Els micromaterials i nanomaterials presenten unes propietats fisicoquímiques úniques i controlables, les quals han permès la creació d’eines innovadores per tal d’afrontar alguns dels reptes que presenten diferents branques de la ciència i tecnologia, incloent la medicina moderna. El creixement exponencial de la microtecnologia i nanotecnologia en els últims anys ha generat la necessitat de conèixer millor el comportament dels micromaterials i nanomaterials en ambients fisiològics, especialment a nivell cel·lular, per tal d’assegurar un desenvolupament segur i eficient. En aquest context, l’objectiu principal d’aquesta tesi ha estat estudiar la interacció entre diferents tipus de micropartícules i cèl·lules. Amb aquesta finalitat, es van dur a terme tres treballs diferents. Primer, s’ha avaluat l’impacte del recobriment de micropartícules amb lípids i polímers catiònics en la seva internalització en cèl·lules no fagocítiques HeLa. En concret, s’ha observat que la utilització de PEI a una concentració de 0.05 mM presenta el millor balanç entre eficiència d’internalització i citotoxicitat. En segon lloc, s’ha analitzat si la modificació de la superfície de les micropartícules té un efecte diferent segons la línia cel·lular utilitzada. En concret, s’ha observat que les cèl·lules epitelials mamàries tumorals (SKBR-3) i no tumorals (MCF-10A) mostraven diferències significatives, tant pel que fa a la eficiència d’internalització de micropartícules com als mecanismes d’endocitosi involucrats. Finalment, s’ha demostrat que els xips intracel·lulars compostos de polisilici, crom i or, són bons candidats per a la seva utilització en aplicacions biològiques, ja que presenten una alta biocompatibilitat i són capaços de desenvolupar diferents funcions mitjançant la seva bifuncionalització. En conjunt, els resultats d’aquesta tesi posen de manifest la importància de determinar la citotoxicitat, l’eficiència d’internalització, la localització intracel·lular i l’efecte de la línia cel·lular a l’hora de dissenyar nous microsistemes i nanosistemes per tal de maximitzar la seva eficiència i minimitzar els efectes adversos. / Los micromateriales y nanomateriales presentan propiedades fisicoquímicas únicas y controlables que han permitido la creación de herramientas innovadoras para abordar algunos de los mayores retos que presentan distintas ramas de la ciencia y tecnología, incluyendo la medicina moderna. El crecimiento exponencial de la microtecnología y nanotecnología durante los últimos años ha generado la necesidad de comprender el comportamiento de los micromateriales y nanomateriales en ambientes fisiológicos, especialmente a nivel celular, para conseguir un desarrollo eficiente y seguro. En este contexto, el objetivo principal de esta tesis ha sido estudiar las interacciones entre diferentes tipos de micropartículas y células. Para ello, se han llevado a cabo tres estudios diferentes. Primero, se ha evaluado el impacto del recubrimiento de micropartículas con lípidos y polímeros catiónicos en la internalización de estas en la línea celular no fagocítica HeLa. Se ha determinado que utilización de PEI a una concentración de 0.05 mM presenta el mejor balance entre internalización y citotoxicidad. En segundo lugar, se ha analizado si la modificación de la superficie de las micropartículas tenía un efecto diferente según la línea celular utilizada. Concretamente, se ha observado que las células epiteliales mamarias tumorales (SKBR-3) y no tumorales (MCF-10A) presentaban diferencias significativas con respecto a la eficiencia de internalización y a los mecanismo de endocitosis involucrados. Finalmente, se ha demostrado que los chips intracelulares compuestos de polisilicio, cromo y oro, son buenos candidatos para su utilización en aplicaciones biológicas, ya que muestran una alta biocompatibilidad y son capaces de desempeñar distintas funciones mediante su bifuncionalización. En conjunto, los resultados de esta tesis ponen de manifiesto la importancia de determinar la citotoxicidad, eficiencia de internalización, localización intracelular y el efecto de la línea celular de los nuevos microsistemas y nanosistemas para maximizar su eficiencia y minimizar sus efectos adversos. / The unique and controllable physico-chemical properties of micro- and nanomaterials have allowed the creation of ground-breaking approaches to overcome some of the major challenges of different branches of technology and science, including modern medicine. The fast advances in micro- and nanotechnology have lead to an increasing demand for understanding the behaviour of micro- and nanomaterials within the physiological environments as well as their interactions at the bio-interface, including the cellular level, for an efficient and safe development. In this scenario, the present Thesis aimed to provide an integrated understanding about microparticle interactions with cells. First, we assessed the impact of cationic lipids and polymer coating of microparticles on their uptake by non-phagocytic (HeLa) cells. We found that non-covalently conjugated PEI at a 0.05 mM concentration offers the best balance between uptake efficiency and cytotoxicity. Second, we observed that surface modified microparticles were differently uptaken by tumoral (SKBR-3) and non-tumoral (MCF-10A) human breast epithelial cells, not only in terms of uptake efficiency but also of their endocytic pathways. Third, we demonstrated that polysilicon-chromium-gold multi-material intracellular chips (MMICCs) are suitable for biological applications due to their biocompatibility and capability of developing multiple functions through their bi-functionalization using orthogonal chemistry. Collectively, our results highlight the importance of assessing cell-particle interactions, in terms of cytotoxicity, uptake, intracellular location and cell type effect of newly designed micro- and nanomaterials, not only with respect to the target cells but also the neighbouring cells, in order to ensure their safety and efficiency.

