En este trabajo se han analizado las siguientes características cariotípicas de diferentes especies de primates Simiiformes: 1) HOMOLOGIAS Y REORGANIZACIONES CROMOSÓMICAS. Mediante la comparación de su patrón de bandas G, se han determinado las homologías cromosómicas de dos especies del género Cebus (C. apella y C. capucinus) y de diferentes especies del género Ateles (A. belzebuth hybridus, A. b. marginatus, A. paniscus paniscus y A. p. chameck). Esta comparación ha permitido determinar las reorganizaciones cromosómicas que explicarían las homologías detectadas: 3 inversiones pericéntricas en el caso de las especies del género Cebus y 4 inversiones pericéntricas, una paracéntrica y una fusión en el caso de Ateles. La aplicación de la técnica de ZOO-FISH y bandas G secuenciales utilizando las sondas de todos los cromosomas humanos completos, ha permitido determinar las homologías entre la especie humana (HSA), Cebus apella (CAP) y Ateles belzebuth hybridus (ABH). La comparación de los cromosomas o segmentos cromosómicos homólogos de las especies comparadas, ha permitido determinar las reorganizaciones cromosómicas que explicarían las homologías detectadas, y las bandas implicadas en dichas reorganizaciones. Las reorganizaciones cromosómicas detectadas han sido: a) 11 fisiones, 10 fusiones, 12 inversiones pericéntricas, 9 activaciones/inactivaciones centroméricas y 3 inversiones paracéntricas al comparar HSA y CAP; b) 19 fusiones, 11 fisiones, 18 activaciones /inactivaciones centroméricas y 6 inversiones pericéntricas al comparar HSA y ABH; y c) 17 fusiones, 11 activaciones/inactivaciones centroméricas, 5 inversiones pericéntricas, 3 fisiones y 3 inversiones paracéntricas al comparar CAP y ABH. Se ha analizado la relación existente entre las bandas implicadas en reorganizaciones cromosómicas evolutivas de la especie humana y de CAP con la localización de lugares frágiles y bandas sensibles al efecto de las radiaciones ionizantes en ambos cariotipos. Aplicando el test de la Ji cuadrado, se ha podido concluir que las coincidencias observadas no son estadísticamente significativas. Se ha determinado también el cariotipo ancestral de los Platyrrhini, así como las homologías de estos cromosomas ancestrales con los del cariotipo humano.2) ANÁLISIS CUALITATIVO DE LA HETEROCROMATINA CONSTITUTIVA. Se ha realizado el análisis cualitativo de la heterocromatina constitutiva de 15 especies de primates Simiiformes: Homo sapiens, Pan troglodytes, Gorilla gorilla, Hylobates syndactylus, Macaca fascicularis, M. tibetana, Papio leucophaeus, P. sphinx, Cercopithecus aethiops, C. sabaeus, C. albogularis, Cebus apella, Ateles belzebuth hybridus, Aotus azarae y A. nancymai. Las técnicas utilizadas para realizar este análisis han sido: a) digestión in situ con los enzimas de restricción AluI, HaeIII, RsaI y Sau3A y b) tinción con el par DA/DAPI en cromosomas sin bandeo previo, en cromosomas con bandeo C previo, y en cromosomas con bandeo G/C previo. La homogeneidad en la heterocromatina intersticial y terminal (HIT), y la heterogeneidad en la heterocromatina de localización centromérica (HC) observadas en la mayor parte de las especies analizadas, parece indicar un origen evolutivo relativamente reciente de la HIT e independiente del de la HC, que tendría un origen más antiguo. / In this work, the following cytogenetic chraracteristics from different Simiiiformes species have been analyzed:1) CHROMOSOMAL HOMOLOGIES AND REORGANIZATIONS. G-banding comparison has been used to determine homologies between two species of Cebus genus (C. apella and C. capucinus), and from different Ateles subspecies (A. belzebuth hybridus, A. b. marginatus, A. paniscus paniscus y A. p. chameck). This study has allowed to establish chromosomal reorganizations that could explain the homologies detected: 3 pericentric inversions in Cebus species, and one paracentric and 4 pericentric inversions, and a fusion in the Ateles subspecies. ZOO-FISH and sequential G-banding technique using whole human chromosome probes, have been used to determine chromosomal homologies between humans (HSA), Cebus apella (CAP) and Ateles belzebuth hybridus (ABH). G-banding comparison of homologous chromosomes from those species has allowed to characterize the chromosomal reorganization that could explain the homologies detected, as well as the bands involved in these reorganizations. The chromosomal reorganizations detected are: a) 11 fissions, 10 fusions, 12 pericentric inversions, 9 centromeric activations/inactivations and 3 paracentric inversions when HSA and CAP were compared; b) 19 fusions, 11 fissions, 18 centromeric activations/inactivations and 6 pericentric inversions when HSA and ABH are compared and c) 17 fusions, 11 centromeric activations/inactivations, 5 pericentrics inversions, 3 fissions and 3 paracentric inversions when CAP and ABH are compared. Relationship between bands involved in evolutive chromosomal reorganizations of HSA and CAP and localization of Fragile Sites and bands sensitive to the ionized radiations in both karyotypes, have been analyzed. Using the Chi square test, results show that coincidences observed are not statistically significant. In this work, the ancestral karyotype of Platyrrhini group is proposed, as well as the homologies between its chromosomes and those of the human karyotype. 2) QUALITATIVE ANALYSIS OF CONSTITUTIVE HETEROCHROMATIN. Constitutive heterochromatin from 15 Simiiformes primate species has been analyzed: Homo sapiens, Pan troglodytes, Gorilla gorilla, Hylobates syndactylus, Macaca fascicularis, M. tibetana, Papio leucophaeus, P. sphinx, Cercopithecus aethiops, C. sabaeus, C. albogularis, Cebus apella, Ateles belzebuth hybridus, Aotus azarae y A. nancymai. Techniques used are: a) in situ digestion with the restiction enzymes AluI, HaeIII, RsaI and Sau3A and b) fluorescent staining with DA/DAPI on unbanded, C-banded and G/C banded chromosomes. The homogeneity in the interstitial and terminal heterochromatin (ITH), and the heterogeneity in centromeric heterochromatin (CH) observed in nearly all the species analyzed seem to indicate that ITH has a more recent evolutive origin than CH.

El objetivo principal de la presente tesis doctoral ha consistido en la comprobación de la siguiente hipótesis de trabajo: las bandas cromosómicas implicadas en reorganizaciones cromosómicas evolutivas podrían ser la expresión de regiones cromosómicas inestables, como son los lugares frágiles. Al mismo tiempo, las secuencias teloméricas en regiones internes de los cromosomas podrían ser el resultado de reorganizaciones cromosómicas evolutivas.Para cumplir dicho objetivo se han descrito, en primer lugar la descripción de homologías cromosómicas entre cariotipos de diferentes especies de Primates, y determinar las reorganizaciones cromosómicas que explican dichas homologías, así como las bandas cromosómicas implicadas en dichas reorganizaciones. Las especies de Primates estudiadas han sido: Macaca fascicularis, Macaca arctoides, Mandrillus sphinx, Cebus apella, Cebus nigrivittatus y Homo sapiens. En segundo lugar, se ha analizado la expresión citogenética de los lugares frágiles en las especies de Primates caracterizadas y se ha comparado su localización con los lugares frágiles descritos en la especie humana en la literatura con la finalidad de determinar si dichas regiones se han conservado durante el proceso evolutivo. Al mismo tiempo se ha estudiado la distribución de las secuencias teloméricas en posiciones internas de los cromosomas de las especies Macaca fascicularis, Cebus apella. Y por último, se ha relacionado la localización de lugares frágiles y la distribución de las secuencias teloméricas intersticiales con las bandas cromosómicas implicadas en reorganizaciones evolutivas.Por tanto, el uso combinado de las técnicas de citogenética clásica e hibridación in situ fluorescente (FISH) ha permitido: (1) la caracterización citogenética de la especies de Primates estudiadas en el presente trabajo, (2) establecer las homologías cromosómicas entre sus cariotipos y el cariotipo humano, (3) determinar las reorganizaciones que explicarían dichas homologías y (4) identificar las bandas cromosómicas implicadas en dichas reorganizaciones. El estudio comparativo de la localización de los lugares frágiles muestra que existe una conservación entre las especies de primates estudiadas. Como resultado significativo, cabe destacar que las reorganizaciones cromosómicas evolutivas no se distribuyen al azar, ya que existe una correlación positiva con la localización de los lugares frágiles. Como conclusión final, hemos podido establecer una clara relación entre puntos de rotura evolutivos, bandas cromosómicas que expresan lugares frágiles y la localización de secuencias teloméricas intersticiales.

