Las proteínas de la familia de las anexinas se caracterizan su unión a los fosfolípidos de la bicapa lipídica de forma dependiente de calcio, a través de los motivos "repetición anexina" presentes en su secuencia. Esta capacidad ha sido descrita mediante ensayos in-vitro, aunque poco se conoce de la funcionalidad de este comportamiento en los sistemas biológicos. Además del calcio, otros componentes celulares, como el citoesqueleto de actina, podrían modular in-vivo la unión de anexinas a las membranas biológicas.En trabajos previos nuestro grupo determinó in-vivo como la anexina A6 era capaz de reclutarse hacia el compartimento endocítico en paralelo a la internalización de las lipoproteínas de baja densidad (LDL), uno de cuyos componentes mayoritarios es el colesterol. En el presente trabajo describimos como el colesterol por si sólo es capaz de inducir este reclutamiento, de forma independiente de calcio. En primer lugar, se determinó que existía una población de anexina A6, asociada a membranas (totales o endosomales) aisladas en ausencia de calcio, y que ésta era liberada al solubilizar el colesterol presente en la bicapa (con digitonina). Además, la acumulación de colesterol en el compartimento endocítico tardío (mediante el tratamiento de las células con la droga U18666A) inducía el reclutamiento in-vivo de anexina A6 hacia éstas membranas, proceso observado mediante fraccionamiento celular (aislamiento de endosomas e immunodetección por western blot) e immunocitoquímica (co-localizando, en estos endosomas a la anexina con el lípido no esterificado -marcado con filipina-). El incremento de la asociación colesterol-dependiente se observó asimismo para la anexina A6 añadida de forma exógena (a membranas aisladas carentes de anexina endógena) descartando la afectación del tráfico intracelular como causa del efecto observado. A continuación se determinó la funcionalidad derivada de la interacción de otro tipo de lipoproteínas involucradas en el metabolismo de colesterol, las HDL (de alta densidad), con la superficie de células CHO. Describimos la activación de Ras de forma subsiguiente a la unión de la partícula a la membrana. involucrando a uno de sus receptores más importantes, el Scavenger Receptor Type B-I (SR-BI). Al estudiar el efecto de la sobreexpresión de anexina A6 sobre esta señalización a partir de las HDL y su receptor SR-BI, en células CHO, se observó una disminución de la activación de Ras y Raf (pero no del resto de MAPKs). Por otro lado, la observación in-vivo (videomicroscopía) de la distribución celular de anexina A6-GFP sobreexpresada en células CHO, muestra como incrementos del calcio intracelular ejercen un reclutamiento masivo y muy rápido de la anexina A6 hacia la membrana plasmática (o dominios subyacentes a ésta), siguiendo un patrón similar al observado para algunas GAPs (GTPase activating proteins). Esta observación, así como la interacción ya descrita in-vitro entre la anexina A6 y p120GAP, sugiere la hipótesis que la translocación calcio-dependiente de la anexina hacia la membrana modularía la concentración de p120GAP, colaborando así en la desactivación de Ras. En este sentido, observamos como la sobreexpresión de anexina A6 induce, en células CHO, un incremento de la asociación de p120 GAP a fracciones de membrana enriquecidas en Ras.La caracterización de estos dominios de concentración de anexina A6 en la membrana indica que se trata de lipid rafts (dominios enriquecidos en colesterol) con presencia de citoesqueleto de actina. Postulamos que, en la célula viva, el calcio, el colesterol y el citoesqueleto de actina colaboran determinando la localización de la anexina en la membrana, desde donde actuaría como un modulador de la señalización a través de Ras. / The annexin family of proteins is characterized by the presence of a tandemly repeated calcium dependant - phospholipid binding domain, called "annexin repeat". However, other cell constituents, like actin cytoskeleton or cholesterol, have been proposed to play a role in annexin binding to biological membranes. In this sense, here we demonstrate in-vivo that cholesterol itself is able to modulate the intracellular distribution of membrane-associated annexin A6, in a calcium - independent manner. Concretely, cholesterol accumulation in the late endocytic compartment, upon treatment of the cells with "U18666A", is accompanied by annexin VI recruitment to this structures. Also, treatment of crude membrane extracts from early or late endosomes with digitonin, a cholesterol-sequestering agent, is able to displace a significant membrane-bound population of annexin VI, associated in a calcium independent manner. Finally, we demonstrate that this redistribution correlates with an increased binding of recombinant GST-annexin VI to cholesterol-enriched endocytic membranes in-vitro.After determining the role of cholesterol in mediating annexin VI recruitment to membranes, we aimed to characterize the signalling pathway activated upon HDL (one of the key lipoproteins in cholesterol metabolism) binding to the cell surface of CHO cells. Here we describe that HDL activates MAP kinases through the small GTPase Ras. We involve in this activation one of the most physiologically important receptors for HDL, the "Scavenger Receptor Type B-I" (SR-BI). We then analyzed this activation pathway in an annexin VI-overexpressing derived cell line, finding that annexin VI partially inhibits the signalling through the small GTPase Ras and blocks the subsequent activation of Raf. This diminished Ras activation is completely dependant on the presence of the enzyme PKC, and does not ultimately lead to a deficient MAPK activation. We also observed that annexin VI overexpression promoted the association of p120 GAP (one of the Ras inactivators and also an annexin VI-interacting protein) with Ras - enriched membrane fractions, suggesting an increased Ras - p120 GAP complex formation in these cells. In summary, we suggest that annexin VI is able to modulate signalling activation from the membranes and that, in this process, both calcium- and cholesterol-mediated membrane recruitment of annexin VI are involved.

