Submitted by Rosana Amâncio (rosana.amancio@ufcg.edu.br) on 2018-07-11T20:08:46Z No. of bitstreams: 1 propriedades eletronicas, ópticas e vibracionais da região C.pdf: 18345145 bytes, checksum: e90bc1985f0f75d2e3d83ecaa39d4a34 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-11T20:08:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 propriedades eletronicas, ópticas e vibracionais da região C.pdf: 18345145 bytes, checksum: e90bc1985f0f75d2e3d83ecaa39d4a34 (MD5) Previous issue date: 2016-07-29 / Neste trabalho, apresentamos um estudo das propriedades eletrônicas, ópticas, vibracionais e termodinâmicas da região C-Terminal de Fosfolipases A2 Lisina 49 (PLA2s Lys 49). Este foi realizado por meio de cálculos quânticos através da Teoria do Funcional da Densidade (DFT), utilizando a aproximação da densidade local (Local Density Approximation - LDA) e a aproximação do gradiente generalizado (Generalized Gradient Approximation - GGA). Também foram realizados cálculos baseados no modelo tight binding. As PLA2 Lys 49 compõe um grupo de miotoxinas que apresentam pouca ou nenhuma atividade catalítica e ainda assim são capazes de atuarem na membrana celular por meio de um mecanismo alternativo propiciando a morte da célula. A região C-terminal destas proteínas, em particular a região compreendida entre os aminoácidos 115-129, é apontada como responsável pelo dano as membranas. Pouco se sabe sobre as características que propiciam a esta região tal capacidade e como acontece a sua interação com a membrana celular. Este trabalho realizou uma caracterização das propriedades físicas desta região. Buscando, portanto, estabelecer uma relação entre as propriedades físicas expressas por essa região e seu potencial de dano celular. Um resultado inicial obtido por este estudo foram as curvas corrente-voltagem (I-V ) para nove diferentes peptídeos que correspondem as regiões 115-129 de PLA2 de diferentes espécies de serpentes. As curvas I-V foram obtidas por meio do modelo tight binding. Elas demostraram que os peptídeos estudados apresentam características de semicondutores. Também apresentam semelhança com resultados experimentais obtidos por LOMONTE et al, 2003. Usando a DFT, foram realizados os cálculos da área acessível ao solvente, da densidade eletrônica, análise populacional de cargas, orbitais de fronteira, densidade de estados. Também foram realizados cálculos de propriedades vibracionais como espectro infravermelho, de propriedades ópticas e das propriedades termodinâmicas como capacidade térmica, entropia, entalpia e energia livre. As propriedades eletrônicas demostram que há a possibilidade de que a interação da região C-Terminal com a membrana seja predominantemente eletrostática. A análise populacional de carga demostrou que o aminoácido Lisina 122 possui carga igual a zero. Este fato indica que ele pode não possuir papel importante como é descrito na literatura. Os resultados obtidos para a área acessível ao solvente indicam que um peptídeo com maior área disponível para interagir com a membrana não causará maior dano. Os resultados ópticos apresentaram picos de absorção dentro da região visível. Estes resultados juntamente com os resultados vibracionais servem como uma "digital" para a identificação dos peptídeos estudados. Os resultados termodinâmicos apresentados neste trabalhos podem ser utilizados em futuras pesquisas envolvendo PLA2s Lisina 49. / In this work, we present a study of the electrical properties, optical, vibrational and thermodynamic of the C-terminal Phospholipase A2 Lysine region 49 (PLA2 Lys 49). This was done by means of quantum calculations by Density Functional Theory (DFT), using the approach of Local Density Approximation (LDA) and the approach of the Generalized Gradient Approximation (GGA). They were also made calculations based on the model tight binding. The PLA2 Lys 49 composes myotoxins group that presents a little or no catalytic activity and still are able to act on the cell membrane by providing an alternative mechanism of cell's death. The C-terminal region of these proteins, in particular the region between amino acids 115-129 is identi_ed as responsible for the damage the membranes. Little is known about the characteristics that propitiate to this region such capacity and how are their interaction with the cell membrane. This work constitutes a characterization of the physical properties of this region. Searching, therefore, establish a relationship between the physical properties expressed by this region and its potential for cell damage. An initial results obtained in this study were current-voltage curves (I-V) for nine di_erent peptides corresponding to regions 115-129 PLA2 from di_erent snake species. The (I-V) curves were obtained by the model tight binding. They demonstrate that the peptides studied have semiconductor characteristics. They also have similarity with experimental results obtained by LOMONTE et al., 2003. Using the DFT were performed the calculations of the area accessible to the solvent, the electron density, population analysis of load, orbital border, and density of states. They were also carried out calculations of vibrational properties as infrared spectrum, optical properties and thermodynamic properties such as heat capacity, entropy, enthalpy and free energy. The electronic properties show that there is a possibility the interaction of the C-terminal region with the membrane it's predominantly electrostatic. The load population analysis showed that the amino acid Lysine 122 has load zero. This indicates that it may not have important role as described in the literature. The consequences obtained for the solvent accessible area indicates that a peptide with the largest area available to interact with the membrane not cause greater damage. The optical results presented absorption peaks in the visible region. These results together with the results vibrational serve like a "digital"to identify the studied peptides. The Thermodynamic results presented in this work can be used in future research involving PLA2 Lysine 49.

