Background: Giardiasis is an intestinal diarrhoeal illness caused by the flagellate protozoan parasite Giardia intestinalis (synonymous with Giardia lamblia and Giardia duodenalis). Traditionally, giardiasis has been diagnosed in patients using faecal concentration and microscopy techniques. Non-microscopy based tests available for the laboratory diagnoses of giardiasis include recent innovations in polymerase chain reaction (PCR) and immunoassays with increased sensitivity. The laboratory diagnosis of giardiasis is complicated by the intermittent excretion of the parasite and asymptomatic presentation that sometimes occurs with this infection. Clinicians may on occasion treat patients for giardiasis on clinical suspicion alone when diagnostic tests have failed to identify Giardia intestinalis and some of the patients do get better putting into question the performance of the diagnostic test used. At the Hospital for Tropical Diseases (HTD) in London the ova, cysts and parasite microscopy (OCP-M) is the front line test for diagnosing giardiasis. Aim: The aim of this study was to critically analyse the performance of a commercial and a published real-time PCR diagnostic tests for their potential use as front line tests for the diagnosis of giardiasis in the clinical parasitology diagnostic laboratory at the HTD. Storage conditions that will allow the best yield of Giardia intestinalis DNA from stored faecal samples were also investigated in this study. Methods: In the absence of a gold standard, a composite reference standard (CRS) of enzyme immunoassay (EIA) and rapid membrane test (RMT) was used to evaluate the performance of Primerdesign Ltd. real-time PCR kit for Giardia intestinalis (which detects only assemblages A and B subtypes) and a real-time PCR assay using Verweij et al published primers (Verweij realtime PCR) which targeted the (SSU) rRNA gene. The two tests were compared with the OCP-M test in a diagnostic accuracy study using a nonprobability sampling technique with consecutive samples. Results: The Verweij real-time PCR which targeted the (SSU) rRNA gene showed a diagnostic sensitivity of 93.4 % (95 % CI: 86.2 to 97.5%) and a specificity of 74.7% (95% CI: 63.6 to 83.8%) with a limit of detection (LOD) of < 5 cysts/ml. The Primerdesign Ltd. real-time PCR which also targeted the gdh gene showed a diagnostic sensitivity of 61.5% (95% CI: 50.8 to 71.6%) and specificity of 98.7% (95% CI: 93.2 to 99.8%) with a limit of detection (LOD) of ≤ 114 cysts/ml. Also, with a serially diluted 1 in 10 dilutions of a known concentration Giardia intestinalis DNA solution, the Verweij real-time PCR produced efficiency (E) of 96% (the slope was - 3.414) with a correlation coefficient (R2) of 0.99 and a copy number variance predominantly less than 10% (< 10%). The Primerdesign Ltd. had E = 100% (the slope was -3.342), R2 = 0.95, and a copy number variance predominantly greater than 10% (> 10%). In this study, the OCP-M missed 16.5% Giardia positive stool samples contrasted with 6.6% missed by the Verweij real-time PCR. The Verweij real-time PCR therefore showed approximately 10% increase (i.e. 16.5% - 6.6%) in detection rate over the OCP-M and with an estimated detection limit of < 5 cysts/ml of stool, it also correctly identified 70% (14/20) of the discrepant cases as true positives. OCP-M identified 10% (2/20). When sensitivities were adjusted for the Verweij real-time PCR as a result of enhancement in the detection rate of the CRS, 19.3% (94.3% - 75% = 19.3%) more positive cases were noted. The Verweij real-time PCR proved to be more robust than the OCP-M and the Primerdesign Ltd. PCR and has therefore been shown to be more suited for deployment as a first line diagnostic test than the other two index tests. Even in combination with the OCP-M, the sensitivity remained unchanged at 93.4%. With its high specificity, the Primerdesign Ltd. Giardia PCR kit may be useful for partitioning clinical history for epidemiological studies but with LOD of ≤ 114 cysts/ml of stool and R2 < 0.99 when faecal samples are involved, it will require further optimisation for use on clinical samples. Up to the end of April 2013, a literature search showed no independent evaluation of this Giardia real-time PCR kit. Storage affects molecular analyses and from the findings of this study stool samples are best stored in industrial methylated spirit and kept at 4-6°C if they are to be used for real-time PCR for Giardia intestinalis detection. Alternatively they can be stored in the freezer at -20°C without industrial methylated spirit. Samples should however be tested within three months of storage. Conclusion: The reason why some patients get better when they are treated empirically following microscopy negative results for Giardia intestinalis may be found in the fact that, in this study, the OCP-M failed to detect 16.5% of positive cases. The Verweij real-time PCR performed better than the OCP-M and showed an improvement of 10% in Giardia intestinalis detection rate. The Primerdesign Ltd. Giardia PCR kit requires further optimisation for use on clinical samples. The Verweij real-time PCR was more robust than the OCP-M and the Primerdesign Ltd. PCR and therefore is more suited for use as a first line diagnostic test with best results obtained when stool samples are first treated with industrial methylated spirit, stored in the fridge at 4-6°C and tested within three months of storage. The Verweij real-time PCR assay may be used as a standalone test for in combination with the OCP-M, there was no improvement in the 93.4% sensitivity when it was used alone. The OCP-M, however, has the advantage of identifying the presence of other parasites.