El citoesqueleto de actina es imprescindible para el mantenimiento de la morfología celular, así como para realizar diversas funciones como la movilidad/migración y división celular. En términos generales, este componente del citoesqueleto está constituido por los filamentos de actina o microfilamentos (MFs) y por una serie de proteínas de unión y/o relacionadas con la actina, implicadas en la organización estructural de los MFs y en la regulación de la dinámica de polimerización/despolimerización de actina. Una forma sencilla y eficaz de interferir en la dinámica de actina es mediante el uso de toxinas de actina. En este trabajo se ha realizado un estudio exhaustivo de los efectos provocados por estas toxinas a nivel de la morfología celular, arquitectura y de salida de proteínas del aparato de Golgi, bien por depolimerización de los MFs (citocalasina D, latrunculina B, micalolide B o toxina botulínica C2) o bien por su polimerización aberrante o estabilización (jasplakinolide). El análisis de los efectos provocados por las distintas toxinas revela como éstos son dependientes del tipo celular, modo de acción de la toxina así como de la concentración y tiempo de exposición a esta. Hemos observado como los cambios de la morfología de las cisternas producto de la despolimerización de los MFs se correlacionan con variaciones en la homeostasis el pH de este orgánulo. Según lo cual, pensamos que los MFs participan en el diseño y mantenimiento de la forma aplanada de las cisternas del aparato de Golgi, probablemente regulando, en parte, la maquinaria molecular implicada en el mantenimiento de la homeostasis iónica de este orgánulo. Por otro lado, hemos observado como los MFs participan de forma variable en la salida del aparato de Golgi de cargo no asociado a balsas lipídicas con destino basolateral y apical. Sin embargo, son prescindibles en la salida de cargo asociado a balsas lipídicas con destino apical. Paralelamente a estos resultados que implican a los MFs en la morfo-funcionalidad del aparato de Golgi, hemos desarrollado un modelo celular para generación de agresomas de actina filamentosa, los cuales han sido descritos en distintas enfermedades como el Alzheimer o el acoholismo crónico bajo el nombre de cuerpos de Hirano. En este sentido, el jasplakinolide es capaz de inducir la formación reversible de un agresoma de actina filamentosa similar al cuerpo de Hirano cuya degradación está mediada por los sistemas proteasomal y lisosomal/autofagia. Por último, describimos por primera vez in vitro la generación y coexistencia de dos agresomas originados por mecanismos diferentes sin que tenga lugar en ningún momento la mezcla de sus componentes moleculares.

L'estudi realitzat ha estat la identificació i caracterització de proteïnes de la matriu nuclear, concretament d'una proteïna de 55 KD (p55) associada a la fase replicativa de l'ADN durant la proliferació cel.lular.La matriu nuclear és una estructura obtinguda després d'una extracció de cromatina i components solubles de nuclis amats. Durant els últims anys s'ha implicat a la matriu nuclear en importants funcions com són: l'organització i replicació de l'ADN, la transcripció i l'acció hormonal (1, 2, 3, 4, 5, 6). Nombroses evidències desvetllen la importància dels components de la matriu nuclear en la regulació de la síntesi de l'ADN i la proliferació cel.lular, com l'increment d'expressió de molts oncogens, que codifiquen proteïnes nuclears les quals s'associen a l'activació proliferativa de diversos tipus cel.lulars normals (7, 8, 9, 10). També s'ha descrit l'increment de moltes altres proteïnes, incloent la calmodulina, proteïnes acceptores de calmodulina (11) i distins enzims replicatius com l'ADN polimerasa a, l'ADN primasa, la 3'-5'-exonucleasa, l'ARNasa H i l'ADN metilasa, les quals s'associen a la matriu nuclear dels hepatòcits durant la fase replicativa de la regeneració (12).Totes aquestes dades suggereixen que la síntesi de certes proteïnes i la seva associació amb la matriu nuclear pot ésser un procés important per a la regulació de la replicació de l'ADN i la proliferació cel.lular en general.El treball desenvolupat s'ha centrat en la identificació d'una proteïna de 55 KDa (p55) associada a la matriu nuclear, que incrementa paral.lelament a l'inici de la síntesi d'ADN durant la regeneració hepàtica després d'una hepatectomia parcial (13). L'hepatectomia parcial ha estat el model emprat per l'estudi dels canvis proteics associats a la matriu nuclear dependents de les distintes fases dels cicle ceLlular.El fet de que la p55 incrementes paral.lelament a la síntesi d'ADN suggería que fos una proteïna relacionada directament amb la replicació de l'ADN.A causa de l'interès que representa l'estudi dels processos i factors que intervenen en el desenvolupament de la síntesi d'ADN i posterior divisió cel.lular, i atès que es desconeixen les proteïnes que forment part o intervenen en l'estructura interna de la matriu nuclear, l'objectiu d'aquest estudi ha estat la caracterització de la p55. Per tal propòsit s'ha purificat i s'han produït anticossos policlonals contra la p55, amb els quals s'han realitzat estudis immunocitoquímics que han desvetllat la localització nuclear d'aquesta proteïna en el teixit hepàtic regenerant.A partir de la seqüència parcial d'aminoàcids, s'ha obtingut que la p55 presenta una granhomologia amb les queratines, concretament amb la queratina núm. 8.Atès que les queratines són proteïnes de la família de filaments intermedis, descrits comconstituents dels citoesquelet cel.lular i per tant la seva localització és citoplasmàtica i no nuclear, com en el cas de la p55, es plantejaren estudis paral.lels emprant anticossos contra la p55 i contra les queratines.Els estudis realitzats a nivell bioquímic, en teixit hepàtic, semblen indicar que la p55 detectada en la matriu nuclear es tracta de la queratina 8. Ja que el patró de les dues proteïnes és el mateix tant a nivell d'electroforesi bidimensional, com a nivell de fosforil.laciò in vitro i mitjançant immunotransferències emprant els anticossos esmentats anteriorment.Com a conclusió d'aquests resultats es podria afirmar, tal com hem indicat, que les duesproteïnes són la mateixa, si no fos pels resultats obtinguts en els estudis immunocitoquímics emprant l'anticossos anti-p55 i anti-queratines, en els quals s'ha comprovat que la queratina presenta distribució citoplasmàtica i la p55 nuclear.Posteriorment, s'inicià l'estudi de la p55 en distintes línies cel.lulars en cultiu, per poder generalitzar i comprovar els resultats obtinguts en el teixit hepàtic regenerant.S'ha utilitzat la línia cel.lular NRK 44F (cèl.lules normals no epitelials de ronyó de rata).Aquestes cèl.lules resultaven un model d'estudi interessant i comparable amb el de la regeneració hepàtica post-hepatectomia parcial, ja que presenten la capacitat d'ésser activades i sincronitzades en les distintes fases del cicle cel.lular.S'ha analitzat, mitjançant tècniques immunocitoquímiques, la presència de la p55 en aquestes cèl.lules en diferents fases del cicle cel.lular i s'ha observat que, al igual que en el fetge, la p55 es detecta exclusivament en el nucli de les cèl.lules NRK en fase S. L'ànalisi bioquímica ens indica que el patró electroforètic bidimensional de la proteïna detectada en les cèl.lules NRK, és