Orientador: Sergio Marangoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T15:45:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Calgarotto_AndranaKarla_M.pdf: 1035943 bytes, checksum: f942243a78f40f0df6fd6b1150c07714 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Bothrops moojeni é uma espécie de serpente de grande importância devido a sua ampla distribuição na América do Sul e Central além dos quadros clínicos que o veneno causa. Dentre as espécies peçonhentas brasileiras o gênero Bothrops é o mais numeroso e é o que apresenta os maiores índices de notificações relacionados a acidentes ofídicos. Os venenos de serpentes possuem uma mistura de substâncias biologicamente ativas sendo a maior parte composta por proteínas. Fosfolipases A2 (PLA2), proteínas presentes no veneno de serpentes, agem hidrolisando fosfolipídios de membrana na posição sn2 liberando lisofosfolipídios e ácidos graxos, além de exibir uma ampla variedade de efeitos farmacológicos. A isoforma de fosfolipase A2 (PLA2), denominada BmTX-I foi isolada através de um sistema de cromatografia em HPLC utilizando uma coluna de fase reversa µ-Bondapak C18. O alto grau de pureza foi confirmado através de eletroforese em SDS-PAGE Tricina (16,5%) e também através da determinação da massa molecular (14,238.71 Da) por espectrometria de massas (MALDI Tof). A caracterização cinética da BmTX-I PLA2 (Asp49) mostrou que tal isoforma é altamente estável e apresenta um pH ótimo de 8,0 e temperatura de 37º C. Frente a diferentes concentrações do substrato ácido 4-nitro-3-(octanoyloxy) benzóico a BmTX-I mostrou um comportamento com tendência alostérica. Na ausência de Ca2+ e na presença de alguns íons divalentes tais como Mg2+, Mn2+ e Cd2+ (na concentração de 10mM) a atividade BmTX-I foi significativamente diminuída, já na presença de Ca2+ (1mM) e com os mesmos íons divalentes citados apresentou uma discreta atividade. Também foi demonstrado o efeito inibitório de crotapotinas crotálicas sobre a atividade PLA2 da BmTX-I. A análise de composição de aminoácidos mostra que se trata de uma proteína de caráter básico pela alta presença de Lys, His e Arg. A presença de 14 resíduos de cisteína sugere a formação de 7 pontes dissulfeto. O estudo de homologia seqüencial da região N-terminal entre BmTX-I com outras PLA2 (Asp49) revelou um alto grau de homologia. O efeito neurotóxico in vitro do veneno total e da BmTX-I foi analisado na preparação biventer cervicis de pintainho. Nossos resultados mostraram que a ação do veneno de Bothrops moojeni na junção neuromuscular é menos potente quando comparado com venenos crotálicos, já que estes últimos levam a um bloqueio muito mais rápido e usando-se baixas concentrações. No entanto, não se pode negar que houve uma ação neurotóxica in vitro. O completo bloqueio tanto do veneno total quanto da BmTX-I não foi acompanhado pela inibição das respostas ao potássio (KCl) e a acetilcolina (ACh), exceto em altas concentrações de veneno (50 e 100 µg/ml) o que demonstra uma ação pré-sináptica primordial. Os testes in vivo do veneno total e da fração BmTX-I demonstraram o efeito miotóxico através da liberação de creatina quinase (CK) e o efeito inflamatório através de edema de pata e liberação de interleucina-6 (IL-6). O comportamento de liberação de CK foi semelhante tanto para o veneno total como para a PLA2 BmTX-I, os quais tiveram o maior liberação de CK uma hora após a injeção i.m. Oito horas após a injeção os níveis de CK estavam similares aos do controle. Ocorreu liberação de IL-6 bem como ação edematizante tanto do veneno total como da BmTX-I. A reprodutibilidade dos efeitos farmacológicos, só é possível com a utilização de frações quimicamente homogêneas que mantenham a integridade da função biológica. Essas frações são obtidas com metodologias de alta eficiência como HPLC, através do qual podemos isolar a BmTX-I em um único passo cromatográfico e o grau de pureza confirmado por espectrometria de massa. Estes resultados podem ser associados com a sua atividade