Tesis por compendio de publicaciones / Esta tesis doctoral está compuesta por cuatro artículos que han sido publicados en revistas científicas internacionales, los cuales tratan de resolver cuestiones relacionadas con la biología, ecología y conservación de los murciélagos en ambientes mediterráneos semiáridos (SE España). La investigación está enfocada a aspectos fundamentales de la biología de los murciélagos, teniendo en consideración que se tratan de estudios preliminares en áreas en las cuales existe muy poca información y donde deben aplicarse medidas de conservación. El primer artículo es un estudio biométrico de las medidas alares de Myotis myotis. Los objetivos eran: 1) la presencia de dimorfismo sexual (SSD) en las medidas alares y determinar qué medidas son más discriminantes, 2) estudiar sí existen diferencias entre machos emparejados y solitarios en los refugios de cópula, y 3) discutir las implicaciones del SSD en esta especie. La longitud del antebrazo y del tercer dedo eran las medidas más discriminantes. No se encontraron diferencias entre machos emparejados y solitarios, siendo los segundos mucho más pesados y con una mejor condición física. El estudio muestra que no existe selección sexual por los machos más pequeños. El segundo artículo estudia la actividad de los murciélagos y la riqueza de especies en una zona cercana a un área protegida. Se utilizó puntos de escuchas y detectores de ultrasonidos para estudiar el uso del hábitat y el papel de los elemento hidráulicos. Los resultados muestran que la actividad era significativamente mayor en el trasvase Tajo-Segura y en las balsas de irrigación en comparación con otros hábitats (bosque, matorral y cultivos). Sólo dos especies de pipistrelos muestran una respuesta positiva significativa con respecto al tipo de hábitat, mientras que otras especies eran influenciadas por otros factores ambientales. La alta actividad en los cuerpos de agua artificiales muestra que tienen un valor para la conservación de los murciélagos, especialmente para los pipistrelos. Sin embargo, un incremento de los cuerpos de agua en esta área podría reducir el valor de conservación para el resto de especies de murciélagos. Se proponen medidas para incrementar el valor de conservación de estas infraestructuras. El tercero emplea una base de datos de presencias para elaborar modelos de nicho ecológico de tres especies de murciélagos simpátricas con características biológicas y ecológicas similares y así conocer su preferencia de hábitat, sus interacciones inter-específicas y la segregación de nichos entre ellas. Esta base fue obtenida mediante diferentes metodologías (refugios, puntos de escucha y trampeo) para evitar sesgos. Los resultados muestran que estas especies coinciden en los sitios muestreados, pero los modelos muestran que existen diferencias en las variables ecológicas entre especies, aunque todas muestran preferencias por los hábitats acuáticos. Estos resultados muestran que las especies tienen una segregación del nicho, aunque existe solapamiento entre ellas. El cuarto artículo trata sobre la efectividad de las áreas protegidas en la conservación de los murciélagos, muchas de las cuales se encuentran en el Anexo II de la Directiva Hábitat y por eso es necesario evaluar la efectividad de la Red Natura 2000. Se evaluó la efectividad de los Lugares de Importancia Comunitaria (LIC) en la protección de seis especies de murciélago cavernícolas e incluidas en el Anexo II. La efectividad fue evaluada a dos niveles: 1) protección de los refugios y 2) protección de los hábitats óptimo e idóneo. Los resultados mostraban que el 60% de los refugios están protegidos, mientras que el porcentaje de protección de los hábitats era menor. El estudio enfatiza la importancia de evaluar la efectividad de las áreas protegidas. / Bat ecology and conservation in semiarid Mediterranean landscapes Abstract This doctoral thesis is composed by four articles that have been published in international journals, attempts to resolve questions related with the biology, ecology and conservation of bats in semiarid Mediterranean landscapes (SE Spain). The research effort focused on fundamental aspects of bat biology that is take into consideration in preliminary studies in areas for which little information exists and where conservation measures need to be applied. The first article is a biometrical study of the wing measurements of Myotis myotis. The aims were: 1) to ascertain whether sexual size dimorphism (SSD) applies to wing measurements and to determine which of these measurements are more discriminant, 2) to check whether there are differences between paired and single males inside the swarming roosts, and 3) to discuss the ecological implications of SSD in this species. Our results confirmed SSD in M. myotis, where females are significantly bigger than males. The forearm and third finger lengths were the most discriminant wing measures. When we examined the differences between paired and single males, we found that there were no significant differences in the wing measurements between them, but the single males were significantly heavier and had a better physical condition. Our study shows that there is not sexual selection for smaller males. The second article studies the activity and richness of bats species which are closed to a protected natural area. We used listening points and ultrasound detectors to study bat habitat use and the role played by different hydraulic elements. Our results show that bat activity was significantly higher in the Tagus-Segura channel and irrigation ponds than in other habitats (forests, scrub and crops). Only two species of pipistrelle showed a significant positive response to habitat type, while other species were influenced by environmental factors. The higher activity recorded in artificial water bodies shows that it has a conservation value for bats, especially for pipistrelle. However, an increase in water bodies in this area would reduce the overall conservation value of the bat community. We propose measures to increase the conservation value of these infrastructures. The third article uses a “presence data set” to elaborate ecological niche models for three sympatric bat species with very similar biological and ecological characteristics in order to ascertain their habitat preferences, inter-species interactions and possible niche segregation phenomena between them. The “presence data-set” were obtained for each species using different methodologies (roosts, listening points, traps) to avoid bias. Our results showed that these species shared the sites surveyed, but the models showed that there are differences in ecological variables between species, although all three species showed preferences for aquatic habitats. These results showed that although the species shows habitat-niche segregation, there is a high overlap between them. We discuss the effects of substantial changes in landscape uses on bats. The fourth paper deals with the analysis of the effectiveness of protected areas in conserving bat populations. There are many bat species in Annex II of the Habitats Directive and the effectiveness of the Natura 2000 network needs to be evaluated. We assessed the effectiveness of the Special Areas Conservation (SAC) sites as regards the protection they offer to six species of cave-dwelling bats included in Annex II. We checked the effectiveness at two levels: 1) the protection offered to roosts, and 2) the protection offered for their suitable and optimal habitats. Our results showed that a 60% of roosts are protected, but the protection levels offered by habitats are generally too low to ensure an effective protection of their populations. Our study emphasizes the importance of assessing the efficiency of protected areas.