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica - Parc Científic de Barcelona / The Armcx gene cluster arose by retrotransposition from a single Arm-containing gene (Armc10), and by subsequent short-range tandem duplications of a rapidly evolving region of the Eutherian X chromosome. In this work we analysed the expression of Armcx/Armc10 genes during embryonic development, describing their expression in the developing neural tissues. As yet shown for Alex3 protein, Armc10 also causes mitochondrial aggregation and/or tethering in neurons and HEK293 cells. In neurons, these processes are believed to serve to capture mitochondria at specific locations requiring high-energy and Ca2+ buffering conditions. The mechanism by which Alex3 and Armc10 cause mitochondrial aggregation may involve Mitofusins, as they both interact with Mfn1 and Mfn2. Nevertheless, we were unable to find evidence about the involvement of Alex3 protein in mitochondrial fusion. Alex3 and Armc10 interact with the KIF5/Miro/Trak2 complex (which controls mitochondrial dynamics in neurons), through a direct interaction with Miro1-2 and Trak2. Importantly, this interaction requires low Ca2+ concentrations. We suggest that the Ca2+-dependent conformational changes in Miro proteins are the essential mechanisms regulating the interaction between Alex3 and the Miro/Trak2complex. Thus, while low Ca2+ concentrations may favour the formation of KIF5/Miro/Trak2/Alex3 complex, increases in intracellular Ca2+ rapidly uncouple such complex (including Alex3), thereby arresting mitochondrial trafficking. The notion that Alex3 (and possibly also Armc10) interacts with the Miro/Trak2 complex when mitochondria are motile at low Ca2+ concentrations is further supported by our findings that knockdown of Alex3 (such as Armc10) results in a decrease in the percentages of motile mitochondria, similarly to what was observed in Miro/Trak2 loss-of-function. In conclusion, we described Alex3 and Armc10 as proteins with evolutionarily conserved functions in the regulation of mitochondrial dynamics and transport. However, gene-specific particularities are present, suggesting overlapping but differential levels and mechanism of regulation of mitochondrial dynamics and transport by Alex3 and Armc10 proteins and probably by the whole Armcx cluster. We next speculate that Alex3 (but also the whole Armcx cluster) could play a role in regulation of mitochondrial dynamics or function during neural development by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway. Using the chicken spinal cord as physiological model, we found that Alex3 overexpression decreases TCF/LEF-transcriptional activity at basal condition and following Wnt3a or β-catenin induction, indicating that Alex3 substantially acts as an inhibitor of canonical Wnt/β-catenin pathway. Moreover, we showed that Alex3 is involved in both negative cell cycle regulation and induction of differentiation in chicken spinal cord, while Armc10 is only involved in negative cell cycle regulation. These differences between Alex3 and Armc10 overexpression effects on spinal cord developmental processes highlight functional divergences between the two proteins, suggesting that Alex3 may have acquired additional function respect to Armc10, phylogenetic ancestor of the whole Armcx gene cluster. The data collected in this study, describing Alex3 overexpression effects on spinal cord development, are coherent with the inhibitor function of Alex3 on Wnt/β-catenin pathway. However there is not sufficient evidence to sustain that these effects on progenitor cell cycle and neuronal differentiation are achieved by inhibition of Wnt/β-catenin pathway and further experiments are required to support this hypothesis. To shade light on the biological processes in which Alex3 can be involved (trough regulation of mitochondrial dynamics, regulation of Wnt/β-catenin pathway or new and different activity) we carried out a genome-wide analysis of changes in mRNA levels subjecting HEK293AD cells stably expressing Alex3GFP to microarray analysis. We found changes in global gene expression that involved key processes of cellular physiology, such as metabolic processes or cell cycle progression. However we are still far to identify the cellular and molecular mechanism by which Alex3 (and the whole Armcx/Armc10 cluster gene) acts in these processes. To achieve this goal it is essential to clarify Armcx/Armc10 function in nervous system development. / Los genes Armcx pertenecen a una misma familia localizada en el cromosoma X y caracterizada por la posesión de dominios armadillo en su secuencia proteica. En este trabajo se ha analizado la expresión de los genes Armcx/Armc10 durante el desarrollo embrionario, en los tejidos neurales en desarrollo y en el cerebro adulto. A continuación se ha analizado localización subcellular de las proteínas Armc10 y Alex3 (codificada por el gen Armcx3), que se encontraron mayoritariamente localizadas a núcleo y mitocondria. La sobreexpresión de Armc10 y Alex3 provoca la agregación y/o “tethering” mitocondrial en las neuronas, donde estos procesos sirven para anclar estas organelas en localizaciones específicas que requieren una alta demanda de energía y unos requerimientos de taponamiento de Ca2+. En la base de nuestros datos bioquímicos y de los estudios funcionales proponemos un modelo en el que las proteínas Alex3 y Armc10 son reguladores positivos del tráfico mitocondrial, interaccionando directamente con los complejos Miro/Trak2. Además, como se muestra para el complejo KIF5/Miro/Trak2, el incremento de la actividad neuronal que conlleva a incrementos en Ca2+ es probablemente la causa del desensamblaje del complejo y de la parada mitocondrial en los lugares de neurotransmisión activa, completando por lo tanto los requerimientos bioenergéticos de la transmisión neuronal. A continuaciòn utilizamos la médula espinal de pollo como modelo fisiológico in vivo para explorar la función de Alex3 y Armc10 en el desarrollo neural. Se encontró que Alex3 cumple un papel regulador por inhibición de la vía de Wnt/β-catenina. También demostramos que Alex3 está involucrado tanto en la regulación negativa del ciclo celular como en la inducción de la diferenciación de precursores neuronales. Por otro lado, Armc10 sólo se encontrò implicado en la regulación negativa del ciclo celular. Estas diferencias entre los efectos de la sobreexpresión de Alex3 y Armc10 en procesos llave del desarrollo de la médula espinal, evidencian las divergencias funcionales entre las dos proteínas, sugiriendo que Alex3 puede haber adquirido funciones adicionales respecto a Armc10, ancestro filogenético del cluster Armcx. Globalmente nuestros datos sugieren que la vía de señalización de Wnt puede estar regulando procesos llave del desarrollo a través de las proteínas mitocondriales Alex3 y Armc10.