biológica, eliminando a subjetividade causada por veneno total ou frações impuras. Essa abordagem pode ser aplicada nos estudos bioquímicos, estrutura-função, fisiológicos e farmacológicos, podendo revelar mecanismos ainda desconhecidos na relação estrutura-função das PLA2 procedentes de veneno de serpentes / Abstract: Bothrops moojeni is a very important snake species due to its great distribution in the South and Central America besides the clinic alterations caused by the venom. Among the Brazilian species the Bothrops genus is the most numerous and shows the highest registrations related to ophidian accidents. The snake venoms are source of biologically active substances which main components are proteins. Phospholipases A2 (PLA2), proteins present in the snake venom, hydrolyze the sn-2 acyl groups of phospholipids liberating fatty acids and lysophospholipds, besides exhibiting many pharmacological effects. The fosfolipase A2 (PLA2) isoform, named BmTX-I was isolated through RP-HPLC performed on a C18 column. The high degree of purity was confirmed by SDS-PAGE and also by determining the molecular mass (14238.71 Da) in a MALDI TOF mass spectrometry. The kinetic characterization of BmTX-I PLA2 (Asp49) showed that the isoform was highly stable and presented an optimum pH of 8.0 and temperature of 37° C. At different substrate acid 4-nitro-3-(octanoyloxy) benzoic concentrations the BmTX-I showed allosteric behavior. In the absence of Ca2+ and in the presence of some divalent ions such as Mg+2, Mn+2, Cd2+ (at the concentration of 10 mM) the BmTX-I activity significantly decreased. But in the presence of 1mM Ca+2, under the same divalent ions conditions, the isoforms showed a discreet activity. An inhibitory effect of crotalic crotapotins on the activity PLA2 was also demonstrated. The analysis of amino acids composition showed a high content of basic amino acids such as Lys, His and Arg indicating a basic character for the BmTX-I. The presence of 14 cysteine residues suggests the formation of 7 disulfide bridges. N-terminal amino acid sequence revealed a high level of homology between BmTX-I and other Asp49 PLA2s. The neurotoxic effect of the whole venom and of BmTX-I was analyzed at chick biventer cervicis muscle preparation. Our results showed that the blockage of the muscle contraction was lesser when compared with crotalic venoms, which blockage at lower concentrations. Nevertheless it is sure that there was an in vitro neurotoxic action. The complete blockage, as much the whole venom as the BmTX-I, was not accompanied by any significant inhibition of the responses to KCl and to Ach, excepting at higher concentrations of the venom (50 e 100 µg/ml) suggesting the primordial presynaptic action. The tests in vivo with the whole venom and BmTX-I fraction showed the miotoxic effect through the creatine kinase (CK) releases and the inflammatory effect through edema-forming activity and interleukin-6 release. The CK release was similar for both whole venom and BmTX-I, which showed higher liberation one hour after the i.m injection. After eight hours of injection the CK levels were similar to the controls. There was the IL-6 release as well as edema-forming activity both in to the whole venom and BmTX-I. The reprodubility of pharmacological effects, is just possible with the utilization of chemically homogenous fractions that maintain the integrity of biological function. These fractions were obtained with high efficient methodologies as HPLC, through which this we the BmTX-I could be isolated in only one chromatography step, with purity direct by mass spectrometry. These results may be associated with the biological activities, eliminating the subjectivity caused by total venom or impure fractions. This approximation may be applied to the biochemical, structure-function, physiological and pharmacological studies, and it may reveal still unknown mechanisms in the structure-function relationship of PLA2 from the serpents venom / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Jose