Ionisierende Strahlung (IR) ist in der medizinischen Diagnostik und in der Tumortherapie von zentraler Bedeutung, kann aber Genominstabilität und Krebs auslösen. Strahleninduzierte Genominstabilität (RIGI) ist in den klonalen Nachkommen bestrahlter Zellen zu beobachten, die zugrundeliegenden Mechanismen sind jedoch noch unverstanden. Zur Erforschung von verzögerten Strahleneffekten wurden primäre embryonale Fibroblastenkulturen mit 2 Gray bestrahlt und für 20 Populationsverdopplungen klonal expandiert. Zellen, die keiner Strahlung ausgesetzt waren, dienten als Kontrolle für normale Alterungsprozesse. Die Klone wurden durch klassische Chromosomenbänderungstechniken analysiert und in Abhängigkeit der Stabilität ihres Genoms in Gruppen eingeteilt. Ein Klon wurde als stabil gewertet, wenn die analysierten Metaphasen keinerlei Auffälligkeiten zeigten, während instabile Klone ein Mosaik aus normalen und abnormalen Metaphasen waren. Die Zellen von zwei Spendern wurden untersucht, um interindividuelle Strahleneffekte zu beurteilen. Nach Bestrahlung hatten mehr als die Hälfte der Klone Metaphasen mit strukturellen Aberrationen und wurden dementsprechend als instabil eingestuft. Drei Klone zeigten zudem numerische Aberrationen, die ausschließlich das Y Chromosom betrafen. Fluoreszenz in situ Hybridisierungen verifizierten diese Beobachtung in weiteren Klonen und deuteten an, dass der Verlust des Y Chromosoms mit RIGI assoziiert ist. Molekulare Karyotypisierungen mit SNP Arrays ergaben, dass IR in den Klonen Veränderungen der Kopienzahl auslöst. Ein Unterschied zwischen chromosomal stabilen und instabilen Klonen konnte jedoch nicht detektiert werden. Chromosomale Regionen, in denen sich bekanntermaßen fragile Stellen befinden, zeigten eine Anhäufung von CNVs. Ein RIGI Effekt konnte für die fragile Stelle 3B, in der sich das Gen FHIT befindet, identifiziert werden. Exom Sequenzierungen von Klonen und der entsprechenden Massenkultur zeigten eine alterungsassoziierte Entstehung von Varianten. Der Effekt wurde durch die Einwirkung von Strahlung erhöht. Auf Ebene von einzelnen Nukleotiden konnten ebenfalls Anhäufungen von Schäden in bestimmten genomischen Bereichen detektiert werden, dieser Effekt ging ohne die typischen RIGI Endpunkte einher. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass strahlenbedingte Veränderungen auf verschiedenen Ebenen (Chromosomen, Genkopienzahl und einzelnen Nukleotiden) beobachtet werden können, welche, unabhängig von RIGI, die Tumorentstehung begünstigen. Speziell Veränderungen im FRA3B Lokus und der Verlust des Y Chromosoms scheinen jedoch über die Destabilisierung des Genoms zur Krebsentstehung beizutragen. / Ionizing radiation is important in medical diagnosis and cancer treatment but can lead to genomic instability and secondary malignancies as a late effect. Radiation induced genomic instability (RIGI) can be observed in the progeny of irradiated cells but the underlying cellular processes remain to be elucidated. To study delayed genetic radiation effects, single cell fibroblast clones from two different male donors were established after a single X ray dose of 2 Gray. Non irradiated cells were used as controls to account for aging related effects. Clones were characterized using chromosome banding analysis. Stable clones were endowed with no karyotype abnormalities in all analysed metaphases after 20 Population doublings, whereas unstable clones showed both normal and abnormal metaphases. Two fibroblast strains were used to detect differences in radiation sensitivity. More than half of the irradiated clones were chromosomally abnormal and thus classified as unstable. Both banding analysis and fluorescence in situ hybridization revealed an increased rate of Y chromosome loss in irradiated clones which might be associated with RIGI. Using SNP Arrays, an increased rate of de novo copy number variations (CNVs) was detected in the progeny of irradiated cells when compared to non irradiated controls. However, a significant difference between chromosomally stable and unstable clones was not found. CNVs clustered in chromosomal regions that are associated with known fragile sites. The fragile site 3B, which encompasses the gene FHIT, was found to be affected by CNVs in unstable clones suggesting a RIGI related effect. Exome sequencing of clones and the respective primary cultures revealed an increased rate of variants during in vitro aging. This effect was further increased by radiation exposure. Analysis of single nucleotides showed a RIGI independent accumulation of damage in specific regions. The results of the present study show that radiation induced changes can manifest as chromosomal abnormalities, copy number variations and DNA sequence mutations promoting tumorigenesis independent from RIGI. However, changes in FRA3B and loss of Y chromosome might trigger cancer through destabilizing the genome.