Las Quimiocinas constituyen un pequeño grupo de moléculas estructuralmente relacionadas, que se caracterizan por regular el tráfico de varios tipos de leucocitos en condiciones fisiológicas y patológicas. En general las quimiocinas se han clasificado en cuatro grupos, en función de los residuos de cisteína que se encuentran en el extremo N-terminal de la proteína madura. Los cuatro grupos son: Las CXC quimiocinas ó a-quimiocina, las CC quimiocinas ó b-quimiocinas, las C quimiocinas ó g-quimiocina y finalmente la CX3C quimiocina ó d-quimiocina. Dentro del grupo de las b-quimiocinas, se encuentran MIP-1a y MIP-1b, que se localizan en el cromosoma 17q 11.2.Las quimiocinas ejercen sus efectos biológicos, a través de la unión con sus receptores que se encuentran expresados en la superficie de diversos grupos leucocitarios. Se ha descrito la utilización de tres receptores para MIP-1b: CCR5, CCR8 y CCR9, siendo el CCR5 el que le otorga propiedades antivirales, ya que éste representa uno de los correceptores del VIH-1.Se ha descrito que MIP-1b ésta codificada por dos loci, el Locus A y el locus B; y que éste último define un polimorfismo en la quimiocina. Esta forma polimórfica se caracteriza por la deleción de 15 pb en el exón 3, que se origina a partir de un cambio de base (A260 - G), provocando que se sintetice una proteína con 5 aminoácidos menos. Para determinar la incidencia de este polimorfismo dentro de la población sana, se estudió la distribución alélica en 200 individuos sanos a través de la técnica de PCR-SSP, confirmadas posteriormente por las técnicas de PCR-SSO post-hibridación y secuenciación; revelando que la frecuencia del alelo canónico representa un 83,5%, mientras que la frecuencia del alelo polimórfico representa un 16,5%. Así mismo el estudio fue realizado en una población de pacientes con enfermedades tiroideas autoinmunes, pacientes diabéticos, pacientes con hepatitis C, observando que existe una correlación entre la frecuencia genómica y la frecuencia alélica de estos pacientes respecto a la población normal. Sin embargo, en los pacientes con VIH se observaron diferencias claras y estadísticamente significativas respecto a los individuos sanos. Para estudiar los niveles de expresión de MIP-1a y de MIP-1b, utilizamos un protocolo que, aprovechando pequeñas diferencias a nivel de la secuencia nucleotídica, combina RT-PCR y restricción con MspI para estimar semicuantitativamente los niveles de ARNm de los loci codificantes para cada una de las dos quimiocinas. El aspecto más relevante de esta técnica, es el uso de un fragmento de ADN recombinante, que actúa de Estándar Interno, tanto para MIP-1a como para MIP-b, a la vez que contiene un lugar de restricción para MspI. De esta manera actúa como control de la amplificación y de la digestión. Esta metodología se aplicó para determinar las posibles diferencias que pudieran existir en los niveles de expresión de los loci A y B de MIP-1b, en la línea celular U-937 tras su estimulación con PMA, LPS e ionomicina, así como también entre individuos sanos y pacientes VIH+ (de diferentes genotipos) en PBMCs y linfocitos T CD8+, estimulados con PHA e IL-2.El estudio mostró que los loci A y B se regulan de manera diferente en las células U-937 y las cinéticas de expresión de mRNA son equivalentes en PBMCs y linfocitos T CD8 de pacientes VIH+ y en controles. En términos generales el locus B contribuye de manera minoritaria a la síntesis de mRNA de MIP-1b y la cinética de inducción del mRNA de los linfocitos T CD8, se ve retrasada en heterocigotos y homocigotos (bb).Por otro lado, los niveles de expresión del receptor CCR5 en linfocitos T CD4+ son diferentes a los que presentan los controles.Finalmente, podemos concluir que MIP-1b ejerce un efecto diferencial sobre sus células diana debido a las distintas iso- y alo-formas que presenta. / The chemokines are a small group of structurally related molecules that regulate cell trafficking of various types of leukocytes in physiologic and pathologic conditions. In general the chemokines can be divided into four groups based on a structural cysteine motiff found near to the amino-terminus of the mature protein. The four groups are as follows: The CXC or a-chemokines, the CC or b-chemokines, the C or g-chemokine and finally the CX3C or d-chemokine. Into the b-chemokines groups, we found MIP-1a and MIP-1b chemokines, that are clustered at chromosome 17 q 11.2.The chemokines exert their biological functions trough binding to seven transmembrane-domain receptors wich are expressed on a variety of leukocyte populations. Three receptors has been described for MIP-1b: CCR5, CCR8 and CCR9, being CCR5 who give it antiviral properties, because it is one of the VIH-1 coreceptors.Human MIP-1b in encoded by two loci, locus A and locus B, and the last one define a polymorphism in this chemokine. This polymorfic form is characterized by a deletion of the first 15 bp in exon 3 and its caused by a mutation A260-G, origining a protein that lacks 5 amino acids. In order to determine the healthy population incidence of this polymorphism, we have studied their allelic distribution in 200 donors using the PCR-SSP technique, confirmed by PCR-SSO technique post-hibridization and sequentiation, showing that the frequency of the canonic form represent a 83,5% whereas a polymorphic form represent a 16,5%. On the other hand, this study was done in a population of thyroid autoimmune disseasse patients, diabetes patients and , hepatitis C patients showing that exist a correlation between genomic frequency and allelic frequency that these patienes with the healthy population. However, the VIH patients showed differences statistically significant respect to the healthy population.In the study of the level expression of MIP-1a and MIP-1b, we used a protocol that, taking advantage of small difference in nucleotide sequence, combines RT-PCR and restriction with MspI to allow the semiquantitative assessment of mRNAs from the two chemokines. The key feature of our approach is the introduction of an internal standard common to MIP-1a and MIP-1b wich is co-amplified and contains a MspI restriction site. This allow and easy control of the amplification and the efficiency of the restriction. This method was used to determine the possible difference in the level expression of the loci A and B of MIP-1b in the cellular line U-937 after its stimulation with PMA, LPS and Ionomicine, as well as between healthy populations and VIH patients (of different genotype) in stimulated PBMCs and lymphocytes TCD8 with PHA and IL-2.The study show that the loci A and B are regulated of different way in the cellular line U-937, and the mRNA cinetics expression are equivalents in VIH patients and healthy populations PBMCs and lymphocytes TCD8. In general terms, the locus B contribute in a minoritary way to the synthesis of the mRNA of MIP-1b and the induction cinetic of the mRNA of the lymphocytes TCD8 are deleted in heterozigous and homozigous (bb).On the other hand, the expression levels of CCR5 receptor in lymphocytes TCD4 are different to the controls.Finally, we can conclude that MIP-1b acts in a different way in a target cells due to a different iso- and alo-forms that it present.

En la siguiente Tesis Doctoral hemos analizado la influencia de la testosterona (T) exógena sobre el metabolismo de esteroides sexuales y la fisiología de la gónada de la dorada (Sparus aurata L.). Además hemos descrito la presencia de un mecanismo de procesamiento alternativo del ARN, para el receptor de andrógenos (AR), cuya expresión varía con el estado reproductor y se correlaciona con el nivel de T. Esta forma truncada del AR está presente en los granulocitos acidófilos (GAs), descubriéndonos así nuevos mecanismos de regulación en la biología de los neutrófilos de vertebrados. El uso de la dorada como ejemplar de estudio se debe a que es una especie de alto interés comercial en el Mar Mediterráneo. La dorada es un teleósteo marino que presenta un hermafroditismo protándrico, siendo los ejemplares machos durante sus dos primeros años de vida, y pudiendo cambiar de sexo a partir del segundo año. El ciclo reproductor (CR) de los ejemplares macho se caracteriza por presentar cuatro etapas secuenciales: espermatogénesis (ES), puesta (P), post-puesta (PP) y quiesciencia (Q) durante el primer CR. La etapa de Q es sustituida por una etapa de involución testicular (IT), en el segundo CR que permite el cambio de sexo. Tras la puesta, el testículo suele sufrir una serie de cambios morfológicos, entre los que se encuentra una infiltración masiva de leucocitos, la cual es mayor en la etapa IT, antes del cambio de sexo. En primer lugar, quisimos comprobar la