Los programas de biomonitorización permiten evaluar las concentraciones de contaminantes y conocer los efectos que pueden causar en los seres vivos. La presente tesis corrobora que la pluma es una excelente herramienta de biomonitorización de Hg en Alca común y Búho real. Sin embargo, su uso para la biomonitorización de plaguicidas organoclorados (OC) se ve afectado por la contaminación externa y el tiempo transcurrido entre la última muda y la toma de muestras. En general, las concentraciones de OC y metales observados en Alca común del Mediterráneo, Búho real de la Región de Murcia y Buitre leonado de la Comunidad Valenciana son menores que los niveles causantes de efectos adversos a nivel reproductivo y de comportamiento en aves. Las enzimas antioxidantes glutatión peroxidasa, catalasa y superóxido dismutasa, y los niveles de TBARS parecen ser buenos biomarcadores de exposición y efecto a Pb, Cd y Hg en búho y buitre. / Biomonitoring programs are conducted in order to assess concentrations of environmental pollutants and to know the effects that contaminants may cause in living beings. This thesis shows that the feather is an excellent tool for Hg biomonitoring in Razorbill and Eagle owl. However, its use in organochlorine pesticide (OC) biomonitoring is affected by external contamination and the time elapsed between the last molt period and sampling. In general, OC and metal concentrations found in Razorbills from Mediterranean area, Eagle owls from Murcia Region and Griffon vultures from Valencian Community are below levels known to cause adverse reproductive and behavioural effects in birds. The antioxidant enzymes glutathione peroxidase, catalase and superoxide dismutase, and TBARS levels seem to be useful biomarkers of exposure and effect to Pb, Cd and Hg in owls and vultures.

Se han investigado la diversidad y estructura genética en poblaciones de abejas (Apis mellifera) de la Macaronesia y Europa del Este, con fines conservacionistas. La estructura poblacional actual indica cierta diferenciación espacial y confirma la presencia de ecotipos en ambas regiones. Los análisis moleculares (ADNmt y microsatélites) revelaron introgresión de subespecies europeas en la Macaronesia e hibridación entre subespecies-C en Europa del Este, lo cual amenaza la conservación de los ecotipos y contribuye a la diseminación de patógenos. Se ha observado una dispersión y aumento de la prevalencia de Nosema ceranae en la Macaronesia ligado a la introducción de reinas. Dado que aún existen ecotipos locales en la Macaronesia y un alto grado de diferenciación y diversidad genética en las poblaciones de Europa del Este a pesar de la evidente influencia antrópica, se deberían implantar políticas de conservación para minimizar los efectos negativos de la introgresión e hibridación introgresiva. / We have investigated the diversity and genetic structure in populations of honey bees (Apis mellifera) in the Macaronesia and Eastern Europe, for conservation purposes. The current population structure indicates some spatial differentiation and confirms the presence of ecotypes in both regions. Molecular analyses (mtDNA and microsatellites) revealed introgression of European subspecies in the Macaronesia and hybridization between C-subspecies in Eastern Europe, threatening the conservation of ecotypes and contributing to the spread of pathogens. We observed dispersion and increased prevalence of Nosema ceranae in the Macaronesia linked to the introduction of queens. Since there are still local ecotypes in the Macaronesia region and a high degree of differentiation and genetic diversity in honey bee populations of Eastern Europe despite the obvious human influence, conservation policies should be implemented to minimize the negative effects of introgressive hybridization and introgression.

El objetivo general de esta tesis es la caracterización de la migración protagonizada por un conjunto de neuronas Pax6+ en el tálamo del pollo y del ratón y su análisis comparativo. MATERIALES Y MÉTODOS Se utilizaron embriones de pollo (HH28 – HH38) para analizar mediante técnicas de inmunohistoquímica y de hibridación in situ con sondas de mRNA del gen Pax6 en secciones de vibratomo. También se llevaron a cabo marcajes mediante BDA y posterior cultivo organotípico. Las preparaciones fueron escaneadas y analizadas. Las imágenes de secciones de cerebros de ratón procesadas mediante hibridación in situ para el gen Pax6 de estadios embrionarios y postnatales fueron obtenidas del atlas de desarrollo del ratón (Allen Brain Atlas). RESULTADOS Y CONCLUSIONES Las observaciones obtenidas confirman la existencia de una migración neuronal tardía que se origina en la región retrohabenular, en el techo posterior del prosómero 2. Las células migratorias Pax6+ comienzan a visualizarse claramente en la región retrohabenular en el estadio HH31, terminando la migración aparentemente en HH37. Se desplazan desde su origen laterorrostralmente en la zona fronteriza entre la región habenular y el tálamo propiamente dicho. En el caso del pollo, este avance es más marcado y alcanza, a través del núcleo superficial microcelular, regiones cercanas a la frontera intertalámica, incorporándose escasas células de esta migración a la región habenular lateral. En ratón, en cambio, la migración penetra más importantemente en la región habenular lateral donde acaba integrándose en el subnúcleo parvocelular de la división lateral del núcleo habenular lateral y a penas se observan otras células fuera de esa zona habenular. En el pollo se observa un segundo origen celular Pax6+ a continuación del área retrohabenular, ya en la zona pretectal precomisural. Desde este origen existe una pequeña migración que alcanza aparentemente las inmediaciones del núcleo parvocelular de la comisura posterior. El resultado de los marcajes con BDA in vitro en el estadio HH31, de producción inicial de estas células, corroboró la existencia de un movimiento migratorio desde este origen en la región retrohabenular hacia la zona de destino descrita mediante hibridación in situ de Pax6, tanto en el caso de la migración talámica como la pretectal. Desde el punto de vista de la anatomía comparada, se concluye que los fenómenos retrohabenulares migratorios observados en el pollo y en el ratón coinciden en su cronología embriológica, ya que aparecen en estadios comparables y en ambos casos figura como diana la región habenular lateral. Si bien en el pollo aparecen células que parecen invadir zonas no habenulares cercanas cabe preguntarse si no cabría incluir dichas regiones en la zona habenular. En el caso del ratón las células migradas componen una subpoblación menor del área habenular lateral que forma el subnúcleo parvocelular de la división lateral del núcleo habenular lateral. / The overall objective of this thesis is to characterize the migration of a population of Pax6+ neurons in the chick and mouse thalamus and its comparative analysis. METHODS Chick embryos (HH28 – HH38) were used to analyze by immunohistochemistry and in situ hybridization with Pax6 mRNA probes in vibratome sections. Labelling with BDA were also carried out and subsequent organotypic culture. The preparations were scanned and analyzed. The images of mouse brain sections processed by in situ hybridization for the Pax6 gene in embryonic and postnatal stages were obtained from the atlas of mouse development (Allen Brain Atlas). RESULTS AND CONCLUSIONS The observations confirm the existence of a late neuronal migration originated in the retrohabenular region, in the posterior roof of prosomere 2. Migratory Pax6+ cells become clearly visible in the retrohabenular region at HH31, finishing the migration apparently at HH37. They progress from their origin latero-rostrally through the habenular-thalamic border. This advance is more pronounced in the chick, reaching through the superficial microcellular nucleus regions near the intrathalamic border, joining few of these migrating cells the lateral habenular region. In contrast, the migration in mouse penetrates mainly in the lateral habenular region where it integrates the parvocellular subnucleus of the lateral division of the lateral habenular nucleus and scarce cells are found out of the habenular region. A second Pax6+ cellular origin is found in chick, adjacent to the retrohabenular area, in the precommisural pretectal region. From this origin a small migration takes place apparently to the surroundings of the parvocellular nucleus of the posterior commisure. The results of the in vitro BDA labelling at HH31, initial production stage of these cells, confirmed the existence of a migratory movement from this origin in the retrohabenular region to the target area described by Pax6 in situ hybridization, for both thalamic and pretectal migrations. From a comparative anatomical point of view, the retrohabenular migratory phenomena observed in chick and mouse concur in their embryological chronology, since they appear at comparable stages and the target is the lateral habenular region in both cases. While in chick there appear cells invading nearby non habenular regions, one might wonder whether these regions should be included in the habenular zone. In the case of mouse, the migrated cells shape a minor subpopulation of the lateral habenular area that forms the parvocellular part of the lateral division of the lateral habenular nucleus.