similar al de la p55 de les cèl.lules hepàtiques. Presenta una forma majoritària i distintes isoformes d'igual pes molecular, degudes a diferents graus de fosforil.lació. En canvi, el pes molecular de la proteïna detectada per l'anticòs anti-p55 en aquestes cèl.lules no és de 55 KOa, si no de 62 KOa.Pel que fa a la correlació que hi ha entre la p55 i la citoqueratina 8 en les cèl.lules hepàtiques, és interessant indicar que les cèl.lules NRK 44F no són cèl.lules d'origen epitelial (tipus cel.lular que presenta típicament queratines com a components dels filaments intermedis), són fibroblasts, i aquests presenten vimentina com a component dels filaments intermedis.S'ha comprovat, mitjançant estudis immunocitoquímics i per immunotransferència la composició dels filaments intermedis de les cèl.lules NRK, emprant els anticossos antiqueratina i anti-vimentina. Ja que és conegut que alguns tipus cel.lulars que contenen un únic tipus de filament intermedi, a l'adaptar-se a les condicions de cultiu o degut a factors tumorals (en el cas de línies tumorals), expressen nous tipus de filaments intermedis que coexisteixen amb els originals.Els resultats obtinguts han estat els esperats. Les cèl.lules NRK no presenten queratines, únicament presenten vimentina.També s'ha caracteritzat la p55 en altres tipus cel.lulars com són: les cèl.lules HeLa (cèl.lules d'adenocarcinoma humà), MOCK (cèl.lules epitelials de ronyó de gos), BRL (cèl.lules d'hepatocarcinoma de rata) i cèl.lules 3T3 NIH (fibroblasts de ratolí). En totes aquestes cèl.lules, l'anticòs anti-p55 presenta localització exclusivament nuclear. En canvi s'han observat diferències respecte a la proteïna detectada. En les cèl.lules HeLa i MDCK l'anticòs anti-p55 detecta específicament una proteïna de 55 KOa, igual que en les cèl.lules hepàtiques. Una altra característica comú entre aquestes cèl.lules i les del fetge és que presenten queratines i concretament la queratina 8, com component dels filaments intermedis.En les cèl.lules 3T3 NIH, l'anticòs anti-p55 detecta una proteïna de 60-62 KOa. Aquest resultat coincideix amb l'obtingut en les cèl.lules NRK. Cal destacar que ambdós tipus de cèl.lules són fibroblasts i presenten vimentina com component dels filaments intermedis.Així doncs podem indicar que l'anticòs anti-p55 detecta una proteïna de localització nuclear independentment del tipus cel.lular que es tracti. En canvi en les cèl.lules d'origen epitelial o que contenen queratina 8, la proteïna detectada per l'anticòs presenta 55 KOa de pes molecular i en els fibroblasts o cèl.lules que no contenen queratina la proteïna detectada presenta entre 60-62 KOa.S'ha intentat esbrinar si la proteïna de 62 KOa detectada en els fibroblasts presenta alguna correlació amb la vimentina, com és el cas de la p55 i la queratina 8 en el fetge. Però, a més de presentar distint pes molecular, ja que la vimentina té un pes molecular de 57 KOa, presenten diferent patró electroforètic, així com tampoc s'ha observat que l'anticòs antivimentina reconegui la p55, ni l'anticòs anti-p55 la vimentina, contràriament al que s'observava amb la p55 i la queratina 8 en el fetge.CONCLUSIONS:Com a conclusió final podem dir que la proteïna detectada per l'anticòs anti-p55, encara que no presenti sempre una correlació amb el tipus de filament intermedi típic del tipus cel.lular en estudi, té relació amb els filaments intermedis degut a la seqüència d'aminoàcids que presenta. La proteïna identificada es pot considerar una proteïna estructural de la matriu nuclear implicada en la segregació dels cromosomes durant la divisió cel.lular, ja que els estudis immunocitoquímics realitzats en cèl.lules en mitosi, emprant l'anticòs anti-p55, ens mostren una reacció associada als cromosomes i a vegades seguint el mateix patró que el fus mitòtic.BIBLIOGRAFIA:1- Nelson, W.G.; K.J. Barrack and O.S. Cotfey. 1986. Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 457475.2- Pardoll, O.M.; B. Volgestein and O.S. Coffey. 1980. Cell 19: 527-536.3- Smith, H.C. and R. Berezney. 1982. Biochemestry 21: 6751-6761.4- Smith, H.C. and R. Berezney. 1983. Biochemestry 22: 3042-3046.5- Jackson, O.A. and P.R. Cook. 1986. EMBO J. 5: 1403-1410.6- Berezney, R. and O.S. Cotfey. 1975. Science 189: 291-293.7- Kelly, K.; B.H. Cochram, Ch.O. Stiles and P.Leder. 1983. Cell 35: 603-610.8- Thompson, C.B.; P.B. Challoner, P.E. Neiman and M. Groudine. 1986. Nature 319: 374380.9- Greenberg, M.E. and E.B. Ziff. 1984. Nature 311: 433-438.10- Thompson, N.L.; J.E. Mead, lo Braun. M. Goyette, P.R. Shank and N. Fausto. 1986.Caneer. Res. 46: 3111-3117.11- Serratosa, J.; M.J. Pujol, O. Baehs and E. Carafoli. 1988. 8ioehem. 8iophys. Res.Commun. 150: 1162-1169.12- Tubo, R.A. and R. Berezney. 1987. J. 8iol. Chem. 262: 1148-1154.13- Higgins, G.M. and R.M. Anderson. 1931. Mreh. Pathol. 12: 186-202. / We have identified a protein (p55) with a molecular weight of 55 KDa and pI of 6.2, which was strongly increased in the nuclear matrix of rat liver cells during proliferative activation. This protein is highly insoluble since it could not be solubilized either by detergents or by alkaline extraction. We have obtained three partial amino acid sequences which revealed that p55 has a high homology with cytoqueratins. Polyclonal antibodies raised against p55 were used to carry out Western blot and immunocytochemical studies which indicated that p55 was localized only in the nuclei, specifically in the nuclear matrix. Autoradiographic experiments revealed that not all the cells presenting an increase in p55 incorporated (3H)thymidine, indicating that this protein is not related to DNA replication. Immunocytochemical studies also revealed that during mitosis p55 is localized surrounding the chromosomes and associated with the mitotic apparatus, suggesting that p55 is involved in the separation of chromosomes during cell division.In order to identify the presence of p55 in different cells types, we have also analyzed the antibody against the p55 in NRK (normal rat kidney) cells.Immunocytochemical studies in synchronic NRK cells revealed that the antibody is located specifically in the nuclei of replicative NRK cells. Western blot analysis of NRK cells showed that the protein detected in NRK cells has 62 KDa and 5.2-5.4 pi value. By western blot studies, we have also found that the protein (p62) is present at the same level in different phases of cell cycle, suggesting that the specific reaction detected by imunocytochemistry in replicative cells is due to increase of antigen accessibility or a change of protein conformation.Immunocytochemical studies in others culture cells, HeLa (human cervical adenocarcinome), NIH 3T3 fibroblasts, MDCK (Madin-Darby canine kidney) cells and BRL (rat hepatocarcinome), confirm the nuclear reaction of the antibody.We also show that the protein detected by the antibody from nuclear matrix liver cells is located in the nuclear matrix in all tested cells after extraction of "in vitro" nuclear matrix fraction.Thus, the NRK cells are fibroblasts and their do not have cytokeratins, we can conclude that the antibody against the nuclear matrix from rat liver cells detect a specific protein of nuclear matrix and from all the results we can also suggest that the protein detected would be related with intermediate filaments proteins.