Els models de malalties són una eina bàsica per la comprensió de les malalties humanes. Actualment, la majoria de la informació de la que disposem de malalties humanes es basa en models animals. Tot i això, els models animals difereixen molecular i fenotípicament dels humans, i no sempre reprodueixen fidelment la malaltia humana. En les últimes dècades, les cèl·lules mare humanes s’han establert com una opció molt interessant en el camp de la modelització cel·lular. En aquest treball hem volgut caracteritzar les cèl·lules mare embrionàries com a models per a l’estudi de la inestabilitat de la repetició de trinucleotids a la distròfia miotonica tipus 1 (DM1) i la malaltia de Huntington (HD). Així mateix, hem volgut estudiar la inactivació del cromosoma X amb la intenció de fer servir linees cel·lulars com a models per l’estudi del desenvolupament embrionàri humà. A la primera part d’aquest treball, hem observant una inestabilitat de repeticions de trinucleotids significativa al locus de la malaltia DM1 de les cèl·lules mare estudiades. La diferenciació d’aquestes cèl·lules va estabilitzar el número de repeticions. L’estabilització de les repeticions va ser concomitant amb la regulació a la baixa de l’expressió de gens involucrats en els mecanismes de reparació cel·lular. Posteriorment a la publicació del nostre article, altres grups varen reproduir els nostres resultats, però en aquest cas utilitzant cèl·lules mare induïdes. Els estudis recolzen la reproductibilitat dels nostres resultats, suggerint que poden ser extrapol·lats a altres linees de cèl·lules mare arreu del mon. Referent a la mutació de HD, varem trobar que era estable en totes les condicions estudiades, en cèl·lules indiferenciades, diferenciades a progenitors d’os, teratomes i progenitors neurals. Aquests resultats estan en concordancia amb els resultats obtinguts per altres grups que descriuen un baix nombre de repeticions al locus de HD. Per altra banda, varis grups han descrit la presencia de inestabilitat de les repeticions en cèl·lules diferenciades a la linea neural. La discrepància entre els nostres resultats i aquests últims podria ser deguda a la obtenció de cèl·lules neurals menys madures en el moment del nostre estudi. A la segona part d’aquesta tesis hem estudiat la inactivació del cromosoma X en 23 línies femenines de cèl·lules mare pluripotents. Vàrem observar una ràpida progressió de les cèl·lules de dependència de XIST en la inactivació del cromosoma X cap a un estat d’adaptació al cultiu que es caracteritza per un estadi de inactivació independent de l’expressió de XIST i amb una erosió de la metilació. També describim un patró d’inactivació esbiaixat en la majoria de les línies estudiades, contrari al patró aleatori observat en cèl·lules femenines adultes. A més a més, aquest patró és independent de XIST, de l’origen del cromosoma X i d’aberracions cromosòmiques. Aquests resultats suggereixen que el patró esbiaixat observant esta dirigit provablement per l’activació o repressió d’al·lels específics que es troben en el cromosoma X i que li confereixen a la cèl·lula un avantatge respecte a les altres cèl·lules. En conclusió, les cèl·lules mare pluripotents semblen ser un bon model in vitro per a l’estudi d’ambdues malalties, DM1 i HD, ja que presenten el mateix patró d’inestabilitat de la repetició del trinucleotid que s’observa in vivo. Cal remarcar també la depencia Overall, hPSC appear to be a good in vitro model for the study of both DM1 and HD TNR instability, as the repeat follows in vitro the same patterns as found in vivo, including its dependency of the MMR machinery, particularly in the case of DM1. However, our results on the study of the X chromosome inactivation (XCI) state suggest caution when using hPSC as early human developmental research models. The eroded state of XCI found in many of the hPSC lines, and the frequency of skewed XCI patterns suggests that these cells are not a good proxy to early embryonic cells, at least what XCI is concerned. Conversely, they may still provide an interesting model to study gene function and mechanisms implicated. / Disease modelling is an essential tool for the understanding of human disease. Currently, much of the information we have on human diseases is based on animal models. However, animal models differ molecularly and phenotypically from humans, and are not always suitable to reproduce with fidelity human diseases. In the past decades, human pluripotent stem cells (hPSC) have emerged as an interesting option in the field of cellular modelling, this development recently having taken up much momentum. In this work, we aimed at characterizing hPSC as models for the study of Myotonic dystrophy type 1 (DM1) and Huntington’s disease (HD) trinucleotide repeat (TNR) instability and to investigate the status of the X-chromosome inactivation with an eye on using these cells as models for early human development. In the first part of our work, we observed a significant TNR instability for the DM1 locus in hESC, and that differentiation resulted in a stabilization of the repeat. This stabilization was concommitant with a downregulation of the mismatch repair (MMR). Our results were later replicated in hiPSC by other researchers, showing their reproducibility and suggesting they may be extrapolated to other hPSC lines worldwide. Regarding the