OBJETIVOS El objetivo principal que se plantea en esta tesis es analizar los patrones de variabilidad en las fuentes de nutrientes y la complejidad de la red trófica planctónica a distintas escalas espaciales. Los objetivos parciales fueron: • Determinar la variabilidad geográfica en la composición isotópica del plancton de distintos tamaños a escalas espaciales de cientos a miles de kilómetros. • Determinar la existencia de patrones macroecológicos en la composición isotópica del plancton en función del tamaño y variables ambientales (principalmente temperatura y nutrientes). • Estimar propiedades de la red trófica (ej. relación de tamaños, diversidad trófica, estado metabólico) a partir de la composición isotópica de los aminoácidos del plancton. MÉTODOS: Analizamos la biomasa y la abundancia natural de isótopos estables de nitrógeno en un amplio muestreo de plancton fraccionado por tamaños durante la expedición Malaspina-2010 a través de tres grandes océanos. La expedición utilizó dos buques oceanográficos para la observación y recolección de muestras de agua, seston y plancton a través de tres de los mayores océanos (http://metamalaspina.imedea.uib-csic.es/geonetwork/srv/en/main.home). En nuestro estudio incluimos muestras de plancton de 145 estaciones. Las muestras fueron recolectadas con redes verticales tipo bongo (30 cm de diámetro, 40 µm de malla y 50 cm de diámetro, y 200 µm de malla) entre 200 m de profundidad y la superficie por la mañana temprano. El plancton fue fraccionado por tamaños usando filtros de 200, 500, 1000, 2000 and 5000 sobre filtros de vidrio pre pesados y secados en horno a bordo (60°C, 24 h). Además, alícuotas de las muestras fueron conservadas en formol (4% concentración final) para la determinación posterior de la abundancia de tricomas de la cianobacteria fijadora de N Trichodesmium. El contaje se realizó con un sistema de análisis de imagen (FlowCam). La biomasa fue determinada en laboratorio para cada fracción de tamaño como contenido de carbono (C) usando un analizador elemental (Carlo Erba CHNSO 1108). La abundancia natural de los isótopos estables de nitrógeno (15N) se determinó usando un espectrómetro de masas (Finnigan Mat Delta Plus) acoplado a un analizador elemental. Para el análisis de isótopos estables en aminoácidos se escogieron un total de 15 muestras en el transecto del Atlántico Norte Subtropical. Los valores de δ15N de aminoácidos individuales se midieron utilizando un espectrómetro de masas de relaciones isotópicas acoplado por combustión a un cromatógrafo de gases (gas chromatography /combustion/isotope ratio mass spectrometry GC/C/IRMS), después por hidrólisis con ácido 6 N HCl y formación de derivados del éster, siguiendo métodos ya publicados (ej., McCarthy et al., 2013; Germain et al., 2013). RESULTADOS Y CONCLUSIONES: Los parámetros del espectro de tamaños de la biomasa y δ15N mostraron baja variabilidad en la mayoría de las regiones, a excepción del noroeste del océano Atlántico. El análisis comparativo del espectro de tamaños de δ15N y la biomasa se reveló como una herramienta práctica para estimar las fuentes de nitrógeno inorgánico y su transferencia neta hacia niveles superiores de la red trófica como se muestra a grandes escalas espaciales con el plancton oceánico. Las diferencias entre el espectro de tamaños de δ15N y la biomasa sugieren homogeneidad geográfica en la transferencia neta de nitrógeno a niveles superiores de la red trófica. El uso de datos de isótopos en compuestos específicos como aminoácidos (CSI-AA) mostró una baja variabilidad del impacto de nitrógeno diazotrófico en las diferentes fracciones de tamaño del plancton, mientras que nuestro primer estudio de 15N en la materia orgánica mostró alta variabilidad con el tamaño. Además estos resultados en aminoácidos indicaron una mayor importancia de la diazotrofía, incluso en zonas con menor abundancia de fijadores de nitrógeno o menores medidas previas de fijación de nitrógeno. Las estimaciones de la posición trófica en CSI-AA para diferentes clases de tamaño del plankton varió en un estrecho rango (1.8 to 2.5), con el valor inferior en la zona central, y un incremento general esperado con el tamaño. El estudio de aminoácidos individuales (en particular Phe y Thr), así como los valores de δ15N del total de proteínas, mostró fuertes correlaciones con 15N en el plancton, lo que sugiere un conjunto de nuevas relaciones que pueden ser importantes en el uso de los datos de CSI-AA para rastrear las contribuciones directas del plancton al pool de nitrógeno orgánico en los océanos. Así estos nuevos resultados representan la investigación más detallada de datos de CSI-AA en clases de tamaños de zooplancton hasta la fecha y apuntan a un papel clave del zooplancton grande en la transmisión del nitrógeno diazotrófico hacia las redes tróficas oceánicas. / OBJECTIVES: The principal goal is to analyze the variability pattern in the nutrient sources and the planktonic trophic web at different spatial scales in the ocean. The secondary objectives were: • To determinate the geographic variability in the isotopic composition to different size fractions of plankton at large-scale spatial scales • To characterize macroecological patterns in the isotopic composition of plankton based on the size and environmental variables (mainly temperature and nutrients). • To estimate food wed properties ( eg. Size ratio, trophic diversity, metabolic state) from the amino acids isotopic composition of plankton. METHODS: We analyzed carbon biomass and the natural abundance of stable nitrogen isotopes in a large set of size-fractionated plankton samples from the research expedition Malaspina-2010 across three ocean basins. The expedition employed two oceanographic ships to make observations and collect water, seston and plankton samples across three major ocean basins (http://metamalaspina.imedea.uib-csic.es/geonetwork/srv/en/main.home). In this study plankton samples from 145 stations were considered. Samples were collected by vertical hauls of bongo-type nets (30 cm diameter, 40 µm mesh size and 50 cm diameter, and 200 µm mesh size) between 200 m depth and the surface during early morning hours. Plankton was size-fractionated using sieves of 200, 500, 1000, 2000 and 5000 µm, collected on pre-weighted glass-fiber filters and oven dried (60°C, 24 h) on board. In addition, sample aliquots were preserved in formalin (4% final concentration) for later determination of the abundance of trichomes of the N-fixing cyanobacterium Trichodesmium. Counts were made using a semiautomatic image analysis flow-through system (FlowCam). Biomass was later determined in the laboratory for each size fraction as carbon content (C) using an elemental analyzer (Carlo Erba CHNSO 1108). Natural abundance of stable nitrogen isotopes (15N) was determined using a mass spectrometer (Finnigan Mat Delta Plus) coupled to the elemental analyzer. In total 15 samples in the transect Subtropical North Atlancic were chosen for CSI-AA. The δ15N values of individual AAs were measured via GC-IRMS, after 6 N HCl acid hydrolysis and the formation of TFA ester derivatives following previously published methods (e.g., McCarthy et al., 2013; Germain et al., 2013). RESULTS AND CONCLUSIONS: Except in the northwestern Atlantic, parameters of biomass and δ15N size-spectra showed low variability in most regions. The comparative analysis of δ15N and biomass size-spectra revealed as a practical tool to estimate the sources of inorganic nitrogen and their net transfer up the food web as illustrated at large spatial scales with ocean plankton. Differences between δ15N and biomass size-spectra suggest geographic homogeneity in the net transfer of nitrogen up the food web. Use of compound-specific amino acid isotope data (CSI-AA) revealed relatively low variability in the impact of diazotrophic nitrogen within the different plankton size fractions, while 15N of bulk organic matter showed high variability with size. Moreover these results indicated a greater importance of diazotrophy than suggested by bulk δ15N, even in zones having less abundant nitrogen fixing organisms and lower concurrent measurements of nitrogen fixation previously reported. Explicit CSI-AA trophic position estimates for different plankton size classes varied in a relatively narrow range (1.8 to 2.5), with the lowest values in the central zone, and showed the expected general increase with mean plankton size class. Investigations of individual amino acids (in particular Phe and Thr), as well as reconstructed total protein δ15N values, revealed strong correlations with bulk plankton 15N, suggesting a set of new relationships that may be important in using CSI-AA data to tracing direct plankton contributions to many detrital organic nitrogen pools in the ocean. Overall, these new results represent the most detailed investigation of CSI-AA data in zooplankton size classes to date, and point to a key role of large zooplankton in the transmission of the diazotrophic nitrogen up oceanic food webs.