Objetivos Los cicindélidos o escarabajos tigre son una familia de coleópteros depredadores frecuentemente estudiados. Esta tesis se centra en dos géneros de cicindélidos: el género australiano Pseudotetracha, perteneciente a la tribu Megacephalini, y el género surasiático Cosmodela, de la tribu Cicindelini. En el primer capítulo se pone a prueba, mediante métodos moleculares, la clasificación presentada en trabajos previos, basados en la morfología, sobre el complejo de especies blackburni/murchisona en el género Pseudotetracha. En el segundo capítulo se analizan las meiosis de las mismas muestras con el fin de estudiar el papel de las reorganizaciones cromosómicas en la especiación y especialización de la tribu Megacephalini, así como confirmar la separación de dos clados hallados en el capítulo anterior. En el tercer capítulo se añaden más muestras de un área mayor de distribución, con el objetivo de revelar la diversidad críptica presente en Pseudotetracha inferida en los dos primeros capítulos y estudiar los procesos que han generado su diversidad. El cuarto capítulo trata del género asiático Cosmodela, en particular la especie C. aurulenta, en la cual se pone a prueba la identidad de las dos 21subespecies descritas como especies independientes, así como el papel que las glaciaciones han tenido en su historia evolutiva. Metodología Para cumplir estos objetivos se utilizaron diversos métodos. Tomando como base la secuenciación de diversos fragmentos de ADN mitocondrial y nuclear (cox1, cox3, 16S, 18S y wingless), se realizaron análisis filogenéticos usando los métodos de Máxima Parsimonia e Inferencia Bayesiana. En los capítulos 2 a 4 se empleó además un reloj molecular para situar en una escala temporal las divergencias observadas. Adicionalmente se realizaron análisis filogeográficos para clarificar las relaciones entre las diferentes poblaciones a un nivel infraespecífico. Los métodos de delimitación de especies GMYC y bPTP, basados en datos moleculares, se usaron en el capítulo 3. En el caso de Cosmodela también se analizaron las distancias genéticas entre los principales clados. En los capítulos 1 y 2 se observaron células en meiosis de los diferentes taxones de Pseudotetracha. Resultados Los resultados obtenidos en el capítulo 1 confirmaron, mediante métodos moleculares, la validez del complejo de especies blackburni/murchisona tal como había sido propuesta previamente en base a la morfología. Estos resultados se mostraron en desacuerdo con un trabajo previo que separaba a la especie P. blackburni de este grupo. La especie P. australis quedaría incluida dentro de este clado. La observación de células en metafase II proporcionó indicios de que los dos clados observados en P. blackburni tendrían un cariotipo diferente y podrían constituir dos especies crípticas. En el capítulo 2 se confirmó este último resultado, revelando que blackburni-2 tiene una fórmula cariotípica n=11+XY y blackburni-1 ha sufrido una reorganización cromosómica resultando en un sistema de cromosomas sexuales múltiples (n=10+X1X2Y) de tipo quiasmático y con un origen reciente como consecuencia de la fusión del cromosoma Y ancestral con un autosoma. Este sistema difiere del conocido en la tribu Cicindelini, antiguo y aquiasmático. Se observó una tendencia a la reducción del número cromosómico en la tribu Megacephalini, posiblemente por repetidos ciclos de incorporación de autosomas al par de heterosomas, proceso que favorecería la especiación y explicaría la alta especialización en este grupo. La filogenia realizada en el tercer capítulo detectó nueve especies previamente conocidas y otras nueve no descritas, en algunos casos crípticas. Además se infirió el papel que tuvo la aridificación de Australia en la separación de los diferentes linajes, así como la historia de cada uno de ellos. Los resultados mostraron que es necesaria una revisión taxonómica del género Pseudotetracha para aclarar las discordancias encontradas con trabajos previos y la identidad de varios taxones crípticos o de identificación confusa. Los resultados del capítulo 4 apoyaron la separación de las dos subespecies C. aurulenta aurulenta y C. a. juxtata como especies distintas, estrechamente emparentadas con C. batesi, que divergieron durante el Pleistoceno. Se reveló que C. aurulenta se habría originado en la península Malaya, desde donde colonizó Indonesia durante los máximos glaciares, mientras que C. juxtata habría colonizado secundariamente la península Malaya, donde coexiste con C. aurulenta. Aims Tiger beetles are a commonly studied family of predatory coleopterans. / This thesis focuses on two cicindelid genera: Australian genus Pseudotetracha, in the tribe Megacephalini, and southern Asian genus Cosmodela, in the tribe Cicindelini. In the first chapter, the classification made in previous works, based on morphology, about the blackburni/murchisona species complex in the genus Pseudotetracha is tested. In the second chapter, meiosis from the same samples are analyzed in order to study the role of chromosomic rearrangements in speciation and the specialization of the tribe Megacephalini, and to confirm the separation of two clades found in the previous chapter. In the third chapter, more samples from a wider area are included in order to unveil the cryptic diversity in Pseudotetracha inferred in the two first chapters, and to study the processes that generated their diversity. The fourth chapter deals with the Asian genus Cosmodela, concretely the species C. aurulenta, in which the identity of its two described subspecies as independent species, and the role of the glaciations in their evolutionary history, are tested. Methods Several methods were used in order to achieve these goals. Phylogenetic analyses using the methods of Maximum Parsimony and Bayesian Inference were carried out, based on the sequencing of mitochondrial and nuclear DNA fragments (cox1, cox3, 16S, 18S and wingless). In chapters 2 to 4 a molecular clock was used in order to trace in a chronological scale the observed divergences. Additionally, phylogeographic analyses were carried out in order to clarify the intraspecific relationships among populations. The species delimitation methods GMYC and bPTP, based on molecular data, were used in chapter 3. The genetic distances between the Cosmodela main clades were analyzed. In chapters 1 and 2, meiotic cells from the Pseudotetracha taxa were observed. Results The results obtained in chapter 1 confirmed, by means of molecular methods, the validity of the blackburni/murchisona species complex as it was previously proposed according to morphology. These results were in disagreement with a preceding work that separated P. blackburni from this group. P. australis would be included in this clade. The observation of metaphase II cells provide evidence that the two observed clades in P. blackburni could actually represent two cryptic species. Chapter 2 confirmed this result, showing that blackburni-2 has a n=11+XY karyotypic formula while blackburni-1 underwent a chromosomal rearrangement that produced a recent and chiasmatic multiple sex chromosome system (n=10+X1X2Y) as a consequence of a fusion between the ancestral Y chromosome with an autosome. This chromosome system differs from the ancient and achiasmatic multiple sex chromosome system known in tribe Cicindelini. A tendency towards the reduction in the chromosome number was observed in the tribe Megacephalini, probably by repeated cycles of incorporation of autosomes to the heterosomal pair. This process would favor speciation and would explain the high specialization found in this group. The phylogeny that was carried out in the third chapter detected nine previously known species and nine undescribed taxa. Moreover, the role of the aridification of Australia in the divergence of the lineages and the history of each clade were inferred. The results showed that a taxonomic revision of the genus Pseudotetracha is needed in order to clarify the discrepancies found in relation to previous works and the identity of several cryptic of difficult to identify taxa. The results of chapter 4 support the separation of the subspecies C. aurulenta aurulenta and C. a. juxtata as different species, closely related with C. batesi, that diverged during the Pleistocene. C. aurulenta was revealed to originate in the Malay peninsula, from which it colonized Indonesia during the glacial maxima, whereas C. juxtata would have secondarily colonized the Malay peninsula where it coexists with C. aurulenta.