HD repeat, we found it was very stable in all conditions studied, both in undifferentiated hESC and cells differentiated into osteogenic progenitor-like cells, teratoma cells and neural progenitors. This is in line with other studies showing that hESC show very limited TNR in the HD locus. On the other hand, some groups have now reported some instability of this locus in cells differentiated into the neuronal lineage. The instability seen in neuronal lineage in later studies, not in our study, is probably explained by the use of hPSC derived neurons more similar to the cells showing in vivo instability than the ones we were able to generate at the time of the study. In the second part of the thesis we studied the X-chromosome inactivation in 23 female hPSC lines. We found that hPSC rapidly progress from a XIST-dependent XCI state to a culture-adapted, XIST-independent XCI state with loss of repressive histone modifications and erosion of methylation. We also report a remarkably high incidence of non-random XCI patterns, and that this skewing of the methylation patterns is independent from the transition to the XIST-independent XCI state, the origin of the X chromosome or chromosomal aberrations. These results suggest that XCI skewing is possibly driven by the activation or repression of a specific allele on the X chromosome, conferring a growth or survival advantage to the cells. Overall, hPSC appear to be a good in vitro model for the study of both DM1 and HD TNR instability, as the repeat follows in vitro the same patterns as found in vivo, including its dependency of the MMR machinery, particularly in the case of DM1. However, our results on the study of the X chromosome inactivation (XCI) state suggest caution when using hPSC as early human developmental research models. The eroded state of XCI found in many of the hPSC lines, and the frequency of skewed XCI patterns suggests that these cells are not a good proxy to early embryonic cells, at least what XCI is concerned. Conversely, they may still provide an interesting model to study gene function and mechanisms implicated.

Las neoplasias mieloproliferativas (NM) son enfermedades clonales originadas en una célula madre hematopoyética caracterizadas por la proliferación de células maduras de una o varias líneas mieloides y que presentan cierto riesgo de progresión a leucemia aguda o a presentar fallo medular debido a la aparición de mielofibrosis, durante la evolución de la enfermedad. En el año 2005 se describió la mutación JAK2V617F que se detecta en el 95% de la Policitemia Vera (PV) y en el 60% de la Trombocitemia Esencial (TE) y la Mielofibrosis Primaria (MFP). Posteriormente, se describieron otros marcadores moleculares implicados en vías de señalización (LNK, SOCS, CBL), en procesos epigenéticos (TET2, ASXL1, IDH1, IDH2, EZH2) o en la maquinaria del splicing del ARN mensajero (SF3B1, SRSF2, U2AF1). En general, estos marcadores se observan en bajos porcentajes en las NM y ninguno es específico de estas enfermedades. Más recientemente, a finales del año 2013, se reportó la presencia de mutaciones en el gen CALR en un 49-84% de las TE y un 67-88% de las MFP JAK2V617F negativas, convirtiéndose en el segundo marcador molecular más frecuente de las NM. Desde su descubrimiento, la mutación JAK2V617F ha sido un criterio para el diagnóstico de las NM clásicas (PV, TE, MFP). Dada su elevada frecuencia, las mutaciones en CALR ya se han propuesto como futuro criterio diagnóstico a incluir en las próximas guías de clasificación de la OMS, mientras que el papel a nivel diagnóstico de otros marcadores es más limitado. Sin embargo, existen varios estudios que reportan que la presencia de alteraciones adicionales a JAK2 o CALR pueden tener un papel en la progresión de la TE o la PV a mielofibrosis o leucemia aguda mieloide. El objetivo principal del trabajo fue identificar si la detección de una hematopoyesis clonal puede tener un papel en la transformación de las NM. Los dos primeros trabajos se basaron en el estudio de una cohorte de pacientes, principalmente con TE JAK2V617F negativos. Lo resultados mostraron que la presencia de alteraciones en nuevos marcadores moleculares como TET2, ASXL1, IDH1/2 y c-CBL son infrecuentes en este grupo de pacientes. También se observó que en la TE JAK2V617F negativa, la detección de clonalidad hematopoyética mediante el análisis del patrón de inactivación del cromosoma X, analizando el polimorfismo del gen HUMARA, se asocia a mayor riesgo de transformación mielofibrótica. Además, aunque los resultados no fueron estadísticamente significativos, se observó cierta tendencia a la asociación entre presentar alteraciones distintas a JAK2V617F y la transformación de la enfermedad. En el tercer trabajo, se realizó un estudio mutacional de nuevos marcadores, en una cohorte de pacientes con mielofibrosis post-trombocitémica (MF post-TE) y mielofibrosis post-policitémica (MF post-PV) y se comparó con el de los pacientes con NM en fase crónica. Los resultados mostraron que la presencia de mutaciones en los genes del spliceosoma son infrecuentes en la TE y PV en fase crónica, y que existe un perfil de mutaciones de los genes de la maquinaria del splicing distinto entre los pacientes con MFP y los pacientes con MF post-TE o MF post-PV. De forma similar, en el grupo de TE y PV con mielofibrosis secundaria, no