La reparación de los defectos osteocondrales en la rodilla del conejo ha sido realizada mediante la utilización de:1. Un injerto libre de periostio invertido (con su capa interna dirigida a la cavidad articular)2. Un biomaterial (fosfato tricalcico-hidroxiapatita), con el objetivo de reemplazar al cartílago y hueso respectivamente.Se utilizaron 25 conejos, machos, adolescentes, de raza New Zealand y se realizó un defecto cilíndrico de 3.5 x 3 mm. En el surco intercondileo. Se permitió la movilización libre inmediata en la jaula y fueron sacrificados a las seis semanas. Se cuantificaron los resultados macroscópicos y microscópicos mediante una tabla de valoración confeccionada. Los resultados histomorfométricos determinaron la variación porcentual entre la situación inicial y final. Se obtuvo un tejido de naturaleza y características cartilaginosas en el 66.3% de las rodillas y el biomaterial se reabsorbió en el 73.09%.

Los ovarios de cabras prepúberes proporcionan una población de ovocitos de pequeño diámetro con una menor competencia para el desarrollo hasta blastocisto después de la maduración, fecundación y posterior cultivo in vitro (MIV, FIV y CIV). Las condiciones del cultivo in vitro aportan los requerimientos necesarios a los ovocitos e influyen sobre su posterior desarrollo embrionario. En esta tesis hemos llevado a cabo dos estudios para evaluar los efectos de la adición de diferentes suplementos a los medios de MIV y CIV sobre el desarrollo embrionario y la calidad de los blastocistos obtenidos a partir de ovocitos de cabras prepúberes. En ovocitos de hembras prepúberes, la adición de sustancias, incluyendo las hormonas gonadotrópicas, factores de crecimiento, fuentes de proteínas y antioxidantes, como son el complejo insulina-transferrina-selenio (ITS) y el L-ácido ascórbico (AA), han demostrado producir una mejora en la maduración citoplasmática de los ovocitos y su subsiguiente desarrollo embrionario in vitro. El objetivo del primer estudio fue evaluar los efectos de la adición de AA, ITS y un bajo nivel hormonal en el medio de MIV sobre el desarrollo embrionario y la calidad de los blastocistos obtenidos. En concreto, hemos utilizado 4 medios maduración: Medio Tradicional (MT), Medio de Crecimiento (MC): MT + ITS + AA + bajo nivel hormonal, Medio Tradicional modificado (MTm): MT + bajo nivel hormonal y Medio de Crecimiento modificado (MCm): MT + ITS + AA + nivel hormonal normal. Los complejos–ovocito-cúmulus (COCs) se clasificaron en dos grupos según el diámetro ovocitario: pequeños (<125μm) y grandes (≥125μm). Los ovocitos ≥125μm fueron madurados en MT mientras que los ovocitos <125μm fueron madurados en combinaciones de MT, MC, MTm y MCm. Después de la MIV, los ovocitos fueron fecundados in vitro y posteriormente los embriones fueron CIV durante 8 días. En este estudio se observó que el desarrollo embrionario de los ovocitos <125 μm no mejoró en las diferentes combinaciones de medios de MIV estudiadas (MT, MC, MTm y MCm). El mayor desarrollo hasta blastocisto se obtuvo en el grupo de embriones procedentes de ovocitos ≥125μm. Sin embargo, cuando los ovocitos de menor diámetro se maduraron en MC, se observó una mejoría significativa en la calidad de los blastocistos obtenidos, optimizando la supervivencia de los embriones tras la descongelación comparado con el MT (53.3% vs 30.8%, respectivamente; P<0.05). En el segundo estudio se analizó el efecto de la suplementación de los medios de MIV y CIV con activina-A sobre el desarrollo embrionario. La activina-A es un miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante β (TGF-β) y cumple un papel importante en la proliferación y diferenciación celular. Con el fin de determinar el efecto de la activina-A sobre los ovocitos de cabras prepúberes, se realizaron 2 experimentos, analizando la maduración nuclear de los ovocitos, su posterior desarrollo embrionario y calidad de los blastocistos obtenidos. En el primer experimento se estudió la suplementación del medio de MIV con varias concentraciones de activina-A (0, 10 y 100 ng/mL) y en el segundo experimento se evaluó la adición de 10 ng/mL de activina-A a los medios de MIV y CIV. Los resultados de este estudio demostraron que la suplementación del medio de MIV con diferentes concentraciones de activina-A proporciona similares porcentajes de maduración nuclear y de blastocistos comparado con la MIV sin activina-A. Además, la adición de 10 ng/mL de activina-A durante el CIV aumentó significativamente las tasas de desarrollo hasta blastocisto en comparación con el grupo control (19.5 ± 2.21% vs. 13.1 ± 2.37%, respectivamente; P<0.05). Sin embargo, no se observó una mejora en la calidad de los blastocistos cuando se añadió activina-A en el medio de MIV (evaluada por la tinción de Hoechst 33342) y/o en el de CIV (evaluado por la tinción diferencial). En conclusión, la maduracíon in vitro de los ovocitos de cabras prépuberes de diámetro <125 μm en medio de crecimiento sería una alternativa útil para mejorar la calidad de los blastocistos producidos in vitro, mientras que la presencia de activina-A durante el cultivo in vitro incrementa el porcentaje de embriones desarrollados hasta el estadío de blastocisto. / The prepubertal goat ovary shows a large number of small oocytes with a compromised competence to develop up to blastocyst stage following IVM, IVF and IVC. Culture conditions used to support in vitro embryo production appears to be an important factor to suit the requirements of these oocytes and to increase the blastocyst yield. In the present thesis work, we have carried out two studies to evaluate the effects of addition of different supplements to in vitro maturation and culture media on embryo development and the quality of resultant blastocyst in prepubertal goat oocytes. In oocytes from prepubertal females, different types and concentrations of substances including gonadotrophic hormones, growth factors, protein sources and antioxidants, such as insulin-transferrin-selenium (ITS) and L-ascorbic acid (AA), have been shown to improve oocyte cytoplasmic maturation and embryo development. The aim of the first study was to assess the effects of adding low level of hormones and/or ITS plus AA to IVM medium through the developmental competence and embryo quality of small oocytes from prepubertal goats. Specifically, we tested four maturation media: conventional IVM medium (CM), CM+ITS+AA and low level of hormones (named as Growth Medium; GM), CM with low level of hormones (modified