indica que, al disminuir la formación de placas amiloides, al proteger contra la muerte neuronal y la pérdida sináptica, al reducir la fosforilación de Tau y al prevenir el deterioro cognitivo de la EA, la vía de Reelina debe ser considerada una estrategia terapéutica para el tratamiento y la mejora de la patogénesis de la EA.

Olfactory ensheathing cells (OECs) implantation has emerged as a promising therapy for spinal cord injury (SCI), but their regenerative properties seem to depend on the presence of a substrate permissive to cell migration. Studies demonstrate that when transplanted after SCI, the migratory properties of OECs are reduced compared to transplantation in not-injured spinal cords. As after SCI, inhibitory molecules such as myelin associated inhibitors (MAIs) are overexpressed in the site of lesion. Therefore we thought that these molecules could modulate OECs migration capacity. We used a rodent clonal OEC line, TEG3, and we demonstrated that these cells express all the components of the NgR-complex. This complex resulted to be active since TEG3s activated RhoA and increased ERK1-2 phosphorylation in response to acute stimuli of myelin. Indeed, myelin inhibited OECs migration over glass surfaces and also over linearly elastic PAA gels. Moreover using traction force microscopy (TFM), we quantitatively demonstrate that TEG3s largely decrease their traction stress over myelin. This decrease in traction force correlated with decreased focal contacts and redistribution the of F-actin cytoskeleton. In fact, OECs cultured on myelin largely reduced the number of protrusions, stress fibers and FAs. Finally we observed that the incubation of TEG3s with the NgR1 blocking peptide NEP1-40 mainly overcame MAIs-mediated migratory inhibition, restoring the traction forces of these cells and their cytoskeletal organization. Altogether these data suggested us that a cell-based strategy, using TEG3s that has the capacity to overcome the inhibitory action of MAIs, is required in other to enhance their migratory properties after SCI transplantation. Indeed in order to overcome the effects of MAIs over TEG3 we tested two strategies. First we investigated whether a particular type of magnetic nanoparticle (MNP) could be used to control the localization and migration of TEG3s. We confirmed that, in vitro, magnetized TEG3s can survive well without exhibiting stress-associated cellular responses. Moreover, their migration can be modulated by magnetic fields and their transplantation in organotypic culture of spinal cord and peripheral nerve, a model more similar to an in vivo situation, showed positive integration in the model. Second we genetically modified OEC to express the NgR(Ecto)coupled with a GFP using a lentiviral based system in order to visualize them. The NgR(Ecto), contains the amino acids 1–310 of NgR1 and blocks the signaling of myelin and previous studies demonstrated that its presence enhances axonal regeneration after SCI. Engineered OEC were able to express and secrete at high levels the ectodomain in vitro. Moreover, by time lapse analysis we could observe that these cells migrate longer distances than normal OEC over a myelin substrate. To observe the behavior of NgR(Ecto)-OECs in vivo we did a preliminary experiment where cells were implanted in a not-lesioned spinal cord of adult rats. The NgR(Ecto)-OECs migrated more distance both caudal and rostral from the site of injection in comparison with normal OEC. These data suggest a therapeutic potential of both strategies tested for SCI. NgR(Ecto)-OECs once implanted after SCI would migrate more and this would enhance their regeneration capacity. Moreover the secreted ectodomain would interfere with the myelin present at the lesion site improving intrinsic axonal regeneration. We could combine the use of these modified cells with MNPs. With the design of specific magnetic sources we could concentrate OECs near the lesion site and therefore increase their possible interaction with damaged axons. Indeed, further studies are necessary the behavior of this modified cells in a SCI model. / La implantación de OECs ha surgido como una terapia prometedora para lesiones medulares, pero sus propiedades regenerativas parecen depender de la presencia de un sustrato permisivo para la migración celular. En esta Tesis Doctoral demostramos que los inhibidores asociados a mielina (IAMs) pueden modular la capacitad migración de las OECs través la interacción y activación del complejo receptor de NgR (el receptor común para los IAMs). Con el uso de la microscopia de tracción, demostramos cuantitativamente que las OECs disminuyen en gran medida su fuerza de tracción sobre la mielina. Además, esta disminución se pudo correlacionar con una disminución de las adhesiones focales y la redistribución del citoesqueleto de F-actina. La incubación con el péptido NEP1-40, que bloquea NgR1, restableció in gran parte la capacitad migratoria, las fuerzas de tracción de estas células y su organización citoesqueletal. En base a los resultados obtenidos exploramos la viabilidad de dos estrategias diferentes para mejorar las propiedades migratorias de la OECs. Una de ellas trataba del posible uso de nanoparticulas magnéticas para guiar a las células. Aunque esta técnica no aumenta la velocidad intrínseca de migración de las células, permite la concentración y la guía de las mismas hace a un área específica después de la implantación in vivo. Pudimos comprobar que las OECs marcada con NPM no exhiben respuestas celulares asociadas al estrés, y pueden ser guiadas por un campo magnético in vitro. Además comprobamos que las células se integraban bien después de su trasplante de en un modelo organotípico de regeneración de médula espinal/nervio ciático. La segunda estrategia consistió en modificar genéticamente las OECs para que expresaran un ectodomínio por el NgR1 para bloquear los efectos negativos de los IAMs sobre su migración. Pudimos observar que las células modificadas migran más in vitro sobre un sustrato de mielinas comparadas con OECs normales. Además, una vez implantadas en una médula no lesionada, las células modificadas se integran bien en el modelo y migran más que células normal. Los resultados obtenidos indican un potencial terapéutico de ambas estrategias.