se pudo demostrar significación estadística entre la presencia de mutaciones adicionales a JAK2 y el riesgo de transformación mielofibrótica. Aun así, cabe destacar que la incidencia de mutaciones era superior en los pacientes evolucionados respecto a los de fase crónica, acorde también a lo descrito en la literatura. / Myeloproliferative neoplasms (MPN) are clonal diseases originated from a hematopoietic stem cell characterized by proliferation of mature cells of one or more myeloid lineages and presenting a risk of progression to acute leukemia or bone marrow failure due to the appearance of myelofibrosis, during the evolution of the disease. In 2005, the JAK2V617F mutation was described in 95% of Polycythemia Vera (PV) and 60% of Essential Thrombocythemia (ET) and Primary Myelofibrosis (PMF) patients. Later, other molecular markers involved in cell signaling pathways (LNK, SOCS, CBL), epigenetic processes (TET2, ASXL1, IDH1, IDH2, EZH2) and in the splicing machinery of messenger RNA (SF3B1, SRSF2, U2AF1) were described. In general, these markers are found in MPN in low percentages and none of them is specific for these diseases. More recently, in late 2013, the presence of mutations in the CALR gene were reported in 49-84% of ET and 67-88% of PMF JAK2V617F negative, becoming the second most frequent molecular marker in MPN. Since its discovery, the JAK2V617F mutation has been a criterion for the diagnosis of classical MPN (PV, ET, PMF). Given its high frequency, mutations in CALR have already been proposed as a diagnostic criteria to be included in the next guide of the MPN WHO’s classification, while the diagnostic relevance of other markers is more limited. However, several studies have reported that the presence of additional alterations to JAK2 or CALR may have a role in the progression of ET and PV to MF or LAM. The main objective of this work was to identify whether the detection of a clonal hematopoiesis may have a role in the transformation of a MPN. The first two works were based on the study of a cohort of patients, mainly with JAK2V617F negative ET. Results showed that the presence of alterations in new molecular markers as TET2, ASXL1, IDH1/2 and c-CBL are infrequent in this group of patients. In addition, it was also observed that the detection of clonal hematopoiesis, by analyzing the X chromosome inactivation pattern (analyzing the HUMARA gene polymorphism), in JAK2V617F negative ET, is associated with an increased risk of myelofibrotic transformation. Moreover, although results were not statistically significant, a tendency to association between the presence of additional alterations to JAK2V617F and transformation of the disease was also observed. In the third study, a mutational study of multiple genes was performed in a cohort of patients with post-thrombocythemic myelofibrosis (post-ET MF) and post-polycythemic myelofibrosis (post-PV MF) and compared with that of patients with chronic phase MPN. Results showed that the presence of mutations in the spliceosome genes are uncommon in ET and PV in chronic phase, and that it exists a different mutational profile in the splicing machinery genes between PMF patients and post-ET MF or post-PV MF patients. Similarly, in the group of ET and PV patients who evolved to MF, statistical significance between the presence of additional mutations to JAK2 and the risk of myelofibrotic transformation could not be demonstrated. However, it was noted that the incidence of mutations in patients with secondary myelofibrosis was higher than in patients with ET or PV in chronic phase, accordingly to what has been previously described.

Prostate cancer (PC) is the most common neoplasia among males from developed countries and the second leading cause of death from cancer in these males. During the last years, serum prostate specific antigen (PSA) has been used as biomarker for PC diagnosis. Although PSA test has increased PC detection, it has a low specificity and leads to over-diagnosis and over-treatment; therefore, it is necessary to improve the current diagnostic methods for PC. In the past decade, urine has received more and more attention for its simplicity, as well as its potential use in identifying new biomarkers as non-invasive detection method. Deregulation of microRNAs (miRNAs) in serum/plasma or tissue has been associated with many diseases including PC, suggesting the possible use of miRNAs as diagnostic biomarkers also in other body fluids. The intent of my PhD research program was to evaluate if miRNAs known to be deregulated in blood or tissue for PC could also be detected in urine from cellular fraction, and characterize the function of the most promising of them. By analysing a large cohort of post-digital rectal exam (DRE) urine samples, we have validated a miRNA panel consisting of 3 urinary miRNAs (miR-648, miR-147b and miR-193a-5p) with a predictive value of area under the curve (AUC): 0,74 In addition, we have determined that miRNAs-miR-28 and miR-210 are under-expressed in PC urine and associated with PC development and progression, mainly affecting PC cell proliferation and migration. Overall, this work introduces novel candidate miRNAs that are aberrantly expressed in PC as diagnostic biomarkers, and perhaps aids in defining how miRNAs might one day serve as anti-cancer therapeutic agents.