CM; mCM) and CM+ITS+AA and normal level of hormones (modified GM; mGM). Cumulus-Oocyte Complexes (COCs) were classified into two categories according to oocyte diameter: small (<125 μm) and large (≥125 μm) oocytes. Large oocytes were matured in CM and small oocytes were matured in different combination of CM, GM, mCM or mGM. After IVM, oocytes were fertilized and after 24h presumptive zygotes were cultured for 8 days. Results of this study showed that using different combinations of CM, GM, mCM, and mGM for IVM of prepubertal goat small oocytes did not have a beneficial effect on the percentage of blastocysts. The high blastocyst rate was only related to oocyte diameter. However, the culture of small oocytes in GM improved the quality of blastocysts and enhanced their survival post-warming compared to CM (53.3% vs 30.8%, respectively; P<0.05). The second study examined the effect of activin-A during IVM and embryo culture on the blastocyst rate of prepubertal goat oocytes. Activin is a member of the transforming growth factor β superfamily that plays a functional role in the process of cellular proliferation and differentiation. In experiment 1, with a view to search for optimal concentration of recombinant human activin-A during IVM, three concentrations (0, 10 and 100 ng/mL) were tested on oocytes meiotic maturation and subsequent in vitro embryo development. The experiment 2 was performed to evaluate the effect of adding 10 ng/mL activin-A at the IVM and/or IVC media on embryo development and blastocyst quality. Results of this study demonstrated that the addition of activin-A to IVM yielded similar percentages of maturation and blastocyst. Moreover, the addition of 10 ng/mL of activin-A throughout the whole embryo culture significantly increased rates of development to the blastocyst stage as compared with the control group (19.5 ± 2.21% v. 13.1 ± 2.37%, respectively; P<0.05). Blastocyst quality was not improved in the presence of activin-A neither during IVM evaluated after Hoechst 33342 staining, nor during IVM and/ or IVC evaluated by differential staining. In conclusion, IVM of prepubertal goat small oocytes in GM would be useful to improve the intrinsic quality of blastocysts produced in vitro and the presence of activin-A during IVC enhances embryo development of prepubertal goat oocytes.

Se exponen los trabajos realizados sobre especies del género Culicoides, vectores del virus de la lengua azul. Durante el desarrollo de la tesis se presentan estudios de comparación de trampas, en los que se llevó a cabo la captura de los vectores e indicaron que las trampas Onderstepoort o mini-CDC, dependiendo de la época del año, fueron las más adecuadas para la captura de estos insectos. Se realizaron ensayos insecticidas con deltametrina para intentar controlar las poblaciones de vector y se observó que las distintas especies de Culicoides fueron muy sensibles al contacto con este insecticida. La evaluación en campo demostró su efectividad ya que incrementó el porcentaje de mortalidad de los insectos significativamente. También se analizó la capacidad de Culicoides imicola (vector principal en África y sur de Europa) de infectarse oralmente con distintos serotipos del virus y se comprobó que este vector se infectó con tres de los cuatro serotipos ensayados.

Pine wilt disease is the result of a complex interaction between a nematode, a host tree and an insect vector. The pine wood nematode (PWN) Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) Nickle is the causal agent, being pines the most important hosts. To be dispersed between hosts the nematode requires a vector insect, being the most effective the cerambycid beetles of the genus Monochamus Dejan. The first detection of PWN in Portugal occurred in 1999, and in 2001 it was associated with its local vector; the pine sawyer Monochamus galloprovincialis (Olivier). Since then M. galloprovincialis has been the main focus of a complex and detailed strategic plan to fight this disease. Management and control strategies against PWN are directed in three ways; controlling the nematode’s populations; creation of trees resistant to the disease and avoiding the spread of the nematode by the dispersal of vector insects, being presently the most effective one. This is done with the implementation of strict sanitary measures in affected forests, by locating, felling and removing/destroying symptomatic trees during autumn and winter, to prevent adult emergences carrying the PWN. During spring and summer, M. galloprovincialis adults are exhaustively controlled by the use of baited traps, diminishing beetles populations. Despite such efforts, the PWN still causes significant mortality in native maritime pine forests in Portugal, and between 2000 and 2007 the number of felled pine trees with wilting symptoms significantly increased, causing significant economic and environmental impacts. Simultaneously, the spread of wilt disease to Spain underlines the necessity to develop and promote innovative control strategies against this sanitary problem. With the intention of developing new biological control strategies, the works here presented were focused on: i) improving a laboratory reared population of M. galloprovincialis, ii) reveal M. galloprovincialis actual distribution and the associated parasitoid guild, iii) discover the most promising entomopathogenic fungi associated with this insect and an effective method for field application. The initial studies concerning the artificial rearing of a laboratory population of M. galloprovincialis allowed the attainment of adults on shorter periods and with less effort. Such objective was successfully accomplished by the development of an artificial rearing substrate which is cheaper to produce and does not require fresh pine material recently extracted from live trees. Concerning the unveil of the insect distribution across the country and its parasitoid guild, it was found that the cerambycidae is present on more than 90% of the surveyed regions, without showing signs of strong susceptibilities to the edaphoclimatic variations of each site. Also, the parasitoid guild associated with this insect showed to be relatively disperse and diverse across the studied regions. Most of the parasitoids found were larval parasitoids, being the most common among them Cyanopterus flavator (Fabricius). Regarding the assays with entomopathogenic fungi, it was revealed that Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill was an important mortality agent for M. galloprovincialis adults while Metarhizium sp. strongly affected the larvae of this insect. A successful application method was also developed using fiber bands to impregnate entomopathogenic fungi under laboratory conditions. It is now possible to state that it was comprehensively studied the parasitoid guild associated with the pine sawyer and the effects of the more common entomopathogenic fungi found in Portugal and associated with this beetle, being now unveiled the basis for a biological control program against M. galloprovincialis populations. / La enfermedad del decaimiento súbito del pino (Pine Wilt Disease, PWD) consiste en una interacción entre tres organismos; el nematodo Bursaphelencus xylophilus (Steiner y Buhrer) Nickle, un insecto vector del genero Monochamus Dejan, y un árbol huésped del género Pinus Linnaeus. Se cree que la enfermedad llegó a Portugal en 1999 a través de la entrada de madera contaminada proveniente de China. En Europa, Portugal es el único país con una gran área de árboles afectados por esta enfermedad, siendo el único huésped el pino marítimo (Pinus pinaster Aiton). La entrada del nematodo en un árbol sano suele llevar a su muerte en algunos meses o mismo semanas y en este país, su principal insecto vector pertenece a la especie Monochamus galloprovincialis (Olivier). Las técnicas actualmente existentes para combatir esta enfermedad son en gran parte basada en metodologías biotécnicas, químicas y culturales para disminuir las poblaciones del insecto, todavía estas medidas no fueron suficientes, pues en el bienio de 2011/2012 aproximadamente 900.000 árboles fueron identificadas como portadores de síntomas de PWD y cortados en el terreno. Su detección en España enfatiza la necesidad de descubrir nuevos métodos de control. Con este objetivo en mente se desarrollaron los trabajos presentados en esta tesis. Se prospectó el país para encontrar la actual distribución del insecto, el complejo de enemigos naturales nativos, y los hongos entomopatógenos que lo afectan. La prospección ha demostrado que este insecto se encuentra ampliamente distribuido por todo el territorio. Juntamente, se descubrió que existen 14 especies de parasitoides en la región Paleártica que pueden afectar esta escarabajo. Los resultados de los ensayos con hongos entomopatógenos demostraron que la especie Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill suele ser más eficaz en el control de adultos de mientras que Metarhizium sp. afecta más los estadios larvales. La técnica de aplicación de estos hongos utilizando bandas de polyester impregnadas con esporos demostró también resultados muy promisores. Se puede considerar que se estudiaron algunos elementos esenciales de un futuro programa de control biológico contra M. galloprovincialis.

El estudio del desgaste microscópico sobre las superficies del esmalte dental es una importante fuente de información para interpretar la dieta y hábitos alimentarios de diferentes grupos de humanos y Primates no-humanos, tanto extintos como actuales. Para ello se han normalizando metodologías de análisis semi-automáticos. Se ha asociado la abrasividad de las partículas presentes en los alimentos (intrínsecas o extrínsecas) a determinados patrones de microdesgaste sobre las superficies vestibulares de los dientes post-caninos analizados mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). La estandarización metodológica del análisis del microdesgaste vestibular requiere obtener información sobre los posibles obstáculos asociados a la técnica por la influencia en la robustez de los resultados y su posterior interpretación, tanto para especies actuales como especímenes extintos. En este trabajo se propone estudiar los efectos abrasivos y erosivos sobre los patrones de microdesgaste en superficies vestibulares por procesos post-mortem, simulando experimentalmente las acciones provocadas por agentes considerados tafonómicos (partículas de arenas y cenizas y ácidos). También se estudia la aplicación del análisis discriminante lineal (LDA) a partir de variables que explican el patrón de microdesgaste vestibular de especies de Primates no-humanos y homininos fósiles, analizando la capacidad predictiva de las funciones discriminantes e identificando las variables más explicativas e informativas, además, se busca establecer criterios adecuados para permitir una óptima ejecución de éstas pruebas estadísticas de forma práctica. Por último, se analiza la variabilidad interespecífica del microdesgaste vestibular en especies Primates no-humano actuales (Cercopithecidae y Hominoidea) y homininos africanos del Plio-Pleistoceno (A. afarensis, A. africanus y P. robustus) mediante el análisis en 3D de los patrones de la textura con una novedosa metodología de análisis realizada hasta ahora esencialmente sobre las superficies oclusales. Los resultados muestran que la densidad de microestrías disminuye a medida que el esmalte se expone a diferentes agentes tafonómicos, evidenciando que los cambios en el patrón de microdesgaste varían entre un agente y otro, en función del grado de acidez y de la dureza y tamaño de las partículas, revelando la influencia de la primera exposición. Los resultados demuestran que para una óptima aplicación de un LDA es necesario cumplir los supuestos a priori, destacado las recomendaciones relacionadas al tamaño y número de los grupos, al número de predictores y a la homocedasticidad. Se observó que un alto número de variables predictoras conlleva un mayor error en la clasificación, pese a que la discriminación aumenta, junto con demostrar que la colinealidad entre las variables también aumenta el error. Se recomienda la aplicación de estas pruebas sin las variables de la desviación estándar de las longitudes de las microestrías y, en lo posible, evitando la inclusión de las variables que resumen la densidad y la longitud de las microestrías. El análisis de textura del microdesgaste vestibular muestra que es posible reconocer la variabilidad interespecífica entre Primates no-humanos y relacionarla a factores ecológicos y dietarios asociados a la abrasividad de los alimentos, siendo la complejidad (Asfc) el parámetro más revelador. El análisis de textura indica que probablemente las propiedades físicas de la dieta entre los homininos africanos estudiados fueron similares, estos se distinguieron dentro de la variabilidad de Primates no-humanos actuales comparados. Los patrones de los australopitecinos gráciles