capacidad de la T exógena para modificar el balance de las hormonas sexuales esteroideas y la fisiología de la gónada. Con este fin, incorporamos la T en las doradas utilizando el sistema de micropartículas in situ (ISM) (T-ISM). La T exógena promueve un incremento supra-fisiológico en los niveles plasmáticos de T y una disminución de los niveles de 17β-estardiol (E2). Sin embargo, no se vieron alterados los niveles de 11-cetotestosterona (11KT). La T, además, bloquea la proliferación de las células germinales del testículo aunque el incremento en la expresión del gen que codifica para dmrt1 podría prevenir la eliminación completa de las células germinales. Por otra parte, comprobamos que los andrógenos, al igual que había sido demostrado para los estrógenos, están implicados en la migración de leucocitos hacia la gónada. Además, la T de los T-ISM promueve una disminución de la expresión de los genes que codifican receptores Toll-like (tlrs), quedando inhibida la capacidad de reconocer y responder a patógenos. Posteriormente, identificamos una variante, constitutivamente activa, del AR que carece de dominio de unión al ligando (ARΔLBD) en testículo y riñón cefálico (RC) de dorada y su expresión varía con el estado reproductor y con los niveles plasmáticos de testosterona. Esta variante se forma por un procesamiento alternativo del ARNm del AR. Nuestros datos sugieren que este procesamiento alternativo es capaz de modificar la fisiología del testículo, debido a que los andrógenos son capaces de modular el procesamiento alternativo del AR. Además, los andrógenos, concretamente la T, es capaz de regular la respuesta inmunitaria a través de la variante ARΔLBD. Otro dato interesante es que sólo los AGs expresan esta forma truncada mientras que los macrófagos (MØs) no la expresan. Además, el procesamiento alternativo del AR también no sólo se ve modulado por T, sino también por estímulos inmunitarios, aunque esta modulación depende del estado reproductor de los individuos. Todos estos datos nos indican una interacción entre los estímulos endocrinos e inmunitarios en la regulación del procesamiento alternativo del AR así como de las funciones de los AGs. Además, la T podría estar implicada en los cambios fisiológicos de la gónada a través de la regulación del ARΔLBD. / During the development of this thesis, we want to analyze the effect of exogenous androgens, mainly testosterone (T), and the activity of androgen receptor (AR) in immune-reproductive interaction in the sparidae, gilthead seabream (Sparus aurata L.). Furthermore, we described the presence of a mechanism, in which the unique AR gene can give diverse transcripts either in testis or immune organs. The gilthead seabream is a marine, protandrous teleost fish with significant economic value in the Mediterranean aquaculture. The specimens of this specie are male during the two first years, and present a reproductive cycle (RC) divided in four stages. In first RC, the stages are spermatogenesis (SG), spawning (S), post-spawning (PS) and resting (R); in the second RC, the last stage is substituted by testicular involution (TI) stage. After spawning there are various changes in gonad, between which are a massive infiltration of leukocytes, being higher in TI and that can lead to sex change. For this motive this specie can being used as a model for studying the immune-reproductive interactions. In first place, we wanted to observe the capacity of exogenous T to modify the balance of sex steroid hormones and on the physiology of the gonad (proliferation, apoptosis, leukocyte influx and immune status) of mature male specimens of the gilthead seabream. To this end, we used the in situ forming microparticle (ISM) system, which delivers sex steroids without promoting significant physiological alterations in gilthead seabream and that has been previously used in our laboratory to show that T modulates the inflammatory response of head kidney (HK) leukocytes in the gilthead seabream. The results suggest that in mature males, exogenous T can blocked the cell proliferation and increase the migratory influx of leukocyte, although decrease the ability to recognize and response to pathogens. Secondly, we identified a truncated form of the AR generated by alternative splicing that lacks the ligand-binding domain (ARΔLBD) either in testis, HK and acidophilic granulocytes (AGs). We studied the modulation of this variant by androgens and immune stimulus in order to demonstrate its mediation in the role of androgens in the immune response. The results showed that T is able to regulate the testicular morphology through the modulation of the expression of ARΔLBD variant. Furthermore, T was also able to regulate the immunecompetence through ARΔLBD variant. Interestingly, ARΔLBD variant only is expressed in AGs but no in macrophages (MØ). Furthermore, the stimulation with bacterial DNA, also regulated the alternative splicing of AR, but depending of the reproductive stage. These data suggest a crosstalk between endocrine and immune stimuli in the regulation of AR alternative splicing and AGs function. Furthermore, T might be implicated, in the migratory influx into gonad and the physiological changes in gonad through by means of regulation of ARΔLBD.

La mayoría de las técnicas actuales para el estudio celular se basan en el análisis de poblaciones celulares y proporcionan resultados que corresponden a valores promedio de toda la población. Sin embargo, multitud de estudios indican la existencia de una variabilidad substancial entre células fenotípicamente similares, y evidencian la necesidad de disponer de sistemas adecuados para el estudio de células individuales. Esta necesidad ha motivado la aparición de trabajos interdisciplinarios entre el campo de la biología y otras áreas de conocimiento como la microelectrónica, que permite desarrollar estructuras y dispositivos tridimensionales con formas complejas a micro y nanoescala. Este trabajo se enmarca dentro de un proyecto de investigación más amplio que tiene como objetivo principal diseñar y fabricar BioMEMS (sistemas microelectromecánicos para aplicaciones biológicas) que permitan el estudio individualizado de células vivas desde su interior o su exterior. Estos dispositivos, en el futuro, deberán ser capaces de llevar a cabo diversas funciones, detectar parámetros celulares y actuar en consecuencia. Los estudios realizados en este trabajo corresponden a la fase inicial del proyecto, y pretenden sentar las bases para el desarrollo de BioMEMS de tamaño subcelular que puedan ser interiorizados en células para aplicaciones en célula única viva. Basándonos en este objetivo principal, se seleccionó el silicio como material apropiado para la fabricación de MEMS y biocompatible en condiciones extracelulares. Utilizando líneas celulares establecidas en cultivo con capacidad fagocítica, se analizó la vía de interiorización, el destino intracelular y la citotoxicidad de micropartículas con base de silicio fabricadas mediante técnicas de la industria microelectrónica. Como prueba definitiva, el efecto citotóxico de estas partículas en el interior celular también se evaluó utilizando embriones de ratón en estadio preimplantacional, extremadamente sensibles a cualquier alteración. Una vez validado el material, como primera aplicación y para demostrar la utilidad de estos dispositivos en estudios de célula única viva, nos propusimos diseñar un sistema de etiquetaje individual de células. Se diseñaron micropartículas que integraban unidades de información básica, y mediante este sistema fue posible etiquetar y trazar células vivas en cultivo con capacidad fagocítica. Finalmente, con tal de poder hacer extensiva esta aplicación a cualquier tipo celular, se optimizó un sistema de modificación química de la superficie de estas micropartículas con moléculas específicas (anticuerpos y lectinas). Las micropartículas modificadas se utilizaron para etiquetar y seguir células vivas e cultivo sin capacidad fagocítica. En el futuro, la utilización del sistema de modificación química de micropartículas desarrollado en el presente trabajo abre la posibilidad de dirigir los dispositivos hacia estructuras celulares concretas (membrana plasmática, núcleo, etc.) pero también de usarlos para la detección de moléculas específicas presentes en las células (por ejemplo la activación de caspasas, el incremento de ROS o las variaciones de concentración de Ca2+). Los resultados obtenidos, por lo tanto, abren una nueva vía de investigación prometedora, significan un progreso en el campo de estudio de los BioMEMS, y son la base para el diseño de futuros dispositivos intracelulares para el análisis de parámetros en célula única in situ.