Augusto Rosario Rodrigues / Dissertação ( mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-13T18:43:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pirolla_RenanAugustoSiqueira_M.pdf: 4621563 bytes, checksum: 4794daa19c9ceefe37205a1eed1b647b (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O projeto explora o potencial catalítico de fosfolipases A2, isoladas de venenos de serpentes brasileiras para efetuar resolução enzimática de substratos com relevância científica, visto que nenhum trabalho anterior foi feito analisando-se sua enantiosseletividade. Foram feitos estudos sobre a resolução do Binol, do a-tetralol, do 1-feniletanol, do para-nitro-1-feniletanol, do ácido 3-(2-bromo-hexanoiloxi)-4-nitrobenzóico e ácido 3-(2-metil-hexanoiloxi)-4-nitrobenzóico.Devido a dificuldade de obtenção e purificação das fosfolipases, a enzima foi imobilizada utilizando a formação de um agregado com ligações cruzadas (Cross-Linked Enzyme Aggregate . CLEA). Os agregados foram produzidos com quatro tipos de precipitantes (solução 55 % de sulfato de amônio, polietilenoglicol 600 Da, dimetoxietano e acetona) e dois adicionantes (TRITON-X100 e polietilenodiimina). Com os testes, observou-se que o CLEA formado com sulfato de amônio, sem adicionante apresentou os melhores resultados, sendo utilizado nas reações de biocatálise. A resolução dos substratos foi feita com a esterificação dos álcoois, formando-se ésteres (acetatos, propanoatos e hexanoatos), e posterior hidrólise com a enzima não-imobilizada e CLEA da fosfolipase A2, para comparação. Alíquotas das reações foram e analisadas por GC/FID com fase estacionária quiral para estudo dos excessos enantioméricos. As reações foram feitas a temperatura ambiente e a 45 °C. Os resultados indicam atividade enzimática sendo possível obter o tetralol com 16% de e.e. utilizando-se o CLEA e o p-nitro-1-feniletanol com 19% de ee usando-se a PLA2 livre. Os outros álcoois foram obtidos com baixos ee. O ácido 3-(2-bromo-hexanoiloxi)-4-nitrobenzóico não pode ser analisado por sofrer hidrólise química completa no meio reacional, e com a hidrólise do ácido 3-(2-metil-hexanoiloxi)-4-nitrobenzóico foi possível a obtenção do ácido 2-metil-hexanóico com 9 % utilizando-se CLEA e 7 % com a enzima livre. A baixa enantiosseletividade foi interpretada como decorrente da fraca interação dos substratos com o sítio ativo da enzima / Abstract: This project explores the catalytic potential of fosfolipases A2, isolated from poisons of brazilian serpents to effect enzymatic substrate resolution with scientific relevance, since no previous work was made analyzing its enantioselectivity. Studies on the resolution of several compounds had been made, including Binol, a-tetralol, 1-phenylethanol, para-nitro-1- phenylethanol, 3-(2-bromohexanoiloxy)-4-nitrobenzoic acid and 3-(2-methylhexanoiloxy)-4-nitrobenzoic acid.Due to difficulty of attainment and purification of the phospholipase, the enzyme was immobilized using the formation of an aggregate with cross-links (Cross-Linked Enzyme Aggregate ¿ CLEA). These aggregates had been produced with four types of precipitation agents (ammonium sulphate solution 55%, polietileneglycol 600 Da, dimethoxyethane and acetone) and two additives (TRITON-X100 and poliethylenediimine). With the tests, it was observed that the CLEA formed with ammonium sulphate, without additives presented the best results, being used in the reactions of biocatalysis.The resolution of substrates was made with the alcohol¿s esterification, forming different (acetates, propanoates and hexanoates) followed by hydrolysis with the free enzyme and CLEA, for comparison. Aliquots of the reactions had been made and analyzed with GC/FID with quiral stationary phase for study of the enantiomerics excesses. The reactions had been made at ambient temperature and 45 °C.The results indicate enzymatic activity and was possible to get tetralol with 16% of ee using CLEA and p-nitro-1-phenylethanol with 19% of ee. The other alcohols had been gotten with low ee. The 3- (2-bromohexanoiloxy) - 4-nitrobenzoic acid cannot be analyzed by suffering complete chemical hydrolysis during the reaction, and with hydrolysis of acid the 3- (2-metilhexanoiloxi) - 4-nitrobenzoic the attainment of the acid 2-metilhexanoic with 9% was possible using CLEA and 7% with the free enzyme. The low enantioselectivity was explained due to the weak interaction of substrates with the active site of enzyme / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