TESI:L'objecte d'estudi d'aquesta tesi és el receptor CD84, que pertany a la Família del CD150, alhora englobada dins la superfamília de les immunoglobulines. La família del CD150 està composta per nou receptors que comparteixen una elevada homologia estructural, i que poden presentar interacció homotípica o heterotípica. Sis dels membres d'aquesta família presenten a la seva cua citoplasmàtica almenys un motiu d'unió a les proteïnes adaptadores SAP i EAT-2. La deficiència del gen que codifica per la proteïna SAP (SH2D1A), és la causant de l'aparició d'una immunodeficiència lligada al cromosoma X, la Síndrome XLP, corresponent a un desordre de baixa incidència, que es caracteritza per una elevada susceptibilitat al virus del Epstein-Barr. El CD84 es troba àmpliament expressat a la superfície dels leucòcits i és l'únic membre de la família que es troba expressat a nivells elevats en mastòcits en estat basal. Els mastòcits són les principals cèl·lules efectores de les reaccions al·lèrgiques, tot i que es troben implicats en molts altres processos, inclosos la immunitat innata i l'autoimmunitat. La via clàssica d'activació dels mastòcits s'inicia amb la unió de la IgE al receptor d'alta afinitat per la IgE (FcepsilonRI) i dóna lloc a l'alliberació d'histamina i molts altres mediadors. Les respostes mastocitàries requereixen una regulació molt precisa que està mitjançada per un ampli ventall de factors i molècules. L'objectiu d'estudi d'aquesta tesi ha estat determinar la funció del receptor CD84 en l'activació mastocitària, donada l'elevada expressió d'aquest immunoreceptor en mastòcits, i les implicacions d'aquest tipus cel·lular en la regulació de les respostes del sistema immunitari.Mitjançant estudis de sobre-expressió del receptor CD84 en una línia mastocitària de rata, RBL-2H3, vam caracteritzar el CD84 com un nou receptor inhibidor de la cascada de senyalització iniciada pel receptor d'alta afinitat per la IgE. Vam demostrar que el receptor CD84 inhibeix tant esdeveniments primerencs (com la senyalització de calci, la reorganització del citoesquelet, la desgranulació i la fosforilació de MAPKs), com esdeveniments tardans (síntesi de citocines), mitjançant la interacció homotípica, on el receptor actua com el seu propi lligand. Mitjançant la generació de mutants puntuals per a les quatre tirosines que el receptor CD84 presenta a la seva cua citoplasmàtica, vam disseccionar la implicació de cadascuna d'elles en el mecanisme inhibitori del CD84, i vam comprovar que les tirosines responsables de la inhibició del CD84 són les que es troben a les posicions 279 i 324. Per altra banda, les tirosines 262 i 299, que es troben englobades en motius d'unió a les proteïnes adaptadores SAP i EAT-2, no participen en el mecanisme inhibitori del CD84, determinant que la funció negativa del receptor és independent de SAP. Mitjançant estudis bioquímics, vam determinar que les molècules adaptadores c-CBL i DOK-1 participen en el mecanisme inhibitori del CD84. Vam fer també estudis de transfecció en cèl·lules COS, amb la finalitat d'establir les cinases implicades en la fosforilació del receptor CD84 i vam determinar LYN i FPS/FES com les cinases principals en la fosforilació de les tirosines 279 i 324, respectivament. Finalment, vam utilitzar una línia mastocitària humana, LAD-2, que ens ha permès corroborar els efectes observats amb la línia RBL-2H3 en un sistema fisiològicament més proper a l'humà. Vam comprovar que l'efecte inhibitori del CD84, es manté en els esdeveniments primerencs estudiats en LAD-2, i vam confirmar també, en aquesta línia cel·lular, la implicació de DOK-1 en la senyalització negativa del CD84. Les dades obtingudes en aquesta tesi perfilen el receptor CD84 com un molècula important en la funció dels mastòcits i una possible diana terapèutica en al·lèrgies inflamatòries. / CD84 belongs to the CD150 family of receptors. This family is a subset of the CD2 cell-surface receptor Ig superfamily and it is defined by its binding to the cytoplasmic adaptors SAP and EAT-2. SAP/SH2D1A is the product of the gene mutation in X-linked lymphoproliferative disease (XLP), a rare immune disorder commonly triggered by Epstein-Barr virus. CD84 is a homophilic adhesion molecule expressed in a broad range of leukocytes. The CD84 is the only member of the CD150 family expressed in resting mast cells. Mast cells are currently recognized as effector cells in many settings other than mere allergic reactions, including innate immunity and autoimmunity. The classic and most studied activation pathway of these cells starts with the binding of IgE to the high-affinity Fc receptor for IgE (FcepsilonRI); and the release of histamine and other mediators after crosslinking of surface-bound IgE by allergen. Appropriate activation and fine tuning of mast cell responses is mediated by a complex array of factors and molecules. The aim of this work was to determine the function of CD84 in mast cells.The CD84 receptor was transfected and overexpressed in the rat mast cell line RBL-2H3. We found that this receptor has an inhibitory effect in early events (degranulation, cytoskeleton arrangement, calcium influx, MAPKs phosphorylation and PI3K phosphorylation) and late events (cytokines synthesis). Generation of mutants for each of the four tyrosines present in the cytoplasmic tail of the CD84, demonstrates that this inhibitory effect is related with Y279 and Y324. Interestingly, Y262 and Y299, which are part of a consensus motif for SAP or EAT-2 binding, do not participate in CD84-mediated inhibition. Thus, we postulate that the inhibitory effect of the CD84 is not mediated by SAP or EAT-2 in mast cells. We performed transfection studies with COS cells and we determined that LYN and FPS/FES kinases are the main kinases in Y279 and Y324 phosphorylation, respectively. Finally we used a human mast cell line, LAD-2, to corroborate the effects observed in RBL-2H3. We found that CD84 receptor has also an inhibitory effect in IgE-dependent early events in LAD-2, whereas no inhibitory effect was seen using non-immunological stimuli. These data suggest that CD84 may play a role in modulating FcepsilonRI-mediated signaling in mast cells and it could have a protective role against undesired allergic and inflammatory responses.