El objetivo general de esta tesis es profundizar en el conocimiento que se tiene sobre los patrones de diversidad que las comunidades biológicas muestran en ecosistemas acuáticos continentales, la comprensión de los principales factores que los determinan y su variación a diferentes escalas espaciales, prestando especial atención a las particularidades y oportunidades de estudio derivadas del carácter lótico o lenítico de los hábitats. Para ello se ha trabajado un amplio rango de enfoques (taxonómico, funcional y ecológico), a distintas escalas espaciales (desde comunidades locales del sureste ibérico hasta inventarios completos de diferentes regiones con entidad biogeográfica del Paleártico occidental), y utilizando coleópteros como indicadores de biodiversidad acuática, de forma que, en última instancia, toda esta información resulte útil para ser implementada en futuras políticas de conservación de la naturaleza. En los capítulos 1 y 2 se estudia la contribución que los cuerpos de agua estancada realizan a la diversidad regional de coleópteros acuáticos, tanto en su conjunto como para cada uno de los tipos de hábitat establecidos. El primer capítulo se centra únicamente en la composición de las comunidades, mientras que el segundo trata, además, el modo en que éstas se estructuran. En ellos se constata la importancia que estos ambientes tienen no sólo para los especialistas leníticos, sino también para un amplio espectro de especies facultativas. También se destaca el papel de las pozas naturales en términos de riqueza total de especies y de las lagunas endorreicas próximas a ambientes salinos en términos de riqueza de endemismos. En el capítulo 2 se identifica la conductividad como la variable que mejor explica las diferencias en la composición de las faunas, mientras que el grado de perturbación de origen antrópico es el principal responsable del patrón de anidamiento detectado. Al analizar los sitios dulces y salinos de manera independiente, ambas variables juegan papeles diferentes tanto en la composición como en la estructura. El nivel de perturbación se muestra de nuevo la variable que mejor explica el patrón de anidamiento para agua dulce, mientras que en sitios salinos lo es la conductividad. En el capítulo 3 se introduce un enfoque funcional, y se demuestra que la riqueza de especies de las distintas familias de coleópteros acuáticos está significativamente relacionada con su diversidad de rasgos, tanto biológicos como ecológicos. No obstante, hubo familias que presentaron mayor o menor diversidad de rasgos biológicos de la que cabría esperar en función de su diversidad taxonómica. Los resultados apuntan hacia un predominio de procesos de filtrado del hábitat en arroyos de cabecera mientras que factores de tipo biótico, por ejemplo competencia entre especies, serían más relevantes en hábitats a priori menos estresados como los ambientes leníticos. Como resultado del estudio taxonómico detallado de las comunidades acuáticas realizado en los capítulos anteriores, en el capítulo 4 se describe una nueva especie para la ciencia: Stictonectes abellani. La información se completa con la estimación de la distribución potencial y las preferencias ambientales de las 3 especies del género endémicas de la península Ibérica. Finalmente, en el capítulo 5 se constata, a una escala espacial más amplia, la existencia de patrones latitudinales de diversidad alfa y gamma diferentes para especialistas lóticos y leníticos, así como un descenso de diversidad beta con la latitud para ambos grupos de taxones. Estos hallazgos confirman el papel clave que la capacidad de dispersión, enmarcada en los cambios climáticos del Pleistoceno, juega en la configuración de los patrones de diversidad observados en el Paleártico occidental, y que en última instancia tiene su origen en la distinta estabilidad (a largo plazo) que presentan ambos tipos de hábitat. / The main goal of this thesis is to increase the existing knowledge about diversity patterns displayed by biological communities in freshwater ecosystems, the understanding on the main factors underlying them and their performance at different spatial scales, especially focusing on the particularities derived from the lotic-lentic divide. For that purpose, different approaches (taxonomic, functional and ecological), at different spatial scales (from local assemblages of Iberian southeast to whole inventories of different biogeographic regions in the Western Palaearctic), and using beetles as surrogates of aquatic biodiversity, so that, all this information can be finally useful to be implemented in future nature conservation policies. Chapters 1 and 2 deal with the contribution of standing water bodies to regional diversity of water beetles, both for the whole set of localities and for each of the habitat types established. The former is focused exclusively on the local assemblage composition, whereas the latter also tackles the way in which they are structured. Both chapters confirm the importance that these systems have not only for lentic specialist but also for a wide spectrum of facultative species. The role of natural pools in terms of total richness and endorheic lagoons close to saline habitats in terms on endemic richness is highlighted as well. Chapter 2 shows that conductivity is the most explanatory variable for differences in assemblage composition, whereas the degree of anthropogenic impact is the main responsible for the nestedness pattern detected. When fresh and saline water bodies were analyzed independently the two mentioned variables played different roles both in the assemblage composition and structure. The degree of anthropogenic stress was again the most explanatory variable for the nestedness pattern showed by the fresh water sites, whereas for saline sites was conductivity. Chapter 3 includes a functional approach and demonstrates that the species richness of the different water beetle families is significantly related to their biological and ecological trait diversities. However, there were families which displayed higher or lower biological trait diversity than expected in relation to their taxonomic diversity. These results point to the predominance of habitat filtering processes in headwater streams whereas biotic factors, such as interspecific competition, would be more relevant in a priori less stressed habitats as some lentic systems are. As a result of the detailed taxonomic study of the water beetle assemblages carried out in the previous chapters, in chapter 4 a new species for science is described: Stictonectes abellani. Such information is completed with the estimation of the potential distribution and the environmental preferences of the 3 Iberian endemic species of the genus. Finally, chapter 5 evidences, in a wider spatial scale, the existence of contrasting latitudinal patterns of alpha and gamma diversity for lotic and lentic specialist, as well as the decrease of beta diversity as latitude increases for both groups of species. Such findings prove the key role that dispersal ability, framed in the Pleistocene climate changes, plays in shaping the diversity patterns observed in the Western Palaearctic, which is finally originated by the contrasting long-term stability displayed by both kinds of habitats.

Introducción La retina es parte del sistema nervioso central (SNC) y se localiza en la cara interna del globo ocular. Su función principal es la fototransducción de las ondas electromagnéticas del espectro de la luz visible en energía eléctrica. Esta función es realizada por los fotorreceptores (conos y bastones). Tras su procesamiento, la información llega a las células ganglionares de retina (CGR). Las CGR son las únicas neuronas aferentes de la retina y transmiten la información visual al cerebro a través de sus axones, que forman el nervio óptico (NO). En roedores, la mayoría de las CGR proyecta contralateralmente, siendo la población ipsilateral menor del 5%. Dentro de las CGR existe un subtipo que contiene un pigmento fotosensible, la melanopsina, que les confiere la propiedad de la fototransducción. Estas CGR melanopsínicas son responsables principalmente de funciones extravisuales o no formadoras de imágenes, como son el reflejo pupilar o la sincronización del ritmo circadiano con la luz. Objetivos 1º Caracterizar un muevo marcador para identificar las CGR de rata: Brn3a. 2º. Caracterizar la expresión de los factores de transcripción de familia Brn3 en las CGR de rata: Brn3a, Brn3b y Brn3c. 3º. Caracterizar las CGR desplazadas en rata albina y pigmentada. 4º. Caracterizar la población de CGR con proyección retino-retiniana en rata. 5º. Desarrollar nuevos métodos de trazado de las CGR de rata: desde el nervio óptico intacto y desde el tracto óptico. 6º. Analizar el efecto del trazado y la lesión axonal en las CGR melanopsínicas y en la expresión de melanopsina en rata albina y pigmentada. 7º. Caracterizar el efecto a largo plazo de la lesión del nervio óptico en la población general de CGR y CGR melanopsínicas ortotópicas y desplazadas y en el resto de las células que componen la capa de células ganglionares en rata albina y pigmentada. 8º. Caracterizar la respuesta de las células microgliales en la retina de rata tras axotomía del nervio óptico. 