El propósito de esta Tesis Doctoral consiste en observación y análisis de la Terapia Asistida por delfines en niños con Síndrome de Down, con el fin de comprobar si hay una mejora en la evolución del lenguaje y la comunicación tanto a nivel mímico, verbal y visual, en las edades comprendidas entre los 5 meses y los 17 años de edad. Dicha práctica esta llevada a cabo a México y Estados Unidos respectivamente. Para poder llevar a cabo la observación se ha partido de la ejecución de unos ítems de observación especificados para cada bloque de edades. Los objetivos generales planteados en esta investigación han sido: * Observar la mejora del lenguaje y la comunicación en niños con Síndrome de Down a través de la terapia asistida por de delfines. * Diseñar un programa de intervención en la Terapia Asistida por delfines en niños con Síndrome de Down. * Describir la formación académica de los delfinoterapeutas. La investigación consta de tres momentos clave. En la primera fase se observaron a los niños antes de realizar la terapia, durante la terapia y después de la terapia. El análisis de la muestra se realizó a través de una encuesta-anamnesis. Durante la segunda fase se procedió a analizar los resultados y estructurarlos por edades según los ítems de observación establecidos anteriormente. Después, se procedió a realizar un diseño de terapia para niños con síndrome de Down, para poder obtener mejoría en los resultados una vez realizada la terapia. Posteriormente se propusieron algunas recomendaciones, orientaciones y propuestas para poder ejecutar en un futuro el uso de la terapia en niños con Síndrome de Down. En los resultados que se obtuvieron hay mejoras en los aspectos de comunicación y lenguaje en las edades comprendidas entre los 5 meses y los 17 años, pero en muchos casos la mejora no es notoria puesto que en algunos ítems de observación no se denota mejoría. Los delfinarios donde se ha realizado el estudio, permiten una variedad de ejercicios y comportamientos beneficiosos para la mejora de los niños con Síndrome de Down, pero los profesionales que trabajan realizando Delfinoterapia, observamos en esta investigación que no obtienen titulación académica al respecto. Se comprobó la falta de formación específica pudiendo ser un indicador en las futuras líneas de investigación. Centrando la atención en los profesionales que atienden a los niños que acuden a terapia con delfines, es de interés recordar que en la mayoría de los delfinarios observados, la experiencia es inferior a los 5 años y no tienen titulación en psicología o en otras ramas de la Educación Especial. Asimismo, estos profesionales conocen muy bien a los delfines y el comportamiento a ejecutar en cada caso, hecho que facilita la terapia en todos los sentidos. Por otro lado, las familias observan en todos los casos una mejoría en la evolución respecto al lenguaje y la comunicación en todas las bastantes tanto del lenguaje mímico, como verbal o bien vidual. Por último, destacar que se han realizado seis sesiones por cada usuario con una duración de cada una de ellas de 30 minutos consecutivos, valorando que son pocas sesiones para obtener una buena evolución así como los minutos dentro del agua los usuarios consideran que también son insuficientes. Sin embargo, la mejora de la práctica en las terapias queda patente en la investigación sobretodo en las primeras edades, considerando dicha terapia como un complemento para la realización de una reeducación para niños con Síndrome de Down. No obstante, debido a las características y la ejecución de los comportamientos de los delfines mulares y de la dificultad de algunos niños en realizar algunos determinados ejercicios, consideramos que el diseño de terapia que se ha elaborado junto con las líneas de investigación descritas al final del capítulo VII, pueden ayudar a contribuir en la mejora de la terapia y en consecuencia de los resultados de mejora una vez realizada la terapia. / The purpose of this thesis is the observation and analysis of dolphin-assisted therapy in children with Down syndrome, in order to check if there is an improvement in the evolution of language and communication in mimic, visual and verbal level, in ages between 5 months and 17 years old. This practice is carried out in Mexico and the United States respectively. To develop the observation we had started executing some observation items specified for each range of ages. The general aims in this study were: * To observe the improvement of language and communication in children with Down syndrome through dolphin assisted therapy. * To design an intervention program in dolphin assisted therapy in children with Down syndrome. * To write the academic training of dolphin professional. The research consists in three key moments. In the first phase, children were observed before therapy, during the therapy and after the therapy. Sample analysis was performed using a survey-anamnesis. During the second phase we proceeded to analyze the results according to the age and structure observation items stated above. Then we proceeded to design the therapy for children with Down syndrome, to obtain better results once the therapy had ended. Later we suggest some recommendations, guidelines and proposals to implement in the future to use the therapy in children with Down syndrome. In the results we had obtained there are improvements in the areas of communication and language in ages from 5 months to 17 years, but in many cases the improvement is not noticeable since some items observation indicates no improvement. Dolphinaria, where the study was performed, allows a variety of exercises and beneficial behaviors improving children with Down syndrome, but professionals working with “Delfinoterapia”, we observed in this study that they do not receive academic qualifications. The lack of specific training can be an indicator that future lines of research has been founded. Focusing on the professionals who care for children who attend dolphin therapy, it is interesting to remember that in most of the observed dolphinaries, the experience of the instructors is less than 5 years and have no degree in psychology or other branches of Special Education. Also, these professionals are well aware of the dolphins and behavior carried out in each case, which facilitates therapy in every way. On the other hand, the family observed in all cases an improvement in the evolution towards language and communication in all quite aware of the sign language, and verbal or visual. Finally, we want to highlight that there have been six sessions for user with duration of each of 30 consecutive minutes, valuing that few sessions to get a good performance as well as the minutes in the water users are also considered inadequate. However, improved therapies practice is evident in the research especially in the early ages, considering such therapy as a complement to the completion of a rehabilitation for children with Down Syndrome. However, due to the characteristics and performance of the behavior of this dolphins and the difficulty some children make some certain exercises, consider the design of therapy that has been developed together with the research described at the end of Chapter VII, can help contribute to improve therapy and thus improves the results once the therapy.

Muestras de músculo esquelético y sangre fueron tomadas a 48 toros bravos (novillos) lidiados en la plaza de toros de Calasparra (Murcia). Los músculos seleccionados, cabeza larga del tríceps braquial y semitendinoso, fueron analizados desde el punto de vista histológico, con el fin de estudiar las características morfológicas e histoquímicas de los distintos tipos de miocitos y las posibles alteraciones consecuencia de la lidia. Las técnicas histoquímicas han posibilitado reconocer tres tipos de fibras musculares, denominadas I (SO), IIA (FOG) y IIX (FG). El músculo tríceps braquial presentó un porcentaje mayor de fibras oxidativas (SO + FOG) en comparación con el músculo semitendinoso donde predominaron las fibras glicolíticas (FG). El estudio histológico del músculo esquelético reveló además que tras la lidia algunas fibras musculares sufrieron lesiones agudas de tipo degenerativo. Estas lesiones se presentaron de forma aislada, afectando a las fibras de tipo II, sin que se viera comprometida la integridad funcional de los fascículos musculares. En un porcentaje reducido de animales se observaron lesiones crónicas relacionadas con la presencia de fibras anguladas atróficas y quistes de Sarcocystis spp. Las muestras de sangre fueron procesadas con objeto de valorar diversas enzimas indicativas del posible daño renal, hepático y muscular consecuencia de la lidia. Los valores de enzimas estudiados en sangre demuestran que en la mayoría de los novillos la lidia no produjo daño renal, ni hepático, ni muscular. Tan solo 5 ejemplares presentaron niveles algo más elevados de lo normal en las enzimas LDH y CK que no se correspondieron con un mayor grado de lesión muscular. Este trabajo demuestra que el músculo esquelético de los novillos estudiados se encontraba bien preparado para afrontar el esfuerzo que supone la lidia. / The samples were taken from blood and skeletal muscle in 48 fighting bulls at bullring in Calasparra (Murcia). Selected muscles, long head of the triceps brachial and semitendinosus were analyzed histologically, in order to study morphological and histochemical characteristics of different types of myocytes and their possible alterations as consequence of the fighting. Three types of muscle fibers, called I (SO), IIA (FOG) and IIX (FG) were identified from histochemical techniques. The triceps brachii muscle presented a higher percentage of oxidative fibers (SO + FOG) when comparing with semitendinosus where glycolytic fibers (FG) were highest. Histological examination of skeletal muscle also revealed that after fighting some muscle fibers suffered acute degenerative injuries. These injuries were scarce, such that these only affected to the type II fibers, without affecting the functional integrity of the muscle bundles. A small percentage of animals showed chronic injuries corresponding with atrophic angulated fibers and cysts of Sarcocystis spp. Blood samples were processed in order to assess several enzymes indicative of kidney damage, liver damage and muscle damage as result of the fight. The enzymes values in blood showed that the fight did not cause damages in kidney, liver, and muscle in the most of the bulls. Only 5 bulls showed levels of LDH and CK enzymes higher than the normal levels without observing positive correlation with the degree of muscle injury. This work shows that the skeletal muscle of the bulls was well prepared to face the effort involved in the fight.