se asemejaron de gorilas de tierras bajas (Gorilla g. gorilla), sugiriendo comportamientos alimentarios y ecológicos en base a alimentos resistentes y dúctiles, aunque con flexibilidad hacia una mayor dureza en fractura y abrasividad, aunque A. africanus mostraría una dieta más frugívoro-granívora que A. afarensis. Los patrones de P. robustus revelan similitud a los observados en P. anubis y P. t. verus, sugiriendo una dieta basada en alimentos resistentes y provenientes de hábitats más abiertos. / The study of microscopic wear on dental enamel surfaces is an important source of information to interpret the diet of different groups of hominins and non-human Primates, both extant and extinct. The methodological standardization of buccal microwear analysis requires detailed information about the possible obstacles that could influence the robustness of the results and its subsequent interpretation. In this regard, one of the aims of this research was to study experimentally the abrasive and erosive effects of post-mortem processes on microwear patterns on buccal surfaces, simulating the action of different taphonomic agents (particles of sand and ash, and acids). Additionally, the application of linear discriminant analysis (LDA) with the variables that explain the buccal microwear patterns was studied on a wide sample of several species of both non-human primates and fossil hominins using scanning electron microscopy (SEM). Finally, the interspecific variability of buccal microwear texture patterns on extant non-human Primates (Cercopithecidae and Hominoidea) and African Plio-Pleistocene hominins (A. afarensis, A. africanus and P. robustus) was studied using a innovative 3D method of analysis that so far has been used fundamentally on occlusal surfaces. The results showed that the striations density decreases as the enamel was exposed to different taphonomic agents, showing variations in the changes of the microwear patterns according to the agent, depending on the acidity and the hardness and size of the particles, and revealing the influence of the first exposure. Our results indicate that for an optimal application of LDA is necessary to meet some a priori assumptions, especially recommendations related to the size and number of groups, the number of predictors, and homoscedasticity. It was observed that a large number of predictors lead to higher misclassification, although discrimination increases along also. The association between the collinearity of predictor variables and misclassification was demonstrated. The application of this statistical method without the variables of standard deviation of the lengths of striations is recommended and, if possible, avoiding to include the variables that summarize the density and length of striations. Buccal microwear texture analysis showed that it is possible to recognize interspecies variability among non-human Primates, and relate them to environmental and dietary factors that are associated with abrasiveness food, showing that Complexity (Asfc) was the most determinant parameter. The texture analysis indicated that probably the physical properties of diet among African hominins studied were similar, albeit distinguishing within the variability of extant non-human Primates species. Texture patterns of gracile australopithecines were similar to lowland gorillas, suggesting food and ecological behaviours based on tough items, but with flexibility towards greater abrasiveness and fracture hardness, although A. africanus would have a more frugivorous–granivorous diet. P. robustus patterns were similar to those observed in P. anubis and P. t. verus, suggesting a tough food diet, probably from more open habitats.

In the behavioral sciences, the concept of phenotypic plasticity can be roughly categorized into two classes: developmental and activational plasticity. Developmental plasticity denotes the capacity of an individual carrying a specific genetic background to adopt different developmental trajectories under distinct settings. Complementarily, activational plasticity refers to the differential activation of adaptation mechanisms: an individual with high activational plasticity would be able to detect a wide range of environments, and to respond to it using a psychobiological phenotype from a relatively large catalogue. In this context, it is feasible postulating that several etiopathogenic mechanisms of depression-related phenotypes can be clarified by expanding on processes of biobehavioral plasticity in response to the experience. This expansion can be elaborated on the basis of both neurodevelopmental phenomena (developmental plasticity) and novel biological mechanisms detectable through neuroimaging and epigenetics approaches (activational plasticity). The present work expands on two specific hypotheses. First, depression-related psychopathological phenotypes are induced by factors altering the early neurodevelopment, and these long-lasting changes can be assessed in adulthood (depression and developmental plasticity). Secondly, the clinical manifestation of depression-related psychopathological phenotypes can be understood as activational plasticity deficits; these deficits can be assessed as neurobiological disease traits using novel epigenetic and neuroimaging techniques (depression and activational plasticity). The results of this work provide support to the neuroplasticity hypothesis of depression, from both developmental and activational perspectives. Developmentally, they suggest putative etiopathogenic pathways leading from an altered early neurodevelopment to an increased risk for depression-related phenotypes. By exploring and combining genetic, environmental and psychopathologic concepts, the feasibility of these results has been explained by combining the popular genetic pleiotropy hypothesis in psychiatry with a notion of disease-specificity liability driven by the environment. With regards to activational plasticity, this work has proposed novel genetic and epigenetic signatures potentially underlying the clinical manifestation of neuropsychiatric and neurocognitive features of depression (i.e., the genetics of DNMT3B and the epigenetics of DEPDC7); additionally, it has proposed new putative neurobiological mechanisms to explain depressive traits (i.e., a combination of differential and variable methylation, a genetically-mediated hippocampal communication deficit, and a new amygdalar synchrony failure driven by the genes).