En este trabajo de tesis hemos identificado la presencia de marcadores polimórficos dentro del gen F8 que han permitido identificar el alelo portador de la mutación en el 91% de las mujeres portadoras de hemofilia A en estudio en nuestro laboratorio. Además, hemos descrito 31 mutaciones nuevas responsables de la HA, de las cuales, 20 fueron mutaciones missense. El análisis estructural de dichas mutaciones proporciona un mejor entendimiento de la enfermedad, además ha permitido predecir el impacto que dichos cambios ocasionan en la estructura de la proteína, así como las consecuencias funcionales de las mutaciones en dicho gen, sugiriendo nuevas áreas del FVIIIa involucradas en la unión a otras macromoléculas, tales como el FIXa y el sustrato del complejo Xasa, el FXa. Por otro lado, demostramos que el uso de nuevas técnicas de cuantificación de dosis génica como la PCR a tiempo real y el MLPA junto con el estudio indirecto por marcadores son una buena herramienta para la detección de mutaciones como las deleciones y duplicaciones de uno o más exones del gen F8, en varones y mujeres portadoras de HA que con la PCR cualitativa no era posible detectar. Y por último, proponemos un algoritmo de trabajo práctico de análisis para optimizar el diagnóstico molecular de pacientes con HA y las portadoras de su familia.

La proteína ykbA de "Bacillus subtilis", purificada y reconstituida en proteoliposomas (PLs), presenta actividad de intercambio de L-serina, L-threonina y L-aminoácidos aromáticos. Por ello la renombramos como SteT (Serine/threonine exchanger Transporter). Los estudios cinéticos de la actividad de SteT son compatibles con un mecanismo secuencial de intercambio. SteT se agrupa filogenéticamente dentro de la familia LAT. Por todo ello, SteT es el primer homólogo procariota de la familia LAT que ha sido identificado y caracterizado. Proponemos SteT como modelo procariota para el estudio funcional y estructural de la familia LAT.Los estudios estructurales de SteT mediante electroforesis no desnaturalizante y TEM con tinción negativa y con criofractura en PLs indican que el intercambiador es funcional como monómero. SteT tiene apariencia de donut elíptico con diámetros exteriores de ~6 y ~7 nm. El residuo C291 en el segmento transmembrana (TM) VIII de SteT es la única diana de inactivación por MTSET y de activación por DTT. El sustrato L-serina protege de la inactivación por MTSET. Por tanto, el sustrato bloquea directamente o provoca un cambio conformacional que bloquea la accesibilidad de MTSET al residuo. El segmento TM VIII presenta dos caras funcionalmente diferenciables con periodicidad de hélice α. Una cara está formada por los residuos I285, I288, L292, K295 y F299 que mutados a cisteína muestran inhibición por MTSET y son insensibles a DTT. La otra cara, adyacente a la anterior, está formada por los residuos S287, G290, G294 y S298 que mutados a cisteína muestran activación por DTT y son insensibles a MTSET. Los residuos I284 y C291 poseen características de ambas ya que se inactivan por MTSET y se activan por DTT. DTT activa ~20 veces SteT cysless G294C en PLs, muy probablemente incrementado la Vmáx sin afectar la KM aparente. Esta activación es protegible por el sustrato L-serina con una EC50 similar a su KM aparente. Por tanto, el sustrato bloquea directamente o provoca un cambio conformacional que bloquea la accesibilidad de DTT al residuo. La mutación K295C, tanto en su entorno cysless como wt, genera un transportador ~50 y ~260 veces más rápido que SteT y SteT cysless respectivamente. La mutación K295G provoca un efecto muy inferior y la mutación K295L rinde un transportador inactivo. Estos datos sugieren que no hay una relación directa entre el tamaño de la cadena lateral en la posición 295 y la actividad de SteT, si no que la presencia de cisteína es la causante del aumento de actividad.Los residuos I285 y K295 parecen presentar interacción con la cadena lateral del sustrato ya que las mutaciones I285C y K295C producen un cambio dramático en el patrón de cis-inhibición. En estos mutantes la mayoría de los aminoácidos estudiados inhiben ampliamente el transporte de L-serina, con la excepción de L-prolina, L-hidroxiprolina, L-glutamato y glicina. En este sentido, SteT cysless K295C presenta un claro cambio de especificidad de sustrato ya que, a diferencia de SteT, transporta L-arginina. El hecho de que I285 y K295 disten ~16 Å indicaría la existencia de al menos dos lugares de unión independientes de la cadena lateral del sustrato, contradiciendo el modelo de "Alternating access". / ykbA, a "Bacillus subtilis" protein was purified and reconstituted in proteoliposomes (PLs) showing a L-serine, L-threonine and aromatic L-aminoacids exchange activity. We rename it as SteT (Serine/threonine exchanger Transporter). The kinetic studies of SteT activity are compatible with a sequential mechanism of exchange. SteT belongs philogenetically to LAT family, so SteT is the first prokaryotic member of LAT family that has been identified and characterized. The structural studies of SteT using native electrophoresis, negative staining and freeze fracture TEM in PLs show that it is functional as monomer. SteT looks like an elliptic donut with external diameters of ~6 and ~7 nm. The residue C291, located in the transmembrane segment (TM) VIII of SteT, is the unique target of inactivation by MTSET and of activaction by DTT. L-serine protects the MTSET inactivation. The TM segment VIII has two differentiable faces with α-helix periodicity. One is formed by I285, I288, L292, K295 and F299. These residues mutated to cysteine show MTSET inhibition and DTT insensitivity. The other, adjacent to the first, is formed by S287, G290, G294 and S298. These residues mutated to cysteine show DTT activation and MTSET insensitivity. The residues I284 and C291 have MTSET inhibition and DTT activation. DTT activates ~20 fold SteT cysless G294C in PLs. This activation is protected by L-serine with an EC50 similar to its apparent KM. The mutation K295C, in cysless and wt environments, causes a transporter ~50 and ~260 fold faster than SteT and SteT cysless respectively. The mutation K295G causes a lower effect and the mutation K295L yields and inactive transporter. These data suggest that the presence of cysteine is the cause of increased activity. The residues I285 and K295 seem to have interaction with the substrate's side chain because the I285C and K295C mutations cause a dramatic change in the cis-inhibition pattern. In this sense, SteT cysless K295C shows a clear change of substrate specificity because it transports L-arginine despite SteT. I285 and K295 are ~16 Å away, indicating the existente of at least two independent binding sites for the substrate side chain, contradicting the Alternating access model.