In the last decade, mobile device ownership has largely increased. In particular, smartphone ownership is constantly rising (A. Smith, 2015; Statista, 2016a), and there is a real hype for luxury brand smartphones (Griffin, 2015). These observations raise the question of which functions smartphones serve in addition to their original purposes of making and receiving calls, searching for information, and organizing. Beyond these obvious functions, studies suggest that smartphones express fashion, lifestyle, and one’s economic status (e.g., Bødker et al., 2009; Statista, 2016b; Vanden Abeele, Antheunis, & Schouten, 2014). Specifically, individuals seem to purchase and use conspicuous luxury brand smartphones to display and enhance status (D. Kim et al., 2014; Müller-Lietzkow et al., 2014; Suki, 2013). But how does owning a conspicuous, high-status smartphone contribute to status, and which benefits may these status boosts provide to their owners? From an evolutionary perspective, status carries a lot of advantages, particularly for males; high status grants them priority access to resources and correlates with their mating success (van Vugt & Tybur, 2016). In this sense, research suggests that men conspicuously display their cell phones to attract mates and to distinguish themselves from rivals (Lycett & Dunbar, 2000). In a similar vein, evolutionarily informed studies on conspicuous consumption indicate that the purchase and display of conspicuous luxuries (including mobile phones and smartphones) relate to a man’s interest in uncommitted sexual relationships and enhance his desirability as a short-term mate (Hennighausen & Schwab, 2014; Saad, 2013; Sundie et al., 2011). Drawing on these findings, this doctoral dissertation investigated how a man is perceived given that he is an owner of a high-status (vs. nonconspicuous, low-status) smartphone as a romantic partner and male rival. This was done in three experiments. In addition, it was examined how male conspicuous consumption of smartphones interacted with further traits that signal a man’s mate quality, namely facial attractiveness (Studies 1 and 2) and social dominance (Study 3). Study 1 revealed that men and women perceived a male owner of a conspicuous smartphone as a less desirable long-term mate and as more inclined toward short-term mating. Study 2 replicated these results and showed that men and women assigned traits that are associated with short-term mating (e.g., low loyalty, interest in flirts, availability of tangible resources) to a male owner of a conspicuous smartphone and perceived him as a stronger male rival and mate poacher, and less as a friend. The results of Study 2 further suggested that specifically more attractive men might benefit from owning a conspicuous smartphone in a short-term mating context and might be hence considered as stronger male rivals. Study 3 partially replicated the findings of Studies 1 and 2 pertaining to the effects of owning a conspicuous smartphone. Study 3 did not show different effects of conspicuous consumption of smartphones on perceptions of a man dependent on the level of his social dominance. To conclude, the findings of this doctoral dissertation suggest that owning a conspicuous, high-status smartphone might not only serve proximate functions (e.g., making and receiving calls, organization) but also ultimate functions, which relate to mating and reproduction. The results indicate that owning a conspicuous smartphone might yield benefits for men in a short-term rather than in a long-term mating context. Furthermore, more attractive men appear to benefit more from owning a conspicuous smartphone than less attractive men. These findings provide further insights into the motivations that underlie men’s purchases and displays of conspicuous, high-status smartphones from luxury brands that reach beyond the proximate causes frequently described in media and consumer psychological research. By applying an evolutionary perspective, this doctoral dissertation demonstrates the power and utility of this research paradigm for media psychological research and shows how combining a proximate and ultimate perspective adds to a more profound understanding of smartphone phenomena. / In den letzten 10 Jahren ist die Zahl der Personen, die ein Mobilgerät besitzen, stark angestiegen. Insbesondere nimmt die Anzahl der Smartphone-Besitzer stetig zu (A. Smith, 2015; Statista, 2016a). Es ist nahezu ein regelrechter „Smartphone-Hype“ zu beobachten, der sich vor allem um bestimmte Geräte von Luxus-Marken dreht (Griffin, 2015). Diese Beobachtungen lassen die Frage aufkommen, welche Funktionen Smartphones haben, die über ihre eigentlichen Funktionen, wie z.B. Anrufe empfangen und tätigen, Informationssuche und Organisation hinausgehen. Studien zeigen, dass Smartphones zusätzlich zu diesen naheliegenden Funktionen auch Ausdruck von Mode, Lifestyle und Status sein können (z.B. Bødker et al., 2009; Statista, 2016b; Vanden Abeele et al., 2014). Dies scheint besonders auf auffällige Smartphones von Luxus-Marken zu zutreffen: Personen kaufen und nutzen diese Geräte, um ihren sozialen Status zu zeigen und zu steigern (D. Kim et al., 2014; Müller-Lietzkow et al., 2014; Suki, 2013). Wie jedoch kann der Besitz eines auffälligen, statusträchtigen Smartphones den eigenen Status erhöhen und welche Vorteile bringt dies mit sich? Aus einer evolutionären Perspektive hat Status viele Vorteile, vor allem für Männer. Ein hoher Status gewährt exklusiven Zugang zu Ressourcen und korreliert mit männlichem Paarungserfolg (van Vugt & Tybur, 2016). So zeigen Studien, dass Männer ihre Mobiltelefone auffallend häufig zeigen, um damit ihren finanziellen und sozialen Status zu demonstrieren, mit dem Ziel potenzielle Partnerinnen auf sich aufmerksam zu machen und sich von Konkurrenten abzuheben (Lycett & Dunbar, 2000). Ähnliches legen auch Studien aus dem Bereich der evolutionären Konsumenten-psychologie nahe: Der Kauf und die Zurschaustellung von auffälligen Luxus-Produkten (inkl. Handys und Smartphones) scheint mit dem Interesse eines Mannes an einer kurzfristigen sexuellen Beziehung in Zusammenhang zu stehen und seinen Partnerwert insbesondere in diesem Kontext zu steigern (Hennighausen & Schwab, 2014; Saad, 2013; Sundie et al., 2011). Aufbauend auf diesen Befunden untersuchte die vorliegende Dissertation in drei experimentellen Studien, wie Männer und Frauen einen Mann, der als Besitzer eines ein auffälligen, statusträchtigen (vs. unauffälligen, wenig mit Status assoziierten) Smartphones präsentiert wurde, als potenziellen Partner und gleichgeschlechtlichen Konkurrenten wahrnahmen. Darüber hinaus wurde untersucht, wie männlicher Geltungskonsum von Smartphones mit zwei weiteren Faktoren, die den Partnerwert eines Mannes signalisieren, interagiert. Dazu