9º. Caracterizar el efecto del envejecimiento en la retina de rata albina y pigmentada. Material y Métodos. Resultados y Conclusiones Para identificar las CGR clásicamente se han usado técnicas de trazado. Los trazadores como el Fluorogold® (FG) se aplican o en el NO, para identificar la proyección retinofugal completa, o en los colículos superiores (CS), adonde proyectan el 98,4%% de las CGRs en roedores. En esta tesis hemos puesto a punto dos métodos nuevos de trazado: desde el NO intacto o desde el tracto óptico mediante una inyección bilateral estereotáctica. Ambas técnicas son asequibles, reproducibles y fiables. Además, hemos caracterizado el Brn3a como marcador de CGR. El Brn3a es un marcador fiable y eficiente para identificar y cuantificar las CGR en retinas intactas y con lesión axonal y además, permite analizar la topografía de las CGR después del daño axonal ya que a diferencia de los trazadores neuronales, no presenta interferencia con la microglía fagocítica trazada transcelularmente. Conjuntamente hemos analizado la expresión de los tres miembros de la familia Brn3 en las CGR, y hemos demostrado que el 70% de las CGR co-expresan dos o tres miembros de la familia Brn3 y el 30% restante expresa solamente Brn3a (26%) o Brn3b (4%) en retina de rata. Por tanto, el Brn3a se expresa en todas las CGRs exceptuando las CGR melanopsínicas y la mitad de la población ipsilateral. La mayoría de las CGR se localizan en la capa de las células ganglionares (CCG), conocidas como CGR ortotópicas (CGRo), aunque una pequeña población de CGR se encuentra desplazada a la capa nuclear interna o a la capa plexiforme interna. Estas CGR se llaman células de Dogiel o CGR desplazadas (CGRd). Nosotros hemos estudiado a ambas poblaciones en paralelo. Mientras que las CGR ortotópicas se distribuyen principalmente por la región dorso-central de la retina, las CGR desplazadas tienen una topografía diferente, se encuentran en el ecuador de la retina, con un densidad mayor en la retina temporal y son más abundantes en la rata pigmentada. La mayoría de las CGRd expresan Brn3a, y una pequeña proporción expresa melanopsina, estas últimas se distribuyen de manera similar a las CGRo melanopsínicas: son más abundantes en la retina dorso-temporal. Existe una pequeña población de CGR que proyecta a la retina contralateral, éstas son las CGR de proyección retino-retiniana (CGR ret-ret). Hemos corroborado que esta proyección es mayor en animales jóvenes que en adultos y que se encuentran preferentemente en la retina nasal y, además hemos demostrado que éstas expresan Brn3a o melanopsina y que, las que lo hacen, son las que se mantienen en los animales adultos. En la CCG, además de las CGRo hay otras poblaciones celulares: células endoteliales, células gliales y las células amacrinas desplazadas (CAd). En esta tesis hemos descrito que el 45% de las neuronas de la CCG son CGRs y el 55% restante son CAd. Y si excluimos las células endoteliales, las células gliales representarían un 10% de la población total de la capa de células ganglionares. En esta tesis, también analizamos como el albinismo afecta a las CGR. El albinismo es una enfermedad hereditaria, en la que hay una ausencia parcial o total de pigmentación que, entre otras, provoca una serie de anomalías en el sistema visual tales como una menor proyección ipsilateral y número de CGRd y, la agudeza visual y el nistagmus optocinético están afectados. Nosotros hemos demostrado que el albinismo produce los mismos defectos en la población melanopsínica que en el resto de las CGR: disminución en el número de CGRd-m y una proporción inferior de ipsilateralidad. Las lesiones en el SNC provocan la muerte neuronal con secuelas permanentes e irrecuperables, ya que las neuronas del SNC no se reemplazan. En esta tesis hemos utilizado dos modelos de degeneración de SNC que afectan específicamente a las CGR: la lesión traumática axonal por sección (SNO) o aplastamiento (ApNO) de nervio óptico, y la hipertensión ocular (HTO) como modelo de glaucoma aumentando la presión intraocular por fotocoagulación láser de la malla trabecular y las venas perilimbares y episclerales. Usando el modelo de la elevación de la presión intraocular hemos observado que las CGR desplazadas presentan la misma respuesta que las CGR ortotópicas. Y los modelos de axotomía de nervio óptico también nos han permitido documentar que estas lesiones causan la pérdida específica de CGR (ortotópicas y desplazadas), sin afectar a otras poblaciones de la capa de células ganglionares. Sin embargo, dentro de las CGR, las CGR melanopsinicas tienen un curso temporal de pérdida diferente, son más resistentes a la lesión, pero la expresión de melanopsina se infra-regula transitoriamente como respuesta tanto la axotomía como al trazado retrógrado desde el NO. Así, este hallazgo debe ser tenido en cuenta cuando se utilice la melanopsina para estudiar la población de las CGR intrínsicamente fotosensibles. Las células de la microglía (CM) son los macrófagos residentes del SNC. En condiciones normales se encuentran en estado de vigilancia. Sin embargo, tras una lesión neurodegenerativa se activan fagocitando desechos celulares. La aproximación experimental que se utiliza para identificar las CM que han fagocitado una neurona (o CM fagocíticas, CMF) se basa en el hecho de que las CM acumulan en sus fagolisosomas productos exógenos, proceso conocido como marcaje transcelular. Así, cuando una CM fagocita una CGR en degeneración previamente trazada, acumula el trazador siendo posible distinguirla de las CM que no han fagocitado. En esta tesis hemos cuantificado y analizado la distribución de las CM en la CCG y la CPI tanto en animales intactos como después de ambos modelos de axotomia (SNO y ApNO). La aparición de las CMF después del insulto aumenta al aumentar el tiempo post-lesión y se distribuyen en la región central de la retina donde hay una mayor pérdida de las CGR, a diferencia de los animales intactos donde se distribuyen homogéneamente. Aunque éste aumento de CMF es más rápido después de la SNO, existe una correlación lineal y topográfica entre la aparición de las CMF y la pérdida de CGR. La aparición de las CMF en la CCG y el descenso de las CM no fagocíticas en la CPI a 14d de ambas lesiones, sugiere que tras la lesión de las CGR las CM migran entre ambas capas. La pérdida funcional o estructural de la actividad sensorial relacionada con la edad, es muy relevante cuando afecta al sistema visual, ya que de él dependemos más que de otros sentidos. No sólo los componentes puramente físicos implicados en la visión (córnea, cristalino, humor vítreo y humor acuoso) sufren cambios estructurales que influyen en la eficiencia de la transmisión lumínica perjudicando la calidad de la visión, sino que hay pérdida numérica y funcional en las poblaciones celulares implicadas en la transmisión de la información hasta el cerebro que aumenta con la edad. En esta tesis hemos comprobado que el envejecimiento causa principalmente un déficit funcional de la retina en ambas estirpes de rata analizadas. Pero anatómicamente, ni el número de células en la CCG, ni el transporte axonal anterógrado disminuyen con la edad, solamente en la cepa pigmentada, hay un descenso del número de fotoreceptores tipo cono. Y mediante un análisis “in vivo” (SD-OCT), también hemos observado un alargamiento y adelgazamiento progresivo de la retina. Para la realización de esta tesis ha sido necesario el desarrollo de rutinas informáticas que permitan tanto la cuantificación como la representación grafica de la distribución de las diversas poblaciones celulares estudiadas en la retina. Todas estas metodologías automáticas fueron realizadas en colaboración con D. Manuel Jiménez López. / Introduction The retina is part of the central nervous system (CNS) and it is located in the posterior part of the ocular globe. The main function of the retina is to sense light. Photoreceptors, cones and rods and send the luminous information to retinal ganglion cells (RGCs) through intermediate neurons. RGCs are the only afferent retinal neurons and transmit this information from the retina to the retinorecipient areas in the brain through their axons that form the optic nerve (ON). In rodents, the majority of RGC project to the contralateral superior colliculi (SCi), being the ipsilateral projection smaller than 5%. There is a subtype of RGC that expresses a photosensitive pigment, melanopsin, that confers them the ability of phototransduction. Melanopsin+RGC (m+RGC) are responsible for the non visual functions triggered by light, such as the pupilary reflex and the circadian photoentrainment. Objetives 1st. To characterize Brn3a as a marker of rat RGCs. 2nd. To characterize the expression of Brn3 transcription factors, Brn3a, Brn3b and Brn3c, in rat RGCs. 3rd. To characterize the population of displaced RGCs in albino and pigmented rats. 4th. To characterize the population of RGCs that project retino-retinially. 5th. To investigate the efficiency of two new methods to trace rat RGCs: from the intact optic nerve and from the optic tract. 6th. To analyze the effect of tracing or axotomy on the expresión of melanopsin and detection of melanopsin+RGCs in albino and pigmented rat RGCs. 7th. To analyze in albino and pigmented rats the long term effect of optic nerve injury on RGCs and m+RGCs orthotopic and displaced, and on the rest of the ganglion cell layer cells. 8th. To analyze the microglial response in the rat retina after optic nerve axotomy. 9th. To study in albino and pigmented rats the effect of aging on the retina. Material and Methods. Results and Conclusions Retrograde tracing with tracers such as Fluorogold® (FG) is the classical approach to identify RGCs. Tracers are applied in the ON to identify the whole retinofugal projection or on the SC, where 98.4% of the RGC project to. In these thesis, we have tuned up two new methods to trace rat RGCs: from the intact optic nerve and from the optic tract by a bilateral stereotactic injection. Both techniques are affordable, reproducible and reliable. In addition we have characterized the Brn3a as a marker of rat RGCs. Brn3a is a reliable marker to identify, quantify and assess the viability of rat RGCs in health and disease. In addition, Brn3a immunodetection allows quantifying and determining the topography of RGCs after a given injury without interference of transcellularly- labelled microglial cells. We have analyzed the expression of the three members of the Brn3 family RGC, and we have shown that 70% of RGC co-express two or three Brn3 members and the remaining 30% expresses only Brn3a (25%) or Brn3b (4%). Brn3a is expressed by all RGCs except melanopsin+ ones and half of the ipsilateral projection. Most of the RGC are placed in the ganglion cell layer (GCL), these are orthotopic RGC (oRGC). However a small proportion of them is located in the inner nuclear layer or in the inner plexiform layer. These are known as Dogiel's cells or displaced RGC (dRGC). We have studied both counterpart together. While the ortothopic RGCs, are denser in the dorso-central retina, the displaced RGCs have a different topography, they are found in the retinal equator, with a higher density in the temporal retina and are more abundant in pigmented animals. Most of the dRGCs express Brn3a, and a small proportion express