En la actualidad, los bioensayos aportan una valiosa información para la toma de decisiones en los programas de vigilancia ambiental. Los metales pesados, debido a su elevada persistencia, bioacumulación y toxicidad, suponen un riesgo importante en aguas superficiales, tanto para organismos marinos como para el ser humano. Las mezclas de metales son consideradas de gran importancia en Toxicología, ya que los metales se presentan habitualmente en formas complejas. Sin embargo, la mayoría de estudios experimentales se desarrollan con metales en forma única, siendo escasas las publicaciones sobre efectos biológicos e interacciones entre metales pesados. En toxicología marina, el mejillón silvestre (Mytilus galloprovincialis) es considerada la especie de elección en estudios de campo como en bioensayos. En esta tesis se ha planteado la evaluación de efectos derivados de la exposición a mezclas de tres metales pesados considerados de interés (Pb, Cd y Cu), analizando los efectos de la exposición simple, a mezclas binarias y finalmente a la ternaria. Los marcadores biológicos seleccionados en primer lugar proporcionan una importante fuente de información sobre el efecto inmediato en los mejillones, evaluables sin necesidad de complicadas técnicas analíticas: comportamiento alimentario, alteraciones biométricas y en la respuesta inmune. Sobre estos marcadores, también se han evaluado los efectos interactivos de las mezclas (aditivo, sinérgico o antagónico). En una segunda fase se consideró la acumulación tisular de Pb, Cd y Cu, ya que se trata de la respuesta que durante años se usado en la interpretación de resultados en estudios de biomonitorización. Como complemento a esta evaluación, hemos estudiado la acumulación en tres compartimentos: glándula digestiva, branquia y resto de tejidos, de manera que también hemos podido realizar el estudio correspondiente a su distribución tisular, para intentar estudiar las posibles traslocaciones entre compartimentos. Finalmente hemos analizado las interacciones de estos metales pesados con otros elementos inorgánicos presentes en los tejidos: elementos traza mayoritarios (ETM) y minoritarios (ETm). En general, los mejillones expuestos a la mezcla ternaria fueron los más afectados. Los ejemplares expuestos a esta mezcla fueron los que menos materia orgánica consumieron, seguidos de los expuestos a Cd y a Cd+Pb (p<0.05). Los marcadores biométricos afectados significativamente fueron los pesos de glándula y branquia, así como sus correspondientes índices de condición (hepatosomático y branquial), aunque solo en el grupo expuesto a la mezcla ternaria. De los índices de condición totales, solo encontramos diferencias significativas en los calculados con el peso de las valvas (ICval) del mismo grupo. Con respecto a la respuesta inmune analizada, solo los grupos expuestos a Cu y a Pb+Cu aumentaron la actividad PO con respecto al grupo control (p<0.05). La acumulación de Pb, Cd y Cu aumentó significativamente en el grupo expuesto a la mezcla ternaria, no existiendo un patrón común de respuesta en las exposiciones a las mezclas simples y binarias. La glándula digestiva fue el órgano en el que mayoritariamente se concentraron los metales pesados, mientras que los porcentajes en los diferentes compartimentos variaban según los tratamientos, poniendo de manifiesto la traslocación tisular de los mismos. Con respecto a los ETM y ETm, las diferencias más marcadas fueron sobre el K, Na, P (ETM), B y Cr (ETm), siendo de nuevo el grupo expuesto a la mezcla ternaria el que más modificaciones presentó. El efecto interactivo más observado fue el aditivo, mientras que el antagónico fue el menos registrado. Finalmente, las concentraciones de Pb, Cd y Cu en heces se incrementaron notablemente en el caso de los grupos expuestos a la mezcla ternaria seguidamente del expuesto a la mezcla Cd+Pb, mientras que los ETM y ETm fueron escasas las diferencias observadas. / At present, bioassays provide useful information when taking decisions related to biomonitoring activities. Heavy metals, because of their high persistence, bioaccumulation and toxicity, they pose a significant risk to superficial waters, as much as for marine organisms as for humans. Mixtures of metals are considered of high relevance in Toxicology, as metals are often present in complex mixtures. However, most of experimental studies are developed with metals in single form, with a few number of published studies on interactions between heavy metals and the biological effects of such interactions. In marine toxicology, wild mussel (Mytilus galloprovincialis) is considered the species of choice in field studies and in bioassays. This thesis sets out the assessment of the effects of exposure to mixtures of three heavy metals considered of interest (Pb, Cd and Cu), analyzing the effects of single exposure in first place, then of exposure to binary compounds and finally to ternary mixtures. Biomarkers selected first provide an important source of information about the immediate effect on the mussels, evaluated without complex analytical techniques: feeding behaviour, biometric alterations and immune response. The interactive effects of mixtures (additive, synergistic or antagonistic) have been also evaluated. In a second phase the tissue accumulation of Pb, Cd and Cu was considered, as it is the response used for years in the interpretation of results in biomonitoring studies. In addition to this assessment, we studied the accumulation into three compartments: digestive gland, gills and remainder tissues, so that we could also make the corresponding tissue distribution study, to try to study possible displacements between compartments. Finally we have analyzed the interactions of these heavy metals and other inorganic elements present in tissues: majority and minority trace elements (MTE and mTE). In general, the mussels exposed to the ternary mixture were the most affected. The specimens which consumed less organic matter were those exposed to that mixture, followed by the specimens exposed to Cd and Cd+Pb (p <0.05). The gland and gill weights were the biometric markers most significantly affected as well as their corresponding condition indexes (hepatosomatic and gill index), but only in the group exposed to the ternary mixture. Among the total condition indexes, we found significant differences only in those calculated from the weight of the shells (ICval) among the same group. Regarding the immune response analyzed, only groups exposed to Cu and Pb+Cu increased the PO activity compared to the control group (p <0.05). The accumulation of Pb, Cd and Cu increased significantly in the group exposed to the ternary mixture, with no common pattern of response to exposure to simple and binary mixtures. Heavy metals mainly concentrated in the digestive gland, and the percentages varied in different compartments according to the treatments, showing their displacement between tissues. Regarding MTE and mTE, the biggest differences were observed on K, Na, P (MTE), B and Cr (mTE), with the group exposed to the ternary mixture being again the one which underwent the biggest modifications. The interactive effect the most observed was the additive, while the less frequent was the antagonistic one. Finally, concentrations of Pb, Cd and Cu in faeces increased significantly in the case of groups exposed to the ternary mixture followed by the group exposed to the mixture of Cd+Pb, and few differences were observed between MTE and mTE groups.

Con el presente trabajo hemos pretendido buscar los siguientes objetivos: La presencia de Wohlfahria magnifica in la provincia de Albacete, en relación con el padecimiento de las ovejas con W. magnifica en función de su aptitud productiva, tamaño del rebaño, nivel estructural e higiénico-sanitario y el manejo de los operarios. • Pare ello hemos utilizado la siguiente metodología. Se realizaron visitas-encuestas a 122 explotaciones. Se recogieron datos e información y ejemplares de larvas y moscas de W. magnifica. Seguidamente, se hizo el análisis estadístico se realizó con del programa R-gui para el cálculo del chi-cuadrado, con corrección de Yates, La Correlación de Pearsons y el Odds Ratio. • Los resultados obtenidos fueron los siguientes: De las 1.617 explotaciones existentes en el momento, se visitaron 122 ganaderías, lo que suponía el 7,54% de la muestra, repartida por 88 localidades. De un censo total de 646.893 ovejas se muestrearon 73.683 animales, únicamente de la especie ovina, lo que representaba el 11,39%. Del total de 122 explotaciones encuestadas, 117 se encontraban afectadas (95,90%). Del total de animales inspeccionados (73.683), 5.284 presentaban miasis cutáneas, de los cuales 5.283 estaban producidas por Wohlfahrtia magnifica, el 99,98% y 1 por Lucilia sericata, 0,02%. La prevalencia media provincial de animales afectados fue del 7,17%. La prevalencia encontrada, para las ovejas de aptitud láctea fue del 7,34%, frente a las ovejas de carne con el 7,03%. Esta prevalencia se situaba en el 7,16% para explotaciones con régimen semi-extensivo y del 7,29% para explotaciones extensivas. Asimismo, según la distribución geográfica, encontramos la prevalencia más elevada en la zona II con el 7,93%, frente a la prevalencia de la zona I, con el 7,33% y la zona III con el 6,52%. Un dato muy destacable de esta investigación, es el referente a que en la zona I, las ovejas de régimen de explotación semi-extensivo superaban en prevalencia 7,99% a las de régimen extensivo con el 6,88%. Este dato se hizo más relevante al saber que el 100% de las explotaciones semi-extensivas eran de producción láctea y que el 100% de las extensivas era