wurden zusätzlich die Gesichtsattraktivität (Studie 1 und 2) sowie die soziale Dominanz (Studie 3) des Smartphone-Besitzers manipuliert. Studie 1 zeigte, dass Männer und Frauen den Besitzer eines auffälligen, statusträchtigen Smartphones als einen schlechteren Partner für eine feste Beziehung einschätzten und ihn als interessierter an unverbindlichen sexuellen Beziehungen wahrnahmen im Vergleich zu einem Mann, der als Besitzer eines unauffälligeren, nur wenig mit Status assoziierten Smartphones gezeigt wurde. Studie 2 replizierte diese Befunde und zeigte zudem, dass Männer und Frauen dem Besitzer eines auffälligen Smartphones eher Eigenschaften zuschrieben, die mit einer Kurzzeitpartnerschaft assoziiert sind (z.B. geringe Treue, erhöhte Flirtbereitschaft, schnelle Verfügbarkeit von Ressourcen). Darüber hinaus wurde der Besitzer eines auffälligen Smartphones als ein stärkerer Rivale, als eine größere Bedrohung für eine bestehende Beziehung sowie als ein schlechterer Freund wahrgenommen. Diese Effekte zeigten sich insbesondere dann, wenn der Besitzer des auffälligen Smartphones auch attraktiv war. In Studie 3 konnten die Effekte, die der Besitz eines auffälligen Smartphones auf die Einschätzung eines Mannes als romantischen Partner und gleichgeschlechtlichen Konkurrenten hat, zum Teil repliziert werden. In Studie 3 traten diese Effekte jedoch unabhängig von der sozialen Dominanz des Mannes auf. Insgesamt lassen die Ergebnisse dieser Dissertation vermuten, dass der Besitz eines auffälligen, statusträchtigen Smartphones einer Luxusmarke nicht nur proximate Funktionen (wie z.B. Anrufe empfangen und tätigen, Organisation), sondern auch ultimate Funktionen erfüllen könnte, die sich auf Paarung und Fortpflanzung erstreckt. Die Ergebnisse deuten an, dass Männer vom Besitz eines auffälligen, statusträchtigen Smartphones einer Luxusmarke eher im Kontext einer kurzen, unverbindlichen Beziehung als im Kontext einer festen Partnerschaft profitieren könnten. Darüber hinaus scheinen v.a. attraktivere Männer vom Besitz eines auffälligen Smartphones zu profitieren. Diese Befunde tragen zu einem besseren Verständnis bei, weshalb Männer auffällige, status-trächtige Smartphones von Luxusmarken kaufen und diese zur Schau stellen. Dabei gehen die in dieser Dissertation erlangten Befunde über bisherige Erkenntnisse der Medien- und Konsumentenpsychologie hinaus, welche vorranging proximate Ursachen für den Kauf und die Nutzung von Smartphones diskutiert haben. Durch die Anwendung einer evolutionären Perspektive veranschaulicht die vorliegende Arbeit die Leistung und den Nutzens dieses Forschungsparadigmas für medienpsychologische Forschung und zeigt auf, wie die Synthese einer proximaten und ultimaten Perspektive zu einem umfassenderen Verständnis des Phänomens Smartphone führt.

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En nuestro laboratorio el estudio de cromosomas en presencia de una elevada concentración de iones divalentes, permitió describir por primera vez las placas de cromatina como unidad estructural básica del cromosoma metafásico compacto. En el periodo experimental de esta tesis (5 años), se han investigado extensamente estas estructuras. El estudio exhaustivo mediante TEM de placas obtenidas utilizando diferentes métodos de preparación y los diferentes controles realizados, indican que las placas no son un artefacto preparativo de esta técnica. La microscopía de fuerza atómica (AFM) ha permitido visualizar e investigar las propiedades mecánicas de las placas en solución acuosa. Las placas son finas (∼6.5 nm; determinado mediante TEM y AFM) pero resistentes a la penetración por la punta de AFM: Su módulo de Young es de ∼0.2 GPa y el estrés requerido para penetrar la superficie es de ∼0.3 GPa (Mg2+ 5-20 mM). El estudio de la desnaturalización en tiempo real (mediante AFM) y las medidas de fricción a nanoescala (Nanontribología) han permitido estudiar las propiedades estructurales de las placas en medio acuoso a temperatura ambiente. Los resultados indican que las elevadas concentraciones de NaCl y EDTA, y la digestión extensa con proteasas y nucleasa micrococal causan la desnaturalización de las placas. Los resultados nanotribológicos indican que las placas en condiciones estructurantes (Mg2+ 5 mM) tienen un coeficiente de fricción relativamente elevado (μ∼0.3), el cual es marcadamente reducido cuando se añaden elevadas concentraciones de NaCl o EDTA (μ∼0.1). La digestión con protasas incrementa el coeficiente de fricción (μ∼0.5), pero la fricción más elevada se observa cuando el DNA se rompe por acción de la nucleasa micrococal (μ∼0.9), indicando que el DNA es el componente estructural principal de las placas. Estos resultados indican que los cromosomas nativos están formados por el apilamiento de placas, que están compuestas por una red bidimensional flexible y mecánicamente resistente de DNA y proteínas. / In our laboratory the study of the chromosomes in the presence of high concentrations of divalent ions, has led us to report the chromatin plate-like structure for the first time as a fundamental element of the metaphase chromosome. In the experimental part of this Ph.D. Thesis (5 years), it has been analysed extensively this plate-like structures. The exhaustive TEM study of this planar structures obtained with different preparation procedures and the different performed controls, suggest that the plates are not an artifact of the sample preparation of this technique. The atomic force microscopy (AFM) has led us to image and investigate the mechanical properties of the plates in aqueous solution. The plates are thin (∼6.5 nm; determined by TEM and AFM) but compact and resistant to the penetration by the AFM tip: Their Young's modulus is ∼0.2 GPa and the stress required for surface penetration is ∼0.3 GPa (5-20 mM Mg2+. It has been applied a real time denaturation study (with AFM) and friction force measurements at the nanoscale (Nanotribology) to analyse the structural properties of the plates in aqueous solution at room temperature. The results show that at high concentrations of NaCl and EDTA, and extensive digestion with protease and nuclease enzymes cause plate denaturation. Nanotribology studies show that native plates under structuring conditions (5 mM Mg2+ have a relatively high friction coefficient (μ∼0.3), which is markedly reduced when high concentrations of NaCl or EDTA are added (μ∼0.1). Protease digestion increases the friction coefficient (μ∼0.5), but the highest friction is observed when DNA is cleaved by micrococcal nuclease (μ∼0.9), indicating that DNA is the main structural element of plates. This results suggest that the native chromosomes are formed by staked plates, that are composed by a flexible and mechanically resistant two-dimensional network of DNA and proteins.