Orientadores: Sergio Marangoni, Luis Alberto Ponce-Soto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T18:20:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bonfim_VeraLucia_D.pdf: 7120787 bytes, checksum: 3839207f36a378b463b63406202ef7e4 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O envenenamento ofídico é um evento comum nos países pobres da área tropical e subtropical e as conseqüências deste, muito graves. Nestes países, pequena têm sido a valorização destas conseqüências, sendo pouco registradas estatisticamente como casos de saúde pública e muitas vezes tratados com procedimentos pouco efetivos ou ultrapassados. Neste trabalho foram utilizados metodologias refinadas e protocolos otimizados de purificação em HPLC com o intuito de se estudar mais detalhadamente a composição do veneno de duas serpentes de importância médica e epidemiológica, Bothrops jararacussu e Calloselasma rhodostoma, e analisar a relação estrutura função de PLA2 D49 (6-1, 6-2 e Cr-IV1) e PLA2 homólogas K49 (Bj-VII e Cr 5). A Bothrops jararacussu, é uma serpente encontrada nas Américas, desde o México até a Argentina sendo que no Brasil cerca de 90% dos acidentes ofídicos são causados pelo gênero Bothrops. A Calloselasma rhodostoma, é uma serpente amplamente distribuída no sudeste da Ásia e é a causa mais comum de acidentes ofídicos na Malásia e Tailândia. As novas toxinas foram obtidas com alto grau de pureza e homogeneidade molecular, como mostram os perfis cromatográficos, eletroforéticos e de espectrometria de massa por MALDi-TOF. A nova PLA2 D49 foi purificada do veneno de Calloselasma rhodostoma após dois passos cromatográficos: exclusão molecular em uma coluna Protein Pack SW 300 (0,78 cm x 3,30 cm), eluída com 0,25M de bicarbonato de amônio, pH 7,9, a um fluxo de 0,3 ml/min e, fase reversa em HPLC usando uma coluna µ-Bondapack C-18. Esta apresentou atividade fosfolipásica de 14,25±0,36 nmol/mg/min na presença de substrato sintético cromogênico (4-nitro-3-(octanoyloxy) benzoic acid), massa molecular de 14,029 Da determinada através de espectrometria de massa por MALDI-TOF, valor calculado de pI igual a 8.55, caráter básico e grande homologia seqüencial evidenciada pela estrutura primária quando esta é comparada com outras PLA2 D49 provenientes de veneno de serpente. A outra proteína, denominada Cr 5, uma PLA2 homóloga K49 foi isolada do veneno de Calloselasma rhodostoma em um único passo cromatográfico de fase reversa em HPLC (µ-Bondapack C-18). A massa molecular de 13,965 Da foi determinada através de espectrometria de massa por MALDI-TOF. A composição de aminoácido mostrou que a Cr 5 tem alto conteúdo de Lys, Tyr, Gly, Pro e 14 cisteínas, resíduos típicos de uma PLA2 básica. A completa seqüência de aminoácidos da Cr 5 contém 120 resíduos e mostra alta identidade quando comparada a outras PLA2 K49 isoladas de venenos de serpentes da família viperidae. Com relação à caracterização biológica, esta foi realizada também com as isoformas 6-1 e 6-2 (provenientes da fração BthTX-II de Botrhops jararacussu) e com a PLA2 K49 Bj-VII, estas purificadas e parcialmente caracterizadas em trabalho anterior. As PLA2 6-1, 6-2 e Cr-IV 1, exibiram miotoxicidade local e na dosagem de 40 µg/150 µl a 6-1 causou 83,06% de citotoxicidade em miotubos e 93,78% em mioblastos, já a 6-2 75,12 % em miotubos e 86,26% em mioblastos e a Cr-IV 1, 91,50% e 88,40% de citotoxicidade em miotubos e mioblastos, respectivamente. O efeito citotóxico também foi visto em fibroblastos mostrando na dosagem de 5 µM (linhagem 3T3) 