de producción cárnica. En función del tamaño del rebaño, observamos que las de tamaños intermedio, entre 251 y 500 animales, tenían el mayor porcentaje con el 8,31%, seguida de las explotaciones pequeñas, menores de 250 animales con el 8,18%, y por último las mayores de 501 animales con el 6,74%. Según el nivel estructural de la explotación son las de peor nivel las que presentaban mayor prevalencia 9,98%, las de nivel regular y bueno 7,20% y 6,52%, respectivamente. De la misma manera que las explotaciones con peor nivel higiénico-sanitario, eran las de mayor prevalencia con el 10,53%, mientras que las de nivel regular y bueno representaban el 7,65% y 6,20% respectivamente. Y las explotaciones con peor manejo eran también la de mayor prevalencia con el 8,09%, seguida de las de manejo regular y bueno con el 7,76% y el 5,72%. Los machos tienen una mayor predisposición 57,14% al padecimiento de una wohlfahrtiosis, 22 veces superior a las hembras 5,71%. Las zonas más afectadas en ovino eran las zonas genitales 80,47%, seguida de las podales con el 5,24% y las auriculares con el 3,27%. Si estos porcentajes se desglosaban por sexos se aprecia que en machos, la afección en el pene se elevaba al 94,46%, en la cabeza el 3,27% y las afecciones podales y oculares con el 0,59%, mientras que en hembras entre la zona vulvar y perianal la prevalencia fue del 76,39%, la zona podal el 6,60%, la zona auricular al 4,15% y la mamaria al 4,11%. Por otro lado, las ovejas de pura raza segureña de aptitud cárnica y régimen extensivo con el 7,74% son más propensas que las ovejas de p-r manchega de la misma aptitud y régimen de explotación 7,12%. En 16 de las 122 explotaciones se pudo observar animales afectados por wohlfahrtiosis sin que estos hubieran salido de la explotación, dato relevante, pues nos demuestra que Wohlfahrtia magnifica es capaz de producir miasis en animales en régimen de explotación intensivo. / With this work we have tried to look for the following objectives: The presence of Wohlfahrtia magnifica in the Albacete province and the interrelationship of the suffering of sheep with W. magnifica according to productive capacity, folck size, structural and hygienic-sanitary level and livestock handling systems. • To do this we used the following methodology: Visits-sampled survey of 122 farms. With the collection of information data and samples of larvae and Spotted Flesh Fly. Subsequently, the statistical analysis was performed with the R-Gui program for the calculation of chi-square, with Yates correction, Pearsons Correlation and Odds Ratio. • The results were as follows. Of the 1,617 farms currently in existence, 122 livestock farms were visited, representing 7.54% of the sample, spread over 88 localities. From a total census of 646,893 ovine livestock, 73,683 animals were sampled, all of which were sheep and which represented 11.39% of the total. A total of 122 farms were surveyed, and 117 (95.90%) of those were found to be affected. Of the 73,683 animals inspected, 5,284 presented symptoms of skin myiasis, 5,283 (99.98%) of which were caused by W. magnifica and one (0.02%) by Lucilia sericata. The average provincial prevalence of infected animals was 7.17%. The prevalence in dairy sheep was 7.34% compared to 7.03% in sheep bred for meat. This prevalence was situated at 7.16% for farms with a semi-extensive pastoral system and 7.29% for extensive farms. Likewise, according to geographical distribution, the highest prevalence was found in zone II with 7.93% as opposed to the prevalence in zone I, of 7.33% and in zone III of 6.52%. A key statistic, revealed by this study, refers to zone I and the fact that the sheep belonging to the semi-extensive farms of that area exceeded a prevalence of 7.99% in comparison with that of 6.88% of those of the extensive farm systems. This information acquires more significance when it is considered that 100% of the semi-extensive farms were dedicated to milk production and 100% of the extensive farms were meat producing. According to the flock size, it can be observed that the intermediate sizes of between 251 and 500 animals had the highest percentage of 8.31% followed by the small farms, with less than 250 animals, with 8.18%, and finally the largest ones with flocks of over 501 animals, with 6.74%. According to the structural level of the farm, it is those with the poorest level that presented the greatest prevalence 9.98%. The prevalence of those with a normal or good level was 7.2% and 6.25%, respectively. Similarly, the farms with the lowest sanitary hygiene levels were those with the greatest prevalence at 10.53%, while those with a normal and good level represented 7.65% and 6.20%, respectively. Furthermore, the farms with the worst livestock handling systems were also those with the greatest prevalence at 8.09%, followed by those with normal handling systems and good handling systems at 7.76% and 5.72%. Males are more predisposed 57.14% to suffering wohlfahrtiosis, 22 times greater than the females 5.71%. The most affected areas for sheep were the genital areas at 80.47%, followed by the feet at 5.24% and the ears at 3.27%. If these percentages are broken down according to sex, it can be observed that in males, the infection on the penis reached 94.46%, that of the head 3.27% and that of the feet and eyes 0.59%. With regards to females, prevalence between the vulva and perianal areas reached 76.39% that of the area of the foot was 6.60%, the area of the ears 4.15% and the mammary area 4.11%. However, it was concluded that the purebred Segureña sheep, bred for meat and with an extensive pastoral system, at 7.74% were more prone to the infection than purebred Manchega sheep raised for meat and with the same extensive system at 7.12%. On 16 of the 122 farms, it was possible to observe animals affected by wohlfahrtiosis without having left the farm. This is important as it shows that W. magnifica is capable of producing myiasis in animals in an intensive farming system.

La presente Tesis Doctoral está constituida en cinco capítulos, orientados al estudio de estrategias que contribuyen a diversificar la oferta del sector acuícola a través de procesos de conservación y desarrollo de nuevos productos a partir de filetes de dorada. El objetivo general de la presente Tesis Doctoral fue la aplicación de estrategias y tecnologías en la conservación para incrementar la vida útil de filetes de dorada (Sparus aurata) frescos y cocinados. Para llevar a cabo este objetivo general se plantearon los siguientes objetivos específicos. • Evaluar el efecto del tiempo y de la concentración de ozono durante la inmersión de filetes de dorada en agua ozonizada sobre la calidad microbiológica y la textura del pescado. • Evaluar el efecto del envasado (vacío y atmósfera modificada) sobre la calidad microbiológica, físico-químico y sensorial de filetes de dorada almacenados en refrigeración. • Desarrollar un nuevo producto con base de dorada cocinada mediante tecnología sous vide. • Estudiar el efecto del envasado (bolsa y barqueta) sobre la calidad microbiológica, físico-química y sensorial de dorada cocinada sous vide. • Evaluar el efecto del tratamiento de altas presiones sobre la calidad microbiológica, físico-química y sensorial de dorada sous vide. En el capítulo I se evaluó el efecto del ozono como agente bactericida en la calidad microbiológica de filetes de dorada frescos. El estudio consistió en la inmersión de los filetes en agua ozonizada con diferentes concentraciones de ozono (0,35, 0,50 y 0,75 mg l-1) durante 10 minutos y 20 y 40 minutos con una concentración de 0,30 mg l-1. La calidad microbiológica del agua (Recuentos a 22 ºC y 36 ºC, Coliformes, E.coli, Enterococcus y Clostridium perfringens) y del pescado (aerobios mesófilos, Enterobacteriaceae, S. Aureus, Coliformes, E.coli y Pseudomonas spp.) así como el análisis de perfil de textura (TPA) fueron llevados a cabo en las diferentes muestras para observar los posibles cambios a consecuencia de tal exposición. En base a los resultados obtenidos, el ozono resultó efectivo en la esterilización del agua de la red de una industria acuícola en todas las concentraciones utilizadas, eliminando por completo la carga microbiana. Sin embargo, las concentraciones utilizadas en el agua y los tiempos prolongados de exposición, no redujeron de manera significativa la carga microbiana inicial de los filetes de dorada, no mejorando por tanto la calidad microbiológica de estos. En el capítulo II se estudió el efecto del tipo de envasado, atmósfera modificada (40 % CO2, 30 % N2, 30 % O2) y vacío, sobre la vida útil de los filetes de dorada. Durante 14 días las muestras estuvieron almacenados en vitrina expositora a 3 ± 1 ºC reproduciendo condiciones de comercialización. Se llevaron a cabo análisis físico-químico (pH, CRA, TBARs, NVBT, TMA y color), microbiológico (aerobios mesófilos, Enterobacteriaceae, coliformes, E.coli, Pseudomonas spp., Psicrófilos y bacterias ácido lácticas) y sensorial de los filetes frescos en los días 0, 4, 7, 11 y 14. Conforme aumentó el tiempo de almacenamiento, los filetes se deterioraron gradualmente, sin embargo a nivel microbiológico, ambos envasados, retrasaron este deterioro. A nivel sensorial los envasados a vacío y atmósfera modificada ayudaron a mantener durante más tiempo el olor a pescado, color y la textura, respecto a los filetes envasados en aerobiosis, los cuales mostraron un alto grado de deterioro en el día 7 de almacenamiento. Debido al incremento en el consumo de platos preparados y la necesidad de la diversificación de productos procedentes de la acuicultura, se llevó a cabo en el capítulo III de la presente Tesis Doctoral, el