La producción in vitro (PIV) de embriones caprinos mediante técnicas de maduración, fecundación y cultivo embrionario in vitro (MIV-FIV-CIV) proporciona un elevado número de embriones utilizables a nivel científico y/o comercial. El objetivo del este estudio ha sido seleccionar ovocitos de cabra prepuber y sistemas de maduración in vitro para mejorar la producción in vitro de embriones. Los ovocitos se maduraron en medio TCM199 + piruvato sódico + L-glutamina + gentamicina + 10% suero bovino de macho castrado (SS) + 10 mg/ml LH + 10 mg/ml o-FSH + 1 mg/ml 17b-estradiol. Tras 27 h de MIV, los ovocitos se inseminaron con semen fresco (3.5x106 espermatozoides/ml) en medio TALP suplementado con 1 mg/ml de hipotaurina. A las 24 h post-inseminación, se cultivaron en medio SOFm y se mantuvieron 7 días en cultivo. En el Estudio 1, se evaluó la utilidad del test de Azul de Cresol Brillante (BCB) para seleccionar los ovocitos de cabras prepúberes. Los ovocitos BCB+ (ovocitos con citoplasma coloreado de azul, crecimiento finalizado) presentaron un mayor diámetro (136.6 ¡À 6.3 mm; P<0.001) y mayores tasas de maduración nuclear (81.4%; P<0.05), fecundación normal (23.5%; P<0.0001) y desarrollo más allá del estadio de 8 células (41.3%; P<0.001) y de mórulas más blastocistos (12.0%; P<0.05) que los ovocitos no coloreados de azul.En el Estudio 2, se utilizó el Factor de Crecimiento Epid¨¦rmico (EGF), para la maduración in vitro. Para ello, se comparó un medio suplementado con hormonas (LH, FSH y 17b-estradiol) y suero (SS o FCS) con un medio suplementado con 10 ng de EGF en ausencia de suero y hormonas. El porcentaje de ovocitos fecundados de forma normal fue inferior (P<0.05) cuando se empleó EGF (17.3%) que SS (SS: 27.2%; FCS: 29.0%). Las tasas de embriones totales (71.5%) y de embriones que superaron el estadio de 8 células (26.2%) fueron superiores (P<0.05) al emplear SS y hormonas en el medio de maduración.En el Estudio 3, se analizó el efecto de la adición de compuestos tiol (100 ¦ÌM de cisteamina, 100 ¦ÌM de b-mercaptoetanol, 0.57 mM de cisteína y 0.57 mM de cistina) al medio de MIV. Los ovocitos madurados en presencia de cisteamina y b-mercaptoetanol mostraron mayor capacidad (P<0.01) para formar el pronúcleo masculino tras la penetración espermítica (88.0% y 97.1%) y para ser fecundados (P<0.01) de forma normal (72.0% y 77.1%) comparados con el grupo control (62.2% y 37.8%, respectivamente). Asimismo, la adición de cisteamina al medio de MIV mejoró (P<0.05) el porcentaje de embriones que alcanzaron los estadios de mórula y blastocisto (22.2%) y la tasa de blastocistos expandidos (13.0%) respecto al grupo control (6.4% y 2.6%, respectivamente). La concentración de GSH intracelular (pmol/ovocito) fue superior en los ovocitos MIV que en los ovocitos inmaduros.En el Estudio 4 se evaluó el efecto de la adición de cisteamina al medio de maduración de ovocitos de cabra prepúber seleccionados mediante el test de Azul de Cresol Brillante (BCB) sobre la maduración nuclear, fecundación y desarrollo embrionario in vitro. En presencia de cisteamina, el porcentaje de ovocitos BCB+ y madirados con cisteamina mejoraron la maduración nuclear, los fecundados normales, la formación del pronucleo masculino y el porcentage de embriones a las 8 celulas, comparados con el control y BCB-. En presencia de cisteamina, la formación de mórulas y blastocistos fue superior (P<0.001) en los ovocitos BCB+ (23.8%). En conclusión, la selección ovocitaria mediante el test de BCB y la MIV en presencia de cisteamina permiten una mayor capacidad de desarrollo tras MIV-FIV-CIV. Sin embargo, a pesar de obtener resultados aceptables en los parámetros de maduración nuclear y de fecundación in vitro, el desarrollo embrionario continúa siendo reducido. / In vitro production (IVP) of caprine embryos using techniques of in vitro maturation, fertilization and embryo culture (IVM-IVF-IVC) provide a high number of embryos.The aim of the present studies has been the establishment of a system of selection and in vitro maturation of oocytes adequate for competence to develop until blastocyst after in vitro fertilization and embryo culture. For this, oocytes were matured in TCM199 + sodium pyruvate + L-glutamine + gentamicine + 10% steer serum (SS) + 10 mg/ml LH + 10 mg/ml o-FSH + 1 mg/ml 17b-estradiol. After 27 h of IVM, the oocytes were inseminated with fresh sperm (3.5x106 sperm/ml) in TALP medium supplemented with 1 mg/ml hypotaurine. A t 24 h post-insemination, the presuntive zygotes were cultued in SOFm medium and were maintained 7 days in culture. In Study 1, the utility of the Brilliant Cresyl Blue (BCB) test was evaluated . The BCB+ oocytes (oocytes with blue coloured cytoplasm, fully-grown oocytes) presented a bigger diameter(136.6 ¡À 6.3 mm; P<0.001) and higher rates of nuclear maturation (81.4%; P<0.05), normal fertilization (23.5%; P<0.0001), development beyond the 8-cell stage (41.3%; P<0.001) and morulae plus blastocyts (12.0%; P<0.05) .In Study 2, the use of an chemically defined medium, based in Epidermal Growth Factor (EGF) for the in vitro maturation of