Tras el trasplante, el sistema inmunitario se activa para inducir una respuesta inmunitaria contra los antígenos de histocompatibilidad del donante expresados por el injerto (alo-antigenos), que conduce al rechazo del órgano. Las células dendríticas (CD) son las células presentadoras de antígeno más potentes y tiene un papel fundamental en la iniciación de la respuesta inmunitaria contra el injerto mediante la presentación de aloantígenos a las células T a través de varias vías. No obstante, las CD son también participantes clave en la inducción de tolerancia. Uno de los principales objetivos en el trasplante es la inducción de tolerancia específica de donante evitando de este modo la administración crónica de inmunosupresión, que tiene muchos efectos secundarios. La comprensión de los mecanismos inmunológicos implicados en el rechazo del trasplante ha permitido la generación de terapias alternativas a la inmunosupresión convencional. En diferentes modelos animales, se han empleado varias estrategias para inducir la tolerancia del injerto tales como la inyección de CD tolerogénicas. En humanos, existen varias posibles fuentes de aloantígenos incluyendo los exosomas, que se pueden aislar de diferentes fluidos biológicos. El objetivo de esta tesis es investigar el potencial uso de los exosomas derivados de plasma como fuente de aloantígenos, la capacidad de las células dendríticas humanas de sangre periférica para capturar exosomas alogénicos y, finalmente, evaluar el efecto de las CD tolerogénicas en la supervivencia del injerto en un modelo de trasplante renal alogénico en rata. Nuestros resultados proporcionan información valiosa sobre las microvesículas derivadas del plasma. Mediante análisis proteómico hemos detectado 161 proteínas asociadas a las microvesículas, incluyendo muchas relacionadas con el complemento y con las cascadas de transducción de señales de la coagulación. Sin embargo, cuando las preparaciones enriquecidas en exosomas fueron analizadas el número de proteínas identificado fue muy reducido, lo que sugiere que en condiciones saludables hay cantidades limitadas de exosomas y, por tanto, no son una fuente viable de aloantígenos. Por otra parte, nuestros resultados proporcionan nueva información sobre la interacción de las células dendríticas humanas de sangre periférica con los exosomas alogénicos. Los experimentos in vitro muestran que tanto las CD convencionales como las plasmacitoides capturan exosomas derivados de una línea de células T aunque con diferente capacidad. La captura de los exosomas por las CD plasmacitoides no modifica su estado de activación. Además, las CD plasmacitoides cargadas con los exosomas son capaces de estimular linfocitos T autólogos lo que sugiere que esta población podría tener un papel en la presentación de aloantígenos. Por último, hemos generado CD tolerogénicas en presencia de dexametasona con el fin de evaluar su efecto en un modelo de trasplante renal en rata. Los aloantígenos donantes fueron obtenidos a partir de exosomas derivados de células dendríticas inmaduras derivadas de médula ósea. Tras la captura de los exosomas donantes, las CD presentan un fenotipo semi-maduro y un perfil de citocinas anti-inflamatorio. Aunque estas DC tolerogénicas no mejoran la supervivencia del aloinjerto tras su inyección vía intravenosa en las ratas receptoras del riñón, son capaces de modificar el número de células B en sangre periférica. Además, los experimentos in vitro muestran que las CD tolerogénicas son capaces de inhibir la proliferación dependiente de LPS de las células B. Estos resultados indican que las CD tolerogénicas, cargadas o no con exosomas donantes in vitro, pueden tener un papel biológico en el rechazo del trasplante a través de la modulación de la respuesta de células B. / Following transplantation, the immune system is triggered to induce an immune response to donor histocompatibility antigens expressed by the graft (allo-antigens), leading to organ rejection. Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen presenting cells and have a fundamental role in the initiation of the immune response to the graft by presenting allo-antigens to T cells through several pathways. However, DCs are also key players in the induction of tolerance. One of the main targets in transplantation is the induction of donor-specific tolerance thereby avoiding chronic administration of immunosuppression, which has many side effects. Understanding the immunological mechanisms involved in transplant rejection has allowed the generation of alternative therapies to conventional immunosuppression. In different animal models, several strategies have been employed to induce graft tolerance such as the injection of tolerogenic DCs. In humans, there are several possible sources of alloantigens including exosomes, which can be isolated from several biological fluids. The aim of this thesis is to investigate the potential use of plasma-derived exosomes as a source of alloantigens, the ability of human peripheral blood dendritic cells to capture allogeneic exosomes and finally, evaluate the effect of recipient tolerogenic DCs on allograft survival in a model of allogeneic kidney transplantation in rats. Our results provide valuable information about plasma-derived microvesicles. By proteomic analysis, we have detected 161 microvesicle-associated proteins, including many related to the complement and coagulation signal-transduction cascades. However, when exosomes-enriched preparations were analysed the number of proteins identified was much reduced, suggesting that under healthy conditions there are limited amounts of exosomes and, therefore, are not a feasible source of alloantigens. Moreover, our results provide some insight in the interaction of human peripheral blood DCs subsets with allogeneic exosomes. In vitro analyses show that both conventional DCs (cDCs) and plasmacytoid DCs (pDCs) capture exosomes from a T-cell line, although with different ability. The uptake of exosomes does not modify the activation state of pDCs. In addition, exosomes-loaded pDCs are able to stimulate autologous T cells suggesting that this subset could have a role in allo-antigen presentation. Finally, we have generated tolerogenic DCs in the presence of dexamethasone to evaluate their effect in a model of kidney transplantation in rats. Donor alloantigens were obtained from immature BMDCs-derived exosomes. After donor exosomes capture, tolerogenic DCs present a semi-mature phenotype and an anti-inflammatory cytokine profile. Although these tolerogenic DCs do not improve allograft survival, after intravenous injection in kidney recipients are able to modify the number of peripheral blood B cells. In addition, in vitro experiments show that tolerogenic DCs are able to inhibit LPS-dependent proliferation of B cells. These results indicate that tolerogenic DCs, in vitro loaded or not with donor exosomes, may have a biological role in transplant rejection through the modulation of B cell responses.

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRBB) / Reelin is a high molecular weight extracellular glycoprotein that exhibits key roles both in the development of the central nervous system and in adult synaptic plasticity. Reelin expression during brain development is driven by cortical Cajal-Retzius (CR) cells (Alcantara et al., 1998). The secretion of Reelin by these cells ensures a correct splitting of the preplate into marginal zone and subplate (Del Rio et al., 1997; Super et al., 1998). Further, Reelin regulates the inside-out patterning formation of the layered cortical structures (Tissir and Goffinet, 2003). Constitutive Reelin deficit in reel ermice (Goffinet and Dernoncourt, 1991)generate an abnormally layered brain with a highly reduced cerebellum concomitant with numerous cellular ectopia(D'Arcangelo and Curran, 1998). The expression of Reelin undergoes an important change after completion of the neuronal migration processes (Alcantara et al., 1998; Soriano and Del Rio, 2005; Herz and Chen, 2006). This early suggested the existence of a new function for Reelin in the postnatal and adult brain. Heterozygous reeler(HRM)and reeler-like mice presented reduced amounts of Reelin signaling (Liu et al., 2001; Badea et al., 2007; Katsuyama and Terashima, 2009)as well as deficits in synaptic plasticity-related events, such as impairments in long-term potentiation(LTP) paradigms (Weeber et al., 2002; Beffert et al., 2005), altered phosphorylation and composition of NMDA receptors (Chen et al., 2002; Groc et al., 2007), and altered AMPA receptor-mediated responses (Qiu et al., 2006). Further, alterations in spine density were found on HRM and reeler mice (Niu et al., 2008), and adult conditional depletion of Dab1 triggers changes in their morphology (Trotter et al., 2011). More interestingly, Reelin supplementation reverts many of these phenotypes (Qiu and Weeber, 2007; Hellwig et al., 2011; Rogers et al., 2013) and adult Reelin over expression in vivo promotes enhanced LTP (Pujadas et al., 2010). Last, Reelin expression abnormalities have been reported in patients for various psychiatric disorders (Knuesel, 2010; Folsom and Fatemi, 2013).Moreover, it has been related to Alzheimer’s disease(AD) (Knuesel, 2010) and its overexpression in mouse models for ADrevealed delayed progression of the appearance of pathological insults (Pujadas et al., 2014). Here we used transgenic mice overexpressing Reelin (Pujadas et al., 2010)as well as approaches involvingconditional depletion of Dab1 in adult mice (Pramatarova et al., 2008; Teixeira et al., 2014)and in new-born granule cellsof the DG (Teixeira et al., 2012) to study the role of Reelin in the establishment and stabilization of synapses in the adult brain. In the first chapter, we analyze the role