El ácido docosahexaenoico, un PUFA omega-3, se ha relacionado con efectos inmunosupresores en linfocitos, monolitos y macrófagos pero no existían estudios sobre sus efectos en las células dendríticas (DCs). Por ello se diferenciaron en presencia de DHA monocitos hacia DCs. Las células tratadas con el ácido graso mostraron cambios fenotípicos divergentes en función del estadio de madurez de las mismas. Así, en estadio inmaduro, se produjeron incrementos de expresión de CD83, CD86, HLA-DR y CD36 y disminución de CD1a y CD80. Sin embargo, en estadio maduro, CD83, CD86 y HLA-DR sufrieron descensos en su expresión con respecto a los controles. CD80 y CD1a de nuevo presentaban una expresión disminuida y la de CD36 se encontraba aumentada. Al medir la capacidad de activación de la proliferación linfocitaria de estas células se encontró que esta se encontraba disminuida. La secreción de IL-10 e IL-12 también había disminuido. Este conjunto de efectos era dependiente de la concentración de DHA. El DHA era capaz de desarrollar algún tipo de efecto inmunosupresor en las DCs.Se realizaron experimentos similares con otros ácidos grasos: EPA, ácido linoleico (LA) y ácido oleico. Con EPA y LA se obtuvieron resultados similares a los mostrados por el DHA cualitativamente pero no cuantitativamente. El DHA era el ácido graso más potente y afectaba tanto al fenotipo como a la capacidad secretora de citocinas y activadora de la proliferación linfocitaria en DCs.Estos resultados eran similares a los obtenidos por otros autores en los tratamientos de DCs con activadores de PPARγ lo cual sugería para el DHA una posible actuación a través de este receptor nuclear. Sin embargo, el hecho de que el DHA sea un activador de PPARγ pobre en comparación con EPA, LA o Rosiglitazona sugirió la presencia de otras vías de activación. En concreto, RXR, con el cual se ha demostrado que el DHA es capaz de interactuar.Se trataron DCs con concentraciones en el rango nanomolar de 9cRA, un activador de RXR, obteniéndose que este retinoide era capaz de interferir en la maduración normal de la DC de forma que se obtenía resultados fenotípicos extraordinariamente similares a los producidos por el DHA. También la capacidad de estimulación de la proliferación linfocitaria estaba disminuida. En cambio, las DCs tratadas con 9cRA mostraron una secreción disminuida de IL-12 y normal de IL-10. La activación de PPARγ:RXR simultáneamente a través de ambos monómeros ha sido relacionada con efectos aditivos, sinérgicos o complementarios en muchos tipos celulares. Se cree que esto es debido a la unión de moléculas coactivadoras complementarias al heterodímero. La adición simultánea de Rosiglitazona y 9cRA a las DCs mostró efectos fenotípicos aditivos indicando que probablemente 9cRa estaba actuando a través del heterodímero. Se realizaron experimentos similares combinando el DHA con 9cRA y el DHA con la Rosiglitazona. La combinación con Rosiglitazona mostró cambios mucho más importantes lo cual sugería que el DHA actuaba principalmente uniéndose a RXR en el heterodímero. Finalmente se añadió un inhibidor específico de PPARγ a las células dendríticas: GW9662; el cual fue capaz de bloquear los efectos producidos por el DHA, la Rosiglitazona y el 9cRA. Además, el inhibidor por sí mismo alteraba por completo el proceso de maduración de las células dendríticas implicando que PPARγ debe desarrollar un papel indispensable en el proceso de maduración de la DC y no solo actuar como un activador de la inmunosupresión y también que el DHA, probablemente, actúe a través del monómero RXR del heterodímero PPARγ:RXR en las DCs. / Docosahexaenoic Acid (DHA), an omega-3 PUFA, has been associated with immunosuppressive effects in lymphocytes, monocytes and macrophages, but there were no studies about its effects on dendritic cells (DCs). So human monocytes were differentiated to DCs in presence of growing concentrations of DHA. These cells displayed divergent changes in their phenotypes depending on the maturation stage, downregulating both their lymphoproliferative stimulation capacity and IL-12 and IL-10 secretion levels in mature stage. All these effects were DHA concentration dependent.We performed then similar experiments with other fatty acids: EPA, Linoleic Acid (LA), and Oleic Acid. With EPA and LA the results were similar to that shown by DHA in a qualitative manner but DHA was the most potent fatty acid affecting DC phenotype, lymphoproliferation activation capacity and cytokine secretion.The results obtained with DHA were similar to those obtained in DCs with PPARγ ligands although DHA is considered a poor PPARγ ligand compared to EPA, LA or Rosiglitazone. By the other side, theoretically, the PPARγ heterodimer can be activated both by RXR and PPARγ ligands. 9cRA, an RXR ligand, was tested at low concentrations in DCs. The results obtained were similar in phenotype and lymphoproliferative stimulation capacity to those shown by DHA treatments. However, mature 9cRA treated DCs secreted normally IL-10 with IL-12 inhibited. The simultaneous addition of 9cRA and Rosiglitazone on DCs displayed additive effects on DCs phenotype indicating that 9cRA was probably acting through PPARγ:RXR. When DHA and 9cRA or Rosiglitazone were combined, the phenotypic changes were much more additive for Rosiglitazone with DHA than for 9cRA with DHA. This was strongly suggesting that DHA could act mainly activating RXR in the PPARγ heterodimer.Finally, GW9662, an specific inhibitor of PPARγ, blocked the effects unleashed by DHA, Rosiglitazone and 9cRA. Moreover, GW9662 by himself altered normal maturation phenotype on DCs implying that PPARγ must fulfil a significant role in the DC maturation process moreover than the immunosuppression of the DC response and that DHA, probably, was acting through the RXR monomer of PPARγ heterodimer in DCs.