prepubertal goat oocytes was investigated. A medium supplemented with hormones and serum (SS or FCS) was compared with a medium with 10 ng EGF. The percentage of normally fertilized oocytes was lower when EGF (17.3%) was employed (SS: 27.2%; FCS: 29.0%). The rate of total embryos (71.5%) and embryos that developed beyond the 8-cell stage (26.2%) were higher (P<0.05) when SS and hormones was used. In Study 3, the effect of the addition of thiol compounds (100 ¦ÌM cysteamine, 100 ¦ÌM b-mercaptoethanol, 0.57 mM cysteine and 0.57 mM cystine) to the IVM medium was analyzed. The oocytes matured in the presence of cysteamine and b-mercaptoethanol showed a better ability to form the MPN and to be normally fertilized (P<0.01; 72.0% y 77.1%) compared to the control group. The addition of cysteamine to the IVM medium improved the percentage of embryos that reached the m¨®rula plus blastocyst stage (22.2%) and the expanded blastocyst formation rate (13.0%) related to the control group. The intracellular GSH concentration (pmol/oocyte), was higher in the oocytes tIVM than immature oocytes. In Study 4, the addition of cysteamine to the IVM medium of oocytes selected by the Brilliant Cresyl Blue (BCB) was studied. The control group oocytes, no exposed to the BCB test, were matured in the same medium, but without cysteamine. In the presence of cyteamine, the percentage of oocytes that matured nuclearly was of BCB+ oocytes (89.5%)., while this rate was higher in the presence of cysteamine (77.8%). 97.0% of the penetrated oocytes exhibited ability to form MPN and a 69.7% were able to develop the 2 pronuclei, being these percentages significantly higher. The exposed oocytes to the BCB with cysteamine showed a lower percentage of non-decondensed heads (3.0%) than the control group (25.6%). Embryos developed beyond the 8-cell stage was higher in the BCB+ (68.3%). Likewise, in the presence of cysteamine, the morule plus blastocysts formation rate was higher (P<0.001) in the BCB+ oocytes (23.8%) related to the BCB- oocytes (5.1%). In conclusion, oocytes selection using the BCB test and the IVM in the presence of cysteamine allow a better development ability after IVM-IVF-IVC. In the present studies, we have been able to confirm an improvement in the oocytes development in relation with the initial IVM system, acting on growing and final maturation phases.

S. cerevisiae (budding yeast) is particularly powerful to study the relation between the molecular mechanisms of actin regulation and its biological significance due to its powerful molecular and genetic methods, well-established biochemical techniques, and development of live cell imaging and immuno-electron microscopy. Further, budding yeast has a simple cytoskeleton but the molecular mechanisms controlling its remodeling are conserved from yeast to mammals. Interestingly, a dynamic actin cytoskeleton is mandatory for endocytosis in S. cerevisiae. In this organism the formation of the primary endocytic profiles in yeast occurs concomitant with the assembly of a complex actin structure (the endocytic actin module), which includes the actin nucleator Arp2/3 complex. Consistent with observations indicating that the myosin-I Myo5 in complex with the WIP homolog Vrp1 is a major Arp2/3-dependent actin nucleating promoting factor (NPF) driving productive membrane invagination, our laboratory has demonstrated that the C-terminal domain of Myo5 immobilized on the surface of Sepharose beads induces assembly of the endocytic actin module in the presence of yeast extracts. Analysis of the in vitro actin assembly assay demonstrated that Myo5 is phosphorylated by the casein kinase CK2 at the serine 1205 during the assay. In this study, we have characterized the CK2 activity that phosphorylates Myo5 at the C-terminus and investigated the functional significance of this phosphorylation in vivo and in vitro. Our results indicate that a non-tetrameric and particulate-associated CK2 activity that includes the catalytic subunit Cka2 but not Cka1 or the regulatory subunits Ckb1 and Ckb2 phosphorylates Myo5 S1205. Our results also indicate that this phosphorylation event down-regulates the assembly of complex actin structures in vitro and slows down the internalization process and the dissociation of the myosin from the plasma membrane in vivo. The Cka2-mediated phosphorylation at Myo5 S1205 does not seem to regulate the affinity of the NPF for the Arp2/3 complex but rather down-regulates the interaction of Myo5 with its co-activator Vrp1. This phosphorylation also increases directly or indirectly the binding of the myosin to the endocytic coat components Sla1 and Pan1 and to the syndapin Bzz1, suggesting that the phosphorylation event occurs late during the maturation of the endocytic invagination. Finally, our data suggest that Cka2 have endocytic targets other than Myo5 and that its activity might also regulate early steps during the assembly of the endocytic coat. / La levadura S. cerevisiae es un organismo modelo muy utilizado para estudiar los mecanismos moleculares que regulan el citoesqueleto actina