desarrollo de un plato de dorada “listo para consumir” cocinado mediante tecnología sous vide. Inicialmente, un panel entrenado seleccionó la temperatura óptima de cocinado y la salsa de los filetes. Elaborados los platos de dorada, se almacenaron en vitrina expositora en refrigeración a 2 ± 1 ºC durante 62 días. Los días 0, 7, 17, 34, 48 y 62, se realizaron análisis microbiológico (Aerobios mesófilos, Enterobacteriaceae, Bacterias ácido lácticas, Anaerobios psicrotróficos, Mohos y Levaduras, Salmonella y Listeria monocytogenes), físico-químico (pH y TBARs) y sensorial del producto cocinado. La temperatura óptima de cocinado resultó ser 60 ºC, y la salsa verde fue la escogida como la más idónea para la combinación con la dorada. Destacar que durante todo el tiempo de almacenamiento, las muestras mantuvieron los recuentos microbianos por debajo del rango de valores que se recogen en el RD 3484/2000, por el que se establecen las normas de higiene para la elaboración, distribución y comercio de comidas preparadas. Con las condiciones utilizadas durante el cocinado, se obtuvo un plato de dorada “listo para consumir” de una calidad sensorial aceptable durante 62 días en refrigeración. Las condiciones y materiales de envasado juegan un papel fundamental durante la elaboración, conservación y comercialización de los alimentos. En el capítulo IV se estudió el efecto del cocinado en bolsa y barqueta sobre el deterioro microbiológico (aerobios mesófilos, Enterobacteriaceae, bacterias ácido lácticas, anaerobios totales psicrótrofas, mohos y levaduras, Salmonella y Listeria monocytogenes) físico-químico (pH y TBARs) y sensorial de filetes de dorada cocinados sous vide. Los resultados mostraron que ambos tipos de envasado fueron idóneos para el cocinado sous vide y posterior almacenamiento en refrigeración retrasándose en ambos casos el crecimiento microbiano y la oxidación lipídica. Asimismo se mantuvo una alta calidad sensorial de los platos aunque el plato envasado en barqueta mostró mejores puntuaciones en la calidad sensorial. Por último, el efecto del tratamiento de tecnologías de conservación “altas presiones hidrostáticas” sobre la calidad microbiológica (aerobios mesófilos, Enterobacteriaceae, bacterias ácido lácticas, anaerobios totales psicrótrofas, mohos y levaduras, Salmonella y Listeria monocytogenes), físico-química (pH, TBARs y TPA) y sensorial de un plato de dorada sous vide, fue estudiado en el capítulo V. Posterior a la elaboración y cocinado de los platos de dorada sous vide, las muestras fueron presurizadas a 300 y 600 MPa durante 5 minutos a 5 ºC, mediante sistema de altas presiones industrial. Posteriormente las muestras fueron almacenadas durante 62 días a temperatura de refrigeración (2 ± 1 ºC) realizándose controles microbiológicos, físico-químicos y sensorial del producto. En base a los resultados obtenidos, el tratamiento de altas presiones no eliminó la carga microbiana inicial de aerobios mesófilos de los platos tal y como se esperaba, aunque los valores obtenidos se encontraron dentro del rango que garantizan la seguridad de los platos durante al menos 62 días. Cabe destacar, que los atributos de textura fueron mejorados con el uso de altas presiones (600 MPa), lo que implica una importante mejora en la calidad sensorial del plato sous vide. / This Doctoral thesis consists of five chapters, oriented to the study of strategies that help diversify the aquaculture sector through conservation processes and new product development from seabream (Sparus aurata) fillets. The overall objective of this PhD thesis was the implementation of strategies and technologies to increase conservation of fresh and cooked seabream fillets (Sparus aurata). To accomplish this general objective the following specific objectives were raised. • Evaluate the effect of time and ozone concentration during immersion of seabream fillets in ozonated water over the microbiological and texture quality of the fish. • Evaluate the effect of packaging (vacuum and modified atmosphere) on the microbiological, physico-chemical and sensory quality of seabream fillets stored under refrigeration. • Developing a new product based with seabream cooked by sous vide technology. • Study the effect of packaging (bag and trays) on the microbiological, physical-chemical and sensory qualities of sous vide seabream. • The effect of treatment of high pressure on the microbiological, physical-chemical and sensory quality of seabream sous vide. In Chapter I the effect of ozone as a bactericidal agent in the microbiological quality of fresh seabream fillets were evaluated. The study consisted of immersion the fillets in ozonated water with different ozone concentrations (0.35, 0.50 and 0.75 mg l-1) for 10 minutes and extending the time of immersion of the fillets, 20 and 40 minutes with a concentration of 0.30 mg l-1. The microbiological quality of water (counts to 22 °C and 36 ° C, Coliforms, E. coli, Enterococcus and Clostridium perfringens) and fish (total viable counts, Enterobacteriaceae, S. aureus, Coliforms, E. coli and Pseudomonas spp.) and analysis texture profile (TPA) were carried out in the different samples to observe any changes as a result of such exposure. Based on the results obtained, ozone was effective in sterilizing the water network of an aquaculture industry in all the concentrations used, completely eliminating the microbial load. However, the concentrations used in the water and prolonged exposure times, do not significantly reduced the initial microbial load in seabream fillets, not thereby improving the microbiological quality of the fillets. In Chapter II, the effect of the type of packaging, modified atmosphere (40% CO2, 30% N2, 30% O2) and vacuum packaging, in order to increase the shelf life of seabream fillets was studied. During 14 days of storage, the samples were stored in display case at 3 ± 1 ° C reproducing marketing conditions. During the control days, were carried out physical-chemical analysis (pH, WHC, TBARs, TVBN, TMA and colour), microbiological (total viable counts, Enterobacteriaceae, Coliforms, E.coli, Pseudomonas spp., anaerobic, Psychrotrophic and lactic acid bacteria) and sensory analysis of fresh fillets. As storage time increased, the fillets gradually deteriorated, however microbiological level, both packaged studied, and they slow down this deterioration. A sensory level packaged in vacuum and modified atmosphere helped keep the odour of fish, the colour of fish muscle and texture, about fillets packaged aerobically, which showed a high degree of deterioration in the 7 day of storage. Due to the increased consumption of prepared meals and the need for diversification of products from fish aquaculture, the chapter III of the present Thesis, studied the development of a seabream dish "ready to eat" cooked by sous vide technology. Prior to the study, the panelists chose the ideal temperature for cooked fillets and the sauce accompanying the dish. Sous vide product was stored in refrigerated display cabinet for 62 days at 2 ± 1 °C. In the control days (0, 7, 17, 34, 48 and 62), physico-chemical (pH and TBARS), microbiological (aerobic mesophilic bacteria, Enterobacteriaceae, lactic acid bacteria, psychrotrophic, anaerobes, molds and yeasts, Salmonella and Listeria monocytogenes) and sensory analysis, were performed. The optimum temperature of 60 °C proved to be cooked, and the green sauce was chosen as the most suitable for combination with the seabream. During the storage time, the samples maintained the microbial counts below the range of values listed in RD 3484/2000, laying down hygiene rules for the production, distribution and sale of prepared foods are established. With the conditions used during cooking, seabream sous vide product obtained an acceptable sensory quality for 62 days under refrigeration conditions. Packaged, is very important during the preparation of meals, storage and marketing of food. In Chapter IV, the effect of cooking on bag and tray on microbiological spoilage (aerobic mesophilic bacteria, Enterobacteriaceae, lactic acid bacteria, psychrotrophic total anaerobes, molds and yeasts, Salmonella and Listeria monocytogenes) physico-chemical (pH and TBARS) and sensory analysis, was studied in sous vide product. The results showed that both packaged, were suitable for packaging the cooked sous vide, later refrigerated storage and delayed in both microbial growth and lipid oxidation. Also, remained high sensory quality of the dishes but the dish packed in tray, showed better scores on the sensory quality. Finally, the treatment effect of technologies "high hydrostatic pressure" on the microbiological quality (aerobic mesophilic bacteria, Enterobacteriaceae, lactic acid bacteria, psychrotrophic total anaerobes, molds and yeasts, Salmonella and Listeria monocytogenes), physical chemistry (pH, TBARs and TPA) and sensory analysis in sous vide product, was studied in Chapter V. After the preparation and sous vide cooked, the samples were pressurized to 300 and 600 MPa for 5 minutes at 5 ° C by Industrial high system pressures. The samples were stored for 62 days at refrigeration temperature (2 ± 1 ° C) performing microbiological, physico-chemical and sensory analysis. Based on the results, the high pressure treatment did not eliminate the initial microbial load of mesophylic aerobic of the sous vide product, as expected, although the values obtained were within the range that guarantee the safety of food for at least 62 days. Curiously, the texture attributes were enhanced with the use of high pressure (600 MPa), which means a significant improvement in sensory quality of the sous vide product.