Tesi realitzada a l'Instituto de Acuicultura de Torre de la Sal (IATS - CSIC) / En esta tesis doctoral se estudia el efecto de una dieta de restricción calórica de mantenimiento a largo plazo (14 meses), en machos de lubina prepúberes, sobre el inicio y desarrollo de la pubertad. Para ello se consideró el papel que los sistemas kisspeptina/GnRH juegan en el cerebro y la gónada de esta especie en términos reproductivos. Nuestros resultados evidencian que tanto las neuronas que expresan kiss1 y kiss2 como sus receptores se encuentran localizadas en zonas hipofisiotrópicas que regulan procesos relacionados con la reproducción. En particular, las células kiss1 y kiss2 se distribuyen en zonas diferentes y específicas del cerebro, lo que sugiere que estas neuronas ejercen funciones distintas en la lubina. Se postula que kiss1 puede además estar involucrado en el control de los factores ambientales, como el fotoperiodo, ya que tiene una expresión notable en la habénula al igual que kiss1r. Sin embargo, el kiss2r tiene una distribución más amplia desde zonas del telencéfalo hasta el hipotálamo ventral. Asimismo hemos encontrado que neuronas kiss1 presentes en el hipotálamo expresan los receptores de estrógenos de tipo alfa y beta 2. Además, con los estudios de localización de las neuronas gnrh1, hemos descartado la interacción de fibras Gnrh1 en células que expresan kiss2r en el área preóptica. La detección de las proyecciones de fibras de neuronas Kiss sólo fue posible con el anticuerpo anti Kiss2 puesto que lamentablemente el anticuerpo anti Kiss1 no dio resultados. La distribución de fibras Kiss2 se localizan en regiones hipofisiotrópica, desde la región del subpallium y continúan en el área preóptica, neurohipófisis y finalmente en la región del receso lateral del tuber. Los resultados biométricos mostraron que los animales experimentales crecieron menos en peso y talla en comparación a los controles a lo largo de todo el experimento. Cabe mencionar que a pesar de ello, los animales experimentales fueron capaces de desarrollar sus gónadas y madurar. Por el contrario, el contenido de grasa mesentérica fue significativamente menor en los animales experimentales, lo que se relaciona con la restricción de alimento al que este grupo de animales estuvo sometido durante la experiencia. Los análisis hormonales del factor de crecimiento insulínico tipo I (Igf-i) y de leptina confirmaron un descenso en el grupo experimental, lo que se relacionó con la menor tasa de crecimiento en peso y talla en comparación al grupo control. Asimismo, se cree que los niveles bajos de Igf-i podían ser responsables de una tasa reducida de la proliferación celular y un aumento de la apoptosis de células espermatogoniales a nivel gonadal en los animales experimentales. Por otro lado, los niveles plasmáticos de leptina mostraron una relación directa entre el contenido de grasa perivisceral y la concentración sérica de esta hormona, como se ha descrito en mamíferos. Los resultados obtenidos demuestran además que los animales sometidos a restricción nutricional mostraron una regulación al alza de los niveles de expresión de kiss1, kiss2, kiss1r y kiss2r en el cerebro de la lubina, en comparación a los niveles detectados en los controles. Por otra parte, los niveles plasmáticos de Fsh fueron significativamente mayores en los animales experimentales, lo que podría sugerir un mecanismo de retroalimentación positiva en estos animales para llevar a cabo el proceso de espermatogénesis. Más aún, evaluando los niveles de fshr mRNA mediante qRT-PCR comprobamos que su expresión aumentaba considerablemente a nivel gonadal. Por el contrario, los niveles plasmáticos de Lh fueron mayores en los animales controles. En cuanto a los niveles plasmáticos de 11-KT y T, éstos fueron similares entre ambos grupos lo que explicaría el desarrollo gonadal de los animales experimentales y su capacidad de alcanzar la maduración sexual. / In the European sea bass, kiss1-expressing cells were consistently detected in the habenula and, in mature males and females, in the rostral mediobasal hypothalamus. In both sexes, kiss2-expressing cells were consistently detected at the level of the preoptic area, but the main kiss2 mRNA-positive population was observed in the dorsal hypothalamus, mainly above, but also below, the lateral recess of the third ventricle. Specific antibodies has been raised against the preprokiss2, but not the preoprokiss1. The data indicate that kiss2 neurons are mainly located in the hypophysiotropic regions. The expression of kiss1r messengers was more limited to the habenula, the ventral telencephalon and the proximal pars distalis of the pituitary. In the sea bass long-term exposure to maintenance diets alters the rhythm of reproductive and metabolic hormones, delays spermatogenesis and increases the incidence of apoptosis at earlier stages of gametogenesis. Thus, maintenance feed regimes in the experimental group over 14 months (EX) not only strongly decreased growth rates, the mesenteric fat index (MFI), muscle lipid content, and the hepatosomatic index (HIS), but also the gonadosomatic index (GSI), thus delaying testis progression and milt production in comparison to the control (CT). Igf-i plasma levels were high at periods during which spermatogonial proliferation was enhanced, suggesting that Igf-i plays a crucial role during mitotic proliferation. Leptin levels and MFI were reduced in the EX group and its suggested tha leptin might acts as a permissive signal that allows puberty to take place during the reproductive period in male sea bass. Finally, gene expression analysis in the brain of male sea bass exposed to restricted feed diets provided evidence of an overexpression of the kiss1, kiss2, kiss1r and kiss2r genes in the main hypophysiotropic regions of the brain throughout gametogenesis. Similarly, plasma Fsh levels of treated fish, showed an up regulation but specifically during the spermiation period. These results show that kisspeptin system and plasma Fsh levels are strongly modulated by the maintenance diets. Sea bass males were able to get into puberty and achieve spermiation under nutritional restriction, suggesting an adaptive strategy may exist for preserving reproductive function in this species.