of Reelin in the molecular features and ultrastructureof the presynaptic terminals in the adult hippocampus of Reelin overexpressing (Reelin-OE) mice. We report an enhanced complexity of hippocampal boutons. In the second chapter, we analyze the role of Reelin in the molecular composition and ultrastructure of the hippocampal dendritic spines of Reelin-OE mice. We report spine hypertrophy, spine apparatus enlargement and redistribution of NMDA receptor subunits and p-cofilin. In the third chapter, we analyze the effects of Reelin signaling up-and downregulationin spine presence and morphology along two types of pyramidal cells, CA1 and S1BF layer 5. We show that Reelin regulates spine plasticity, but that the precise effects are cell-dependent and dendritic domain-specific. In the fourth chapter, we present a new approach for correlative optical microscopy (OM) –focused ion beam / scanning electron microscopy (FIB/SEM) imaging of pre-labeled dendritic segments with diaminobenzidine (DAB). We applied this method to study the synaptic integration into the preexisting circuitryof new-born DG granule cells (GCs). We report that these cells exhibit branched spines, that morphometrical parameters of a spine and synapse correlate and that spine morphologyand presynaptic innervation changes with cell development. Finally, in the fifth chapter we analyze the effects of Reelin signaling up-and down regulationin integration of new-born DG GCsinto the preexisting circuitry. We describe changes in the size and morphology of these spinesand synapses, as well as in their connectivity. REFERENCES: Alcantara S, Ruiz M, D'Arcangelo G, Ezan F, de Lecea L, Curran T, Sotelo C, Soriano E (1998) Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse.J Neurosci 18:7779-7799. Badea A, Nicholls PJ, Johnson GA, Wetsel WC (2007) Neuroanatomical phenotypes in the reeler mouse. Neuroimage 34:1363-1374. Beffert U, Weeber EJ, Durudas A, Qiu S, Masiulis I, Sweatt JD, Li WP, Adelmann G, Frotscher M, Hammer RE, Herz J (2005) Modulation of synaptic plasticity and memory by Reelin involves differential splicing of the lipoprotein receptor Apoer2. Neuron 47:567-579. Chen Y, Sharma RP, Costa RH, Costa E, Grayson DR (2002) On the epigenetic regulation of the human reelin promoter. Nucleic Acids Res 30:2930-2939. D'Arcangelo G, Curran T (1998) Reeler: new tales on an old mutant mouse. Bioessays 20:235-244. 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INTRODUCCIÓN: Las vesículas y los túbulos son los intermediarios de transporte (ITs) que regulan el flujo de membrana a través de la vía secretora y endocítica. A diferencia de las vesículas, poco se conoce sobre los mecanismos de formación de los túbulos. Cada vez más estudios apuntan a que los lípidos y las enzimas modificadoras de lípidos tienen un papel muy importante en la formación, mantenimiento y fisión de los intermediarios de transporte. Los glicerolípidos pueden jugar un papel importante en estos procesos reclutando proteínas a las membranas, modulando la función de estas o afectando directamente la curvatura de la membrana, Las proteínas relacionadas con la formación, mantenimiento y desacoplamiento de las proteínas de cubierta tipo I (COPI) también se han relacionado con la formación de túbulos. OBJETIVOS: El objetivo general de esta tesis doctoral fue el de avanzar en el conocimiento sobre el papel de los túbulos como ITs en la vía secretora temprana e identificar mecanismos moleculares y de regulación involucrados en el proceso de tubulación, más específicamente, en el papel de glicerolípidos y enzimas modificadoras de lípidos y de las cubiertas tipo COPI. METODOLOGÍA: Para llevar a cabo estos objetivos Para inducir la formación de túbulos derivados del aparato de Golgi las células HeLa se incubaron a baja temperatura (15ºC) y con la droga brefeldina A (BFA). Se usaron inhibidores específicos de enzimas implicadas en el metabolismo de lípidos de membrana para ver el efecto que producen sobre los túbulos mediante ensayos de inmunofluorescencia. Se determinó la localización de la enzima endógena fosfolipasa D2 (PLD2) en el complejo de Golgi mediante inmunocitoquímica ultraestructural. También, se analizó el efecto de la sobreexpresión y el silenciamiento génico de PLD2. CONCLUSIONES: De los resultados obtenidos se desprenden las siguientes conclusiones: 1. Las células HeLa incubadas a 15ºC son un buen modelo para estudiar el papel de glicerolípidos y enzimas modificadoras de lípidos en la formación de túbulos. 2. El ácido fosfatídico (PA) y el diacilglicerol (DAG) son necesarios para la formación y mantenimiento de los túbulos inducidos a 15ºC y BFA, respectivamente. 3. El PA generado por PLD es el más importante para la formación de los túbulos inducidos a baja temperatura. Este lípido está involucrado en un paso temprano de la formación y en la elongación de estos túbulos. 4. PLD2, pero no PLD1, es la enzima responsable de la formación del PA necesario en la tubulación inducida a baja temperatura. Esta enzima está asociada a las membranas del complejo de Golgi y está implicada en el mantenimiento de la arquitectura de este orgánulo. 5. La reducción del PA generado por PLD2 induce la formación de un tipo específico de túbulos que contienen proteínas de matriz. 6. El reclutamiento de ArfGAP1 en las membranas del complejo de Golgi es dependiente del PA generado por PLD2. ArfGAP1 podría ser un componente de la maquinaria molecular implicada en el reclutamiento de la carga en los túbulos. 7. Las membranas del complejo de Golgi son capaces de generar distintos tipos de túbulos con una composición específica. Cuando su actividad enzimática se ve potenciada o cuando la enzima se recluta en ciertas regiones del complejo de Golgi, el PA generado favorece la curvatura local de la membrana reclutando a ArfGAP1, el cual, a su vez, podría ser necesario para el reclutamiento de enzimas residentes. Por el contrario, cuando esta actividad enzimática es inhibida, podría haber una acumulación de DAG o ácido lisofosfatídico, podrían generar otro tipo de túbulos que contienen proteínas de matriz.. Se podría especular que algunos túbulos de Golgi podrían estar relacionados con el transporte retrógado intra-Golgi, mientras que otros mantienen la arquitectura de la cinta del Golgi o bien intervienen en el transporte anterógrado intra-Golgi. / Vesicles and tubules are the transport carriers that regulate membrane flux through the secretory and endocytic pathways. In contrast to vesicles, little is known about the mechanism of formation of Golgi tubules. An increasing body of evidence has pointed to the crucial importance of lipids and lipid-modifying enzymes in the biogenesis, maintenance and fission of transport carriers. Glycerophospholipids may play an important role in these processes, by mediating protein recruitment to membranes, modulating protein functions or by affecting membrane curvature directly. The proteins involved in the formation, maintenance and detachment of the coat protein I (COPI) have also been related to the formation of tubules. AIMS: The aim of the present study was to deepen our understanding of the molecular mechanisms that participate in Golgi tubule formation. More specifically, we analysed the role of glycerolipids and related enzymatic activities in the generation and/or maintenance of Golgi tubules as well as their relationship with the COPI machinery. METHODS: To perform these aims we used low temperature (15°C) and the drug brefeldin A (BFA) to induce the formation of Golgi tubules in HeLa cells. Immunofluorescence microscopy was used to visualize the effect of specific inhibitors of lipid modified enzymes in the formation of Golgi tubules. We assessed the localization of endogenous phospholipase D2 (PLD2) within the Golgi membranes by cryoimmunoelectron microscopy. Furthermore, PLD2-overexpressed and depleted cells we analysed. CONCLUSIONS: The results obtained after these studies rendered these conclusions: 1. Hela cells cultured at low temperature (15ºC) are an useful model to study the role of glycerolipids and lipid modified enzymes in the formation of Golgi tubules. 2. Phosphatidic acid (PA) and diacylglycerol (DAG) are needed for the formation and maintenance of low temperature- and BFA-induced Golgi tubules, respectively. 3. PA generated by PLD is the most important glycerolipids for the formation of low temperature-induced Golgi tubules. This glycerolipid may be involved in an early step of the budding process as well as in the tubule elongation. 4. PLD2, but not PLD1, is the enzyme responsible for the formation of PA needed in the low temperature model of Golgi tubulation. This enzyme is associated to Golgi membranes and is involved in the maintenance of the architecture of this organelle. 5. The reduction of the levels of the PA generated by PLD2 induces the formation of a specific set of Golgi tubules containing matrix proteins. 6. ArfGAP1 recruitment to the Golgi membranes depends on the presence of the PA generated by PLD2. This protein might be a component of the molecular machinery involved in cargo recruitment into Golgi tubules. 7. Golgi membranes are able to generate different types of tubules of varied composition. When PLD2 enzymatic activity is enhanced or the enzyme is recruited to certain Golgi areas, the PA generated is able to bend the membrane and to recruit ArfGAP1, which might be necessary for the recruitment of resident enzymes. Conversely, when its activity is inhibited, there is an accumulation of DAG or lisophosphatidic acid, which might generate another type of tubule containing matrix proteins. It can be speculated that some Golgi tubules may be involved in retrograde intra-Golgi traffic, whereas others keep the architecture of the Golgi ribbon or anterograde intra-Golgi transport.