ATR és una proteïna cinasa essencial per a la viabilitat cel·lular que participa en els mecanismes de resposta al dany en el DNA per tal de mantenir la integritat del genoma. Aquesta proteïna es activada en resposta a regions de cadena simple del DNA (ssDNA) generades per la resecció dels trencaments de doble cadena (DSBs) i controla la progressió de les forques de replicació durant la fase S del cicle cel·lular. Durant la meiosi, un tipus de divisió cel·lular especialitzada per la qual les cèl·lules es divideixen per formar gàmetes haploides, es generen deliberadament una sèrie de DSBs en el genoma. La reparació d’aquests DSBs condueix a l’aparellament, sinapsi i recombinació dels cromosomes homòlegs creant connexions entre ells per tal de promoure la correcta segregació dels cromosomes durant la primera divisió meiòtica i evitar la formació de gàmetes aneuploides. Aquests processos son crucials per a la viabilitat de les cèl·lules meiòtiques, i per tant es troben altament regulats mitjançant diferents mecanismes que inclouen les vies de senyalització de les proteïnes d’ATM i ATR. Estudis citològics suggereixen que ATR està implicada en la reparació meiòtica, ja que s’ha demostrat que es troba als DSBs juntament amb altres proteïnes de resposta al dany el DNA, i que a més, participa en els processos meiòtics de silenciament transcripcional de les regions asinapsades del genoma. En aquest estudi s’ha emprat un model murí del Síndrome de Seckel humà, així com, tècniques de cultiu de teixit testicular per tal d’estudiar la funció d’ATR durant la meiosi de mamífers i la gametogènesi. Els nostres resultats posen de manifest que ATR és necessària per reparar els DSBs meiòtics mitjançant recombinació homòloga, i per tal de que es generin un nombre adequat de DSB als eixos cromosòmics que resten asinapsats al llarg de la profase. Errors en aquests processos afecten particularment als cromosomes sexuals provocant alteracions en la sinapsi. A més, la reducció del nivells d’ATR en els ovaris afecta al correcte desenvolupament de les cèl·lules fol·liculars donant lloc a defectes durant la fol·liculogènesi. / ATR kinase is one of the main players of the DNA damage response (DDR) machinery involved in maintaining genome integrity. ATR is mainly activated in response to ssDNA structures present at resected double strand breaks (DSBs) and in aberrant replicative structures. During meiosis, the specialized cell division that generates haploid gametes, hundreds of programmed DSBs are introduced in the genome. DSB repair promotes pairing, synapsis and recombination of homologous chromosomes creating connections between them to promote proper chromosome segregation, thus avoiding the formation of defective gametes. The correct execution of these processes is essential for meiocytes viability and is carefully controlled by different signaling mechanisms involving ATM and ATR proteins. Some studies have reported that ATR associates with meiotic chromosome axes. ATR colocalizes with other DDR proteins on meiotic recombination nodules and accumulates on unsynapsed chromosomes participating in meiotic transcriptional silencing of those regions. These evidences underline ATR involvement in DSB repair and mediating checkpoint responses. Here we used mouse model of human ATR-Seckel syndrome and a novel testis organ culture in order to investigate the role of ATR during mammalian meiosis and gametogenesis. Our findings showed that down-regulation of ATR function during meiotic prophase results in defective meiotic homologous recombination and reduced local DSB accumulation on unsynapsed axes as prophase progresses. Both alterations particularly concern XY pair leading to inaccurate sex chromosomes synapsis. Moreover, deficient ATR levels impair folliculogenesis progression compromising proper follicular development.