Exposure to contaminants, such as Persistent Organic Pollutants (POPs), is currently considered a serious anthropogenic threat to marine predators and their food webs. Exposure to contaminants by marine wildlife is mainly related to their trophic ecology, distribution and movements. However, the contribution of these biological features to pollutant levels remains poorly understood in most marine predators, including seabirds. New methodologies, including dietary and geographic tracers, such as stable isotope analyses, and a wide array of devices to track movement at different spatial and temporal scales, can provide new light into this issue. Although stable isotope signatures in marine wildlife provide valuable information about their trophic ecology, isotopic baseline levels also show geographical differences. Therefore, to understand isotopic differences among separate wildlife populations we first need to evaluate the influence of spatial variability in stable isotope signatures. In the present dissertation, some ecological factors, mainly feeding ecology, breeding locality and movements, and their influence shaping the isotopic signatures and the contaminant burdens, were examined in most Procellariiformes breeding in the Northeast Atlantic Ocean and the Mediterranean Sea. In particular, the isotopic signatures of Carbon and Nitrogen (δ13C and δ15N) as well as burdens of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and organochlorinated compounds (OCs), e.g., polychlorinated biphenyls (PCBs) and pesticides such as DDT, in seabirds were determined. In this study, firstly, we evaluate the relative influence of geographic origin, movements and trophic ecology in shaping stable isotope signatures and contaminant burdens in pelagic seabirds. Then, we show the spatial patterns in the isotopic signatures, OCs and PAHs that emerge among Mediterranean and northeast Atlantic seabirds and evaluate pollutant sources and the influence of long-range transport mechanisms on these basins. Secondly, we provide evidences that show no marked differences in the trophic ecology of the studied seabird species throughout their breeding distributions, but clearly differ among species, pointing out the marked relationship of seabird trophic ecology with their PCB, DDT and PAH burdens. Overall, this study underlines the usefulness of combining environmental chemistry methodologies with new approaches in the study of animal ecology, showing the value of pelagic seabirds in marine contamination monitoring / La exposición a sustancias químicas altamente tóxicas como los contaminantes orgánicos persistentes (COP), representa una seria amenaza para los depredadores marinos y sus redes tróficas. Dicha exposición depende en gran medida de la ecología, distribución y áreas de alimentación de la fauna marina. Sin embargo, la contribución relativa de estas características biológicas para explicar los niveles de contaminación que se encuentran en los organismos es aún desconocida para la mayoría de los depredadores, incluyendo las aves marinas. Metodologías novedosas como el análisis de isótopos estables y los sistemas de geolocalización proporcionan información esencial para poder entender la influencia de los distintos factores que determinan la exposición a los contaminantes marinos. En la presente tesis se evalúa la influencia de factores ecológicos clave, principalmente posición trófica, áreas de forrajeo, distribución y movimientos, sobre las relaciones isotópicas de carbono y nitrógeno (δ13C y δ15N) y los niveles de contaminación encontrados en la mayor parte de las especies de Procellariiformes que crían en el Atlántico Nordeste y en el mar Mediterráneo. En particular, se determinaron los niveles de hidrocarburos policíclicos aromáticos (HAP), bifenilos policlorados (PCB) y pesticidas organoclorados como el DDT. En este trabajo, en primer lugar, se evalúa la influencia relativa de la distribución y la ecología trófica de las aves marinas sobre las firmas de isótopos estables y las cargas de contaminantes encontradas. A continuación se exponen los patrones geográficos encontrados para δ13C y δ15N y los contaminantes estudiados en el NE Atlántico y el Mediterráneo. En segundo lugar, se expone la marcada relación encontrada entre la ecología trófica, incluyendo posición trófica y áreas de forrajeo, de las aves estudiadas y los niveles de contaminación que presentan. En conjunto, esta tesis pone de manifiesto la utilidad de combinar los avances y metodologías propios de la química ambiental con las nuevas metodologías utilizadas para el estudio de la ecología de la fauna salvaje, así como el gran valor de las aves marinas pelágicas como centinelas del estado de contaminación que sufren nuestros océanos.