melanopsin, the last ones have a similar distribution than the m+-oRGCs: they are more abundant in the dorso-temporal retina. There is a small number of RGC projects to the contralateral retina, these are retino-retinal projecting RGC (ret-ret RGC). We have beared out the retino-retinal projection is minute but higher in young than in adult animals. Ret-ret RGCs are mainly nasal, and express Brn3a or melanopsin and those do it, are preserved in adult animals. In the GCL besides oRGC there are endothelial cells, glial cells and displaced amacrine cells (dAC). In this work, we have described that 45%percent of neurons in the GCL are RGCs, and 55% are displaced amacrine cells. And, if we exclude the endothelial cells, glial cells represent 10% of the total cell population of the ganglion cell layer. In this thesis, we have also analyzed how albinism affects RGCs. Albinism is a hereditary disease caused by the partial or total lack of pigmentation that causes a long list of abnormalities in the visual system such as an impaired visual acuity and optokinetic nystagmus and defects in the crossing of the retinofugal projections. Here, we added to this knowledge, that albinism produces in the melanopsin population the same defects than in the general RGC population: reduced number of displaced m+RGCs and a lower ipsilaterally. CNS lesions induce the permanent and irreversible death of the affected neurons, since CNS neurons do not proliferate and thus, are not replaced. In this thesis we have used two models of RGC degeneration: traumatic axonal injury (axotomy) transecting (ONT) or crushing (ONC) the optic nerve, and ocular hypertension (OHT), a model of glaucoma created by increasing the intraocular pressure with laser photocoagulation of the trabecular meshwork, the perilimbar and episcleral veins. Using the ocular hypertension, we have observed that the dRGCs and oRGC respond similarly to lesion. And the axotomy models also allowed us to document that after axotomy only RGCs are lost (ortothopic and displaced) without affecting other populations in the ganglion cell layer. However, within RGCs, the m+RGCs have a different course of loss, they are more resistant to injury, but the expression of melanopsin is temporarily under-regulated in response to both axotomy and retrograde tracing from the NO. Thus, this finding should be considered when melanopsin is used to study the population of the intrinsically photosensitive CGR. Microglial cells (MC) are the CNS resident macrophages. In the healthy CNS they are found in a resting (surveying) state. However, during a neurodegenerative process, they activate and among other functions, phagocytose the cellular debris. The experimental approach to identify CM that have phagocytose a neuron (phagocytic microglial cells, PMC) is based on the fact that CM accumulate in their phagolysosomes exogenous compounds, such as tracers. This process is known as transcellular tracing. Thus, when a MC engulfs a traced RGC it is possible to distinguish it from the rest of MC. In this thesis, we quantified and analyzed the distribution of MC in the GCL and the IPL in intact animal or after both axotomy models (SNO and APNO). The number of CMF after the insult increases with time post-injury. These PMC are distributed in the central region of the retina where the loss of RGCs is greater, unlike in intact animals where they are homogeneously distributed. The appearance of PMC correlates linearly and topographically with the loss of RGCs. The increase of PMC in the GCL and the decrease of MC in the IPL suggest that upon RGC injury, MC migrate between both layers. Aging is very relevant when affects the visual system, since we depend on vision more than on any other senses. Not only the physical components of the eye (cornea, lens, vitreous and aqueous humor) through which the light passes age, there is also a progressive neuronal loss and degeneration. In this thesis we found that aging causes, mainly, a functional deficit in the retina in both rat strains. Anatomically, neither the number of cells in the GCL nor the anterograde axonal transport diminishes with age, however, in the pigmented, but not in the albino rat, there is a loss of cone photoreceptors. And by “in vivo” analysis (SD-OCT), we have also observed a progressive elongation and thinning of the retina. For the consecution of this thesis it has been necessary to develop several automated routines to perform the quantification and graphic representation of the different cell populations analyzed. All these automated methodologies were created in collaboration with D. Manuel Jimenez López.

Objetivos: - Analizar las variaciones en la composición lipídica y el contenido de carbohidratos del músculo y de la glándula digestiva de O. vulgaris durante un periodo corto de ayuno, como aproximación a sus requerimientos nutricionales. - Conocer la aceptabilidad y crecimiento de O. vulgaris alimentado con dietas formuladas con diferentes ingredientes de origen vegetal y animal. - Elaborar piensos formulados en base a los resultados previos de aceptabilidad y comprobar su rendimiento en O. vulgaris mediante ensayos de engorde y digestibilidad. - Estimar los requerimientos lipídicos de O. vulgaris después de suministrar dietas con distinto contenido en aceite de pescado, comprobando los cambios que se producen en el crecimiento, aprovechamiento nutritivo y digestibilidad de la dieta. - Determinar la composición nutricional de O. vulgaris después de suministrar dietas formuladas con distinto contenido en aceite de pescado. - Estudiar los cambios que se producen en el crecimiento, composición nutricional, aprovechamiento nutritivo y digestibilidad de la dieta de O. vulgaris después de suministrar dietas formuladas que incluyen carbohidratos simples o complejos. Metodología: -Ensayos de ayuno: Se configuraron 5 grupos experimentales (n = 4). Cuatro grupos se sacrificaron a los días 1, 2, 4 y 8 después de suministrar la última comida y un grupo control fue alimentado durante los 8 días de duración del experimento. El día del sacrificio los animales se diseccionaron separando el tejido muscular y la glándula digestiva. Se determino el contenido de carbohidratos, los lípidos totales, y las clases lipídicas mediante HPTLC. -Aceptabilidad de ingredientes: Se prepararon diferentes dietas formuladas con un ingrediente a testar (30%), gelatina como aglomerante (20%), y agua (50%). Los ingredientes de la dieta se mezclaron al Baño María a 45ºC y se dejaron enfriar a 4ºC. Se utilizaron grupos experimentales de entre 6 y 8 individuos (887,0 ± 274,2 g) y se le suministró la dieta entre 3 y 15 días. Se calcularon las tasas de alimentación y crecimiento y el índice de eficacia alimentaria de cada dieta. -Ensayos de engorde: Se probaron 8 piensos diferentes elaborados con ingredientes secos o liofilizados. La duración de los ensayos fue de 42 a 56 días con ejemplares subadultos (700-800 g) mantenidos a 18ºC en recirculación con control de la temperatura. Se realizaron análisis de composición corporal (humedad, proteína, grasa, cenizas y MELN) de los animales, las heces y en las dietas suministradas. Con los datos obtenidos se calcularon las tasas de alimentación, crecimiento y digestibilidad. Resultados y Conclusiones En los animales sometidos a un periodo de ayuno se detectó un aumento en los monoglicéridos y el colesterol en el músculo y se movilizó un promedio de 0,23 g de lípidos por día de ayuno, principalmente ácidos grasos libres, ésteres de esterol y triglicéridos procedentes de la glándula digestiva. Los lípidos contribuyeron con un 26% y los carbohidratos con un 9,9% al gasto energético diario durante el ayuno en el pulpo de roca. Los piensos elaborados con liofilizados de pescado y la yema de huevo en polvo ofrecieron los mejores resultados, con tasas de alimentación y crecimiento similares a las obtenidas para dietas naturales a base de pescado. Las dietas artificiales semihúmedas basadas en una mezcla de ingredientes secos o liofilizados, que emplearon pota (T. sagittatus) como ingrediente principal, mostraron buenas tasas de alimentación, crecimiento, aprovechamiento nutritivo y digestibilidad, igualando o superando las dietas naturales a base de pescado. Se sugieren tasas óptimas de ingesta de lípidos para el pulpo en torno a 1 g al día, con porcentajes apropiados de grasa para dietas formuladas entre el 13-14% en sustancia seca, aunque estos porcentajes pueden variar en futuros estudios según las proporciones de lípidos polares y neutros de la dieta. La dieta mejor aceptada incluía almidón al 5%, aunque los mejores índices de aprovechamiento nutritivo se observaron en la dieta con glucosa al 5%, destacando un PPV del 72% e índices de conversión inferiores a 1 / Aims: - To analyse the variations in lipid composition and carbohydrates content of muscle and digestive gland of O. vulgaris during short-term starvation as approximation to its nutritional requirements. - To determine the acceptability and growth of O. vulgaris fed formulated diets with different ingredients of vegetal and animal origin. - To prepare formulated diets based on the previous results of acceptability and check its efficiencies on O. vulgaris by means of ongrowing and digestibility experiments. - To estimate the lipid requirements of O. vulgaris after supplying diets with different content in fish oil, comparing the changes that take place in the growth, feed efficiency and digestibility of diet. - To determine the proximate and lipid classes composition of O. vulgaris after supplying formulated diets with different content in fish oil. - To study the changes that produce in the growth, nutritional composition, feed efficiency and digestibility of diet in O. vulgaris after supplying formulated diets including simple or complexes carbohydrates. Methodology: -Experiment of starvation: We configured 5 experimental groups (N = 4). Four groups were sacrificed 1, 2, 4 and 8 days after the last meal and a group control was fed throughout the 8 day experimental period. The day of the sacrifice the animals were dissected separating the muscular and the digestive gland. We determined the content of carbohydrates, total lipids, and lipid classes by means of HPTLC. -Acceptability of ingredients: We prepared different