Le paludisme est une maladie tropicale due au parasite P. falciparum. Avec le grand nombre de victimes qui lui sont imputées chaque année, cette maladie demeure la plus grande parasitose tropicale et il est primordial de la combattre. Ce combat passe aussi bien par la sensibilisation des populations que par la recherche. Plusieurs échecs thérapeutiques, dus à la résistance du parasite aux médicaments déjà disponibles, sont recensés. L’émergence de cette résistance pousse la recherche à identifier de nouvelles molécules antipaludiques. Ces travaux de thèse s'inscrivent dans le cadre d'une meilleure connaissance de la biologie du parasite dans le but d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et de déterminer de nouvelles stratégies antipaludiques. Les protéines kinases, dont la protéine kinase A (PKA), sont connues pour avoir des rôles clé dans la régulation du cycle cellulaire. La régulation spatiale et temporelle de la PKA est assurée par des protéines d'ancrage appelées AKAP (A Kinase Anchoring Protéines). Nous avons identifié par homologie de séquences la première protéine AKAP putative chez P. falciparum (PfAKAP). Associant des études de biologie moléculaire (RT-PCR, interruption génique), de biologie cellulaire (immunofluorescence), de biochimie (« pull-down », « peptide array »), et de protéomique (spectrométrie de masse), nous avons caractérisé la PfAKAP. Cette protéine, majoritairement exprimée aux stades matures du développement érythrocytaire, semble importante pour le développement du parasite mais n'interagit pas directement avec la PKA du parasite. Elle fait intervenir des partenaires protéiques tels que la protéine Pf14-3-3I. En effet, la Pf14-3-3I pourrait être un substrat de la PfPKA et cependant jouer un rôle dans sa localisation. Par ailleurs, comme son proche homologue humain l’AKAP18, la PfAKAP interagit avec les nucléotides comme l’AMP et l’AMPc. Cela suggère entre autres que cette protéine peut interagir avec la voie de l'AMPK ou avec celle des phosphodiestérases chez le parasite. Nos premiers résultats sont encourageants et révèlent l’importance de la PfAKAP pour le développement parasitaire. Des recherches complémentaires permettront à l'avenir de développer et concevoir des nouvelles stratégies thérapeutiques comme celle des peptides interférents. / Pas de résumé

L’objectif de ce travail était d’étudier les conséquences immunologiques du paludisme gestationnel chez la femme enceinte et le nouveau-né. Ce travail de recherche fait partie du projet STOPPAM, un suivi de cohorte de femmes enceinte et de leurs enfants, réalisés dans deux pays d’Afrique : le Bénin et la Tanzanie. Les objectifs de STOPPAM étaient d’élucider les mécanismes et le déroulement de la pathologie du paludisme associé à la grossesse (PAG) et de quantifier les conséquences du PAG sur la santé de la mère et du jeune enfant. Nous avons, dans un premier temps, caractérisé les cellules immunocompétentes chez des femmes infectées et non-infectées au cours de la grossesse. Deux études ont été ainsi réalisées sur deux sous-groupes de femmes prélevées au début de la grossesse et à l’accouchement. Sur une vingtaine de données appariées entre le début de la grossesse et l’accouchement, nous avons mis en évidence une diminution de fréquence des lymphocytes T indépendamment de l’infection palustre. Au cours du PAG, nous avons déterminé sur deux sous-populations de femmes enceintes, au début de la grossesse et à l’accouchement : i) les fréquences et le niveau d’activation des cellules médiatrices de l’immunité et ii) les concentrations de cytokines et de chimiokines plasmatiques. Nos résultats ont permis de montrer, d’une part que le paludisme gestationnel induit des changements qualitatifs et quantitatifs sur le profil cellulaire et cytokinique, en fonction de l’âge gestationnel et en fonction de la date de l’infection. L’originalité de ces études réside dans l’identification au début de la grossesse, de marqueurs cellulaires et cytokiniques, tels que les lymphocytes B et les Treg d’une part, l’IL-10, l’IP-10 et le MIG d’autre part, qui pourraient être un facteur de risque d’infection placentaire à l’accouchement. Ces observations suggèrent la nécessité de la prise en charge des infections au début de la grossesse dans le contrôle du paludisme gestationnel. La deuxième partie de notre travail s’est intéressée aux conséquences du PAG sur les réponses innées du jeune enfant. Dans une première étude, nous avons caractérisé les cellules présentatrices d’antigènes dans le sang du cordon en fonction du paludisme placentaire ou de l’inflammation du placenta. Nos résultats montrent une altération partielle des cellules présentatrices d’antigènes du nouveau-né, induite par la présence de pigment malarique dans le placenta. Nos résultats soulignent l’importance de l’âge de la mère au moment de la grossesse et de la parité, sur les cellules présentatrices d’antigène du nouveau-né. Ces résultats suggèrent une modulation des réponses cellulaires néonatales par le PAG. La dernière partie de ce travail a considéré les réponses cytokiniques dans le sang de cordon et le sang périphérique du jeune enfant, à des ligands de TLR sur une cohorte de 134 enfants. Les observations issues de cette étude démontrent que l’activation du système immunitaire inné du jeune enfant peut être modifiée par une l’infection survenue à l’accouchement chez la mère. Nos résultats montrent que la susceptibilité au paludisme au cours de la première année de vie dépend de la période de stimulation des récepteurs TLR du système immunitaire néonatal. L’ensemble des travaux réalisés au cours de cette thèse permet de comprendre des mécanismes cellulaires et inflammatoires impliqués dans le paludisme gestationnel chez la femme enceinte et chez l’enfant. Nos résultats ont permis d’identifier des bio-marqueurs liés au PAG. / The objective of this thesis was to investigate the immunological consequences of pregnancy associated malaria (PAM) in pregnant women and their newborns. The study populations comprise sub-groups drawn from a longitudinal study known as “Strategies TO Prevent Pregnancy Associated Malaria” (STOPPAM) that was conducted in parallel in the two study sites i.e. Benin and Tanzania. The STOPPAM objectives were to elucidate the mechanisms and course of PAM and quantify the effects of PAM on mothers and their childhood’s health. First, we characterized cell mediated-immunity from P. falciparum-infected or non-infected pregnant women. Two studies were carried out in two sub-groups of pregnant women at early pregnancy and at delivery. In the first study, we observed a decrease frequency of T cells independently of malaria infection in the twenty-four pregnant women matched at early pregnancy and at delivery. In the second study, we characterized: i) the frequency and the level of activation of cell mediated-immunity and ii) quantify the plasma level of cytokine and chemokine in sub-groups at early pregnancy and at delivery. We observed that malaria infected pregnant women enhanced qualitative and quantitative changes in cells frequencies early during pregnancy and at delivery. The main finding of this study was the B cells activation at any time of infection and the decreased frequency of Treg at early pregnancy. PAM enhanced also higher levels of IL-10, IP-10 and MIG in our sub-groups. These bio-markers were identified as risk factors of placental infection at delivery. These observations suggest the management of malaria control in pregnant women in early pregnancy. The second part of this thesis was focused on the impact of PAM on neonatal innate immune responses. In a first study, we characterized antigen-presenting cells (APC) in cord blood as a function of placental malaria infection or inflammation of the placenta. Our results showed that the presence of malaria pigment in the placenta was associated to partial activation of cord blooddendritic cells. Our results highlight the importance of the age of the mother at the time of pregnancy and parity on APC activation in cord blood. These results suggest that PAM can induce neonatal innate responses alteration. Then we considered the cytokine responses in cord blood and in peripheral blood of newborn, to TLR ligands in a cohort of 134 children. The observations from this study demonstrate that infection occurred close to/at delivery in the mother can induce modulation of young-children innate immune system, through the TLR. Our results suggest that susceptibility to malaria infection during the first year of life could depend on the period of stimulation of TLRs neonatal immune system. All the work done in this thesis provides an understanding of the cellular mechanisms involved in inflammatory and gestational malaria in pregnant women and in children. Our results have identified biomarkers associated with PAG.