Mucor circinelloides es un hongo filamentoso utilizado como modelo para el estudio del mecanismo de silenciamiento génico mediado por RNA. Una vez caracterizado dicho mecanismo y los principales genes implicados, se pretende determinar el papel de la ruta de silenciamiento en la regulación de genes endógenos, así como identificar otros posibles elementos genéticos que participen en dicha ruta. Para ello, se plantean los siguientes objetivos concretos: 1. Identificación del gen implicado en la eliminación de la cadena pasajera de los siRNAs y estudio de la existencia de interacciones entre las proteínas de la maquinaria de silenciamiento. 2. Estudio de la participación de Ago-1 en la biogénesis de los distintos tipos de ex-siRNAs de M. circinelloides. 3. Identificación de los genes regulados por el mecanismo de silenciamiento mediante el análisis de los perfiles transcriptómicos de la estirpe silvestre y de mutantes en genes de silenciamiento. 4. Caracterización fenotípica detallada de los mutantes afectados en la ruta de silenciamiento, para identificar los procesos celulares regulados mediante dicho mecanismo. Para desarrollar estos objetivos se ha utilizado la siguiente metodología: 1. La identificación de otros genes implicados en el mecanismo de silenciamiento se llevó a cabo mediante la disrupción de los genes candidatos por recombinación homóloga y su posterior análisis fenotípico. Para ello, se utilizaron técnicas de amplificación de DNA mediante PCR, clonación, transformación de protoplastos e hibridaciones tipo Southern y Northern. Las interacciones entre proteínas de la maquinaria de silenciamiento se analizaron mediante el sistema de doble híbrido de levaduras. 2. La participación de Ago-1 en la biogénesis de los ex-siRNAs se analizó mediante la secuenciación de librerías de sRNAs. Ago-1 fue purificada mediante FLPC para el aislamiento y secuenciación de los sRNAs unidos a ella. Los datos obtenidos fueron validados experimentalmente mediante hibridaciones tipo Northern. 3. El análisis transcriptómico de las distintas estirpes se realizó mediante hibridaciones con micromatrices y secuenciación de RNA (RNA-seq). 4. El análisis fenotípico de los mutantes en genes de silenciamiento incluyó la cuantificación de la producción de esporas vegetativas y zigosporas, el estudio de la respuesta frente a diferentes situaciones de estrés, la cuantificación del proceso de autolisis y el análisis de la virulencia en Galleria mellonella. Los resultados obtenidos permitieron alcanzar las siguientes conclusiones: 1. El gen qip es esencial para el eficaz funcionamiento del mecanismo de silenciamiento génico inducido por transgenes, sugiriendo un papel en la activación del complejo RISC. No se detectaron interacciones entre proteínas de la maquinaria de silenciamiento de M. circinelloides, lo que podría deberse a la necesidad de modificaciones post-traduccionales específicas de las proteínas de silenciamiento o a la formación de complejos multiproteicos. 2. El gen ago-1 está implicado en el mecanismo de silenciamiento endógeno de M. circinelloides, siendo necesario para la biogénesis y/o estabilidad de las cuatro clases de ex-siRNAs. Las clases I y II de ex-siRNAs se unen específicamente a Ago-1 para llevar a cabo la identificación y degradación de sus mensajeros diana. Las clases III y IV son generadas por una ruta de silenciamiento no canónica, en la que se requiere la participación de Ago-1, pero no la unión específica de estos ex-siRNAs a dicha proteína. 3. Los análisis transcriptómicos ponen de manifiesto que el mecanismo de silenciamiento posee un papel modulador de la expresión de un gran número de genes endógenos a lo largo del crecimiento vegetativo. Las funciones de las proteínas cifradas por estos genes están relacionadas con la biogénesis y modificación de la pared celular, el control de la división celular y el crecimiento, metabolismo de carbohidratos, envejecimiento celular o respuesta a estrés. 4. La ruta canónica de silenciamiento está implicada en la regulación del proceso de esporulación vegetativa y en la activación del programa de autolisis inducido por estrés nutricional. La regulación del desarrollo sexual debe ser llevada a cabo por una ruta no canónica independiente de Dicer. Los experimentos de patogénesis no revelan una clara participación del mecanismo de silenciamiento en el proceso de virulencia, aunque no se descarta una respuesta diferencial en otros organismos modelo, como el ratón. / Regulation of endogenous gene expression by the RNA silencing mechanism in Mucor circinelloides. Mucor circinelloides is a filamentous fungus used as a model for studying the RNA silencing mechanism. Once the mechanism and main genes involved were characterized, the next goal is to determine the role of the RNA silencing pathway in the regulation of endogenous genes, and to identify other possible genetic elements that participate in the pathway. To do this, the following specific objectives were proposed: 1. Identification of the gene involved in the removal of the passenger strand of siRNAs duplex, and analysis of the interactions between silencing proteins. 2. Study of the participation of Ago-1 in the biogenesis of different classes of ex-siRNAs in M. circinelloides. 3. Identification the genes regulated by the RNA silencing mechanism by analyzing the transcriptome of the wild type and silencing mutants. 4. Phenotypic characterization of mutants affected in the silencing pathway to identify the cellular processes regulated by this mechanism. To develop these objectives the following methodology has been used: 1. Identification of other genes involved in the silencing pathway was addressed by disrupting candidate genes by homologous recombination and subsequent phenotypic analysis. To this end, PCR amplification of DNA fragments, cloning, transformation of protoplasts and Southern and Northern blot hybridizations were carry out. The study of interaction between RNA silencing proteins was performed using the yeast two-hybrid system. 2. cDNA libraries of sRNAs were generated and sequenced to analyze the participation of Ago-1 in the biogenesis of ex-siRNAs. Ago-1 was purified by FPLC for the isolation and sequencing of Ago-1 bound sRNAs. The sequencing data were validated by Northern-blot experiments. 3. Transcriptomic analysis of the different strains was carried out by hybridization methods using microarrays and RNA sequencing (RNA-seq). 4. Phenotypic analysis of silencing mutants included quantification of vegetative spore and zygospores, study of the response to different stresses, quantification of the autolysis process and virulence analysis of the different silencing mutants in Galleria mellonella. The results allowed reaching the following conclusions: 1. The qip gene is essential for transgene-induced gene silencing, suggesting a role in the activation of the RISC complex. No interactions were detected between proteins involved in the RNA silencing pathway of M. circinelloides. This could be due to the need for specific post-translational modifications of silencing proteins or the formation of multiprotein complexes. 2. Ago-1 is involved in endogenous RNA silencing in M. circinelloides, and it is necessary for the biogenesis and / or stability of all ex–siRNAs classes. Classes I and II of ex-siRNAs specifically bind to Ago-1 for the identification and degradation of their mRNA targets. Classes III and IV are generated by a non-canonical silencing mechanism that requires the participation of Ago-1, but there is not specific binding of these ex-siRNAs to Ago-1 protein. 3. Transcriptomic analysis showed that the silencing mechanism has a modulatory role in the expression of a large number of endogenous genes during vegetative growth. The functions of the proteins coded by these genes are linked to the biogenesis and modification of the cell wall, the control of cell division and growth, carbohydrate metabolism, cell aging or stress response. 4. The canonical RNA silencing pathway is involved in regulation of vegetative sporulation and autolysis induced by nutritional stress. Sexual development should be regulated by a non-canonical Dicer-independent RNA pathway. Pathogenesis experiments did not reveal a role of RNA silencing in the virulence process, but a differential response can’t be ruled out when using other model organisms, such as mouse.