Les malalties autoimmunes es caracteritzen per una pèrdua de la tolerància als antígens propis que dóna lloc a l'aparició de limfòcits autoreactius. La susceptibilitat genètica és un factor determinant en el desenvolupament de l'autoimmunitat i és el resultat de l’acció combinada de diversos gens. S'han identificat diferents locus de susceptibilitat i polimorfismes dels gens que contribueixen al desenvolupament de l'autoimmunitat sistèmica. Entre d'altres, s’ha trobat un locus principal de susceptibilitat al lupus eritematós sistèmic (LES) en ratolins (Sle1b) i humans (1q23) localitzat en el cromosoma 1 (Wang et al) que conté els gens de la família SLAM (Signaling Lymphocyte Activation Molecule), un grup de receptors de membrana amb importants funcions immunoreguladores. Els membres de la família SLAM han estat identificats, en els últims anys, com un grup de receptors que modulen l'activació i la diferenciació d'una àmplia gamma de tipus cel·lulars involucrats en la resposta immune innata i adaptativa. La família SLAM està constituïda per nou molècules de membrana pertanyents a la superfamília de les immunoglobulines (IgSF): SLAMF1, SLAMF2 (CD48), SLAMF3 (CD229 o LY9)), SLAMF4 (CD244 o 2B4), SLAMF5 (CD84), SLAMF6 (CD352 o NTB-a), SLAMF7 (CD319 o Cracco), SLAMF8 (CD353 o BLAME) i SLAMF9, que s'expressen diferencialment en les cèl·lules del sistema hematopoètic. La regió extracel·lular d'aquests receptors conté típicament un domini immunoglobulina (Ig) variable (IgV) en l'extrem N-terminal i un domini Ig constant (IgC2) a l'extrem C-terminal, excepte SLAMF3 (CD229), que està format per dos sèries de IgV / IgC2. A través d'aquests dominis estableixen interaccions específiques amb els seus lligands, la majoria dels casos de tipus homofílic, excepte la proteïna CD48 que és el receptor de CD224. Els lligands de SLAMF8 i 9 no s'han descrit fins ara. Sis dels receptors SLAM contenen un o més motius ITSM (Immunoreceptors Tyrosine-based switch motif) en la seva cua citoplasmàtica, que serveixen com a llocs d'unió per a molècules adaptadores i enzims amb dominis SH2 (Src homology 2 domains). Les molècules adaptadores SAP (SLAM-associated protein), EAT-2 (EWS / FLI activated transcript-2) i ERT (EAT-2 related Transducer) tenen una gran afinitat per aquest motiu. Estudis amb ratolins mostren l'expressió diferencial de dues isoformes de Ly108 (SLAMF6), que difereixen en la seva regió citoplasmàtica, entre ratolins normals i ratolins susceptibles al lupus. L'expressió de la isoforma Ly108-1, amb dos dominis ITSM, es troba incrementada respecte a l'altra isoforma Ly108-2, amb tres motius ITSM, a les cèl·lules B i T de ratolins susceptibles al lupus en comparació amb ratolins normals. Darrers estudis d'aquesta proteïna demostren l'existència d'una nova isoforma (Ly108-H1), absent en ratolins susceptibles al lupus i que protegeix d'aquesta malaltia als ratolins transgènics. Recentment, s’ha descrit una expressió alterada de dos receptors SLAM, CD244 i CD319, i una expressió diferencial d'isoformes d'aquestes molècules en pacients amb LES. Per tant, un concepte emergent derivat d'aquest i d'altres estudis, és que l'expressió diferencial d'isoformes dels receptors SLAM pot contribuir a la susceptibilitat a trencar l’autotolerància. Un dels membres d'aquesta família és la proteïna CD84, la qual ha estat caracteritzada i estudiada àmpliament en el nostre grup durant els últims anys. Es tracta d'una proteïna d'uns 50-80 kDa depenent del seu grau de glicosilació, amb un ectodomini format per un domini IgV en el seu extrem N-terminal al que li falta el pont disulfur; i un domini IgC2 en el seu extrem C-terminal amb dos ponts disulfur. La seva cua citoplasmàtica conté dos dominis ITSM mitjançant els quals s'uneix al domini SH2 de diferents molècules adaptadores, entre elles SAP. La interacció homofílica té lloc a través del domini IgV. RESULTATS 1. CD84 té almenys quatre ARN missatgers diferents La base de dades ECgene descriu set isoformes de la proteïna CD84. Només en quatre d'aquestes isoformes s'han localitzat seqüències d’ARN missatger i d'ESTs (Expressed Sequence Tag), que juntament amb una estructura proteica compatible, farien possible que aquestes isoformes expressessin a nivell de proteïna. Els estudis in silico realitzats van demostrar que el transcrit H1C22218.5, amb dues seqüències d'ARNm i 91 ESTs correspondria al gen íntegre o full length (CD84_FL); amb una regió codificant de 1017 pb formada per vuit exons. El transcrit H1C22218.2, amb una seqüència d'ARNm i 66 ESTs té una regió codificant de 642 pb a la qual li falten els exons 2 i 5 (CD84_Delta2, 5). En canvi el transcrit H1C22218.3, amb 5 seqüències d'ARNm i 93 ESTs està format per 984 pb i li falta l'exó 5 (CD84_Delta5). Finalment, el transcrit H1C22218.4, amb una seqüència d'ARNm i 88 ESTs està format per 816 pb i li falten els exons 5 i 6 (CD84_Delta5, 6). Estudis previs del grup van demostrar que CD84 s'expressa a nivell de proteïna en diverses línies cel·lulars del sistema immune. Per aquesta raó, i amb la intenció d'esbrinar si les isoformes descrites en les bases de dades eren presents en aquestes línies cel·lulars, es van dur a terme diferents PCR amb oligonucleòtids específics per CD84 dissenyats a les unions dels exons per aconseguir una major especificitat. La primera PCR correspon a una amplificació de la cua citoplasmàtica i dóna lloc a tres bandes de 341 pb, 308 pb i 210 pb. La seqüenciació de les bandes obtingudes demostrar que la banda de 341 pb corresponia a la proteïna íntegra (CD84_FL), mentre que la banda de 308 pb corresponia a una cua citoplasmàtica amb un exó menys, que coincidia amb les seqüències dels transcrits CD84_ Delta2, 5 i CD84_Delta5. Finalment, la banda de 272 pb amplificar una seqüència coincident amb CD84_Delta5, 6. Una segona PCR amb els oligonucleòtids dissenyats a la unió dels exons 1-3, unió present únicament en la possible isoforma CD84_ Delta2,5, va permetre diferenciar entre aquest transcrit i el CD84_Delta5. La seqüenciació de la banda obtinguda va confirmar que es corresponia amb el transcrit CD84_ Delta2,5. L'amplificació de la cua citoplasmàtica en les diferents línies cel·lulars va demostrar que almenys tres de les quatre isoformes esmentades s'expressen en diferents línies cel·lulars com cèl·lules B (Ramos, Namalwa, Raji, Daudi i Cess), cèl·lules T (Jurkat, Hsb2 i Molt4), cèl·lules mieloides (Hl60, U937, K562 i THP-1) i NK (Yt i Nkl). Les isoformes esmentades també es troben expressades en cèl·lules de sang perifèrica de voluntaris sans, en melsa i en amígdala amb una expressió de CD84_Delta5, 6 molt marcada a melsa. La PCR específica per al transcrit CD84_Delta2, 5 demostrar que aquest es troba lleugerament expressat en algunes cèl·lules T i B, però no en NK, PBMC, melsa i amígdala. 2. La isoforma CD84_Delta2, 5 no s'expressa en la membrana Diversos assajos per FACS en cèl·lules · cèl·lules COS-7 transfectades transitòriament amb la construcció pCDNA3.1 CD84_Delta2, 5 i amb l’anticòs a-CD84 2151, el qual reconeix el segon domini immunoglobulina de la proteïna, no van permetre identificar la isoforma. El marcatge intracel·lular per comprovar la presència de la isoforma al citoplasma, també va ser negatiu. Es va decidir doncs utilitzar una construcció de la isoforma que contingués el tag fluorescent GFP, per estudiar la localització de la proteïna. Es van transfectar transitòriament cèl·lules COS-7 i es va observar el resultat en el microscopi de fluorescència, indicant que la proteïna no es troba localitzada a la membrana. A causa de que el nostre interès per aquesta isoforma es centra en el possible paper funcional que podria tenir en faltar-li el domini responsable de l'adhesió, es va decidir seguir amb els assajos funcionals sense estudiar aquesta isoforma. 3. L'anticòs 688.1 contra la cua citoplasmàtica de CD84_Delta5, 6 reconeix específicament aquesta isoforma Aprofitant que la isoforma CD84_Delta5, 6 té en la seqüència de nucleòtids de la seva cua citoplasmàtica un canvi en la pauta de lectura que genera una seqüència d'aminoàcids única, es va generar un anticòs que reconegués específicament aquesta cua. La validació de l'anticòs demostrar que aquest no reconeix la resta d'isoformes de CD84 en transfectants transitoris de cèl·lules COS-7 per FACS, però sí que reconeix la isoforma d'interès. També es va demostrar que l'anticòs 688.1 immunoprecipita específicament la isoforma CD84_Delta5, 6 a transfectants transitoris de cèl·lules COS-7. La immunofluorescència en cèl·lules adherents transfectades transitòriament també mostra l’especificitat d'aquest anticòs enfront de la proteïna íntegra. 