formulated diets with an ingredient to test (30%), gelatine as binder (20%) and water (50%). The ingredients of the diet were mixed at 45ºC and cool to 4 ºC. Each diet was tested in experimental groups of between 6 and 8 individuals (887.0 ± 274. g) during a period between 3 and 15 days. The feeding and growth rates and feed efficiency indices of each diet were calculated. -Ongrowing experiments: Eight different formulated diets including dry or freeze-dried ingredients were tested. The length of the experiments was of 42 to 56 days with subadults (700-800 g) kept to 18ºC in a recirculation seawater system with control of the temperature. The proximate composition (moisture, protein, lipid, ash and MELN) of the animals, the faeces and the diets supplied were analysed. The feeding and growth rates and digestibility were calculated with the data obtained. Results and Conclusions In the animals subjected to a starvation period detected an increase in the monoacylglycerols and the cholesterol in the muscle and 0.23 g of lipids by day of starvation, mainly free fatty acids, steryl esters and triacylglycerols were mobilized from the digestive gland. The lipids contributed with 26% and the carbohydrates with a 9.9 % of the energy costs of the animals during starvation in octopus. The elaborated diet based on freeze-dried fish and egg yolk powder offered the best results, with feeding and growth rates similar to the obtained for natural diets based on fish. The semi-moist formulated diets based on a mixture of dried or freeze-dried ingredients, composed of squid (T. sagittatus) as the main ingredient, showed good feeding and growth rates, feed efficiency and digestibility, similar or surpassing the natural diets based on fish. We propose optimal lipid feeding rates of around 1 g day-1, with appropriate percentages of lipid for formulated diets between the 13-14% dry matter, although these percentages can vary in future studies according to the proportions of polar and neutral lipids of the diet. The best acceptability was detected in the diet formulated with 5% of starch, although the best feed efficiency was observed in the diet with 5% of glucose, highlighting a productive protein value of 72% and a food conversion ratio lower than

INTRODUCCIÓN: La señalización a través de los NOD-like receptors (NLRs), que son una familia de receptores citosólicos de reconocimiento de patrones (PRRs), da lugar al procesamiento y activación de las citoquinas pro-inflamatorias IL-1 β e IL-18 mediados por caspasa-1, así como de la inducción de una forma de muerte celular recientemente descrita llamada piroptosis. Para ello, los NLRs median la formación de plataformas multiproteicas de señalización llamadas inflamasomas, que alertan al sistema inmune de la presencia de infección o daño tisular. OBJETIVOS: (1) Establecimiento de un modelo de infección de Salmonella Typhimurium en pez cebra para estudiar la activación, el ensamblaje y el funcionamiento del inflamasoma; (2) Caracterización del papel de la flagelina de S. Typhimurium en el mecanismo de infección en pez cebra; (3) Caracterización del papel de Gbp4 de pez cebra en la activación y ensamblaje del inflamasoma, así como en la eliminación de S. Typhimurium; (4) Caracterización del papel de los neutrófilos en la eliminación de S. Typhimurium dependiente de Gbp4 en pez cebra; (5) Caracterización del papel de Gbp4 en la producción de prostaglandinas dependiente del inflamasoma, y del de las prostaglandinas en la eliminación de S. Typhimurium. METODOLOGÍA: Los métodos utilizados en la tesis doctoral son: Ensayos de infección con S. Typhimurium, ensayos de actividad caspasa-1, toma de imágenes de larvas de pez cebra, reclutamiento de neutrófilos y análisis de la muerte celular, ensayos de luminescencia, citometría de flujo, análisis de expresión génica, Western blot, ensayo de reconstitución del inflamasoma en células HEK293. RESULTADOS: Aquí demostramos que la proteína Gbp4 de pez cebra, una enzima GTPasa inducible por IFNγ que alberga un dominio C-terminal CARD, se expresa en los neutrófilos y es necesaria para la eliminación de Salmonella Typhimurium in vivo dependiente del inflamasoma. A pesar de la presencia del dominio CARD, Gbp4 requiere la presencia de la proteína adaptadora Asc para desempeñar su función antibacteriana. Además, la actividad GTPasa de Gbp4 es indispensable para la activación del inflamasoma, el reclutamiento de neutrófilos al lugar de la infección, y la eliminación de S. Typhimurium. La reconstitución de los complejos Gbp4-Asc en células embrionarias humanas de riñón (HEK293) en cultivo, nos mostró que forman complejos macromoleculares con un anillo exterior de Asc y un núcleo de Gbp4. Mecanísticamente, Gbp4 es esencial para la liberación de prostaglandinas dependiente del inflamasoma, de las cuales PGD2 se asocia con la eliminación de bacterias mediada por Gbp4. Por tanto, nuestros resultados señalan a las proteínas de unión con GTPasa como los adaptadores clave del inflamasoma necesarios para la biosíntesis de prostaglandinas y la eliminación de bacterias intracelulares por los neutrófilos in vivo. CONCLUSIONES: (1) El pez cebra es un excelente modelo para estudiar la activación y la función del inflamasoma en respuesta a una infección por S. Typhimurium; (2) El reconocimiento intracelular de S. Typhimurium en pez cebra depende altamente de la producción de flagelina; (3) La activación del inflamasoma dependiente de Gbp4 mejora la resistencia de las larvas de pez cebra e incrementa la actividad caspasa-1 después de la infección con S. Typhimurium; (4) Tanto Gbp4 mutante que carece de la actividad GTPasa, como el doble mutante al que también le falta el dominio CARD, se comportan como dominantes negativos, incrementando la susceptibilidad a S. Typhimurium y, en paralelo, reduciendo la actividad caspasa-1; (5) El mutante de Gbp4 sin el dominio CARD actúa, al igual que GBP5 de mamíferos, rescatando la elevada susceptibilidad de las larvas deficientes en Gbp4, pero no aumenta la actividad caspasa-1 después de la infección con S. Typhimurium en pez cebra; (6) Gbp4 regula el reclutamiento de neutrófilos al lugar de infección y, además, la eliminación de S. Typhimurium dependiente de Gbp4 esta mediada por los neutrófilos; (7) El inflamasoma dependiente de Gbp4 activa la biosíntesis de las prostaglandinas, que a su vez fomentan la eliminación de S. Typhimurium. / NTRODUCTION: The nucleotide-binding domain leucine-rich repeats (NLRs) constitute a family of cytosolic pattern recognition receptors (PRRs), which are the responsible for the caspase-1-mediated processing and activation of pro-inflammatory cytokines, such us IL-1 β and IL-18, and the induction of a recently described form of cell death called pyroptosis. NLRs achieve these functions by forming multiprotein signaling platforms, called inflammasomes, which alert the immune system about the presence of infection or tissue damage. OBJECTIVES: Taking that into consideration, the objectives of the present work are: (1) Establishment of a zebrafish – Salmonella Typhimurium infection model to study inflammasome activation, assembly and function; (2) Characterization of the role of flagellin of S. Typhimurium in the infection mechanism in zebrafish; (3) Characterization of the role of zebrafish Gbp4 in inflammasome activation, assembly and clearance of S. Typhimurium; (4) Characterization of the role of neutrophils in the Gbp4-dependent clearance of S. Typhimurium in zebrafish; (5) Characterization of the role played by the Gbp4 inflammasome in prostaglandin production and S. Typhimurium clearance. METHODOLOGY: The following methods were used in this doctoral thesis: yolk sac or ear infection assays with S. Typhimurium, caspase-1 activity assays of infected larvae, counting of neutrophils using different zebrafish transgenic lines with fluorescent neutrophils using live imaging, neutrophil recruitment assays, cell death analysis, luminescence assays for the measurement of Il1-β contents, flow cytometry and FACS-sorting of fluorescent cells, gene expression analysis, western blot, inflammasome reconstitution assays in HEK293 cells. RESULTS: Here we report that zebrafish Gbp4, an IFNγ-inducible GTPase harboring a C-terminal CARD domain, is expressed in neutrophils and is required for the inflammasome-dependent clearance of Salmonella Typhimurium in vivo. Despite the presence of the CARD domain, Gbp4 requires the universal inflammasome adaptor protein Asc for mediating its antibacterial function. In addition, the GTPase activity of Gbp4 is indispensable for the inflammasome activation, the neutrophil recruitment and the clearance of S. Typhimurium. Reconstitution of Gbp4-Asc complexes in human embryonic kidney cells (HEK293) revealed a macromolecular complex with an outer ring of Asc and an core of Gbp4. Mechanistically, Gbp4 is essential for the inflammasome-dependent release of prostaglandins, of which PGD2 is associated with the Gbp4-mediated bacterial clearance. Our results, therefore, point to GTPase-binding proteins as the key inflammasome adaptors required for prostaglandin biosynthesis and intracellular bacterial clearance by neutrophils in vivo. CONCLUSIONS: The above results suggest that: (1) Zebrafish is an excellent model to study inflammasome activation and function upon S. Typhimurium infection; (2) Intracellular recognition of S. Typhimurium in zebrafish highly depends on flagellin production; (3) Gbp4-dependent inflammasome activation improves zebrafish larvae resistance and increases caspase-1 activity upon S. Typhimurium infection; (4) A Gbp4 mutant lacking GTPase activity, as well as a double GTPase and CARD mutant, behave as dominant negatives by increasing the susceptibility to S. Typhimurium and, in parallel, decreasing caspase-1 activity; (5) A Gbp4 mutant lacking the CARD domain acts as mammalian GBP5; that is, rescues the higher susceptibility of Gbp4-deficient larvae but fails to increase caspase-1 activity upon S. Typhimurium infection in zebrafish; (6) Gbp4 regulates neutrophil recruitment to the site of the infection. In addition, the Gbp4-dependent clearance of S. Typhimurium is mediated by neutrophils; (7) The Gbp4-dependent inflammasome activates prostaglandin biosynthesis, which in turn promotes S. Typhimurium clearance.