Ce travail a eu pour objectif de caractériser les parasites P. falciparum, infectant les femmes enceintes et responsables du paludisme associé à la grossesse. Dans la première partie de ce travail, le phénotype d’adhérence et le profil d'expression des gènes var chez les parasites infectant les femmes enceintes ont été étudiés. Ces analyses ont été réalisées sur des isolats parasitaires collectés dans deux études menées au Bénin entre 2008 et 2013. La première étude, sur des isolats prélevés dans le cadre d'une étude de cohorte de femmes enceintes dans les zones rurales au Bénin, a montré que les parasites qui infectent les femmes dans le premier trimestre de la grossesse expriment déjà un phénotype placentaire. Dans une deuxième étude, portant sur les isolats prélevés en prospective chez des femmes enceintes se présentant en consultations prénatales dans les centres de santé à Cotonou, une analyse plus détaillée des propriétés d'adhérence des hématies parasitées par P. falciparum, a confirmé nos premiers résultats. Cette étude a souligné une plus grande complexité dans les propriétés d’adhérence des isolats obtenus pendant le premier trimestre de grossesse qui adhèrent sur plusieurs récepteurs. Tout au long de la grossesse cette diversité phénotypique s’affine vers des phénotypes typiquement placentaires. Ce travail a également démontré, qu'au-delà de la parasitémie, l'adhérence à la CSA est un facteur important au regard de l’issue défavorable de la grossesse ; les parasites qui infectent les primigestes adhèrent en moyenne plus à la CSA que ceux provenant des multigestes. Conformément aux travaux antérieurs, les études menées au Bénin ont montré que le gène var2csa est le membre de la famille des gènes var qui est préférentiellement transcrit par les parasites infectant la femme enceinte. L’expression de la protéine correspondante à la surface des érythrocytes infectés a été démontrée grâce à des anticorps spécifiques. Cette expression a été étroitement associée à la capacité des isolats à adhérer, in vitro, à la CSA. La deuxième partie de ce travail a examiné le potentiel vaccinal de VAR2CSA par l’exploration des régions peptidiques impliquées dans l'acquisition d'anticorps « anti-adhérence ». En utilisant une approche d'immunisation génétique chez la souris, nous avons été en mesure d'identifier la région minimale de VAR2CSA située dans son extrémité N-terminale comme étant le site qui concentre les épitopes anti-adhérence. Les IgG induites contre la région NTS-DBL2X de VAR2CSA ont été capables d’inhiber l'adhérence de plus de 60% ??des isolats naturels de P. falciparum à la CSA. Cette étude a par ailleurs mis en évidence des propriétés fonctionnelles des IgG qui seraient souche-spécifique ainsi qu’a aidé à formuler une hypothèse concernant la combinaison antigénique des variants de VAR2CSA nécessaires pour garantir une activité optimale sur des isolats de terrain. La dernière partie de ce travail a porté sur l'analyse du polymorphisme des séquences de VAR2CSA dans sa partie N-terminale chez les isolats de terrain. Ces analyses ont démontré l'existence d'une région dimorphique dans le domaine structurellement critique ID1, qui a révélé une association très intéressante avec la survenue d'infections à très forte densité de parasite. Le travail développé dans cette thèse a permis de mettre à jour les connaissances sur les parasites qui infectent les femmes pendant la grossesse et de formuler des hypothèses sur les pistes d'optimisation moléculaire, nécessaires au développement d'un vaccin efficace à base de VAR2CSA. / This thesis aimed to characterize the P. falciparum parasites infecting pregnant women and causing pregnancy-associated malaria (PAM). In the first part of this work, cytoadherence phenotype and var genes expression profile of pregnant women parasites have been investigated on parasite isolates collected in two studies conducted in Benin between 2008 and 2013. The first study on isolates collected as part of a cohort study of pregnant women in rural areas in Benin, showed that parasites which infect women in the first trimester of pregnancy already express placental phenotype. In a second study on isolates collected prospectively from pregnant women attending antenatal clinics in health centers in Cotonou, the analysis of the adhesion phenotype using multiple host receptors described so far confirmed the first results and highlighted a greater complexity of the binding properties in isolates collected during the first trimester and those obtained from multigravidae. This study also demonstrated that beyond parasitaemia, adhesion to CSA is a major factor for poor pregnancy outcomes. Consistent with previous reports, studies in Benin showed that var2csa was the most transcribed var gene by PAM-isolates and its surface expression on infected erythrocyte (IE) was demonstrated with specific antibodies. This was closely linked to the ability of isolates to adhere to CSA in vitro. The second part of the work investigated the vaccine potency of VAR2CSA by exploring the region of var2csa involved in the acquisition of anti-adhesion antibodies. Using a DNA immunization approach performed in mice, we were able to identify the var2csa minimal region located in its N-terminus as the site that concentrates the anti-adhesion epitopes. The NTS-DBL2X region of VAR2CSA has been found to induce cross-reactive antibodies that inhibit adhesion of more than 60% of field P. falciparum isolates to CSPG. This study highlighted some strain-specific properties in functionality of the antibodies induced and helped formulate a hypothesis of antigenic FCR3 and 3D7 variants combination for optimal activity on field isolates. The last part of this work focused on the analysis of sequence polymorphism in the N-terminal part of VAR2CSA expressed by field isolates. The analysis demonstrated the existence of a dimorphic region within the structurally critical ID1 domain that revealed a very interesting association with the occurrence of infections with very high parasite density. The work developed in this thesis updates knowledge on parasites infecting women during pregnancy and formulates hypotheses on the molecular optimization tracks necessary for the development of an effective VAR2CSA-based vaccine.