La metamorfosi és un procés de canvi morfològic radical que succeeix en un període específic durant el desenvolupament postembrionari de diverses espècies animals, tals com amfibis o insectes. En el cas dels insectes, hi ha dos tipus principals de metamorfosi: de tipus hemimetàbol, on els individus fan una metamorfosi progressiva i les nimfes s’assemblen als adults, com succeeix en les xinxes, paneroles i saltamartins. En la metamorfosi holometàbola, en canvi, es dóna una transformació morfològica radical, de larva a pupa i de pupa a adult, com s’observa en papallones, escarabats i mosques. La metamorfosi holometàbola s’originà a partir d’ancestres hemimetàbols, i aquesta innovació va tenir molt d’èxit si considerem que més del 80% dels insectes actuals són espècies holometàboles. En tots dos tipus de metamorfosi la regulació és propiciada per l’acció de dues hormones, l’esteroide 20-hidroxiecdisona (20E), o hormona de la mud,a i el sesquiterpenoide hormona juvenil (HJ). Mentre que la 20E indueix les mudes, l’HJ reprimeix la metamorfosi. L’objectiu general d’aquesta tesi doctoral és ajudar a comprendre els mecanismes moleculars pels quals l’HJ reprimeix la metamorfosi, utilitzant com a model la panerola Blattella germanica, un insecte amb metamorfosi hemimetàbola poc modificada, i emmarcar aquests resultats en un context evolutiu. Així, hem estudiat el paper del receptor de l’HJ, el factor de transcripció Methoprene-tolerant (Met). Els estudis suprimint l’expressió d’aquest gen mitjançant RNA d’interferència (RNAi) en fases nimfals mostren que Met és necessari en la transducció del senyal hormonal, ja que la seva supressió provoca una metamorfosi precoç. El factor de transcripció Taiman (Tai) es postula com a millor candidat a actuar com a heterodímer de Met en la recepció de l’HJ, encara que cap experiment in vivo ha pogut demostrar aquesta funció degut a que la seva supressió en diversos models d’insectes resultà letal. A B. germanica Taiman s’expressa en quatre isoformes resultants de la combinació de dues insercions/delecions (indels) a la regió carboxi-terminal de la seqüència. La reducció de l'expressió de les isoformes que contenen la inserció-1 de Tai provoca una metamorfosi precoç. La presència d’aquesta inserció en isoformes de Tai d’altres espècies suggereix que el mecanisme de transducció de l’activitat antimetamòrfica de l’HJ mitjançant aquestes isoformes és un fenomen conservat en altres insectes. Un altre factor de transcripció que participa en la senyalització de l'HJ és Broad-Complex (BR-C). A les espècies holometàboles BR-C s’expressa al darrer estadi larvari i la seva expressió transitòria és essencial per una formació de la pupa. Els estudis a B. germanica revelen funcions ancestrals de BR-C relacionades amb divisió cel·lular i creixement de l’ala, alhora que aporten noves pistes que ajuden a entendre l’evolució de la metamorfosi dels insectes. Un altre element important que participa en la transducció del senyal de l’HJ en relació amb la metamorfosi és el factor de transcripció Krüppel-homolog 1 (Kr-h1). Hem mostrat que la reducció de nivells d'expressió de Kr-h1 a fases nimfals a B. germanica indueix una metamorfosi precoç. Aquests resultats, conjuntament amb els resultats previs obtinguts en espècies holometàboles, suggereixen que el paper repressor de Kr-h1 en la metamorfosi és una condició ancestral que s’ha conservat en espècies hemimetàboles i holometàboles. Els microRNAs (miRNAs) són una classe d’RNAs petits no codificants que regulen l’expressió de gens a nivell transcripcional mitjançant la regulació de l’mRNA. Per tal de desvetllar la funció dels miRNAs durant el desenvolupament de B. germanica, es van dur a terme experiments suprimint l’expressió de Dicer-1, enzim que participa en la biosíntesi dels miRNAs, i el resultat va ser una inhibició de la metamorfosi. Els resultats presentats en aquesta tesi suggereixen aquest fenotip és la conseqüència principal d’una davallada de l’expressió d’una sola família de miRNAs, miR-2. El conjunt d’experiments realitzats indiquen que miR-2 regula la davallada de l’expressió del transcrit de Kr- h1 a la darrera fase nimfal de B. germanica, la qual cosa propicia que la metamorfosi es desenvolupi correctament. / Metamorphosis is a process were a sudden and conspicuous morphological change occurs at a specific time point during the postembryonic development of several animal groups, like amphibians and insects. Insect metamorphosis proceeds in two modes: hemimetaboly, defined by a gradual change along the life cycle, as occurs in bugs, cockroaches and locusts, and holometaboly, characterized by an abrupt change from larvae to adult mediated by a pupal stage, has observed in butterflies, beetles and flies. Metamorphosis evolved from hemimetaboly to holometaboly and the latter innovation was most successful because more than 80% of present insects are holometabolan species. From an endocrine point of view, both hemimetabolan and holometabolan metamorphosis is regulated by two kinds of hormones: 20-hydroxyecdysone (20E), which induce molts, and juvenile hormone (JH), which inhibits metamorphic changes. Using the cockroach Blattella germanica as a basal hemimetabolous model, the general objective of this thesis is to study the molecular action of JH in repressing insect metamorphosis. One of the main players in hormonal signalling is Methoprene-tolerant (Met), which plays the role of JH receptor. Depletion of Met in young nymphal instars triggers precocious metamorphosis, suggesting that Met transduces the antimetamorphic signal of JH. Recent studies report that Met heterodimerizes with Taiman (Tai) forming the receptor complex of JH in metamorphosis repression. However, there is no data in vivo demonstrating a role of Tai in metamorphosis, because its depletion in a number of insect models resulted in 100% mortality. B. germanica possesses four Tai isoforms resulting from the combination of two indels in the C-terminal region of the sequence. RNAi depletion of insertion-1 isoforms results in a precocious adult development, demonstrating its involvement in metamorphosis. The insertion-1 of Tai is conserved in other insect species, which suggests that the mechanism of signal transduction of the antimetamorphic action of JH I conserved in other species. An important JH-dependent factor is BR-C, whose expression in holometabolan species is inhibited by JH in young larvae and enhanced in mature larvae to specify to pupal stage. The functional study of BR-C in cockroach reveal ancestral functions related to cell division and wing pad growth. Krüppel-homolog 1 (Kr-h1) is a transcription factor whose function as transductor of the antimetamorphic action of JH has been demonstrated in holometabolan species. RNAi experiments depleting Kr-h1 in young nymphal instars of B. germanica results in precocious metamorphosis, suggesting that their role as a JH transductor in metamorphosis is evolutionary conserved in hemimetabolan and holometabolan species. Finally, it has been reported that depletion of dicer-1, the enzyme that catalyzes the final step of miRNA biosynthesis, prevents metamorphosis in B. germanica. This thesis has addressed the question of how miRNAs act in metamorphosis and why their absence impairs it. The whole data of experiments reported here indicate that miR-2 scavenges Kr-h1 transcripts in the last nymphal instar of B. germanica, which contributes to the correct development of metamorphosis.