85,63%, 86% e 91,34% de citotoxicidade na presença de 6-1, 6-2 e Cr-IV 1 respectivamente, e na linhagem COS7, 95,42%, 95,07% e 96,42% respectivamente, além de atividade inflamatória, sendo esta mais pronunciada na presença da Cr-IV 1. As PLA2s K49 homólogas, Bj-VII e Cr 5, evidenciaram miotoxicidade local e na dosagem de 40 ug/150 µl, a Bj-VII causou 87±50% de lise em mioblastos e 84±85% em miotubos e 91±25% de lise em mioblastos e 91±0.8 % em miotubos quando em contato com a Cr 5, além de atividade inflamatória evidenciada pela indução de edema. No caso destas proteínas, todos os efeitos biológicos induzidos por elas ocorreram na ausência de atividade fosfolipásica mensurável in vitro, suportando a idéia proposta pela literatura de mecanismos catalíticos e farmacológicos independentes. Apesar de todas apresentarem algumas diferenças biológicas, elas possuem um comportamento semelhante na estrutura-função, sugerindo uma ancestralidade comum embora sejam proteínas provenientes de venenos de serpentes separadas geograficamente / Abstract: Snake poisoning is a common event in poor countries of tropical and subtropical areas and the consequences of this is very serious. In these countries, there is the valorization of these consequences, due to few registers of published health cases and a lot of times treated with procedures a little effective or outdated. In this work we refined methodologies and optimized purification protocols used in HPLC with the intention to study the composition of the venom of two serpents of epidemic importance, Bothrops jararacussu and Calloselasma rhodostoma, and to analyze the relationship of structures function of PLA2 D49 (6-1, 6-2 and Cr-IV1) and homologous PLA2 K49 (Bj-VII and Cr 5). Bothrops jararacussu is a serpent found in America, from Mexico to Argentina being in Brazil, about 90% of the snake accidents caused by Bothrops genus. Calloselasma rhodostoma is a serpent thoroughly distributed at the Southwest of Asia and it is the most common cause of snake accidents in Malaysia and Thailand. The new toxins were obtained with high degree of purity and molecular homogeneity, like showed the chromatographics profiles, electrophoresis and MALDi-tof mass spectrometric (MS) analysis. A new D49 PLA2 was purified from the venom of Calloselasma rhodostoma after two chromatographic steps; molecular exclusion was loaded onto a Protein-Pack 300 SW column (0.78 cm 3 30 cm) and eluted with 0.25 M ammonium bicarbonate, pH 7.9, at a flow rate of 0.3 ml/min and reverse phase HPLC on µ-Bondapack C-18 and showed phospholipasic activity of 14.25±0.36 nmol/mg/min in the presence of a synthetic chromogenic substrate (4-nitro-3-(octanoyloxy) benzoic acid), a molecular mass of 14.029 Da was determined by MALDI-TOF mass spectrometry, calculated pI value 8.55, basic character and great sequential homology evidenced by the primary structure when this was compared with other PLA2 from D49 snake venom. The other protein, denominated Cr 5 PLA2 homologous (K49) was isolated from Calloselasma rhodostoma venom in one chromatographic step in reverse phase HPLC (RP-HPLC) (on l-Bondapack C-18). A molecular mass of 13.965 Da was determined by MALDI-TOF mass spectrometry. The amino acid composition showed that Cr 5 had a high content of Lys, Tyr, Gly, Pro, and 14 half-Cys residues, typical residues of a basic PLA2. The complete amino acid sequence of Cr 5 PLA2 contains 120 residues and this sequence shows high identity values when compared to other K49 PLA2s isolated from the venoms of viperid snakes. In relation with biological characterization, this was also done with the isoforms 6-1 and 6-2 (from fraction BthTX-II of Botrhops jararacussu) and with PLA2 K49 Bj-VII, these purified and partially characterized in The Masters. PLA2 6-1, 6-2 and Cr-IV 1 exhibited in mice local myonecrosis and edema upon intramuscular and intravenous injections, respectively. In dosage of 40 ug/150 ml, 6-1 showed 83.06% of citotoxicity in myotubes and 93.78% in myoblasts, 6-2 showed 75,12 % in myotubes and 86,26% in myoblasts, to Cr-IV 1 91.50% and 88.40% of citotoxicity in myoblasts and myotubes respectively. The citotoxic effect also in fibroblasts (cell line 3T3 and COS7) and in dosage de 5 µM (cell line 3T3) 85.63%, 85% and 91.34% of citotoxicity in the presence of 6-1, 6-2 and Cr-IV 1 respectively, and lineage COS7, 95.42%, 95.07 and 96.42% respectively, besides inflammatory activity, being this one more pronounced in the presence of the Cr-IV 1. PLA2 homologue K49, Bj-VII and Cr 5, evidenced local myotoxicity and in dosage of 40 ug/150 ml, showed 87±50 of lise in myoblasts and 84±85 in myotubes and 91±25% and 91±0.8 % when in contact with Bj-VII and Cr 5, respectivally besides of inflammatory activity evidenced by the edema induction. In the case of PLA2 K49 (Bj-VII and Cr 5), all of the biological effects induced by them happened in the absence of activity phospholipase measurable in vitro, supporting the idea proposed by the literature of catalytic and pharmacological mechanisms independent. Even though all show some kind of biologic differences all of them have a similar behave in function and structure which suggests a common ascendance of course we know they are proteins coming from different snakes geographic separated. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Alteração da fosfolipase A2 tem sido descrita em diversas doenças neuropsiquiátricas. Esta enzima é responsável pelo metabolismo dos fosfolípides de membrana e parece estar envolvida na fisiopatologia do transtorno bipolar. Neste estudo, foram analisados os três principais subtipos da PLA2 (sPLA2, cPLA2 e iPLA2) em plaquetas de pacientes e indivíduos controles. A atividade de subtipos de PLA2 foi determinada em 20 pacientes TB sem tratamento com estabilizadores de humor e após seis semanas de tratamento com lítio; 72 pacientes medicados e 65 controles (16 pareados com os pacientes sem tratamento e 49 com os pacientes previamente medicados), pelo método radioenzimático. Os pacientes foram diagnosticados e classificados de acordo com os critérios estabelecidos no DSM-IV-TR. Foi verificado que Os pacientes no estágio inicial da doença apresentaram menor atividade de iPLA2, sPLA2 e cPLA2 quando comparadas ao grupo controle. Seis semanas de tratamento com o lítio não foram suficientes para observar alterações nos resultados obtidos. No entanto, o lítio diminuiu a sintomatologia maníaca e a depressiva, avaliadas pelas escalas de Hamilton e Young, respectivamente (p < 0,01 para as duas comparações). Os pacientes medicados não diferiram do grupo controle para os três subtipos de PLA2 avaliados. Estes resultados sugerem que no estágio inicial do TB há uma diminuição da atividade das PLA2, e que a ação de um ou mais medicamentos que são incluídos na terapêutica para este transtorno podem reverter essa diminuição. Sugere-se ainda que a diminuição da atividade da iPLA2 no estágio inicial do transtorno bipolar, além de alterar o remodelamento da membrana, possa ser um fator de risco para o desenvolvimento de demência nestes pacientes. / Changes in phospholipase A2 have been reported in several psychiatric disorders. This enzyme is responsible for the metabolism of membrane phospholipids and has been suggested to play a role in bipolar disorder physiopathology. In this study, the activity of the three main subtypes of phospholipase A2 (PLA2) were analyzed (sPLA2, cPLA2 and iPLA2) in platelets of BD patients and health subjects. Subjects enrolled were: 20 drug-naïve and drug free BD patients, who were treated with lithium for six weeks; 72 BD long-term treatment patients and 65 controls (16 for the drug-naïve and drug free and 49 for the long term group). PLA2 subtype activities were determined by the radio enzymatic method. Patients\' diagnostic and classification were made according to DSM-IV-TR criteria. Patients at the early stage of the disease presented lower iPLA2, sPLA2 and cPLA2 activity than the control group. Six weeks treatment with lithium did not change these activities. However, lithium reduced the maniac and depressive symptoms, evaluated with Hamilton and Young scales, respectively (p < 0.01, for both comparisons). Long-term treated patients presented similar PLA2 activities to control group. The results suggest that at the early stage of BD iPLA2 activity is decreased and that the adequate treatment of BD could reverse this reduction. We suggest that a reduction of iPLA2 activity at the early stage of BD can modify the membrane metabolism, and could be a risk for the development of dementia in BD patients.