La tesi que es presenta per optar al grau de doctor en biologia titulada: “Anàlisi de l’expressió del receptor scavenger CD36 en els leucòcits: conseqüències funcionals en la inflamació” ha estat acceptada per ser presentada per compendi de publicacions. Aquesta consta de dos articles: • Functional consequences of CD36 downregulation by TLR signals. Carlos Zamora et al. Cytokine 2012 Oct; 60(1): 257-65. • Functional consequences of platelet binding to T lymphocytes in inflammation. Carlos Zamora et al. Journal of Leukocyte Biology 2013 Sep; 94(3): 521-9. La inflamació és un conjunt de processos biològics que tenen com a finalitat comú protegir a l’organisme dels patògens i dany. Durant el procés inflamatori, intervenen diferents components cel·lulars a través de diferents receptors de membrana i citoquines proinflamatòries i antiinflamatòries. Un dels receptors involucrats en aquest procés inflamatori és el receptor scavenger CD36. En els monòcits, el CD36 és una molècula capaç de reconèixer i captar lipoproteïnes modificades, patògens, neutròfils apoptòtics i actuar com a coreceptor dels Toll-like receptors (TLRs) perquè es doni una eficient resposta inflamatòria. Fins al moment es desconeixia si els TLRs modulaven el CD36 en els monòcits i les conseqüències funcionals comportarà aquesta modulació. Per altra banda, es desconeixia si l’expressió de CD36 en limfòcits era extrínseca a ells i quines funcions podria tenir la subpoblació de limfòcits T que l’expressen. En el primer article, vam observar que els lligands de TLR2 i TLR4 disminuïen l’expressió de CD36 en la superfície de les diferents subpoblacions de monòcits, internalitzant-se cap al interior d’aquests. Aquesta, era parcialment deguda al TNFα produït en els cultius de TLRs. La reducció de l’expressió de CD36 en els monòcits va donar lloc a una disminució de la fagocitosis de neutròfils apoptòtics, un procés clau en el manteniment de l’homeòstasi en els teixits. En el segon article, vam observar que l’expressió de CD36 en una petita subpoblació de limfòcits T CD4+ era extrínseca a ells, provenint de les plaquetes unides a ells que presentaven. Aquesta subpoblació de limfòcits T CD4+ amb plaquetes unides presentava una disminució de la capacitat proliferativa i de producció de citoquines inflamatòries (IL-17 i IFNγ). En els pacients d’artritis reumatoide, s’observa un grup de pacients amb un augment de limfòcits T CD4+ amb plaquetes unides. Aquet grup de pacients van ser els que van presentar un fenotip menys sever de la malaltia, suggerint així que la unió de plaquetes als limfòcits era un mecanisme immunoregulador. / Thesis presented to obtain the degree of Biology PhD entitled: “Analysis of scavenger receptor CD36 in leukocytes: functional consequences in inflammation” has been accepted to be presented to collection of published articles. This thesis contain two articles: • Functional consequences of CD36 downregulation by TLR signals. Carlos Zamora et al. Cytokine 2012 Oct; 60(1): 257-65. • Functional consequences of platelet binding to T lymphocytes in inflammation. Carlos Zamora et al. Journal of Leukocyte Biology 2013 Sep; 94(3): 521-9. Inflammation is a set of biological processes that aim to protect from the harmful effects of pathogens and cellular damage. During inflammatory process, different cells are involved, such as monocytes and lymphocytes, through different membrane receptors and pro- and antiinflammatory cytokines. One of the receptors involved in this inflammatory process is scavenger receptor CD36. In monocytes, CD36 molecule is able to recognize and capture modified lipoproteins, pathogens, apoptotic neutrophils, and act as a coreceptor of Toll-like receptors (TLRs) to give an efficient inflammatory response. Until now, it was not known whether TLRs modulate CD36 on monocytes and functional consequences that involve modulation in these cells. Moreover, it was not known whether the expression of CD36 on lymphocytes was extrinsic to them and how this T lymphocyte CD36+ subpopulation functions. In the first article, we observed that TLR2 and TLR4 ligands decreased the expression of CD36 on the surface of different subpopulations of monocytes, internalizing towards the inside of them. This was partially due to the TNFα production after TLRs cultures. Reduced expression of CD36 on monocytes resulted in a decrease of phagocytosis of apoptotic neutrophils, a key process in the maintenance of tissue homeostasis. In the second article, we observed that CD36 expression in a small subpopulation of CD4+ T lymphocytes was extrinsic to them, deriving from platelet bind to them. This subpopulation of CD4+ T cells with bound platelets showed a decreased proliferate capacity and inflammatory cytokine production (IL-17 and IFNγ). In rheumatoid arthritis patients, we observed a group with increased CD4+ T cells with bound platelets. This group of patients was those who had a less severe phenotype of the disease, suggesting that the binding of platelets to lymphocytes was an immunoregulador mechanism.

Resums pendents

No description available.