In the present thesis, we have studied the evolution of the inflammasome functions in fish. We observed that inflammasome and caspase-1 trigger pyroptotic cell death but they are not involved in the processing of IL-1β. In addition, we have developed a zebrafish-Salmonella infection model to study the role of the inflammasome in the clearance of intracellular bacteria. Finally, we have identified and characterized a new member of the IL-1 family, IL-1Fm2, which is exclusively present in most evolutionarily advanced teleosts. The identification of this new IL-1 family member helps to understand the evolution of this family of cytokines in vertebrates and point out to its complexity. / En la presente tesis doctoral se ha estudiado la evolución de las funciones del inflamasoma en peces, llegando a la conclusión de que tanto el inflamasoma como la caspasa-1 desencadenan muerte celular conocida como piroptosis, pero no son necesarios para el procesamiento de la IL-1β. Además se ha desarrollado un modelo de infección en pez cebra para el estudio del papel del inflamasoma en la eliminación de bacterias intracelulares, como Salmonella. Por último, se ha descrito un nuevo miembro de la familia de la IL-1, IL-1Fm2, perteneciente exclusivamente a los peces teleósteos más avanzados evolutivamente. La identificación de este nuevo miembro de la familia de la IL-1, IL-1Fm2, ayuda a entender la evolución de esta familia de citoquinas en vertebrados e indica su gran complejidad.

OBJETIVOS: 1. Evaluar la capacidad del EE2 de provocar una respuesta estrogénica en vivo en ejemplares macho de dorada 2. Evaluar la capacidad del EE2 de alterar la fisiología y la respuesta inmunitaria local de la gónada 3. Evaluar la habilidad del EE2 de alterar la respuesta inmunitaria sistémica, analizando actividades inmunitarias de leucocitos de riñón cefálico, el perfil de expresión de macrófagos y la capacidad en vivo de responder a un reto inmunológico. 4. Realizar una caracterización funcional del receptor de estrógenos asociado a proteína G tanto in vitro como in vivo. METODOLOGÍA: Se llevo realizó una experimentación in vivo e in vitro. Se usaron ejemplares sanos de dorada (Sparus aurata L.), especie hermafrodita protándrica y de puesta estacional, mantenidos en el Centro Oceanográfico de Murcia (IEO, Mazarrón, Murcia). La experimentación in vivo se llevo a cabo exponiendo a los ejemplares a EE2 o G1 a diferentes dosis y tiempos. En algunos casos, la exposición se simultaneó con una inmunización programada. A continuación, se realizaron, entre otros, análisis de supervivencia, de calidad del esperma, histológicos, determinación de hormonas e IgM en suero, de expresión génica y de citometría de flujo. La experimentación in vitro se desarrollo, principalmente, tratando con leucocitos de riñón cefálico con EE2 o G1 (para la activación específica de la señalización de GPER para su caracterización funcional) a diferentes dosis y tiempos y analizando actividades inmunitarias como fagocitosis y explosión respiratoria y el perfil de expresión génica. CONCLUSIONES: 1. La exposición in vivo a EE2 promueve una respuesta estrogénica evidente caracterizada por un descenso en el IGS, alteración en los niveles séricos de E2, T y 11KT y una inducción en la expresión hepática de vtg. Estos efectos son más evidentes cuando el EE2 se administra en la dieta que cuando se administra en el agua del baño. Además, estos efectos dependen, ligeramente, del estado de desarrollo de los ejemplares. 2. El EE2 incrementa la sensibilidad a estrógenos en gónada y en riñón cefálico ya que aumenta la expresión del REα. 3. La exposición in vivo a EE2 interrumpe la espermatogénesis e induce en el testículo la morfología característica de la etapa de post-puesta. Aunque los túbulos seminíferos continúan llenos de espermatozoides se observa una reducción en el volumen y motilidad de los espermatozoides. Además, el EE2 genera un proceso pro-inflamatorio en la gónada, promoviendo una infiltración masiva de leucocitos y un incremento en la expresión de citoquinas y moléculas implicadas en el reconocimiento y presentación de antígenos. 