L’artésunate est désormais le traitement de référence du paludisme grave au plan mondial. Cependant, des cas d’anémie hémolytique différée ont été décrits chez 20% à 25% des voyageurs traités. L’épisode hémolytique survient 2 à 3 semaines après traitement. Environ la moitié des patients vont nécessiter une transfusion sanguine. L’artésunate induit un phénomène original en physiologie humaine : le “pitting” ou épépinage splénique des érythrocytes parasités. Il consiste en l’expulsion du parasite mort de l’érythrocyte hôte lorsque celui-ci traverse une structure microcirculatoire splénique appelée « fente interendothéliale ». Ces érythrocytes pittés retournent sans destruction immédiate dans la circulation générale. Nous avons étudié l’efficacité et la tolérance de l’artésunate intraveineux chez 123 voyageurs atteints de paludisme grave. Cent dix-sept patients ont survécu (95%). Parmi 78 patients suivis plus de 8 jours, 76 (97%) ont eu une anémie au cours du suivi et 21 une hémolyse différée typique (27%). Dans ce sous groupe de patients la chute médiane en hémoglobine a été de 1,3g/dl avec un nadir <7g/dl dans 15% des cas. Un seul patient a été transfusé. Le marquage de la protéine parasitaire Resa, véritable empreinte de l’infection érythrocytaire par Plasmodium falciparum, permet la visualisation des érythrocytes pittés. Chez 21 patients non transfusés le pic de concentration en érythrocytes pittés est survenu durant la première semaine. Chez 9 patients évoluant vers une hémolyse différée le pic de pittés était significativement plus élevé que chez 12 patients présentant d’autres profils évolutifs d’anémie (0,30 vs. 0,07 ; P = 0,0001). Une concentration d’érythrocytes pittés au pic supérieure à 180 millions/l aurait prédit le risque d’hémolyse différée avec une sensibilité de 89% et une spécificité de 83%. Utilisant la technologie ImageStream* l’étude morphologique érythrocytaire chez 4 patients a montré que l’infection plasmodiale suivi de pitting entraine une réduction de surface projetée de 8,9%. Cette altération pourrait contribuer à la réduction de la durée de vie des érythrocytes pittés. La destruction différée des érythrocytes infectés et épargnés par le pitting durant le traitement par artésunate est un mécanisme original d’anémie hémolytique. Ce travail a permis de structurer l’espace nosologique de l’anémie post-thérapeutique au cours du paludisme, de clarifier la physiopathologie de l’hémolyse différée et d’identifier certains de ses mécanismes. Malgré l’incidence élevée de l’hémolyse différée, l’anémie résultante n’est préoccupante que dans 15% des cas et ne remet pas en cause le bénéfice de l’artésunate par rapport à la quinine dans le traitement du paludisme grave. La concentration précoce des érythrocytes pittés pourrait être un marqueur prédictif intéressant de la survenue d’une hémolyse différée post-artésunate. / Worldwide, artesunate is now the recommended treatment for severe malaria. However cases of delayed hemolytic anemia have been described in 20% to 25% travelers treated with artesunate. The episode usually occurs 2 to 3 weeks after the end of the treatment. About half on the inpatients need blood transfusion. Artesunate induces an original phenomenon called splenic “pitting” of parasitized erythrocyte. The dead parasite is expelled from the host erythrocyte when it comes through a microcirculatory structure called inter-endothelial slit. These pitted red blood cells go back to the general blood circulation without destruction. We have studied efficacy and tolerance of intravenous artesunate in 123 patients with imported severe malaria, of whom 117 have survived (95%). Among 78 patients followed more than 8 days, 76 (97%) suffered from anemia during follow-up and 21 had a typical delayed hemolysis pattern (27%). In this sub group the median loss of hemoglobin was 1.3g/dl with a nadir below 7g/dl in 15% of them. Only one patient was transfused. The labelling of Resa protein, a plasmodium protein included in the bilayer membrane of the red blood cell, allowed the visualization of pitted cells. In 21 patients non transfused, the pitted cells peak occured during the first week post treatment. In 9 patients with typical delayed hemolysis pattern, the pitted cells peak was higher than in the 12 patients with other kind of anemia patterns (0.30 vs. 0.07 ; P = 0.0001). A pitted cells concentration above 180 millions/l would have predicted the risk of late hemolysis with 89% sensitivity and 83% specificity. Red blood cell morphology was studied using ImageStream* technology in 4 patients. It has shown that infection and pitting process induces a membrane projected area loss of 8.9%. This loss could explain the reduced life span of the pitted red blood cells. Differed destruction of the erythrocytes first infected and then spared by pitting process during the treatment with artesunate is a new pattern of hemolytic anemia during malaria. This work has provided a nosological framework of post therapy hemolysis during malaria, a clarified pathophysiology of delayed hemolysis and has identified potential explanatory mechanisms. Notwithstanding the high incidence of hemolysis, the resulting anemia is severe in 15% of the patients and does not jeopardize the advantage of artesunate compared to quinine in the treatment of severe malaria. Early pitted cells concentration could be a surrogate marker to determine the risk of delayed hemolysis and anemia after artesunate treatment.

L'objectif général de cette thèse était d'étudier le rôle des anticorps dans la susceptibilité ou la résistance au paludisme chez de jeunes enfants béninois exposés naturellement aux infections palustres durant leurs deux premières années de vie. Deux projets complémentaires (PALNOUGENENV et TOLIMMUNPAL) ont été mises en place au Bénin et consistaient à suivre des mères et leurs enfants. Dans le cadre du projet PALNOUGENENV, l'étude incluait 600 mères à l'accouchement et a suivi leurs enfants pendant les dix-huit premiers mois de vie dans le but d’étudier les conséquences de l’infection placentaire palustre chez les mères sur la survenue des premières infections palustres chez les nouveau-nés. Suite au projet PALNOUGENENV, il semblait important de connaitre le statut palustre de la mère pendant la grossesse et pas seulement à l’accouchement. Le projet TOLIMMUNPAL a donc été mis en place et incluait 400 mères et leurs enfants. Les mères ont été inclues à la première consultation prénatale et suivies au niveau parasitologique et clinique jusqu'à l'accouchement et leurs enfants ont été suivis de la naissance jusqu'à 24 mois dans le but d'étudier des déterminants environnementaux, biologiques et génétiques impliqués dans le développement de la tolérance immunitaire associée au paludisme et ses conséquences sur la protection de la femme enceinte et du jeune enfant. Plus spécifiquement, nous avons étudié chez ces enfants les relations entre l'infection palustre et les niveaux d'anticorps spécifiquement dirigés contre les antigènes candidats vaccins les plus avancés du stade érythrocytaire d'une part et la capacité des anticorps à inhiber le développement in vitro de P. falciparum d'autre part. Nos résultats mettent en évidence une association dans la cohorte PALNOUGENENV entre les niveaux élevés des sous-classes cytophiles IgG1 dirigées contre les antigènes candidats vaccins MSP1 (p<0,001, OR=0,90) et IgG3 anti-MSP2 (p<0,001, OR=0,89) et la protection contre l'infection palustre. Dans la cohorte TOLIMMUNPAL, les hauts niveaux d'IgG2 anti-GLURP R2 (p=0.05, OR=2.10) ont plutôt été associés au risque d'infection palustre. L'analyse fonctionnelle des IgG en utilisant le test GIA a révélé que l'infection par P. falciparum au moment du prélèvement affectait la capacité des IgG à inhiber la croissance parasitaire in vitro. Les IgG purifiées à partir d'échantillons collectés chez des individus infectés par P. falciparum avaient une capacité moyenne d'inhibition de la croissance parasitaire inférieure (p=0.003, Wilcoxon matched pairs test) de 19 % à celles purifiées à partir de plasmas d'enfants non infectés. Une corrélation inverse a été observée entre l'âge et la capacité des anticorps à inhiber l'invasion des globules rouges par le parasite. Aucune association entre les niveaux d'anticorps et leur capacité à inhiber le développement du parasite in vitro n'a été mis en évidence. Dans le cadre du développement du test Antibody-Dependent Respiratory Burst (ADRB), les cellules promyélocytaires de la lignée PLB 985W ont été utilisées. Ces cellules ont la capacité de se différencier en neutrophiles sous l'action du DMSO. Nos résultats ont montré que cette lignée a une faible capacité à produire les espèces réactives d'oxygène (ROS) comparés aux neutrophiles humains et les niveaux de ROS produits par cette lignée cellulaire sont insuffisants pour être utilisés dans le test ADRB. Nos résultats confortent le rôle important des antigènes candidats vaccins MSP1 et MSP2 dans la protection contre le paludisme. Cette relation est essentiellement établie au regard des quantités d’anticorps spécifiques produits, l’étude de fonctionnalité des anticorps employant le test GIA n’ayant pas permis de mettre en évidence de relation claire à la protection. (...) / The aim of this thesis was to study the role of antibodies in susceptibility or resistance to malaria in young Beninese children naturally exposed to malaria infections during their first two years of life. Two complementary projects (PALNOUGENENV and TOLIMMUNPAL) were implemented in Benin to identify individual factors of malaria susceptibility. The PALNOUGENENV cohort included 600 mothers at delivery and their children from birth to 18 months of age in order to study the effects of placental malaria infection in mothers on first occurrence of malaria infections in newborns. In the TOLIMMUNPAL cohort 400 mothers were included at the first antenatal visit and followed until delivery while their infants were followed from birth to 24 months in order to study environmental determinants, biological and genetic involved in the development of immune tolerance associated with malaria and its impact on the protection of pregnant women and infants. Specifically, the association between malaria infection and the level of antibodies specifically directed against the most advanced vaccine candidate antigens of the erythrocyte stage on one hand and the ability of antibodies to inhibit in vitro the development of P. falciparum on the other hand were investigated. Our results show an association in the cohort PALNOUGENENV between high levels of IgG1 to MSP1 19 vaccine candidate antigens (p <0.001, OR = 0.90) and IgG3 to MSP2 3D7 (p <0.001, OR = 0.89) and protection against malaria infection. In the TOLIMMUNPAL cohort, high levels of IgG2 to GLURP R2 (p = 0.05, OR = 2.10) were instead associated with an increased risk of malaria infection. Functional analysis of IgG using the GIA test revealed that the infection with P. falciparum at the sampling time affected the ability of IgG to inhibit parasite growth in vitro. The purified IgG from individuals infected with P. falciparum when the sample was collected had an average 19% lower capacity of inhibition of parasite growth (p = 0.003, Wilcoxon matched pairs test) than those that were uninfected at the time of sampling. An inverse correlation was found between age and the ability of antibodies to inhibit in vitro invasion of red blood cells by the parasite. There was no association between antibody levels and ability to inhibit the in vitro parasite development. In the development of the Antibody-Dependent Respiratory Burst (ADRB) assay, the promyelocytic cell line PLB 985W was used. These cells have the capacity to differentiate into neutrophils after exposure to DMSO. Our results showed a low ability of this cell line to produce reactive oxygen species (ROS) compared to human neutrophils and ROS levels produced by this cell line are insufficient to be used in the test ADRB. Our results confirm the important role of MSP1 19 and MSP2 3D7 vaccine candidate antigens in malaria protection. Although the levels of antibodies to MSP1 19 and MSP2 3D7 were associated with decrease risk of P. falciparum infection, the functional study of antibody using the GIA assay did not allow demonstrating the relationship to protection. Investigation on the functional role of antibodies is complex as IgG could act through multiple direct or indirect mechanisms. We will continue to investigate the functional role of antibody, particularly in plasma samples from our two birth cohorts by using the ADRB assay. Results will aid in providing new information to the existing knowledge gap and will help in malaria vaccine development.

Quatre études épidémiologiques menées en Afrique ont montré que les enfants issus de mères ayant un placenta infecté par Plasmodium falciparum lors de l’accouchement font des infections palustres plus précocement que les autres enfants. Le fœtus serait sensibilisé in utero par les parasites infectants et développerait par la suite une tolérance aux infections palustres. Cette hypothèse nous conduit à supposer que i) la réponse anticorps spécifique de P. falciparum est différente chez les enfants en fonction du statut infectieux du placenta des mères à l’accouchement et ii) que cette sensibilité ne pourrait être induite que par les antigènes parasitaires porteurs des mêmes polymorphismes que ceux rencontrés in utero. Un troisième projet a consisté au développement d’une méthodologie permettant de distinguer les anticorps maternels de ceux néo-synthétisés par l’enfant dans le but de mesurer précisément l’acquisition de la réponse anticorps élaborée par l’enfant dès son plus jeune âge. Nous avons mis en place le suivi régulier et rapproché d’une cohorte de 620 nouveau-nés de la naissance à 18 mois au Bénin. Nous avons mesuré leurs réponses anticorps dirigées contre sept antigènes de P. falciparum candidats vaccins et constaté que le processus de maturation immunitaire commence à être mis en place à l’âge de 18 mois. L’infection palustre placentaire ne semble pas influer sur l’acquisition de la réponse anticorps spécifique jusqu’à 18 mois de vie. La méthodologie de distinction des anticorps maternels et néo-synthétisés a été validée. La caractérisation des polymorphismes des antigènes parasitaires présents à l’accouchement et pendant le suivi des enfants, mis en relation avec les données environnementales, a permis de valider en partie l’hypothèse de tolérance immunitaire. / Four epidemiological studies showed that infants born from mothers with Plasmodium falciparum placental malaria at delivery present a higher susceptibility to plasmodial infections than others. In connection with this observation, we hypothesized that i) the infants’ P. falciparum specific antibody responses are different according to presence or absence of placental malaria at delivery in their mothers and ii) susceptibility could only be induced by antigens that bring the same polymorphisms as those found in infected mothers. Another project consisted to develop a new methodology to distinguish maternal and neonatal antibodies in order to measure accurately neo-synthesized antibodies in the first months of life. A birth cohort of 620 newborns was established in an area endemic for malaria. Infants were followed-up until 18 months of age and their antibody responses specific for 7 P. falciparum antigens were quarterly measured. The emergence of the immune maturation process was observed in 18-months-infants. The acquisition of specific antibody responses was not impacted by placental malaria. The new methodological approach leading to distinguish maternal and neonatal antibodies was validated. The genetic characterization of the parasite antigen polymorphisms in mothers at delivery and their infants during the follow-up, in link to environmental data, led partially to the validation of the immune tolerance hypothesis.