Per tal de poder entendre la dinàmica evolutiva dels genomes de mamífers és necessari estudiar l’estructura dels cromosomes i quins han estat els canvis que s’han donat tant a gran escala (en forma de reorganitzacions cromosòmiques) com a petita escala (en forma de mutacions d’un sol nucleòtid). Les reorganitzacions cromosòmiques han jugat un paper crucial en el procés evolutiu ja que els canvis a què han donat lloc (inversions, translocacions, fusions o fissions) han provocat canvis genòmics amb conseqüències per a la diferenciació de les espècies. Dins dels mamífers, a més, els rosegadors són el grup que presenta més diversitat d’espècies amb un ampli espectre de cariotips. En aquesta tesi, hem estudiat les reorganitzacions cromosòmiques al llarg de l’evolució dels rosegadors així com els factors que han condicionat la distribució genòmica de les reorganitzacions. Gràcies a la creixent disponibilitat de genomes seqüenciats, hem pogut comparar els genomes de sis espècies de rosegadors (incloent com a referència el del ratolí) i de sis outgrups corresponents a diferents taxons de mamífers (Primats, Carnivora, Artiodactyla i Perissodactyla). Hem identificat les regions d’homologia (o Homologous Synteny Blocks; HSBs) i les regions de disrupció de l’homologia (o Evolutionary Breakpoint Regions; EBRs) que s’han donat al llarg de l’evolució dels rosegadors. La localització de les EBRs ens ha permès, estudiar les característiques genòmiques de les regions d’inestabilitat que han donat lloc a les reorganitzacions cromosòmiques en el genoma de ratolí i que s’han donat al llarg de l’evolució dels rosegadors. Els nostres resultats mostren que les EBRs presenten una distribució no-homogènea i es caracteritzen per presentar un alt contingut gènic, taxes de recombinació meiòtica més baixes i una proporció més baixa de lamina associated domains (cLADs), comparant amb la resta del genoma de ratolí. D’altra banda, està descrita la tendència de poblacions naturals de ratolí domèstic occidental (Mus musculus domesticus) a presentar una gran diversitat de nombres diploides a causa de l’aparició de fusions Robertsonianes (Rb). De totes les poblacions estudiades fins al moment, n’hi ha una, localitzada a les províncies de Barcelona, Lleida i Girona, que presenta una estructura diferent a la resta ja que no existeix en ella una raça metacèntrica i les fusions Rb detectades es troben en un estat de polimorfisme: aquesta zona es coneix amb el nom de sistema Robertsonià de Barcelona. En segon lloc, donades les característiques úniques d’aquest sistema Robertsonià hem analitzat: (i) el paper que podien jugar els telòmers en l’aparició de les fusions Rb i (ii) l’efecte d’aquestes fusions i del gen Prdm9 sobre la recombinació meiòtica. En el nostre treball hem detectat que l’escurçament telomèric dels braços p dels cromosomes acrocèntrics podria ser un dels factors que explicarien l’aparició de les fusions Rb ja que afavoririen la seva interacció i la posterior fusió. Em vist que la presència de les fusions Rb provoca una baixada en la taxa de recombinació que es deu a una redistribució dels crossovers (o punts de recombinació homòloga) cap al telòmers en els cromosomes fusionats. Aquest fenomen es deu a un efecte d’interferència del centròmer que suprimeix la recombinació a la zona pericentromèrica. També hem analitzat la distribució allèlica del gen Prdm9 en el sistema Robertsonià de Barcelona, així com un possible efecte de la seqüència d’aquest gen sobre la taxa de recombinació. Donats els nostres resultats, proposem que l’efecte de supressió de la recombinació en els individus amb fusions Rb és a causa d’un factor mecànic (com es l’efecte d’interferència centromèrica) i d’un factor genètic (com es la seqüència al·lèlica de Prdm9). Aquests resultats aporten una informació esencial per entendre la dinàmica dels processos d’especiació cromosòmica en poblacions naturals. / In order to understand the evolutionary dynamics of mammalian genomes, is necessary to analyze chromosome configuration as well as the genomic changes that have occurred at a large-scale (in the form of chromosomal rearrangements) and at a micro-scale (in the form of nucleotide changes) within species. Chromosomal rearrangements (i.e., inversions, translocations, fusions or fissions) have played a crucial role during evolution as they have led to genomic changes with consequences for the species differentiation. Within mammals, rodents represent the most specious taxon with a wide spectrum of karyotypes. In this thesis, we have first analyzed the chromosomal reorganizations along rodents evolution together with the factors that have been involved in the distribution of chromosomal rearrangements. Taking advantage of the increasing number of available whole-genomes sequenced, we have compared the genomes of six rodent species (including the mouse genome as a reference) and six outgroup species corresponding to different mammalian taxa (Primates, Artiodactyla, Carnivora and Perissodactyla). We have identified genomic regions of homology (or homologous synteny blocks, HSBs) and the regions of synteny disruption (or Evolutionary Breakpoint regions, EBRs) among rodents. Moreover, the localization of EBRs has permitted us to analyze the genomic features that could be involved in the origin of chromosomal rearrangements. Our results showed that EBRs present a non-homogeneus distribution across the mouse genome. Additionally, EBRs are characterized by specific genomic features such as higher gene content, lower recombination rates and low proportion of lamina associated domains (cLADs) compared with the rest of the mouse genome. Secondly, it is known that the western house mouse (Mus musculus domesticus) natural populations present a wide variety of diploid numbers due to the presence of Robertsonian (Rb) fusions. Within all these populations analyzed, one of them, localized in the Barcelona, Lleida and Girona provinces, presents a specific structure, where no metacentric race has been described, being the Rb fusions found in a polymorphic state. This chromosomal polymorphism zone is known as The Barcelona Rb system. Giving the specific characteristics of this population, we have: (i) analyzed the role of telomeres in the occurrence of the Rb fusions and (ii) studied the effect of the Rb fusions and Prdm9 gene on meiotic recombination. We have detected that telomere shortening in acrocentric p-arms can be one of the factors that could explain the occurrence of Rb fusions by promoting the interaction between chromosomal ends and thus, to the fusion events. Moreover, we have observed that the presence of Rb fusions leads to a decrease in recombination rates due to a re-distribution of crossovers towards the telomeres in metacentric chromosomes. Furthermore, we have detected that this phenomenon is due to an interference effect of the centromere in metacentric chromosomes, which acts suppressing recombination within the pericentromeric regions. Additionally, we have also characterized the Prdm9 allelic distribution within the Barcelona Rb polymorphism system, as well as an effect of the Prdm9 sequence on recombination rates. Therefore, and in the light of our results, we propose that the effect of suppression of recombination on individuals with Rb fusions is due to a mechanicstic (by the centromeric interference effect) and genetic (the Prdm9 allelic sequence) factors. These results, together with the characterization of the genomic features that have been involved in the occurrence of evolutionary chromosomal rearrangements in rodents, would help us to understand the dynamics of chromosomal speciation along evolution and how chromosomal rearrangements occur in natural populations.