Objetivos • Caracterizar la población de CGRm del ratón pigmentado y albino adulto. • Estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO en ratón pigmentado. • Estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO y su protección con BDNF en rata albina adulta. Material y métodos Para la realización de los experimentos se utilizaron ratones machos pigmentados y albinos adultos y ratas hembras adultas albinas. Las manipulaciones de los animales se realizaron siguiendo la normativa europea (Directiva 2010/63/UE) y nacional (RD 53/2013) sobre la protección de los animales utilizados para la experimentación y otros fines científicos. Para caracterizar la población de CGRm del ratón pigmentado y albino adulto, se inmunodetectaron secciones transversales de retina y retinas a plano con el anticuerpo contra la melanopsina, con el anticuerpo contra Brn3a y se contratiñeron los núcleos de todas las células de la retina con DAPI. Para estudiar la proyección de las CGRm, se aplicó en ambos CS o en el muñón del nervio óptico el trazador neuronal OHSt. Para estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO en ratón pigmentado, se caracterizó el modelo de HTO fotocoagulando con láser las venas perilimbares y epiesclerales del ratón. Para analizar el curso temporal de daño axonal y muerte de las CGR y las CGRm, las CGR fueron trazadas retrógradamente desde los CS con OHSt, las retinas se inmunodetectaron con Brn3a y melanopsina, y se analizaron a las 2 y 4 semanas. Para estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO y su protección con BDNF en rata albina adulta, se analizó el curso temporal de daño axonal y muerte de las CGR y CGRm tras HTO en retinas tratadas con BDNF o vehículo. Las CGR fueron trazadas retrógradamente desde los CS con FG, y las retinas se inmunodetectaron con Brn3a y se analizaron a 12 y 15 días tras la inducción de la HTO. Para el análisis estadístico, el test Kruskal-Wallis se utilizó cuando se compararon dos o más grupos y el test Mann-Whitney cuando se compararon dos grupos solamente. Las diferencias entre grupos se consideraron estadísticamente significativas para p<0.05. Resultados Los ratones pigmentados y albinos tienen un número similar de CGRm (1.021±109 CGRm pigmentado y 962±169 CGRm albino). En los ratones pigmentados las CGRm son más abundantes en la retina tempora y en los albinos están más localizadas en la retina superior. Ambos ratones también tienen CGRm desplazadas (CGRm-d) en la capa nuclear interna, que representan el 14% del total de CGRm en ratones pigmentados y el 5% en los albinos. El marcaje desde ambos CS muestra que el 98% (pigmentado) y el 97% (albino) de la población total de CGRm se marcan retrógradamente, mientras que el estudio de colocalización de melanopsina y Brn3a confirma que un porcentaje muy pequeño de CGRm expresa este factor de transcripción en ratones. En el estudio del marcaje retrógrado colocando OHSt en el muñón del nervio óptico demuestra que no todas las CGRm eran trazadas. Existía una subpoblación de CGRm-d (14% en pigmentados y 28% en albinos) y CGRm residentes en la zona ciliar marginal de la retina (20% en pigmentados y 24% en albinos) que no se trazaban desde el nervio óptico; por lo que estas células no envían el axón a través del nervio óptico y pueden ser consideradas interneuronas de la retina, quizá relacionadas con el reflejo pupilar intrínseco. En el estudio de la caracterización del modelo de hipertensión ocular en el ratón pigmentado observamos un aumento significativo de la presión intraocular desde las primeras 6 horas de la fotocoagulación láser hasta los 5 días. En ratón pigmentado, la HTO resulta en una pérdida difusa y/o sectorial de CGR trazadas con el trazador neuronal OHSt (CGR OHSt+) (50% a 2 semanas y 62% a 4 semanas). Sin embargo, a las 2 semanas aún se observa un 66% de CGR marcadas con Brn3a (CGR Brn3a+). Esto indica que sobreviven en la retina aproximadamente un 16% de CGR cuyo transporte axonal retrógrado está comprometido. Parte de estas CGR acaban muriendo y a las 4 semanas el número de CGR trazadas con OHSt e inmunodetectadas con Brn3a se iguala. La población de CGRm disminuyó aproximadamente al 59% a las 2 semanas y al 46% a las 4 semanas, valores similares a los de las CGR Brn3a+ para los mismos tiempos. La distribución topográfica de la pérdida de CGRm, aunque era mayor en la zona supero-temporal de retina, no era sectorial, sino difusa a lo largo de la retina y no se complementaba con la distribución de la pérdida del resto de CGR. En rata albina, la HTO resulta en una pérdida sectorial de las CGR FG+ (78 y 84% a los 12 y 15 días, respectivamente). El número de CGR Brn3a+ fue significativamente mayor para ambos tiempos de estudio, esto indica que una proporción considerable (≈21 - 26%) de CGR sobreviven en la retina con su transporte axonal retrógrado deteriorado. Las CGRm también presentaron una disminución significativa (50-51%) y esta pérdida, al igual que en ratón, fue difusa. La administración intravítrea de BDNF aumentó la supervivencia de las CGR Brn3a+ a 81 y 67% a los 12 y 15 días, respectivamente, pero no tuvo ningún efecto sobre las CGRm. D. Francisco Javier Valiente Soriano “Characterization in adult rodents of the melanopsin retinal ganglion cells population and study of the retinal ganglion cells degeneration after ocular hypertension and neuroprotection” / Objetives • Characterization of the mRGC population of adult pigmented and albino mouse. • Study the RGC and mRGC degeneration after OHT in the pigmented mouse. • Study the RGC and mRGC degeneration after OHT and their protection with BDNF in adult albino rat. Material and methods To perform the experiments we used adult pigmented mice, adult albino mice and female adult albino rats. Manipulations of animals were carried out according to the European (Directive 2010/63/UE) and National (RD 53/2013) regulations existing on the protection of animals used for experimentation and other scientific purposes. To study the characterization of the mRGC population of adult pigmented and albino mouse, cross sections of retina and whole mounts were immunoreacted with anti-melanopsin antibody, with anti-Brn3a antibody and stained with DAPI. To study the projection of the mRGC, the neuronal tracer OHSt was applied in both SC or in the optic nerve. To study the RGC and mRGC degeneration after OHT in the pigmented mouse, ocular hypertension model was performed by laser photocoagulation of the perilimbar and epiescleral veins of the experimental eye. To study the time course of the axonal damage and RGC and mRGC death caused, the RGC were traced from the SC with OHSt and retinas were immunodetected with Brn3a and melanopsin and analyzed at 2 and 4 weeks. To study the RGC and mRGC degeneration after OHT and their protection with BDNF in adult albino rat, we analyzed the time course of the axonal damage and RGC and mRGC death after OHT in BDNF or vehicle-treated retinas, RGC were retrogradely traced from the SC with the retrogradely transported tracer fluorogold (FG), retinas were immunodetected with Brn3a and analyzed at 12 and 15 days after the induction of OHT. For statistical analysis, Kruskal–Wallis test was used when comparing more than two groups and Mann–Whitney when comparing two groups only. Differences were considered significant when p<0.05. Results Both pigmented and albino mice have a similar number of mRGC (1,021±109 mRGC in pigmented, 962±169 mRGC in albino). The mRGC are most abundant in the temporal retina in pigmented mice, and in dorsal retina in albino mice. Both mice also have displaced mRGC (d-mRGC) located in the inner nuclear layer representing 14% of the total population of mRGC in pigmented mice and 5% in albino mice. The 98% (pigmented) or 97% (albino) of the total population of mRGC were marked retrogradely from both SC, while the colocalization study of melanopsin and Brn3a confirms that a very small percentage of this transcription factor was expressed by mice mRGC. A surprising fact in the study of retrograde labeling with OHSt applied on the ON stump was that not all the mRGC were traced. A subpopulation of d-mRGC (14% in pigmented and 28% in albino) and mRGC located in the ciliary marginal zone of the retina (20% pigmented and 24% in albino) that were not traced from the optic nerve, that means that these cells do not send an axon into the optic nerve and can be considered an interneuron of the retina, perhaps related to the intrinsic pupil reflex. In the study of the characterization of ocular hypertension model in pigmented mouse, a significant increase of the intraocular pressure (IOP) was observed from 6 hours of laser photocoagulation up to 5 days. OHT results in a sectorial and/or diffuse loss of RGC traced with OHSt (OHSt+RGC) (50% at 2 weeks and 62% at 4 weeks). However, at 2 weeks, 66% of RGC, which were immunodetected with Brn3a (Brn3a+RGC) were still present. This indicates that at this time around 16% of RGC survive in the retina with their retrograde axonal transport committed. These RGC, however, died at 4 weeks and the number of traced OHSt+RGC and immunodetected Brn3a+RGC was equal. The mRGC population decreased to 59% at 2 weeks and to 46% at 4 weeks. These percentages of loss were similar to the Brn3a+RGC at the same time points. The loss of the mRGC was higher in the supero-temporal area of the retina. However, this loss was not sectorial, but was diffuse along the retina, and did not parallel the distribution of loss of the rest of RGC. In albino rat, OHT resulted in a sectorial loss of FG+RGC (78-84% at 12 and 15 days, respectively). The number of Brn3a+RGC was significantly higher in both times of study, which indicates that a significant proportion (≈21-26%) of RGC survive in the retina with their impaired retrograde axonal transport. The mRGC also presented a significant reduction of approximately 50-51%, and this loss, as in mice, was diffuse. The intravitreal administration of BDNF increased the Brn3a+RGC survival to 81% and 67% at 12 and 15 days, respectively, but had no effect on the mRGC. The study of the inner retinal vasculature did not show any abnormality that could explain the sectorial loss of RGC.