4. La isoforma CD84_Delta5, 6 s'expressa diferencialment en les línies cel·lulars testades Un cop identificades les isoformes i analitzada la seva expressió a nivell gènic, l'anticòs generat permetre analitzar l'expressió de l’isoforma CD84_Delta5, 6 a nivell de proteïna. Els estudis per FACS demostren que aquesta està present en totes les línies cel·lulars testades, i els nivells d'expressió es correlacionen amb els resultats obtinguts a nivell gènic, indicant que l'anticòs és sensible a l'expressió diferencial en cadascuna de les línies. D'aquesta manera, mentre que la proteïna CD84 total s'expressa de manera important en les línies de cèl·lules B, els nivells de isoforma CD84_Delta5,6 són baixos en aquest tipus cel·lular. En canvi, en línies de cèl·lules T, on generalment CD84 es troba expressada en un nivell més baix, la isoforma CD84_Delta5, 6 té una expressió relativa més elevada. Els nivells més alts d'expressió de la isoforma es troben en les línies de llinatge mieloide, on l'expressió de CD84 total també és alta. En el cas de les línies de cèl·lules NK gairebé la totalitat del CD84 trobat correspon a la isoforma. 5. La isoforma CD84 Delta5, 6 es detecta en les diferents subpoblacions de PBMC estudiades L'anàlisi per citometria de flux en les diferents subpoblacions de PBMC va permetre conèixer l'expressió diferencial de CD84_Delta5, 6 en individus sans. La subpoblació B1 de cèl·lules B (IgM + CD19 + CD5 +), la qual està involucrada en la immunitat humoral, té una expressió de la isoforma més elevada que la resta de cèl·lules B (IgM + CD19 + CD5-). En les cèl·lules T CD4 +, les cèl·lules memòria expressen més la proteïna total que les cèl·lules verges (CD3 + CD4 + CD45ROlow), mentre que la isoforma s'expressa de manera similar en ambdues poblacions. Pel que fa a les cèl·lules · cèl·lules T reguladores (CD4 + CD25 + FoxP3 +), tant el nivell de CD84 total com el de la isoforma és significatiu. En les cèl·lules T CD8 +, l'expressió de CD84 és considerablement més important en cèl·lules efectores memòria (CD8 + CD45RA-CCR7-) que en cèl·lules centrals memòria (CD8 + CD45RA-CCR7 +), com també ho és l'expressió de la isoforma. En canvi, les cèl·lules naïve (CD8 + CD45RA + CCR7 +), tot i tenir una expressió de CD84 total similar a les cèl·lules efectores (CD8 + CD45RA + CCR7-), tenen una expressió de CD84_Delta5, 6 més elevada que aquesta. En cèl·lules NK (CD3-CD16 + CD56 +), l'expressió de la isoforma és elevada en relació a l'expressió de CD84 total. Els monòcits tenen una expressió significativa tant de CD84 com de CD84_Delta5, 6. 6. La isoforma CD84 Delta5, 6 s'internalitza deficientment respecte la proteïna CD84 Estudis d'activació de cèl·lules Jurkat transfectades amb els ADNc de les diferents isoformes van demostrar que la isoforma CD84_Delta5, 6 té una expressió més alta després de l'activació que la resta d’isoformes. Això va fer pensar que probablement el fet de no tenir la cua citoplasmàtica amb les quatre tirosines, donaria lloc a un reciclatge deficient de la proteïna i en conseqüència, d'una acumulació en la membrana. Per demostrar si això era cert, es van fer diversos estudis d'internalització amb diferents procediments de citometria, com l’ús de l'aparell Amnis, que combina la citometria de flux amb la microscòpia de fluorescència i permet veure la localització de la proteïna marcada en una cèl·lula. El resultat obtingut va demostrar que les cèl·lules Jurkat transfectades amb la isoforma CD84_Delta5, 6 tenen una internalització més baixa que les transfectades amb CD84_FL, en condicions normals, el que incrementa amb l'activació. 7. Estudi de l'expressió de CD84 i de la isoforma CD84_Delta5, 6 a malalties autoimmunes Deu pacients de LES i dotze d'AR van participar en l'estudi de l’expressió de CD84 i de la isoforma CD84_Delta5, 6 a les diferents subpoblacions de PBMC analitzades en l'apartat 5. Els resultats obtinguts van ser comparats amb els valors d'expressió dels mateixos paràmetres de dotze voluntaris sans. D'altra banda, es comparar l'expressió de CD84 amb un altre membre de la família SLAM, NTBA, el qual ha estat assenyalat com una proteïna implicada en algunes malalties autoimmunes. En termes generals, es va veure un augment de l'expressió de CD84_Delta5, 6 a totes les subpoblacions estudiades de malalts de LES, resultat que coincideix en un estat d'activació en els estudis in vitro. En AR en canvi, els resultats assenyalen una tendència contrària en algunes subpoblacions. CONCLUSIONS Les isoformes de CD84 d'estudi han estat identificades per PCR en les línies cel·lulars d'interès. S'ha vist que aquestes isoformes es troben expressades de forma diferencial tant en les línies cel·lulars com en cultius primaris. Inicialment la isoforma CD84_Delta2, 5 ens va semblar interessant perquè en faltar el primer domini immunoglobulina, a través del qual té lloc la interacció homofílica, donaria lloc a importants deficiències en la interacció amb altres cèl·lules. Però els resultats observats mostren que la isoforma no transloca a la membrana, el que pot ser degut al fet que part del pèptid líder forma part del segon exó, absent en aquesta isoforma. La manca d'aquest fragment de pèptid líder podria fer que la proteïna no tingués la capacitat de translocar a la membrana. La isoforma CD84_Delta5, 6 té una deficient internalització causa probablement a la manca dels motius tirosina de la seva cua citoplasmàtica. La generació dels anticossos específics per a la isoforma CD84_Delta5, 6 ens va permetre estudiar l'expressió d'aquesta isoforma tant en línies cel·lulars com en les diferents subpoblacions de sang perifèrica. S'ha vist una expressió diferencial en les diferents subpoblacions estudiades, la qual cosa pot estar indicant un paper funcional important d'aquesta isoforma. Una possible explicació que es desprèn dels resultats amb pacients de LES i AR podria ser que la presència de més CD84_Delta5, 6 a la membrana fa que, encara que la proteïna no sigui funcionalment activa a nivell de senyalització intracel·lular, produeixi més adhesió i per tant afavoreixi la senyalització d'altres molècules coestimuladores, donant lloc a una hiperactivació del sistema immune. La conclusió final que es pot extreure d'aquest treball és que hi ha indicis que demostren que CD84 i els seus isoformes podrien tenir un paper important en la ruptura de la tolerància i el desenvolupament de la autoimmunitat. Les dues malalties estudiades, LES i AR, han donat resultats oposats. D'una banda, sembla ser que en el LES ha lloc una activació cel·lular. L'expressió més elevada de la isoforma en cèl·lules naïve podria indicar que CD84 és un factor de susceptibilitat al desenvolupament d'aquesta malaltia. D'altra banda, en AR no s'observa diferència d'expressió en els malalts sense tractament, mentre que el grup tractat presenta un increment de la proporció entre la proteïna total i la isoforma, suggerint que CD84 podria ser un biomarcador en el tractament de l’artritis. / The membrane protein CD84 belongs to SLAM family, in the immunoglobulins superfamily. It was established as a molecule CD (cluster of differentiation) in 1995 in the 6th International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens (HLDA). In recent years, the SLAM family members have been identified as a group receptors that modulate the activation and differentiation of various cell types involved in the innate and adaptive immune response. In addition, many studies indicate that the genetic region where SLAM family genes are located is a susceptibility locus for Systemic lupus erythematosus (SLE). In the last years, it has been demonstrated some evidences that shows a clear implication of polymorphisms and alternative splicing isoforms generated by different members SLAM family in the development of certain autoimmune diseases, especially in SLE. Following this way, an emerging concept is that the differential expression of isoforms of SLAM receptors may contribute to susceptibility to break self-tolerance. Moreover, studies in our group showed that CD84 is a costimulatory protein widely expressed in the hematopoietic system, both human and mouse. It is in this context that we characterized different isoforms of CD84 and its study possible involvement in the development of autoimmunity.