El neuroblastoma (NBL) es el tumor sólido más común en la infancia y representa un 10% de todas las muertes pediátricas por cáncer. Existen varios factores de riesgo que predicen el alcance de la enfermedad, tales como la edad en el momento del diagnóstico, el estadio, alteraciones cromosómicas y la amplificación del oncogén MYCN, que caracteriza el grupo de NBLs más agresivos con una probabilidad de supervivencia inferior al 30%. En general, los tumores MYCN amplificados desarrollan resistencia a todas las modalidades de tratamiento y muestran una alta capacidad metastática. Estas propiedades han sido atribuidas a alteraciones en la maquinaria apoptótica, ya sea por silenciamiento de componentes de la vía extrínseca (como caspasa-­‐8) o por sobreexpresión de reguladores anti-­‐apoptóticos (como BCL-­‐2, MCL-­‐1 o c-­‐ FLIP). Hasta hoy se sabe muy poco de la implicación de los receptores de muerte y sus antagonistas en NBL. En esta tesis se analizaron los niveles de expresión de varios antagonistas de receptores de muerte en múltiples bases de datos de NBL humano. Nuestro trabajo muestra que la expresión de Lifeguard (LFG/FAIM2/NMP35) se ve disminuida en los tumores más agresivos y que bajos niveles de LFG correlacionan con una peor supervivencia del paciente. Curiosamente, aunque LFG fue inicialmente caracterizada como una proteína anti-­‐ apoptótica, nosotros describimos una nueva asociación de esta proteína con la diferenciación del NBL. Asimismo, la represión de LFG resultó en una reducción de la adhesión celular, una mayor habilidad de formar de esferas y un aumento en la capacidad de migración de las células, confiriéndoles una mayor capacidad metastática que pudo ser confirmada en experimentos in vivo. Además, descubrimos que la expresión de LFG estaba directamente reprimida por MYCN a nivel transcripcional. Por tanto, nuestros datos respaldan una nueva función para una diana de MYCN antes desconocida y proporcionan una nueva conexión entre la sobreexpresión de MYCN y la mayor capacidad metastática del NBL. / Neuroblastoma (NBL) is the most common solid tumor in infants and accounts for 10% of all pediatric cancer deaths. Several risk factors predict NBL outcome, such as age at time of diagnosis, stage, chromosome alterations, and amplification of the oncogene MYCN, which characterizes the subset of the most aggressive neuroblastomas with an overall survival below 30%. MYCN-­‐amplified tumors develop resistance against all treatment modalities and show a high metastatic capacity. These properties have been linked to alterations in the apoptotic machinery, either by silencing components of the extrinsic apoptotic pathway (e.g. caspase-­‐8) or by overexpression of anti-­‐apoptotic regulators (e.g. BCL-­‐2, MCL-­‐1 or c-­‐FLIP). Very little is known on the implication of death receptors and their antagonists in NBL. In this thesis, the expression levels of several death receptor antagonists were analyzed in multiple human NBL data sets. We report that Lifeguard (LFG/FAIM2/NMP35) is downregulated in the most aggressive tumors and that low LFG levels correlate with poor patient survival. Intriguingly, although LFG has been initially characterized as an anti-­‐apoptotic protein, we have found a new association with NBL differentiation. Moreover, LFG repression resulted in reduced cell adhesion, increased sphere growth and enhanced migration, thus conferring a higher metastatic capacity to NBL cells that was confirmed in vivo. Furthermore, LFG expression was found to be directly repressed by MYCN at the transcriptional level. Our data, which support a new functional role for a hitherto undiscovered MYCN target, provide a new link between MYCN overexpression and increased NBL metastatic properties.