y su función biológica, ya que los mecanismos moleculares que controlan la organización del citoesqueleto de actina están conservados, por lo que muchos de los descubrimientos realizados en S. cerevisiae son aplicables también en eucariotas superiores. Una de las principales funciones biológicas de la actina en S. cerevisiae es la formación de una vesícula endocítica. En este organismo, la formación de los perfiles endocíticos primarios ocurre de forma simultánea con el ensamblaje de una estructura de actina compleja (módulo de actina) que incluye al complejo nucleador de actina Arp2/3. Diferentes estudios indican que la miosina-I Myo5 junto su co-activador Vrp1 activan al complejo Arp2/3 produciendo la elongación del perfil endocítico. Nuestro laboratorio ha demostrado que el dominio C-terminal de Myo5 inmovilizado en la superficie de bolas de sefarosa induce el ensamblaje del módulo de actina en presencia de extracto de levadura. El análisis del ensayo demostró además que Myo5 está fosforilada por la quinasa CK2 en la S1205. En este estudio hemos caracterizado la actividad CK2 que fosforila a Myo5 en la S1205 y hemos investigado el significado funcional de dicha fosforilación in vivo e in vitro. Nuestros resultados indican que una actividad CK2 asociada a partículas, que incluye la subunidad catalítica Cka2 pero no Cka1 ni las subunidades reguladoras Ckb1 y Ckb2 fosforila la S1205 de Myo5. Esta fosforilación perturba la interacción entre Myo5 y su co-activador Vrp1, regulando negativamente la formación de las estructuras de actina complejas in vitro, y consistentemente, disminuyendo la velocidad de la internalización endocítica in vivo. Además, nuestros resultados también sugieren que Cka2 seguramente tiene otras dianas además de Myo5, y que su actividad podría regular otras fases iniciales durante la formación de la vesícula endocítica.

Es fundamental, de cara a poder tratar las enfermedades que afectan al aparato digestivo, conocer, entre otras cosas, los neurotransmisores que están implicados en la relajación de la musculatura lisa intestinal. Actualmente, está bastante aceptado que los principales neurotransmisores inhibitorios implicados en esta relajación en la mayorías de mamíferos son el óxido nítrico y el ATP o un nucleótido relacionado. Sin embargo, el papel de ambos en el tubo digestivo humano y la implicación de cada uno de ellos es todavía desconocido. Además, la mayoría de los estudios previos se han realizado con fármacos poco selectivos lo que imposibilita el conocimiento y la caracterización de los receptores implicados en la relajación de origen purinérgico.Por tanto los objetivos de esta tesis doctoral han sido:El estudio de la neurotransmisión inhibitoria no adrenérgica no colinérgica (NANC), no nitrérgica en el colon humano. Caracterización de los receptores implicados en la relajación purinérgica del colon humano. Estudiar el mismo mecanismo en otras áreas del tracto gastrointestinal y otras especies. Caracterización de la neurotransmisión purinérgica en el intestino delgado de cerdo. Estudiar la co-transmisión funcional entre NO y ATP en el colon humano y establecer la función de cada uno de estos neurotransmisores. El estudio de otros posibles neurotransmisores inhibitorios como el sulfhídrico (H2S) y su vía de acción en el colon humano y de otras especies.Para llevar a cabo estos objetivos se han utilizando, principalmente, las técnicas de baño de órganos y de microelectrodos, que permiten la caracterización in Vitro de las vías inhibitorias, incluyendo la identificación de los neurotransmisores, los receptores y las vías intracelulares implicadas en la interacción neuromuscular. Además se han utilizado de forma complementaria otras técnicas como la inmunohistoquímica. Además y a modo de colaboración externa hemos incluido el estudio de los receptores purinérgicos en neuronas del plexo mientérico de cobayo (técnica de medida de calcio con Fluo-4) y hemos caracterizado el efecto del sulfhídrico en segmentos intestinales donde se preserva el circuito nervioso responsable de la peristalsis.Los resultados obtenidos mediante estas técnicas han demostrado que: El receptor purinérgico responsable de la relajación intestinal (colon humano e intestino delgado de cerdo) es el P2Y1. Este receptor media el componente rápido del potencial de unión neuromuscular y de la relajación mecánica correspondiente a este fenómeno eléctrico. La relajación a nivel del colon humano responde, probablemente, a un mecanismo de co-transmisión entre ATP (a través de receptores P2Y1) y óxido nítrico. El ATP es responsable de la relajación fásica, mientras que el NO sería responsable de la relajación tónica. El sulfhídrico causa relajación de la musculatura lisa intestinal a través de canales de potasio de baja conductancia sensibles a apamina y canales de potasio sensibles a ATP. El conocimiento de los receptores y los mecanismos implicados en la relajación intestinal puede contribuir en un futuro a diseñar estrategias terapéuticas en alteraciones motoras ocasionadas por patologías en el tracto gastrointestinal humano.