Durante años se ha tratado de simular in vitro el proceso de selección y capacitación espermática que lleva a cabo el tracto genital de la hembra en condiciones fisiológicas, pero los resultados mucho de la selección que ocurre en el oviducto in vivo. El objetivo principal de esta tesis fue: el estudio de las subpoblaciones espermáticas previamente seleccionadas a través de métodos in vitro (por gradientes de Percoll, Capítulo 1; en cultivo de células oviductales, Capítulo 2; y la combinación de ambos sistemas, Capítulo 3), ex vivo (en explantes oviductales, Capítulo 2) e in vivo (en el oviducto de la cerda tras una inseminación artificial, Capítulo 2), y su relación con la funcionalidad y el estado de capacitación, así como su capacidad fecundante. En el Capítulo 1 se analizó la centrifugación mediante gradientes de Percoll como método de selección y capacitación espermática y se evaluó la eficacia en la selección de espermatozoides en función del gradiente utilizado (45/60, 60/75 y 45/90%). En el experimento 1, se analizaron diferentes parámetros espermáticos de las poblaciones obtenidas a través de los 3 grupos experimentales. Los resultados demostraron que al aumentar la diferencia en la densidad del gradiente de Percoll se reduce el número de espermatozoides morfológicamente anormales o con fragmentación del ADN, recuperando principalmente, espermatozoides que han iniciado el proceso de capacitación (95% presentan fosforilación de tirosina en alguna zona). Podemos decir que la separación de espermatozoides mediante gradientes de Percoll se fundamenta en sus diferencias funcionales. En el experimento 2, se emplearon las poblaciones espermáticas en fecundación in vitro para evaluar su capacidad de penetración, y determinar qué gradiente selecciona los espermatozoides más aptos para fecundar y su posible relación con los parámetros estudiados en el experimento 1. Se evaluó el porcentaje de penetración y el número medio de espermatozoides que presentaba cada ovocito. Los resultados mostraron que aquellos espermatozoides obtenidos a partir del gradiente de Percoll más restrictivo (45/90%) dieron lugar a unos mayores niveles de penetración del ovocito. En el Capítulo 2 se estudió el efecto de las células epiteliales del oviducto sobre la capacitación espermática. Se evaluó el estado de capacitación (mediante la distribución de la fosforilación de la tirosina) de los espermatozoides seleccionados mediante células oviductales bajo tres condiciones experimentales: in vitro, ex vivo e in vivo. Los resultados mostraron que existen diferencias entre los espermatozoides unidos o no unidos a las células oviductales, lo que demuestra que este tipo de células seleccionan espermatozoides con bajo grado de fosforilación en tirosina en cualquiera de las condiciones estudiadas. En el Capítulo 3 se estudiaron qué características presentan los espermatozoides para ser seleccionados por las células oviductales y la capacidad de fecundación in vitro de estos espermatozoides doblemente seleccionados [a través de gradientes de Percoll (45/90%) y posteriormente incubados sobre cultivos in vitro de células epiteliales del oviducto]. En el experimento 1 se evaluó la capacidad para fecundar de las dos poblaciones de espermatozoides obtenidas mediante el análisis de diferentes parámetros de fecundación. Los resultados demostraron que los espermatozoides doblemente seleccionados dan mejores resultados de fecundación in vitro, mejorando las tasas de penetración del gameto femenino. En el experimento 2 se analizaron las características funcionales de los espermatozoides. Los resultados indicaron que las células oviductales unen espermatozoides de mayor calidad y realizan su propia selección incluso partiendo de espermatozoides previamente seleccionados. En resumen, los resultados de esta tesis doctoral muestran que las células epiteliales del oviducto son capaces de distinguir aquellos espermatozoides con una capacidad de fecundación superior, lo que en un futuro podría representar un incremento en la eficiencia de los sistemas de reproducción asistida evitando, de este modo, la selección parcialmente subjetiva que existe actualmente en las técnicas convencionales de selección espermática. / For many years, attempts have been made to control sperm selection and capacitation in order to simulate under in vitro conditions, but the results are highly variable and are far from in vivo ones. The aim of this thesis was the study of sperm subpopulations that have been previously selected by different methods: in vitro (Percoll gradients in Chapter 1, oviductal cells culture in Chapter 2 and by combining both in Chapter 3), ex vivo (in oviductal explants, Chapter 2) and in vivo (in the oviduct of the sow after insemination, Chapter 2), and their relationship with functionality, sperm capacitation status and fertilizing capacity. In Chapter 1 centrifugation by Percoll gradients was analysed as a sperm selection and capacitation method, and its efficiency for selecting sperm was evaluated. Three different Percoll gradient combinations (45/60, 60/75 and 45/90%) were used. In experiment 1, several parameters related to sperm function were analysed in the different sperm populations obtained through the three experimental techniques. The results of this experiment showed that as the Percoll gradient increased, the number of morphologically abnormal sperm or sperm with DNA fragmentation is reduced, recovering especially those sperm that have begun the process of sperm capacitation (since 95% of spermatozoa present tyrosine phosphorylation in any of the studied areas). So, we can say that the separation of sperm by Percoll gradients is primarily based on their functional differences. In experiment 2, the different sperm populations were used in an in vitro fertilization system to evaluate the penetration rate and checking which Percoll gradient selects the best sperm for fertilization purposes. The penetration rate and the mean number of spermatozoa found in each oocyte were evaluated. The results showed that spermatozoa obtained from the most restrictive Percoll gradient (45/90%) had higher levels of penetration. In Chapter 2 the capacitation status of sperm selected by the oviductal epithelial cells was evaluated (by measuring levels of tyrosine phosphorylation) under three conditions: in vitro, ex vivo and in vivo. The results showed that the phosphorylation pattern changes when sperm are incubated with the epithelial cells of the oviduct, with differences between sperm bound or unbound to the cells. It was concluded that the epithelial cells of the oviduct are able to select spermatozoa with a low level of tyrosine phosphorylation in any of the studied conditions. In Chapter 3 sperm selected by Percoll gradients (45/90%) were incubated with in vitro cultured oviductal epithelial cells. This incubation resulted in two distinct sperm populations: sperm bound to cells and sperm unbound. The study was divided into two experiments. In experiment 1 the ability of the two populations to fertilize was evaluated using different parameters. The results showed that the doubly selected sperm led to better results in the in vitro fertilization systems, significantly improving penetration rates. In experiment 2 the functional characteristics of sperm from the two populations were analysed. The results indicated that the oviductal epithelial cells bind higher quality sperm according to different functional parameters and perform their own sperm selection. In summary, the results of this thesis show that the oviductal epithelial cells are able to distinguish those sperm with a higher fertilization capacity. In the future this could provide an increase in the efficiency of assisted reproduction systems thereby preventing the partially subjective selection that currently exists in conventional sperm selection techniques.