Giardia duodenalis est le protozoaire responsable de la giardiose, la parasitose intestinale la plus répandue dans le monde. Cette infection se caractérise par une malabsorption intestinale, des diarrhées, une perte de poids et des douleurs abdominales intenses chez l’Homme et de nombreux mammifères. Par ailleurs, cette maladie dont l’impact en santé publique et vétérinaire est reconnu, peut entraîner d’importantes déficiences nutritionnelles en particulier chez les sujets jeunes. L’infection est causée par l’ingestion de kystes de Giardia duodenalis (syn. G. lamblia, G. intestinalis) présents dans les aliments ou l’eau contaminée. Infectieux à très faibles doses, ces kystes survivent pendant plusieurs semaines dans l’environnement et sont résistants aux différents désinfectants. Suite au dékystement, la forme végétative de Giardia, le trophozoïte, adhère à l’épithélium intestinal au niveau des parties supérieures de l’intestin grêle et se multiplie, causant les symptômes. Cette phase se termine par un nouvel enkystement et l’excrétion de kystes par les fèces. Le nombre croissant d’infections liées à la contamination de l’eau potable, à l’émergence de souches résistantes aux médicaments disponibles, à la fréquence des échecs thérapeutiques et à l’importance des effets secondaires associés aux traitements font de cette maladie un sujet d’actualité de plus en plus préoccupant qui nécessite le développement de traitements alternatifs. Il est désormais bien établi que le microbiote et/ou certaines souches de bactéries probiotiques ont un impact bénéfique dans la giardiose. En particulier, la bactérie probiotique Lactobacillus johnsonii La1 (LjLa1) a un rôle protecteur contre la croissance de Giardia in vitro et in vivo. Nous avons cherché dans ce travail de Thèse à décrypter les mécanismes moléculaires associés à l’effet inhibiteur des facteurs sécrétés par LjLa1. Nous avons montré qu’in vitro, LjLa1 agissait en libérant des enzymes de type Bile Salt Hydrolases (BSH) qui modifient alors des composants de la bile non-toxiques pour le parasite (sels biliaires conjugués) en des composants toxiques (sels biliaires déconjugués). Les 3 gènes BSH codés dans le génome de LjLa1 ont été clonés chez Escherichia coli et les protéines taguées histidine purifiées pour étudier leurs propriétés biochimiques et biologiques. Obtenues sous forme active, nous avons pu en définir les spécificités de substrats et montrer qu’elles sont capables d’inhiber significativement la croissance de G. duodenalis in vitro et in vivo, dans un modèle murin de la giardiose (souriceaux OF1 non sevrés). En parallèle, nous avons identifié, à l’issue d’un large criblage de souches de lactobacilles selon leur activité anti-Giardia in vitro, une souche probiotique aux effets inhibiteurs comparables à ceux de LjLa1 : Lactobacillus gasseri CNCM-4884. Administrée in vivo dans le modèle murin de la giardiose, cette souche a réduit de 93% la charge parasitaire dans l'intestin grêle des nouveaux nés et a également réduit de façon significative le nombre de kystes libérés dans l’environnement, permettant ainsi de réduire la transmission de Giardia. Des travaux parallèles ont été réalisés au cours de ce projet de Thèse, notamment le développement d’outils de moléculaire pour l’expression hétérologue de molécules d’intérêt en santé animale chez divers lactobacilles. Le développement de ces « vecteurs mucosaux » permettra à terme de proposer une stratégie de surexpression de BSH par les lactobacilles afin d’accroitre l’activité BSH in vivo, et renforcer ainsi l’élimination du parasite. Ces résultats permettent de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques originales contre les giardioses humaines et animales, basées sur l’utilisation de lactobacilles probiotiques ou sur les activités BSH qui en sont dérivées. Ces traitements offrent alors une alternative sérieuse aux antibiotiques et permettront de pallier aux actuels fréquents échecs thérapeutiques. / Giardia duodenalis is a protozoan parasite responsible for giardiasis, the most common intestinal parasitic disease worldwide. This infection is characterized by intestinal malabsorption, diarrhea, weight loss and abdominal pain in humans and various mammalian species. Besides, this disease has a high veterinary and public health impact, leading to important nutritional deficiencies in young subjects. The infection is caused by the ingestion of food or water contaminated with infectious cysts of the parasite. Giardia cysts can survive for several weeks in the environment and are highly resistant to disinfectants. Giardia excysts in the intestinal tracts of its host and replicates under the trophozoite stage causing the symptoms. Trophozoites adhere to the intestinal epithelium of the small intestine and multiply, causing the symptoms. The cycle ends by a new encystment and infectious cysts are released in environments with feces. The increasing number of giardiasis cases, mainly due to water contaminations, the emergence of parasite strains resistant to drugs and therapeutic failures, make research on alternative therapeutic strategies and treatments highly needed. Nowadays, it is well known that the microbiota and probiotics play an important role in protection against this parasite. For instance, the probiotic strain Lactobacillus johnsonii La1 (LjLa1) prevents the establishment of Giardia in vitro and in vivo. In this thesis, we have tried to point out the molecular mechanism(s) involved in this inhibitory effect(s). We showed in vitro that LjLa1 was releasing "Bile Salt Hydrolases" (BSH) – like activities that modify some components of bile (conjugated bile salts) into toxic compounds (deconjugated bile salts) for Giardia. We have cloned and expressed each of the three bsh genes present in the genome of LjLa1 in Escherichia coli in order to study their enzymatic and biological properties. Two BSH were obtained as recombinant active enzymes and biochemical tests showed that they have distinct substrate specificities despite similar predicted 3D structures. Moreover, these two BSHs of LjLa1 exhibited anti-giardial effects in vitro and in vivo in a murine model of the giardiasis (OF1suckling mice), comforting the hypothesis of the biological role of active BSH, derived from probiotics, against Giardia. A wide collection of diverse lactobacilli strains was screened to assess their effectiveness to also display both anti-giardial and BSH activities. This screening allowed the identification of several strains exhibiting strong anti-giardial effects such as Lactobacillus gasseri CNCM I-4884. In a murine model of giardiasis, this strain dramatically reduced the parasite burden in the small intestine of treated animals and significantly reduced the number of cysts in the colon, which could contribute to blockage of parasite transmission in environments. Additional studies were realized in parallel in order to explore the potency of lactobacilli to exert beneficial effects on health. For this, molecular tools were successfully developed in various lactobacilli strains to express and deliver therapeutic molecules at mucosal surfaces. The development of these tools will further allow the overexpression of BSH by lactobacilli to increase their in vivo BSH-activity and strengthen the elimination of the parasite. Altogether, this thesis work proposes new original therapeutic strategies against human and animal giardiasis, based on the use of BSH-positive lactobacilli strains or recombinant BSH- derived from probiotic strains, to counteract the frequent therapeutic failures, offering a serious alternative to antibiotics.