This investigation reaches beyond one single discipline or mode of discourse, exploring current possibilities for contemporary abstract painting and spiritual experience. Types of experience associated with previous 'spiritual' abstract painting are explored in view of the need for new languages for abstraction and spirituality in both word and image. This is developed alongside. the recognition of the importance of engagement with the contemporary world for abstract painting (in this case via technology). The investigation is given a theoretical critical context through reference to and analysis of writers such as Donald Kuspit, Peter Fuller, James Elkins and Jeremy Gilbert-Rolfe and three leading painters Gerhard Richter, Jan McKeever and David Reed along with a record and analysis of my own painting and digital images. Abstract painting and spiritual experience are subjected to critique and reinterpretation within this investigation and a contemporary concept of the spiritual emerges through an opening of thought found within postmodernism and a renewed critical interest in negative theology. .' Negative theology is seen as having similarities to a broader apophatic outlook found both in contemporary thought and art. This leads to a contemporary model of abstract painting and spiritual experience using a language of doubt through terms such as the unknowable, unrepresentable or unintelligible. The initial process based paintings of this investigation explored problems surrounding authorship and of authorial suspension via process, however a counter and more positive aspect of process emerged from an alternative alchemical or hypostatic view of process painting as a deep. engagement with matter. The limitations of process painting are considered, for example, basic repetitiveness, lack of surface and form, lack of imaginative engagement and most importantly the lack of risk on an emotional or psychological level. Previous modernist models of spiritual abstraction are seen to be made problematic by contemporary critical theory resulting in the need for a new, contemporary language for spiritually motivated abstract painting. Through the use of image deconvolution software (normally used within the sciences) relatively formless process paintings gave rise to new digitally generated form. Subsequent paintings were a response to the potential of these digital forms arid reintroduced both brushstrokes and form within an abstract, illusionistic space. This investigation explores a language of the unknown and unfamiliar within a broader context of doubt as positive strategy. Process and technology along with a critical reintroduction of authorial subjectivity and imaginative response gave rise to strange and unpredictable paintings which exist within a contemporary discourse of the apophatic, a mode in which, I argue, a contemporary form of spirituality may also be encountered.

Thesis (M.S.)--Brigham Young University. Dept. of Physiology and Developmental Biology, 2004. / Includes bibliographical references (p. 17-21).

Univ., Diss.--Münster, 2005.

Thesis (Ph.D.)--Virginia Commonwealth University, 2008. / Title from title-page of electronic thesis. Prepared for: Dept. of Biochemistry and Molecular Biology. Bibliography: leaves 168-205.

Thesis (Ph.D.)--Virginia Commonwealth University, 2008. / Prepared for: Dept. of Biochemistry and Molecular Biology. Bibliography: leaves 168-205. Also available online via the Internet.