Distinguishing population units of small cetaceans continuously distributed in a widespread area is challenging, but critical for their conservation and management. The common dolphin (genus Delphinus) has a wide distribution range that has led to the differentiation of a number of morphotypes which, until today, remain of unclear taxonomic adscription. In many areas, two morphotypes were initially distinguished and later separated into two species: the long-beaked common dolphin, or Delphinus capensis, and the short-beaked common dolphin, or Delphinus delphis. The general aim of the present thesis is to investigate the taxonomy, morphology, distribution, and habitat use of the common dolphins (genus Delphinus) occurring in the eastern sub-tropical Atlantic Ocean (NW Africa). This area is amongst those most productive in the world. It is characterized by a quasi-permanent upwelling zone that promotes high biological productivity and a highly diverse and abundant fauna of marine mammals. It has been proposed that the short- and long-beaked forms of common dolphins occur sympatrically in this area, a scenario that provides a unique opportunity to discriminate between the two morphotypes and investigate whether differences are of taxonomic relevance. For the present thesis we investigated the local marine trophic network and the relationship between apex predators, as well as the distribution (offshore vs. inshore) and niche segregation (trophic level exploited) of the two common dolphin morphotypes. Additionally, differences in morphology and habitat use between NW Africa common dolphins and those from other areas, particularly from the northeastern and southeastern Atlantic Ocean, were investigated. Because research of intra and inter specific population variability requires a multiplicity of approaches, different methods were used, including stable isotope analyses of carbon (δ13C) and nitrogen (δ15N) in bone, and measurement-based and 'landmark'-based (geometric) morphometric analyses of the skull. The results obtained revealed that most of the marine mammal species distribute in the outer continental shelf and the upper slope, and that common dolphins are rarely distributed inshore, displaying a typical oceanic behaviour. With the exception of baleen whales, common dolphins showed the lowest trophic level of all marine mammals analyzed, despite the fact that there was large variability between individuals in the exploitation of food resources, possibly to adapt to local environmental variations. The presence of both short- and long-beaked morphotypes of common dolphins was confirmed off the coast of NW Africa, with the short-beaked form inhabiting waters closer to coast and feeding at a lower trophic level than the long-beaked form. Morphological analysis of the skull revealed that variation in relative beak length in common dolphins from NW Africa was larger than in other Delphinus populations worldwide; as opposed to other regions, relative rostrum size followed a clinal variation and intermediate ratios were found. There were significant differences between common dolphin populations and species analyzed in the size and shape components of the skull. The skull of the short-beaked morphotype from NW Africa was shorter but broader than that of the long-beaked. However, despite the differences, there is a closer morphological similarity between the short-beaked morphotype of NW Africa and Delphinus delphis, and between the long-beaked morphotype of the same region and Delphinus capensis. We conclude that taxonomic splitting of common dolphins in this area into two putative species should be postponed until further research is conducted because skull differentiation could be related to niche segregation and not to speciation. Furthermore, the above results indicate that the taxonomic model described for the Northeast Pacific should not be generally applied to other areas where the sort- and long-beaked morphotypes co-habit. / Distinguir unidades poblacionales de pequeños cetáceos distribuidos de forma continua en un área extensa es fundamental para su conservación y gestión. En el amplio rango de distribución de los delfines comunes se han establecido varios morfotipos de adscripción taxonómica incierta, identificados por la longitud relativa de su morro. En muchas áreas, dos morfotipos fueron distinguidos y más tarde separados en dos especies: el delfín común de morro largo, Delphinus capensis, y el delfín común de morro corto, Delphinus delphis. El objetivo general de la presente tesis es investigar la taxonomía, morfología, distribución, y uso del hábitat del delfín común (género Delphinus) en el este del Océano Atlántico Subtropical (NW África). Se ha propuesto que las formas de delfín común de morro corto y largo ocurren en simpatría en esta área, lo que permite una oportunidad única para discriminar entre los dos morfotipos e investigar si las diferencias son de importancia taxonómica. Los resultados han demostrado una gran variabilidad entre los individuos en la explotación de los recursos alimentarios, posiblemente para adaptarse a las variaciones ambientales locales del ecosistema. La presencia de ambos morfotipos de delfines comunes se confirmó en la costa NW de África; la forma de morro corto habita aguas más cercanas a la costa y se alimenta en un nivel trófico inferior a la de morro largo. El análisis morfológico del cráneo reveló que la variación en la longitud del morro es más grande que en otras poblaciones, con el morfotipo de morro corto presentando un cráneo más corto pero más amplio que él de morro largo. Como era previsible, existe una similitud morfológica más cercana entre el morfotipo de morro corto del NW de África y Delphinus delphis, y entre el de morro largo y Delphinus capensis. La división taxonómica de delfines comunes en dos especies, en esta área, debe posponerse hasta que se realicen más investigaciones, ya que la diferenciación craneal puede estar relacionada con la segregación de nicho y no con la especiación. Además, el modelo taxonómico descrito para el Pacífico Nordeste no debe aplicarse indiscriminadamente a otras áreas donde ambos morfotipos cohabitan.