Le paludisme à P. falciparum est l’une des causes majeures de mortalité et de morbidité dans le monde. Ce parasite est responsable de plusieurs manifestations cliniques allant du portage asymptomatique et infections non compliquées aigüe au paludisme grave et compliqué, tel que le neuropaludisme. Nous avons émis l’hypothèse que l’expression différentielle des gènes contribue à la variation phénotypique de parasites, entraînant des interactions spécifiques avec l’hôte, qui à son tour déterminent le type de manifestations cliniques du paludisme. L’objectif principal de cette étude était d’identifier les facteurs génétiques de P. falciparum impliqués dans la pathogenèse du neuropaludisme. Ceci a été réalisé par l’analyse complète du transcriptome d’isolats provenant d’enfants camerounais porteurs asymptomatiques (PA) ou atteints d’accès simple (AS) ou de neuropaludisme (NP). Le transcriptome du clone non sélectionnée (3D7) et la lignée sélectionnée (3D7-Lib) a été également analysé. Les résultats ont montré la surexpression de plusieurs gènes chez des isolats provenant d’enfants atteints de neuropaludisme et chez la lignée 3D7-Lib, par rapport à ceux provenant d’enfants asymptomatiques et 3D7, respectivement. L’analyse de l’ontologie de gène indique que les gènes potentiellement impliqués dans la pathogenèse, la cytoadhérence et l’agrégation des érythrocytes sont surreprésentés parmi les gènes surexprimés chez les isolats de CM et 3D7-Lib. Les résultats les plus marquants étaient la surexpression des gènes var (groups A et B) portant les domaines cassettes DC4, DC5, DC8 et DC13 et les gènes avoisinants rif chez les isolats de NP et la lignée 3D7-Lib, par rapport aux isolats de PA et au clone non sélectionné 3D7, respectivement. Le rôle joué par ces gènes dans la virulence parasitaire est lié à la cytoadhérence, c’est-à-dire la capacité de leurs protéines exprimées à interagir entre les érythrocytes parasités et les récepteurs endothéliaux post capillaires. Parmi ces récepteurs, le CD36 et inter cellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) ont été les plus couramment utilisés par les isolats. L’étude sur l’implication de ces deux récepteurs, ainsi que celle des ligands PfEMP-1, dans la pathogenèse du neuropaludisme devrait être approfondie poursuivie. Nous avons analysé le phénotype de cytoadhérence et les profils de transcription des variantes de Pfemp-1 des isolats frais provenant des enfants béninois atteints de NP ou AS à l’aide du test d’adhérence statique aux récepteurs CD36, ICAM-1 et CSPG et au moyen de RT-PCR quantitative pour les groupes A, B, var2, var3, DC8 et DC13. Nos résultats montrent que le niveau de cytoadhérence des parasites associés au neuropaludisme au CD36 est significativement plus important que celui des parasites associés à l’accès simple. En outre, nous n’avons pas trouvé de différence significative entre la cytoadhérence des isolats de deux groupes cliniques à ICAM-1 et au CSPG. En outre, les niveaux d’expression des groupes var A, B, var2, var3 et du DC8 et DC13 sont plus élevés chez les isolats associés au neuropaludisme que chez les isolats associés à l’accès simple. Nos résultats montrent également que, chez les parasites provenant de NP le haut niveau de cytoadhérence des parasites au CD36 est corrélé au niveau de l’expression de groupe B de gènes var. En revanche, les profils d’expression des groupes spécifiques du gène var et le phénotype de cytoadhérence aux récepteurs ICAM-1 et CSPG n’étaient pas corrélés. Nos résultats suggèrent un rôle important du récepteur CD36 et des protéines codées par les variantes de PfEMP-1 codées par le groupe B dans la pathogenèse du neuropaludisme. / Plasmodium falciparum infection is a major cause of mortality and morbidity worldwide. This parasite is involved in several clinical manifestations, ranging from asymptomatic carriage and acute uncomplicated to severe and complicated malaria, including cerebral malaria. We hypothesized that differential gene expression contributes to phenotypic variation of parasites leading to specific interaction with the host which induces several clinical categories of malaria. The principal aim of this study was to identify parasite genetic factors implicated in the pathogenesis of cerebral malaria. We investigated the whole transcriptome of parasites isolated from Cameroonian children with asymptomatic (AM), uncomplicated (UM) and cerebral malaria (CM). We also investigated the transcriptome of 3D7 clone and the selected 3D7-Lib line. Our results revealed the up-regulation of several genes in CM isolates and 3D7-Lib line compared to AM isolates and 3D7 clone respectively. Gene ontology analysis indicates an over-representation of genes implicated in pathogenesis, cytoadherence, and erythrocyte aggregation among up-regulated genes in CM and 3D7-Lib. The most remarkable outcomes were the up-regulation of UPS A and B var genes containing architectural Domains Cassettes DC4, DC5, DC8, and DC13 and their neighboring rif genes in isolates from CM and 3D7-Lib line, compared with isolates from AM and the unselected 3D7 line, respectively. The involvement of these genes in parasite virulence rises from the ability of their encoded proteins to mediate cytoadherence of infected erythrocytes to post-capillary endothelial receptors. Of these receptors, CD36 and Inter Cellular Adhesion Molecule-1 (ICAM-1) were found as the most commonly used by the isolates. The implication of these two receptors, as well as that of PfEMP-1 ligands in the pathogenesis of CM needs to be more elucidated. We examined the adhesive phenotype and the transcription patterns of Pfemp-1 variants of fresh isolates from Beninese children with CM or UM malaria by static binding assay to CD36, ICAM-1 and CSPG and RT-qPCR for groups A, B, var2, var3, DC8, and DC13. Our findings showed that isolates from CM patients bind more to CD36 than those from UM cases. No differences were observed in binding levels to ICAM-1 or CSPG between these two groups. Furthermore, CM isolates transcribed groups A, B, var2, var3, DC8 and DC13 of var genes at higher levels than UM isolates. Interestingly, the high transcription levels of group B in CM parasites correlated with their higher level of binding to CD36. In contrary, the expression profiles of a specific var group and the binding phenotype of isolates to ICAM-1 and to CSPG were not correlated. Our findings support the implication of CD36 along with PfEMP-1 variants encoded by group B in cerebral malaria pathogenesis.