L’endometri és el revestiment interior de la mucosa de l’úter. Histològicament, en l’endometri podem diferenciar dos tipus cel·lulars epitelials: l’epiteli luminal i l’epiteli glandular. Els teixits epitelials es caracteritzen per ser teixits polaritzats que presenten unes característiques morfològiques distingibles com són: polarització apico-basal, contactes cèl·lula - cèl·lula específics i adhesió a la membrana Basal. El primer objectiu d’aquest treball va ser la creació d’un cultiu en tres dimensions (3D) de cèl·lules epitelials d’endometri de ratolí, que permetés la possibilitat d’estudiar els diferents processos relacionats amb la morfogènesi i carcinogènesi endometrial. Un cop desenvolupat el sistema de cultiu, vam estudiar els factors extracel·lulars que influïen en la correcta formació del lumen glandular, així com l’establiment de la polaritat de les cèl·lules epitelials que formen les glàndules. D’aquesta manera hem pogut determinar un nou paper de les citocines TNF-α i IL-1α en la formació i manteniment del lumen. A més a més, també hem pogut demostrar que els glucocorticoides són els encarregats de reprimir l’expressió d’aquestes citocines a través de l’acció del receptor d’estrògens. En segon lloc, hem utilitzat el model de cultiu desenvolupat per estudiar aspectes relacionats amb la polaritat cel·lular i la carcinogènesi. Recentment s’ha suggerit que l’establiment de la polarització cel·lular podria actuar com a supressor tumoral mentre que la pèrdua de la mateixa, és un reconegut marcador de la progressió tumoral. Per aquest motiu, i utilitzant el nostre sistema de cultiu, vam voler caracteritzar l’acció del TGF-β tant en cèl·lules polaritzades com en no polaritzades. En aquest treball demostrem que la pèrdua de la polaritat canvia la resposta pro-apoptòtica del TGF-β en cèl·lules polaritzades a una resposta associada a la progressió del fenotip tumoral (EMT) en cèl·lules no polaritzades. Finalment vam voler estudiar els efectes de l’hiperestrogenisme en relació a pèrdues del gen supressor de tumors PTEN en la carcinogènesi endometrial. Per una banda, les pèrdues del supressor tumoral PTEN constitueixen una de les principals alteracions en el carcinoma d’endometri. Per altra banda, l’hiperestrogenisme és un conegut factor de risc en el desenvolupament de neoplasies endometrials. Tanmateix, no està clara si l’acció de l’estradiol sobre les cèl·lules epitelials, és directa o és dóna a través d’un efecte paracrí de les cèl·lules del estroma; i si la pèrdua d’expressió de PTEN té repercussió en els efectes produïts pels estrògens sobre l’endometri. Per aquest motiu, vam voler investigar els efectes de l’estradiol en cèl·lules polaritzades que creixen en un medi definit, sense la interferència de factors paracrins provinents de les cèl·lules de l’estroma. Els nostres estudis indiquen que l’estradiol i la Insulina cooperen en la regulació de la proliferació de cèl·lules endometrials a través del receptor d’estrògens α. A més a més, pèrdues al·lèliques en PTEN donen lloc a una proliferació desmesurada en resposta a Insulina i estradiol, similar a la que es troba en les hiperplàsies endometrials. Fa més d’una dècada que es va suggerir, per primera vegada, la rellevància de la polarització cel·lular a l’hora d’entendre els mecanismes involucrats en la morfogènesi cel·lular així com en la progressió tumoral. Tot i això, avui en dia encara es desconeixen molts dels mecanismes involucrats en aquest processos. En aquest context, el nostre treball és important perquè: per primer cop, hem generat un cultiu en 3D de cèl·lules no immortalitzades i no transformades; hem determinat quins són els factors extracel·lulars involucrats en el manteniment i formació de la cavitat luminal; hem aportat evidencies què la polaritat epitelial actua com a supressor tumoral no canònic i; hem demostrat que pèrdues en PTEN causen una hiperplàsia de les cèl·lules endometrials en resposta a l’exposició a l’estradiol i la Insulina. / El endometrio es el revestimiento interior de la mucosa del útero. Histológicamente en el endometrio podemos diferenciar dos tipos celulares epiteliales: el epitelio luminal y el glandular. Los tejidos epiteliales se caracterizan por ser tejidos polarizados que presentan unas características morfológicas distinguibles como son: polarización apico-Basal, contactos célula - célula específicos y adhesión a la membrana Basal. El primer objetivo de este trabajo fue la creación de un cultivo en tres dimensiones (3D) de células epiteliales de endometrio de ratón, que presentara algunas ventajas a los cultivos ya existentes, a la vez que permitiera la posibilidad de estudiar los diferentes procesos relacionados con la morfogénesis y la carcinogénesis endometrial. Una vez obtenido el sistema de cultivo, quisimos estudiar los factores extracelulares que influían en la correcta formación del lumen de las glándulas, así como el establecimiento de la polaridad de las células epiteliales que forman las glándulas. De esta manera hemos podido determinar un nuevo papel de las citoquinas TNF-α y IL-1α en la formación y mantenimiento del lumen. Además, también hemos podido concluir que los glucocorticoides son los encargados de reprimir la expresión de estas citoquinas a través de la acción del receptor de estrógenos. En segundo lugar, utilizamos el modelo de cultivo desarrollado, para estudiar aspectos relacionados con la polaridad celular y la carcinogénesis. Recientemente se ha sugerido que el establecimiento de la polarización celular podría actuar por si misma como un supresor tumoral, mientras que la pérdida de dicha polarización es un reconocido marcador de la progresión tumoral. Por este motivo, y utilizando nuestro sistema de cultivo, quisimos caracterizar la acción del TGF-β tanto en células polarizadas como en no polarizadas. En este trabajo demostramos que la pérdida de la polaridad, cambia la respuesta pro-apoptótica del TGF-β en células polarizadas a una respuesta asociada a la progresión del fenotipo tumoral (EMT) en células no polarizadas. Finalmente quisimos estudiar los efectos del hiperestrogenismo en la tumorogénesi endometrial. El hiperestrogenismo es un factor de riesgo muy importante en el desarrollo de neoplasias endometriales. Sin embargo, no está claro si la acción del estradiol es directa o se da mediante un efecto paracrino de las células del estroma. Por este motivo, quisimos investigar los efectos del estradiol en células polarizadas que crecían en un medio definido, sin la interferencia de factores paracrinos procedentes de las células del estroma. Gracias a nuestro estudio, hemos podido determinar que la acción del estradiol mediante el receptor de estrógenos alpha, actúa por debajo de la acción de PTEN en la tumorogénesis endometrial. Hace más de una década se sugirió, por primera vez, la relevancia de la polarización celular a la hora de entender los mecanismos involucrados en la morfogénesis celular así como la progresión tumoral. Sin embargo, hoy en día todavía se desconocen muchos de los mecanismos involucrados en estos procesos. En este contexto, nuestro trabajo es importante porque: por primera vez hemos generado un cultivo en 3D de células no transformadas, hemos determinado cuáles son los factores extracelulares involucrados en el mantenimiento y formación de la cavidad luminar, hemos aportado evidencias de que la polaridad epitelial actúa como supresor tumoral no canónico y que el hiperestrogenismo ligado a una deficiencia en la expresión de PTEN da lugar a un fenotipo de hiperplasia. / The endometrium is innermost glandular layer of the uterus. It functions as a lining for the uterus. Histologically, we can distinguish two types of epithelial cells: luminal and glandular epithelium. The epithelial tissues have some distinct morphological features such as: apico-Basal polarity, cell-cell specific contacts and adhesion to the basement membrane. The first objective of this work was to establish a three dimensional culture (3D) of mouse endometrial epithelial cells suitable for the study of endometrial morphogenesis and carcinogenesis. Once the 3D culture protocol was established, our next step was to analyze the influence of the extracellular factors in the formation and maintenance of the glandular lumen. To this regard, we have identified a new role of cytokines TNF-α and IL-1α in the formation and maintenance of the lumen. In addition, we demonstrate that glucocorticoids are the responsible of cytokine down-expression, in an estrogen receptor alpha dependent manner. Our next step was to use our culture model to study the issues related with the cellular polarity and malignance development. Recently it has been suggested that the establishment of cell polarization is a potent tumor suppressor mechanism. Loss of this polarization is a wellknown marker of tumor progression. Taking advantage of our 3D culture system, we sought to characterize the action of TGF-β in both polarized cells and in non-polarized. In this study, we show that loss of polarity changes the pro-apoptotic response of TGF-β (in polarized cells) to a response associated with tumor progression phenotype (EMT) in non-polarized cells. Finally we wanted to study the effects of hyperestrogenism. Hyperestrogenism represent a major risk for development of endometrial neoplasia. However, it is unclear whether estradiol action occurs direct or trough a paracrine effect of stromal cells. For this reason, we wanted to investigate the effects of estradiol on polarized cells growing in a defined medium without interference of paracrine stromal factors. With our study, we could conclude that estradiol trough its receptor, acts as downstream mediator on PTEN mediated tumorogenesis. More than one decade ago, cell polarization was as an important mechanisms involved in cellular morphogenesis and tumor progression. However, most of the mechanisms involved in these processes are still unknown. Our study provides new insights about mechanisms involved in those processes. In this context, we have generated, for the first time, a 3D culture from untransformed cells, we have determined the extracellular factors involved in maintaining and formation of the luminal cavity, we have provided evidence that epithelial polarity acts as a non-canonical tumor suppressor and PTEN deficient expression leads an exacerbated response to estrogen, which leads to loss of cell polarity and glands structure, two alterations observed in cancer.