Esta tesis aborda diferentes retos relacionados con la conservación de la biodiversidad acuática en la península ibérica utilizando los macroinvertebrados acuáticos como sistema modelo. Esta información pretende contribuir a un mejor conocimiento de los factores que determinan y amenazan la biodiversidad de macroinvertebrados acuáticos así como proporcionar herramientas útiles para su conservación. Los Capítulos 1 y 2 se centran en la búsqueda y evaluación de posibles sustitutos o indicadores de biodiversidad en ecosistemas acuáticos, mientras que el capítulo 3 está dedicado a testar la eficacia de las redes de áreas protegidas en la representación de la biodiversidad de macroinvertebrados. En el capítulo 4, a partir de nuevos registros de un insecto acuático invasor detectado a lo largo de la península ibérica, se proporcionan mapas globales de distribución potencial considerando que la prevención de invasiones biológicas es la estrategia más efectiva para evitar problemas de conservación y nuevas expansiones. El Capítulo 1 revela que los parques nacionales de montaña en España contienen un porcentaje importante de la biodiversidad ibérica con respecto a las familias de macroinvertebrados. La riqueza de familias de Coleoptera muestra la correlación más alta con los otros grupos taxonómicos y puede ser propuesta como un sustituto/indicador de la biodiversidad de macroinvertebrados en las zonas montañosas bien conservadas. Tal indicador taxonómico podría complementarse con el uso de la riqueza de familias de Odonata en ambientes estancados. El Capítulo 2 presenta una evaluación del funcionamiento de un grupo carismático (aves acuáticas) como sustituto de la biodiversidad de macroinvertebrados en humedales. Los resultados muestran una concordancia limitada entre la composición de la comunidad de aves acuáticas y macroinvertebrados, así como correlación no significativa o negativa entre las métricas de riqueza taxonómica. Ambos grupos muestran diferentes respuestas a gradientes ambientales, y por lo tanto las aves acuáticas se pueden considerar malos indicadores de la biodiversidad acuática en estos ecosistemas. El Capítulo 3 proporciona el primer intento de evaluar la efectividad de las redes de áreas protegidas en la representación de los componentes alfa, beta y gamma de la diversidad tanto taxonómica como funcional de macroinvertebrados a diferentes escalas espaciales. Los resultados muestran un funcionamiento de las áreas protegidas marcadamente diferente en el mantenimiento de la diversidad taxonómica y funcional de macroinverebrados, y apuntan a un sesgo en la representación de determinados hábitats acuáticos dentro de las redes de reservas. Tal desajuste llama a la prudencia en cuanto al uso de cualquier componente de una diversidad como un sustituto para los demás, y hace hincapié en la importancia de adoptar un enfoque integral para la conservación de la biodiversidad en los ecosistemas acuáticos. El último capítulo se centra en Trichocorixa verticalis verticalis (Corixidae, Hemiptera), una de las pocas especies de insectos acuáticos consideradas como exóticas, y para la que se han detectado nuevos registros de poblaciones importantes en numerosos humedales Ramsar en Andalucía (suroeste de España). Los mapas predictivos de distribución potencial obtenidos sugieren que este coríxido puede extenderse mucho más allá de su área de distribución actual y encontrar condiciones habitables en áreas templadas a lo largo de una amplia gama de latitudes. Además, al considerar un escenario climático futuro, el área de idoneidad muestra cambios limitados en comparación con la distribución potencial actual. Los resultados permiten la detección de zonas de contacto entre áreas actualmente colonizadas y áreas potenciales de invasión, así como zonas con alto nivel de idoneidad que coinciden con áreas reconocidas como puntos calientes de biodiversidad a nivel mundial. La combinación de estos resultados entronca con algunos de los retos claves para la conservación de la biodiversidad de macroinvertebrados acuáticos (indicadores de biodiversidad, eficacia de las áreas protegidas y potenciales amenazas a la biodiversidad) y proporciona información útil acerca de temas claves para gestores y biólogos de la conservación. / This thesis addresses different challenges related to the conservation of freshwater biodiversity in the Iberian Peninsula using aquatic macroinvertebrates as a model system. This information will contribute to a better understanding of the determinants that affect and threat aquatic macroinvertebrate biodiversity and, aims to provide insights for use in nature conservation policies. Chapters 1 and 2 focus on the assessment of potential biodiversity surrogates in aquatic ecosystems, while Chapter 3 is dedicated on the effectiveness of protected areas networks in representing freshwater diversity. In Chapter 4, starting from new records of an alien aquatic insect detected in the Iberian Peninsula, global potential distribution maps for this species are produced since the prevention of biological invasions is the most cost-effective way to avoid problems related with nature conservation. Chapter 1 reveals that mountainous national parks in Spain contain a large percentage of the overall Iberian biodiversity with respect to aquatic macroinvertebrates at family level. Coleoptera family richness displays the highest correlation with the other taxonomic groups and remaining richness values and may be used as a macroinvertebrate biodiversity surrogate in well preserved mountainous areas. Such a taxonomic indicator could be complemented by the use of Odonata family richness in case of standing waters. Chapter 2 assesses the performance of a charismatic group (waterbirds) as surrogate of macroinvertebrates biodiversity in wetlands. The results show limited concordance between the community composition of waterbirds and macroinvertebrates, and negligible or negative correlations between the metrics of their taxonomic richness. Contrasting responses to environmental gradients were detected and waterbirds can therefore be considered poor indicators of aquatic biodiversity in these ecosystems. Chapter 3 provides the first attempt at assessing the effectiveness of protected areas in representing alpha, beta and gamma components of taxonomic and functional macroinvertebrate diversity at different spatial scales. The main findings highlight the contrasting performance of reserve systems in the maintenance of taxonomic and functional freshwater diversity, and point to a bias in environmental representation within protected area networks. Importantly, this mismatch means that caution should be exercised when using any one diversity component as a surrogate for others, and emphasizes the importance of adopting an integrative approach to biodiversity conservation in aquatic ecosystems. The last chapter focuses on Trichocorixa verticalis verticalis (Corixidae, Hemiptera), one of the few exclusively aquatic insects that can be considered as an alien species, and for which large populations have been newly recorded in numerous Ramsar wetlands in Andalusia (south-west Spain). The predictive maps obtained of current potential distribution suggest that this corixid may expand well beyond its current range and find inhabitable conditions in temperate areas across a wide range of latitudes. When considering a future climatic scenario, the suitability area showed only limited changes compared with the current potential distribution. The results allow the detection of potential contact zones among currently colonized areas and potential areas of invasion, as well as zones with a high level of suitability overlapping areas recognized as global biodiversity hotspots. These results, taken as a whole, point to some of the main challenges for the conservation of aquatic macroinvertebrate biodiversity (biodiversity surrogates, reserve performance and biodiversity threats) and provide useful information about important topics that concern protected area managers and conservationists.