Los factores guía son proteínas esenciales en el proceso de guía de neuronas y axones que ocurre durante el desarrollo del sistema nervioso. Netrinas y Semaforinas componen dos de las cinco familias de factores guía existentes. En este trabajo, nosotros hemos estudiado el efecto quimiotáctico de Netrina1 y Semaforinas secretables Sema3A y Sema3F en la guía de interneuronas y sus axones durante el desarrollo del cerebelo y el hipocampo, así como la participación de Sema3A en el proceso de regeneración de axones axotomizados en un modelo in vitro. El primer objetivo de nuestro trabajo fue el estudio de la función de Netrina1 en el desarrollo postnatal de interneuronas de la corteza cerebelar, y pudimos constatar que: a) Netrina1 es un factor quimiorepulsivo in vitro para interneuronas de la corteza cerebelar postnatal; b) Netrina1 y sus receptores Dcc, Unc5h2 y Unc5h3 se expresan en la corteza cerebelar durante el desarrollo postnatal; c) las interneuronas de la corteza postnatal cerebelar expresan Netrina1 y sus receptores Dcc, Unc5h2 y Unc5h3; d) Dcc no parece participar en la señal quimiorepulsiva de Netrina1 ante interneuronas de la corteza cerebelar; e) las interneuronas de la corteza cerebelar migran tanto in vitro como in vivo asociadas a fibras gliales. Nuestro segundo objetivo fue estudiar el efecto de Sema3A y Sema3F sobre axones GABAérgicos de la formación hipocampal en desarrollo. Hemos observado que: a) Sema3A y Sema3F son agentes quimiorepulsivos in vitro sobre axones hipocampales embrionarios y postnatales, mientras que solamente Sema3F repele axones entorrinales embrionarios; b) Sema3A, Sema3F y sus respectivos receptores Neuropilina1 y Neuropilina2 se expresan en el hipocampo a edades embrionarias y postnatales; c) interneuronas GABAérgicas de la capa piramidal y el estrato oriens expresan Neuropilina1 y 2, mientras que aquellas situadas en los estratos radiado y lacunosum-moleculare no expresan dichos receptores. Nuestro tercer y último objetivo fue estudiar el posible efecto inhibitorio de Sema3A sobre axones adultos axotomizados, utilizando el cultivo organotípico entorrino-hipocampal como modelo de lesión in vitro. Nosotros demostramos que: a) tras axotomía a 15 días in vitro (DIV), cuando los axones entorrinales no regeneran, aumenta la expresión de Sema3A tanto en hipocampo como en corteza entorrinal, y también aumenta la expresión de su receptor Neuropilina1 en corteza entorrinal; b) en cultivos organotípicos entorrino-hipocampales obtenidos de ratones homocigotos deficientes en Sema3A, se produce la regeneración parcial de axones entorrinales axotomizados a 15 DIV. / Guidance cues are essential during the development of the central nervous system. In the present Thesis, we studied the migration of postnatal interneurons of the cerebellar cortex, and the role of Netrin1 in this process; furthermore, we studied the effect of Sema3A and Sema3F in the extension of GABAergic axons projecting locally in the development of hippocampal formation, and the role of Sema3A in the regeneration process of adult injured axons using the in vitro model of the entorhino-hippocampal organotypic culture. We obtained the following results:- Interneurons of the postnatal cerebellar cortex migrate closely associated to glial fibres, both in-vivo and in-vitro;- Netrin1 is a chemorepulsive cue for interneurons of the postnatal cerebellar cortex in vitro, and the expression pattern of Netrin1 and its receptors Dcc, Unc5h2 and Unc5h3 as well as the fact that interneurons express these receptors in vivo, indicate that Netrin1 may influence the migration of interneurons in vivo.- Dcc does not participate in the repulsive signal that Netrin1 exerts on interneurons of the cerebellar cortex in vitro.- Sema3A and Sema3F have a chemorepulsive effect on GABAergic axons from the embryonic and postnatal hippocampus, but only Sema3F is a chemorepulsive cue for GABAergic axons from the embryonic entorhinal cortex.- The expression pattern of Sema3A, Sema3F and their respective receptors Neuropilin1 and 2, and the fact that some of the GABAergic interneurons in the embryonic and postnatal hippocampus express those receptors, suggest a possible role of Sema3A and Sema3F in the axonal development of hippocampal GABAergic interneurons.- The axotomy of the entorhino-hippocampal pathway increases the expression of Sema3A and its receptor Neuropilin1 in entorhino-hippocampal organotypic cultures.- The lack of Sema3A in entorhino-hippocampal organotypic cultures yields a partial regeneration of injured entorhinal axons.

The reproductive biology of poriferans is still poorly understood. We have investigated the sexual reproductive biology of seven demosponge species, six of them from the Mediterranean (Corticium candelabrum, Crambe crambe, Raspaciona aculeata, Axinella damicornis, Chondrosia reniformis, and Petrosia ficiformis), and one from the Pacific coast of Canada (Asbestopluma occidentalis). The thesis consists of a general introduction, 7 different chapters and a general discussion.Chapter 1. It is well established that in temperate regions invertebrates restrict their reproductive cycles to the warm periods. The sexual cycle of A. damicornis, C. candelabrum, C. reniformis, and R. aculeata is very different in timing and duration, despite all of them shared habitat and thermal regime. While the gametogenesis of R. aculeata and C. reniformis underwent during summer and autumn (warm periods in the Mediterranean), the gametogenesis of C. candelabrum and A. damicornis occurred during winter. Therefore, the relationship between gametogenesis and temperature in temperate waters was not straightforward, and many different relationships appeared.Chapter 2. The oogenesis of C. candelabrum resulted in a surprising long process, with continuous production of oocytes. However, the oocyte maturation extended for 7/8 months during autumn and winter. Spermatogenesis occurred during 4 or 5 at the end of the oocyte maturation (spring and summer). Spermatozoans were primitive but possessed a true C-shaped acrosome. Chapter 3. The gametogenesis of the oviparous demosponge P. ficiformis occurred during autumn and early winter. Large oocytes and round primitive spermatozoans with proacrosomal vesicles were released to the water on December. Recently fertilised eggs were placed in Petri dishes. Since no free-swimming larva was observed, the development in this demosponge was suggested to be direct.Chapter 4. The reproduction of the carnivorous sponge A. occidentalis was studied under light and electron microscopy. It was a contemporaneous hermaphroditic sponge with clusters of oocytes and very complex spermatic cysts. The fertilisation mechanism was unusual for the phylum Porifera, and shared many similarities with the feeding mechanism of this carnivorous sponge.Chapter 5. The spermatogenesis of the common Mediterranean demosponge C. crambe was investigated by light and electron microscopy. The mature spermatozoan was a extremely modified cell, with the body bent at the level of the flagellum insertion, a true acrosome, and a striated rootlet that connected the basal body to the mitochondrion. In addition, such modifications resembled to the sperm morphology of a phoronid, in a well example of adaptive convergence. Chapter 6. The oogenesis in A. damicornis and R. aculeata was very similar, except for the duration. While it extended for 5 months in R. aculeata, A. damicornis required 7 months to complete it. The differences resided in the vitellogenesis. Yolk was almost exclusively auto-synthesized in A. damicornis from digestion of bacteria. However, in R. aculeata the process shortened because of the help of nurse cells in creation of yolk. Chapter 7. Unspawned sperm and precursors of sperm cells were phagocytosed by motile phagocytic cells in the spermatic cysts of P. ficiformis and R. aculeata. All these features observed for the first time in demosponges revealed that sponges contain many complex features and are capable of complex processes that are usually regarded to higher invertebrates and vertebrates.