Le paludisme est une infection parasitaire de répartition mondiale notamment en zones intertropicales où l’infection par Plasmodium falciparum est responsable de centaines de milliers de morts par an principalement chez les enfants de moins de cinq ans. Le paludisme constitue également un problème en France par l’importation de cas de paludisme chez le voyageur de retour de zone d’endémie. L’infection à Plasmodium falciparum dans cette population, considérée comme à risque de développer les formes graves de la maladie, peut se présenter sous différentes formes cliniques plus ou moins associées au risque de mortalité. Même si certains facteurs de risque de gravité tels que l’âge et l’immunité ont été identifiés, cette interaction complexe hôte-parasite n’a été largement étudiée que chez l’enfant en zone d’endémie et peu de données sont disponibles pour le paludisme d’importation. L’objectif de ces travaux de thèse repose sur l’analyse des facteurs d’hôte et des facteurs parasitaires intervenant dans le paludisme d’importation. A travers le réseau de surveillance du centre national de référence du paludisme en France métropolitaine, l’ensemble des données démographiques, épidémiologiques, cliniques et biologiques des cas de paludisme d’importation, notifiés entre 2011 et 2015, ont été collectées ainsi que les échantillons ayant servis au diagnostic. Après expertise diagnostique, le plasma obtenu après centrifugation a été utilisé pour les dosages des antipaludéens, pour la quantification d’HRP2 ainsi que pour la sérologie anti-palustre. L’ARN extrait par le TRIZOL® à partir du culot globulaire a été utilisé pour l’étude de l’expression des gènes var et des domaines cassettes par qRT-PCR. Le culot de globules rouges parasités a été mis en culture pour la maturation des formes parasitaires en vue de l’étude du phénotype de cytoadhérence sur les récepteurs solubles CD36, ICAM-1, EPCR et du phénomène de rosetting . L’ensemble de ces études a été réalisé sur une population de patients dans le cadre du paludisme d’importation groupée en migrants de première génération, migrants de deuxième génération et voyageurs/expatriés et dont la présentation clinique du paludisme d’importation a été classée en paludisme « très grave », paludisme « grave » et paludisme « simple ». L’ensemble des données épidémiologiques, cliniques et biologiques recueillies au cours de l’étude a permis d’identifier l’âge élevé, l’origine ethnique, la profondeur de la thrombopénie et l’absence d’antécédents de paludisme comme des facteurs de risque associés à la survenue d’un accès palustre « très grave », entité clinique caractérisée pour une biomasse parasitaire séquestrée élevée. L’effet de la pré-exposition au parasite, reflété par le statut sérologique des patients, semble être à l’origine de la présentation clinique de la maladie en limitant notamment la biomasse parasitaire séquestrée au cours de l’accès palustre. L’étude de l’expression des gènes var et des domaines cassettes réalisée dans cette population, en fonction de la présentation clinique, de l’origine ethnique et du statut sérologique des patients, a révélé une surexpression du groupe de gènes var A et B et des motifs protéiques composant les domaines cassettes DC4, DC8 et DC13 dans le paludisme « grave » et « très grave » d’importation au sein de cette population hétérogène de patients. L’étude du phénotype de cytoadhérence et du rosetting, réalisée dans un autre groupe de patients rencontré dans le cadre du paludisme d’importation, a identifié le rosetting comme le phénotype d’adhérence à l’origine de l’accès palustre « très grave ». Le profil d’expression des gènes var et domaines cassettes correspondants à cette population a confirmé les observations antérieures et corrèle le phénotype de rosetting à l’expression des motifs protéiques DBLß3 et DBLa2 de DC4 et DC8 (...) / Malaria is a worldwide parasitic infection especially in tropical area where Plasmodium falciparum infection is responsible for hundreds of thousands annually mainly among children under five years old. Malaria is also a problem in France by the importation of malaria cases in travelers coming from endemic area. The Plasmodium falciparum infection in this population, considered at risk of developping severe malaria, can present different clinical forms more or less associated with mortality.While some risk factors for severity like age and immunity have been identified, this complex host-parasite interactions have been widely studied in children in endemic areas and few data are available for imported malaria. The aim of the thesis work is based on analysis of host factors and parasite factors in imported malaria.Through the monitoring network of the French National reference center of malaria, all the demographic, epidemiological, clinical and laboratory of imported malaria cases, notified between 2011 and 2015, were collected and also samples of the parasitological diagnosis. After diagnostic expertise, the plasma obtained after centrifugation was used for determinations of antimalarial drugs, for quantification of plasmatic HRP2 and for serological tests. RNA extracted by the Trizol® from red cells pellets was used to study the expression of var genes and domain cassettes by qRT-PCR. The pellet of parasitized red blood cells were cultured for maturation of parasitic forms for the study of phenotype cytoadherence on soluble receptor CD36, ICAM-1 and EPCR and for the study of the rosetting phenomenon. All of these studies was conducted in an imported malaria context,in a population of patients composed by first-generation migrants, second-generation migrants and travelers / expatriates and whose clinical presentation of imported malaria was classified into very severe (VSM), mild severe (MSM) and uncomplicated malaria (UM).All the epidemiological, clinical and biological data collected during the study identified the high age, ethnicity, depth of thrombocytopenia and no history of malaria as factors risk associated with the occurrence of very severe malaria, clinical entity characterized by high sequestered parasite biomass. The effect of pre-exposure to the parasite, reflected by the serological status of patients, seems to be the cause of the clinical presentation of the disease in particular by limiting parasite biomass sequestered during malaria. The study of the expression of var genes and domain cassettes performed in this population, according to clinical presentation, ethnicity and the serological status of patients, revealed an overexpression of the group of var genes A and B and protein patterns of the domain cassette DC4, DC8 and DC13 in mild severe and very severe malaria within this heterogeneous patient population. The study of cytoadherence phenotype and rosetting, made in another group of patients in imported malaria context, identified the rosetting as adhesion phenotype causing very severe malaria. The expression profile of var genes and domain cassettes corresponding to this population confirmed earlier observations and correlates rosetting phenotype to the expression of DBLß3 and DBLa2 of DC4 and DC8 (...)