4. El EE2 disminuye la capacidad de los ejemplares de responder a un estímulo inmunológico in vivo ya que inhibe la producción de citoquinas pro-inflamatorias tras una inmunización aunque no se comporta como inmunosupresor. Además, el EE2 inhibe in vitro las actividades inmunitarias de leucocitos de riñón cefálico y dirige hacia un fenotipo anti-inflamatorio en macrófagos. 5. EL GPER se expresa en tejidos reproductores e inmunitarios de dorada y su expresión no es modulada por su activación. 6. Los granulocitos acidófilos son las células del riñón cefálico que tienen un mayor nivel de expresión de GPER. Éstos expresan un GPER funcional cuya activación in vitro dirige, de manera general, hacia un fenotipo anti-inflamatorio. Dichos efectos son regulados, en parte, por la activación de la ruta de señalización AMPc/PKA/CREB. 7. La activación de GPER no promueve una respuesta estrogénica aunque provoca, en general, un efecto anti-inflamatorio y modula ligeramente la respuesta inmunitaria adaptativa. / OBJETIVES: 1. To evaluate the ability of EE2 to provoke an estrogenic response in vivo in male gilthead seabream. 2. To evaluate the ability of EE2 to alter the physiology and the local immune response of the gonad. 3. To evaluate the ability of EE2 to alter the systemic immune response, analysing immune activities of head kidney leukocytes, the expression profile of macrophages and the in vivo capabilities to respond to an immune challenge. 4. To perform a functional characterization of the G protein-coupled estrogen receptor, GPER, both in vitro and in vivo. METHODOLOGY: In vivo and in vitro experimentation was carried out. For this, healthy specimens of gilthead seabream (Sparus aurata L.) were bred and kept at the Centro Oceanográfico de Murcia (IEO, Mazarrón, Murcia). In vivo experiments were carried out by exposing the specimens to EE2 or G1 at different doses and times. In some cases, the exposure was simultaneous to a scheduled immunization. Afterwards, analysis of survival, sperm quality, histological, determination of hormones and IgM in serum, gene expression and flow cytometry were performed. In general, for the in vitro experiments, leukocytes from head kidney (bone marrow equivalent) were treated with several doses of EE2 and G1 (to specifically activate GPER signalling) at different time points, and analyzing immune activities such as phagocytosis and respiratory burst and gene expression profile. CONCLUSIONS: 1. Exposure to EE2 in vivo promotes an evident estrogenic response characterized by decreased GSI, altered serum levels of E2, T and 11KT, and induced hepatic expression of vtg. These effects are more evident when EE2 is administered in the diet than when is administered in bath water. In addition, its effects slightly depend on the development stage of the specimens. 2. EE2 increases the sensitivity to estrogens in the gonad and the head kidney by increasing the expression of the gene coding for ERα. 3. Exposure to EE2 in vivo disrupts spermatogenesis and induces a characteristic morphology of the post-spawning in the testis. However, the seminiferous tubules were filled with sperm, causing a reduction in the volume and sperm motility. Moreover, EE2 also generates a pro-inflammatory process in the gonad, promoting a massive infiltration of leukocytes and an increased expression of the genes encoding cytokines and molecules involved in antigen recognition and presentation. 4. EE2 decreases the ability of specimens to respond to an immune stimulus in vivo by inhibiting the production of pro-inflammatory cytokines after immunization but does not behave as an immunosuppressor. Moreover, EE2 inhibits in vitro the immune activities of head kidney leukocytes and direct primary macrophages towards an anti-inflammatory phenotype. 5. GPER is expressed in reproductive and immune tissues in gilthead seabream and its expression is not modulated by its activation. 6. Acidophilic granulocytes are the head kidney cells with a higher level of expression of GPER. They express a functional GPER whose activation in vitro leads, in general, to an anti-inflammatory phenotype. These effects are regulated, in part, by activation of the cAMP/PKA/CREB signalling pathway. 7. GPER activation in vivo does not promote an estrogenic response, although in general, provokes an anti-inflammatory effect and slightly modulates the adaptive immune response.