Els mecanismes moleculars i cel·lulars responsables del fenotip metastàtic en el càncer de mama són poc coneguts. Tanmateix, l'habilitat de les cèl·lules tumorals per resistir els senyals de mort podria contribuir a crear les condicions favorables per al desenvolupament de les metàstasis. Bcl-2 i Bcl-xL són proteïnes de la família de Bcl-2 capaces d'inhibir l'apoptosi. L'objectiu d'aquest estudi fou obtenir un model experimental de carcinoma de mama ortotòpic amb el qual estudiar la contribució que la sobreexpressió de Bcl-2 i Bcl-xL, junt amb la inhibició de l'apoptosi que indueixen, pot tenir en diferents etapes de la progressió metastàtica del càncer de mama humà. Amb aquest objectiu es van transfectar amb l'ADN complementari del bcl-2 i bcl-xL línies cel·lulars derivades d'adenocarcinoma de mama humana amb diferent capacitat tumorígena, metastàtica i hormonodependent: MCF-7, MDA-MB-468 i MDA-MB-435P. Els nostres resultats mostren que Bcl-2 i Bcl-xL confereixen resistència a l'apoptosi induïda per factors de creixement (TGF-alfa i TNF-beta) i agents quimioterapèutics (paclitaxel i tamoxifen) en funció de la dotació oncogènica de les cèl·lules. La sobreexpressió de les proteïnes antiapoptòtiques Bcl-2 i Bcl-xL afavoreix l'activitat metastàtica de les cèl·lules 435 en diferents etapes del procés: disminució de l'adhesió cel·lular a proteïnes de la matriu extracel·lular (laminina, fibronectina i col·lagen IV), inhibició de la mort cel·lular per desadhesió de la matriu extracel·lular o anoikis i avantatge per sobreviure en el torrent sanguini i/o en l'òrgan diana facilitant el creixement metastàtic. La inhibició de l'apoptosi i de l'anoikis induïdes per la sobreexpressió de Bcl-2 i Bcl-xL requereix alhora altres alteracions genètiques necessàries perquè les cèl·lules de càncer de mama esdevinguin metastàtiques. Així, Bcl-2 i Bcl-xL no indueixen el fenotip metastàtic dels tumors obtinguts amb les cèl·lules no metastàtiques 468. Les cèl·lules derivades dels tumors organotòpics van ser exposades repetidament al microambient de la glàndula mamària per analitzar si la perllongada supervivència induïda per la sobreexpressió de Bcl-2 o Bcl-xL afavoria la selecció d'un fenotip metastàtic més agressiu en els tumors 435 o si induïa el fenotip metastàtic en els tumors 468 no metastàtics. La sobreexpressió de Bcl-xL en cèl·lules 435 afavoreix la ubiqüitat de les metàstasis, induint metàstasis ganglionars i pulmonars. Però, la perllongada supervivència induïda per Bcl-2 no indueix l'aparició d'altres localitzacions metastàtiques. Altrament, Bcl-2 no és capaç d'induir el fenotip metastàtic a les cèl·lules 468 després dels successius implants in vivo/in vitro. Les cèl·lules tumorals no metastàtiques 468 no posseeixen tots els canvis genètics necessaris o propietats cel·lulars requerides per a la metàstasi, i la perllongació de l'expressió de Bcl-2 no és suficient per induir-los. De fet, l'augment de l'activitat metastàtica pulmonar i ganglionar induïda per la sobreexpressió de Bcl-xL es neutralitza en els tumors induïts amb cèl·lules 435/Bcl-xL transfectades amb la construcció antisentit de bcl-xL, cosa que reafirma el paper decisiu d'aquest gen en l'evolució metastàtica dels tumors. D'altra banda, la inhibició de l'apoptosi induïda per la sobreexpressió de Bcl-2 o Bcl-xL en els tumors afavoreix la selecció de cèl·lules 435 amb major capacitat tumorígena. En contraposició, Bcl-2 i Bcl-xL contribueixen a disminuir la tumorigènesi de les cèl·lules no metastàtiques 468 amb les successives fases de selecció in vivo/in vitro, comprovant-se in vitro menor proliferació. Així, la disregulació de les proteïnes antiapoptòtiques Bcl-2 i Bcl-xL afavoreix la selecció de cèl·lules de càncer de mama amb un fenotip més agressiu. I, consegüentment, la capacitat per modular la funció i/o expressió de Bcl-2 o Bcl-xL en tumors de mama amb sobreexpressió d'aquestes proteïnes pot representar un esdeveniment crític per induir la reversió del fenotip metastàtic i regular la sensibilitat de les cèl·lules tumorals a drogues terapèutiques, millorant la resposta als mètodes tradicionals de tractament del càncer.