Colorectal Cancer is the main type of cancer in Spain. Up to 90% of the cases are sporadic in nature and its aetiology is still unclear. It is supposed to be a multi-factorial disease, where factors play an important role in the tumor onset and development, like microbiota. The main goal of this study was to describe and quantify the bacterial community of the intestinal mucosa associated to colorectal cancer patients. This work has revealed the existence of a bacterial dysbiosis in colorectal cancer patients, which is in agreement with previous research. Specific phylotypes previously descrived using stool samples and also new phylotypes were associated with this disease.Furthermore, streptococcal populations have been studied and also a case report from a patient who present an infection caused by E. faecalis at the same time of CRC diagnosed. Future research should focus on specific aspects of intestinal microbiota such as its interaction with the host, together with the mechanisms by which bacteria can affect on the onset of tumor in the colon. / El càncer colorectal és el tipus de càncer més abundant a Espanya. Fins el 90% dels casos són d'origen espontani i la seva etiologia és desconeguda malgrat existeixen diversos factors que poden afectar en el desenvolupament tumoral, com la microbiota. L'objectiu d'aquesta tesi ha estat analitzar la composició de la comunitat microbiana en mostres de mucosa intestinal quantitativa i qualitativament. Els resultats mostren una disbiosi en els malalts de càncer colorectal i una associació amb l'augment o disminució d'espècies bacterianes, així com l'augment de determinats filotips/gèneres. També s'ha analitzat les poblacions d'estreptococs i l'exposició d'un cas clínic d'un pacient amb càncer colorectal amb una infecció causada per E. faecalis. Estudis focalitzats en aspectes més específics de la relació hoste-microbiota, així com explorar nous mecanismes induïts per bacteris són necessaris per comprendre alguns aspectes de la carcinogènesis colorectal.

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRBB) / El tráfico de membrana en el cono crecimiento axonal es clave durante el desarrollo del sistema nervioso. La familia de proteínas SNARE son una familia de moléculas cuya función principal es mediar la fusión entre membranas. Este hecho hace que las proteínas SNARE tengan potencialmente tengan un papel en el desarrollo axonal y otros procesos que impliquen una gran actividad en los procesos de tráfico de membrana: un ejemplo de casos como así es la progresión de tumores con un alto grado de recambio de membrana como el glioblastoma, que es el caso más común y mortal de astrocitoma de grado IV. Las proteínas SNAREs se clasifican en dos grupos t-SNARE (localizadas en las membranas objetivo) y v-SNARE (localizadas en las membranas vesiculares) y juntas median la fusión entre membranas a través de la formación del complejo SNARE. El complejo SNARE mejor caracterizado es el tetrámero formado por Sintaxina1 (Stx1), dos SNAP-25 y VAMP2. En esta tesis doctoral estudiamos en primer lugar el papel de las proteínas SNARE en los procesos de guía axonal. Para ello utilizamos como modelo el desarrollo del sistema nervioso embrionario en Drosophila melanogaster y obtuvimos como resultado que problemas en las proteínas SNARE, especialmente en Sintaxina1A (Syx1A), generan problemas de guía axonal en el sistema nervioso. Si nos centramos en los estudios del desarrollo del sistema nervioso en mutantes nulos para Syx1A, todas las estructuras nerviosas desde el sistema nervioso central, los nervios motores y el sistema periférico desarrollaron problemas de guía axonal. Además, estudios de interacción génica y una detalla caracterización del fenotipo sugieren que la alteración de las proteínas SNARE, especialmente Syx1A, genera problemas en la vía de guía axonal Slit/Robo. En segundo lugar, estudiamos el rol de las proteínas SNARE en la progresión tumoral. Pare ello analizamos los efectos in vitro e in vivo que tiene el bloqueo de la función de Stx1 en líneas celulares y modelos murínicos del glioblastoma Como resultado, detectamos una pérdida de la proliferación in vitro e in vivo al bloquear Stx1. Además, el bloqueo de Stx1 disminuye la capacidad invasiva in vitro de las células de glioblastoma. / The membrane delivery/traffic in the growth cone is a key element during axons development. SNARE family proteins may be important players in this process since they mediate the fusion of membrane vesicles with their targets. Moreover, since membrane trafficking is a key element during the progression of several tumors, SNAREs may be important also during tumoral progression. Two groups form the SNARE family: t-SNARE (Syntaxins, SNAPs…) located in the target membranes, and, v-SNARE (VAMPs), located in the vesicles. Complexes between specific t- and v- SNAREs are formed which ultimately leads to the fusion of vesicles with their target membranes. The best-characterized SNARE complex is the tetramer formed by syntaxin1 (Stx1), two SNAP-25 and VAMP2, which mediates the fusion of synaptic vesicles during the exocytosis of neurotransmitters. In order to study the role of SNARE in axon guidance we used as a model Drosophila melanogaster embryonic nerve system development. Embryos mutant for SNARE proteins developed axon guidance defects. From all the stocks, Syx1A had a severe phenotype in comparison with the other mutants. Syx1A null embryos developed axon guidance problems in all the nerve system structures: ventral nerve cord, motor axons or peripheral nerves. In addition, a deep analysis of the phenotype and genetic interaction studies suggest that Syx1A mutants have problems in Slit/Robo axon guidance pathway. In order to study the role of SNARE protein in tumoral progression we studied in vitro and in vivo the effect of Stx1 inactivation in glioblastoma models (glioblastomas are the most common and deadliest astrocitomas). Our results show that the loss of function in Stx1 decreases in vitro and in vivo glioblastoma progression and it blocks in vitro cellular invasion.